專利名稱：多維生物材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及間充質(zhì)干細胞和它們的分化以制備多維組織或生物材料或基質(zhì)的領(lǐng)域。本發(fā)明的產(chǎn)品可以用于風濕病學、組織重建和/或外科手術(shù)，尤其是創(chuàng)傷、矯形、整形和頌面外科手術(shù)。尤其是，本發(fā)明的產(chǎn)品可以用于骨或軟骨修復或置換。
背景技術(shù)：
組織工程是一個不斷成長的領(lǐng)域，在此領(lǐng)域中，不斷開發(fā)出新材料以用于植入至體內(nèi)。一個重要的領(lǐng)域包括置換由于創(chuàng)傷或疾病(如例如，腫瘤切除術(shù))而損失的骨區(qū)域的骨移植物材料。過去，移植物材料可以獲自接受移植物材料的個體的骨。然而，這需要額外的手術(shù)和額外的康復。骨也可以取自其它來源，或甚至取自尸體，但這帶來了生物相容性問題以及疾病轉(zhuǎn)移的風險。在用于制備組織的干細胞分化的領(lǐng)域已經(jīng)進行了許多研究。例如，W02007/103442 公開了一種包含蠶絲支架和成體干細胞的組合物，其中所述成體干細胞是脂肪來源的干細胞。[技術(shù)問題]然而，制備用于骨移植物或骨增強或骨重建的多維組織仍然存在實際的技術(shù)問題。在軟骨重建或減輕軟骨缺損中也存在相同的問題。因此在本領(lǐng)域中仍然需要這樣的組織工程材料，其是完全生物相容的，并且為特定應用提供適宜的機械特征。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及天然的人骨誘導性生物材料，其具有多維結(jié)構(gòu)并且包含分化的間充質(zhì)干細胞(MSC)組織和脫礦質(zhì)骨基質(zhì)(DBM)，其中所述脫礦質(zhì)骨基質(zhì)分散在所述分化的MSC組織內(nèi)。用來制備所述分化的MSC組織的MSC是人或動物來源的。根據(jù)第一個實施方案，MSC已經(jīng)從脂肪組織中分離，并且下文稱為脂肪組織間充質(zhì)干細胞(AMSC)。根據(jù)另一個實施方案，MSC已經(jīng)從骨髓中分離，并且下文稱為骨髓干細胞(BMSC)。 優(yōu)選地，包含在本發(fā)明的生物材料中的MSC是傳代晚期的(late passaged)脂肪組織來源的干細胞。本發(fā)明的生物材料打算用于植入至人或動物體內(nèi)。植入的生物材料可以是自體來源的，或同種異體的。本發(fā)明的生物材料可以植入至骨或軟骨區(qū)域中。本發(fā)明的生物材料可以植入至人或動物身體的不規(guī)則區(qū)域中。本發(fā)明的生物材料是生物相容的。典型地，本發(fā)明的生物材料是均質(zhì)的，這意味著所述生物材料的結(jié)構(gòu)和/或構(gòu)造在整個組織內(nèi)是相似的。典型地，本發(fā)明的生物材料具有在原始疾病區(qū)域中植入所需的合乎需要的處理和機械特性。根據(jù)具體的實施方案，本發(fā)明的生物材料可以使用手術(shù)器械夾持而不會被撕碎。在本發(fā)明的實施方案中，所述生物材料不包含任何粘結(jié)劑或粘合劑。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，根據(jù)本發(fā)明的生物材料是三維的。在此實施方案中，本發(fā)明的生物材料可以形成厚度為至少Imm的厚膜。生物材料的尺寸可以適當調(diào)節(jié)以便于使用。 在另一個實施方案中，生物材料形成支架；因此，本發(fā)明的生物材料不需要使用任何其它的合成支架。根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明的生物材料可以形成小于Imm的薄膜。在此實施方案中，生物材料是所謂兩維的。根據(jù)第一個實施方案，本發(fā)明的生物材料具有與實際骨相同的性質(zhì)，其具有骨鈣蛋白表達和礦化性質(zhì)，即，其包含骨細胞和中間結(jié)締組織(intercormective tissue)。根據(jù)具體的實施方案，本發(fā)明的生物材料包含骨細胞(也稱為骨細胞樣細胞)和膠原(優(yōu)選鈣化和礦化的膠原)、骨基質(zhì)和骨細胞上的礦物涂層，所述涂層為有序的磷鈣晶體(organized phosphocalcic crystal) 0典型地，本發(fā)明的生物材料具有與天然骨接近的多孔性。根據(jù)第二個實施方案，本發(fā)明的生物材料具有與實際軟骨相同的性質(zhì)，S卩，其包含軟骨細胞和包含膠原和蛋白聚糖的細胞外基質(zhì)。本發(fā)明的生物材料的再生性質(zhì)可以取決于所述生物材料被移植的環(huán)境當被置于骨質(zhì)環(huán)境中時本發(fā)明的生物材料可以是可再生的，并且當被置于非骨質(zhì)環(huán)境中時可以是不可再生的。本發(fā)明的生物材料為這樣的材料所述生物材料的細胞的分化已經(jīng)達到終點，并且當被移植時所述生物材料的表型仍然保持不變。本發(fā)明的移植物可以是多層的，即，其包含至少兩層生物材料，所述至少兩層可能彼此被縫合在一起或通過任何合適的方式，諸如例如外科膠或任何合適的固定方式彼此固定在一起。典型地，本發(fā)明的生物材料包含粒子形式的脫礦質(zhì)骨基質(zhì)，所述粒子具有 50-2500 μ m的平均粒徑；在第一個實施方案中，所述粒子的平均粒徑為50-125 μ m ；在第二個實施方案中，所述粒子的平均粒徑為125-200 μ m ；在第三個實施方案中，所述粒子的平均粒徑為500-1000 μ m。典型地，脫礦質(zhì)骨基質(zhì)來自年齡小于40歲的供體。根據(jù)一個實施方案，骨基質(zhì)的脫礦質(zhì)率為90-99%，優(yōu)選95-98%，且甚至更優(yōu)選約97%。使用HCl 0. 6N 經(jīng)3小時的過程有利地獲得此脫礦質(zhì)率。根據(jù)特殊的實施方案，脫礦質(zhì)骨基質(zhì)被滅菌。根據(jù)具體的實施方案，所述脫礦質(zhì)骨基質(zhì)由大學組織庫(University Tissue Bank) (Cliniques universitaires Saint-Luc, Brussels, Belgium)提供。本發(fā)明還涉及一種制備多維生物材料的方法，所述方法包含在15-25天期間在成骨細胞培養(yǎng)基和/或軟骨形成培養(yǎng)基中孵育MSC，然后在所述培養(yǎng)基中加入脫礦質(zhì)骨基質(zhì)并維持孵育另外15-30天的時間，優(yōu)選15-25天，更優(yōu)選20天；在所述另外的時間期間，優(yōu)選地在不去除脫礦質(zhì)骨基質(zhì)的條件下每兩天更換培養(yǎng)基。在加入脫礦質(zhì)骨基質(zhì)之前孵育MSC是本發(fā)明的方法的一個關(guān)鍵步驟。此步驟對于使MSC分化成軟骨形成細胞和/或成骨細胞是必不可少的。另外，此步驟對于獲得3D骨樣結(jié)構(gòu)是必不可少的。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，MSC是傳代晚期的脂肪組織間充質(zhì)干細胞。
根據(jù)一個實施方案，每毫升培養(yǎng)基加入l_20mg脫礦質(zhì)骨基質(zhì)。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，每毫升培養(yǎng)基加入I-IOmg脫礦質(zhì)骨基質(zhì)。最優(yōu)選地，每毫升培養(yǎng)基加入5-10mg脫礦質(zhì)骨基質(zhì)。所述量的脫礦質(zhì)骨基質(zhì)是用于提供所述生物材料的3D樣結(jié)構(gòu)的最適濃度。根據(jù)一個實施方案，所有培養(yǎng)基不含動物蛋白。根據(jù)第二個實施方案，分化培養(yǎng)基包含人血清。有利地，所述分化培養(yǎng)基不包含任何動物血清，優(yōu)選其不包含人血清以外的其它血清。本發(fā)明還涉及能夠通過本發(fā)明的方法獲得的多維生物材料。能夠通過本發(fā)明的方法獲得的生物材料打算用于植入至人或動物身體中。被植入的生物材料可以是自體來源的，或同種異體的。本發(fā)明的生物材料可以植入至骨或軟骨區(qū)域中。此生物材料可以植入至人或動物身體的不規(guī)則區(qū)域中。能夠通過本發(fā)明的方法獲得的生物材料是生物相容的。此生物材料是均質(zhì)的，這意味著所述生物材料的結(jié)構(gòu)和/或構(gòu)造在整個組織內(nèi)是相似的。優(yōu)選地，此生物材料具有在原始疾病區(qū)域中植入所需的合乎需要的處理和機械特性。典型地，能夠通過本發(fā)明的方法獲得的生物材料可以使用手術(shù)器械夾持而不會被撕碎。在本發(fā)明的實施方案中，所述生物材料不包含任何粘結(jié)劑或粘合劑。在另一個實施方案中，能夠通過本發(fā)明的方法獲得的生物材料是三維的。在此實施方案中，所述生物材料可以形成厚度為至少Imm的厚膜。生物材料的尺寸可以適當調(diào)節(jié)以便于使用。在另一個實施方案中，所述生物材料形成支架；因此，能夠通過本發(fā)明的方法獲得的生物材料不需要使用任何其它的合成支架。還在另一個實施方案中，能夠通過本發(fā)明的方法獲得的生物材料可以形成小于 Imm的薄膜。在此實施方案中，生物材料是兩維的。根據(jù)第一個實施方案，就骨鈣蛋白表達和礦化性質(zhì)而言，能夠通過本發(fā)明的方法獲得的生物材料具有與實際骨相同的性質(zhì)，即，其包含骨細胞和中間結(jié)締組織。在一個實施方案中，此生物材料包含骨細胞(也稱為骨細胞樣細胞)和膠原(優(yōu)選鈣化和礦化的膠原)、骨基質(zhì)和骨細胞上的礦物涂層，所述涂層為有序的磷鈣晶體。典型地，所述生物材料具有與天然骨接近的多孔性。根據(jù)第二個實施方案，能夠通過本發(fā)明的方法獲得的生物材料具有與實際軟骨相同的性質(zhì)，即，其包含軟骨細胞和包含膠原和蛋白聚糖的細胞外基質(zhì)。能夠通過本發(fā)明的方法獲得的生物材料為這樣的材料所述生物材料的細胞的分化已經(jīng)達到終點，并且當被移植時所述生物材料的表型仍然保持不變。本發(fā)明的移植物可以是多層的，即，其包含至少兩層生物材料，所述至少兩層可能彼此被縫合在一起或通過任何合適的方式，諸如例如外科膠或任何合適的固定方式彼此固定在一起。能夠通過本發(fā)明的方法獲得的生物材料包含粒子形式的脫礦質(zhì)骨基質(zhì)，所述粒子具有50-2500 μ m的平均粒徑；在第一個實施方案中，所述粒子的平均粒徑為50-125 μ m ；在第二個實施方案中，所述粒子的平均粒徑為125-200μπι;在第三個實施方案中，所述粒子的平均粒徑為500-1000 μ m。典型地，脫礦質(zhì)骨基質(zhì)來自年齡小于40歲的供體。根據(jù)一個實施方案，骨基質(zhì)的脫礦質(zhì)率為90-99 %，優(yōu)選95-98 %，且甚至更優(yōu)選約97 %。使用HCl 0. 6N經(jīng)3小時的過程有利地獲得此脫礦質(zhì)率。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，脫礦質(zhì)骨基質(zhì)被滅菌。
典型地，所述脫礦質(zhì)骨基質(zhì)由大學組織庫(University Tissue Bank) (Cliniques universitaires Saint-Luc, Brussels, Belgium)提供。本發(fā)明涉及本發(fā)明的生物材料作為醫(yī)療設(shè)備或包含在醫(yī)療設(shè)備中，或包含在藥物組合物中的任何用途。本發(fā)明還涉及一種試劑盒，所述試劑盒包含包含本發(fā)明的生物材料的醫(yī)療設(shè)備和合適的固定裝置，所述固定裝置諸如例如，外科膠，或組織膠，或任意的粘合劑組合物，所述粘合劑組合物是生物相容的、無毒的以用于外科用途，并且可能是生物可吸收的，并且特別地用于將生物組織彼此連接在一起或連接到被植入的生物材料。本發(fā)明還涉及一種試劑盒，所述試劑盒包含本發(fā)明的生物材料，和合適的固定裝置，所述固定裝置諸如例如，外科膠，或組織膠，或任意的粘合劑組合物，所述粘合劑組合物是生物相容的、無毒的以用于外科用途，并且可能是生物可吸收的，并且特別地用于將生物組織彼此連接在一起或連接到被植入的生物材料。在另一個方面，本發(fā)明涉及在用于減輕或治療骨質(zhì)缺損或軟骨缺損的方法中使用的根據(jù)本發(fā)明的生物材料。本發(fā)明還涉及一種減輕或治療哺乳動物中的骨質(zhì)缺損或軟骨缺損的方法，所述方法包含向所述具有骨質(zhì)缺損或軟骨缺損的哺乳動物施用治療有效量的如本文所述的生物材料。所述生物材料以用于減輕或治療哺乳動物中的骨質(zhì)缺損或軟骨缺損的有效量使用。骨質(zhì)缺損或軟骨缺損的非限制性實例是骨折、骨骼脆弱、骨礦物質(zhì)密度損失、關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、骨軟化、骨質(zhì)減少、骨癌、帕哲病O^aget’ s disease)、硬化病變、骨的浸潤性病癥、代謝性骨損失。本發(fā)明還涉及所述生物材料在矯形外科，尤其是在頌面或整形外科中的用途。本發(fā)明的生物材料還可以用于風濕病學。本發(fā)明進一步涉及使用本發(fā)明的生物材料的方法，所述方法用于支持或糾正關(guān)節(jié)、顱-面-上頌骨的先天性或獲得性異常，正畸程序，手術(shù)、創(chuàng)傷或其它先天性或獲得性異常后的骨或軟骨置換，和用于支持其它肌肉骨骼植入物、尤其是人工和合成植入物。在另一個方面，本發(fā)明涉及用于填充人或動物身體內(nèi)的骨腔的本發(fā)明的生物材料。還在另一個方面，本發(fā)明涉及用于重建或美容外科的本發(fā)明的生物材料。本發(fā)明的生物材料可以是自體的或同種異體的。其可以在組織移植中使用。本發(fā)明進一步涉及一種填充人或動物身體內(nèi)的腔隙的方法，所述方法包含施用本發(fā)明的生物材料的步驟。本發(fā)明的生物材料可用作同種異體移植物或自體移植物。所述生物材料也是有利的，其原因在于其是無免疫原性的，并且在于其具有免疫調(diào)節(jié)作用令人驚奇地，在本發(fā)明的生物材料中，保留了未分化的MSC的免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)，使得將本發(fā)明的生物材料植入至人或動物體內(nèi)不會導致任何炎癥反應相反，所述生物材料的存在減輕了植入部位的炎癥。本發(fā)明的生物材料因此尤其適合于作為抗炎藥物的替代品，或作為減少遭受關(guān)節(jié)炎導致的后果的患者所需的抗炎藥物的量的方式，來治療關(guān)節(jié)炎，尤其是炎性關(guān)節(jié)炎。本發(fā)明的生物材料進一步有利于刺激血管生成。實際上，生物材料的MSC釋放血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)，其刺激新血管的生長。本發(fā)明的此方面是非常有前途的，因為其為骨或軟骨形成提供了最適條件。[定義]在本發(fā)明的含義中，術(shù)語“組織”是指互連細胞(interconnected cells)的集合體，所述互連細胞在天然人組織內(nèi)執(zhí)行相似的功能。在本發(fā)明的含義中，術(shù)語“間充質(zhì)干細胞”或MSC是可以分化成多種細胞類型的多能干細胞。“脂肪”是指任何脂肪組織。脂肪組織可以是褐色的、黃色的或白色的脂肪組織。 優(yōu)選地，脂肪組織是皮下白色脂肪組織。脂肪組織包含脂肪細胞和基質(zhì)。脂肪組織可以存在于動物的身體各處。例如，在哺乳動物中，脂肪組織存在于網(wǎng)膜、骨髓、皮下空間、脂肪墊 (例如，肩胛或髕下脂肪墊)和周圍的大多數(shù)器官中。獲自脂肪組織的細胞可以包括原代細胞培養(yǎng)或祖細胞系。脂肪組織可以來自具有脂肪組織的任何生物體。術(shù)語“脂肪組織來源細胞”是指源自脂肪組織的細胞。從脂肪組織分離的初始細胞群是異源的細胞群，包括，但不限于基質(zhì)血管成分(SVF)細胞。當用于本文中時，術(shù)語“脂肪組織間充質(zhì)干細胞”(AMSC)是指源自脂肪組織的基質(zhì)細胞，其可充當多種不同細胞類型、諸如但不限于脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞的前體。當用于本文中時，術(shù)語“傳代晚期的脂肪組織間充質(zhì)干細胞”是指與傳代早期的細胞相比表現(xiàn)較少免疫原特性的細胞。脂肪組織來源的基質(zhì)細胞的免疫原性與代數(shù)相對應。 優(yōu)選細胞已經(jīng)傳代至至少第四代，更優(yōu)選所述細胞已經(jīng)傳代至至少第六代，和最優(yōu)選所述細胞已經(jīng)傳代至至少第八代。當在此使用時，“生物相容的”是指當被植入至哺乳動物中時不會引起哺乳動物任何不良應答的任何材料。生物相容材料當引入至個體中時，對該個體是無毒的或無害的，其也不會誘發(fā)所述材料在所述哺乳動物中的免疫排斥。當在本文中使用時，“自體的”是指來源于個體的生物材料，所述材料以后將被重新引入至該同一個體中。當在本文中使用時，“同種異體的”是指來源于與其中將要引入所述材料的個體相同的物種的基因不同的個體的生物材料。當在本文中使用時，“移植物”是指被植入至個體中，典型地為置換、糾正或以其它的方式克服缺損的細胞、組織或器官。所述組織或器官可以由源自同一個體的細胞組成；此移植物在本文中以下面的可互換術(shù)語提及“自體移植物”、“自體移植體”、“自體植入物”和 “自身移植物”。包含來自同一物種的基因不同的個體的細胞的移植物在本文中以下面的可互換術(shù)語提及“同種異基因移植物”、“同種異體移植體”、“同種異體植入物”和“同種異體移植物”。來自其同卵雙生個體的移植物在本文中稱為“同基因移植物”、“同系移植體”、“同系植入物”或“同系移植物”?！爱惙N移植物”、“異基因移植體”或“異基因植入物”是指來自另一種不同物種的個體的移植物。當在本文中使用時，術(shù)語“組織移植”和“組織重建”均指將移植物植入至個體中以治療或減輕組織缺損，諸如例如骨質(zhì)缺損或軟骨缺損。
當在本文中使用時，“減輕”疾病、缺損、病癥或病況是指減小所述疾病、缺損、病癥或病況的一個或多個癥狀的嚴重性。當在本文中使用時，“治療”是指減少患者所經(jīng)歷的疾病、缺損、病癥或不良狀況的癥狀發(fā)生的頻率。當在本文中使用時，“治療有效量”是本發(fā)明的組合物足以對施用所述組合物的個體提供有益效果的量。當在本文中使用時，“骨質(zhì)缺損”是指發(fā)生破碎、骨折、一部分缺失或以其它方式受損害的骨。此類損害可能是由于先天性畸形、疾病、疾病治療、創(chuàng)傷或骨感染引起的，并且可能是急性的或慢性的。例如，骨質(zhì)損失可以是由腫瘤切除術(shù)導致發(fā)生的，因此導致骨質(zhì)缺損。骨質(zhì)缺損的非限制性實例包括骨折、骨/脊柱變形、骨肉瘤、骨髓瘤、骨發(fā)育不良、脊柱側(cè)凸、骨質(zhì)疏松癥、骨軟化、佝僂病、纖維性骨炎、骨纖維異樣增殖癥、腎臟骨營養(yǎng)不良和佩吉特骨病(Paget‘ s disease of bone)。當在本文中使用時，“軟骨缺損”是指正在缺失、數(shù)量減少或以其它方式受損的軟骨。軟骨組織缺損可以由先天性畸形、疾病、疾病治療或創(chuàng)傷引起，或可以是急性的或慢性的(骨關(guān)節(jié)炎)。當在本文中使用時，術(shù)語“成骨細胞和/或軟骨形成培養(yǎng)基”意指促進成骨細胞和 /或軟骨形成細胞的生長和分化的培養(yǎng)基。有利地，通過對標準培養(yǎng)基添加人或動物(優(yōu)選胎?；蚺Ｑ?FCS，F(xiàn)BS))血清、 地塞米松(dexamethasone)、抗壞血酸鈉、磷酸二氫鈉、青霉素和鏈霉素誘導骨生成。細胞在成骨培養(yǎng)物中培養(yǎng)，培養(yǎng)基每2天更換一次。在優(yōu)選實施方案中，成骨細胞培養(yǎng)基是標準培養(yǎng)基，優(yōu)選DMEM，所述培養(yǎng)基添加了 10% ν/ν的人血清、1 μ M的地塞米松、50 μ g/ml的抗壞血酸鈉、36mg/ml的磷酸二氫鈉、 100U/ml的青霉素和100 μ g/ml的鏈霉素。有利地通過對標準培養(yǎng)基添加人或動物(優(yōu)選胎?；蚺Ｑ?FCS，F(xiàn)BS))血清、 地塞米松、TGF-B3、L-脯氨酸、抗壞血酸鈉、磷酸二氫鈉、丙酮酸鈉、ITS(胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒，例如來自可獲自Sigma的胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉培養(yǎng)基添加物凍干粉末)、 青霉素和鏈霉素誘導軟骨形成。優(yōu)選軟骨形成培養(yǎng)基是標準培養(yǎng)基，優(yōu)選DMEM，所述培養(yǎng)基添加了 10% ν/ν的人血清、1 μ M的地塞米松、IOng的TGF_B3、40 μ g/ml的L-脯氨酸、50 μ g/ml的抗壞血酸鈉、 36mg/ml的磷酸二氫鈉、100 μ g/ml的丙酮酸鈉、100 μ 1/ml的ITS (胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒， 例如來自可獲自Sigma的胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉培養(yǎng)基添加物凍干粉末)、100U/ml 的青霉素和100 μ g/ml鏈霉素。用于成骨和軟骨形成培養(yǎng)基兩者的合適標準培養(yǎng)基包括但不限于DMEM、EMEM、 RPMI和GMEM，DMEM是優(yōu)選的標準培養(yǎng)基。當在本文中使用時，“支架”是指包括但不限于下列形式的結(jié)構(gòu)膜(例如，二維基本上大于第三維的形式)、帶、索、薄片、平皿、圓柱體、球體、三維無定形形狀等。


圖1.圖1顯示在添加有人血清和DBM的成骨培養(yǎng)基中的人AMSC分化。通過用
8Trichrom Masson染色法(C)染色發(fā)現(xiàn)具有組織收縮和中間結(jié)締組織(B)的多層結(jié)構(gòu)(A)。圖2.圖2顯示在不含(A，B)和含(C，D，E)DBM的軟骨形成培養(yǎng)基中的AMSC分化。 在不含DBM的軟骨形成培養(yǎng)基(B)中形成具有匯合細胞的單層結(jié)構(gòu)(A)。相反，通過蜂窩狀組織收縮(D)獲得的多層結(jié)構(gòu)(C)由被阿辛藍(Alcian blue)染色的軟骨形成樣基質(zhì)(E 和經(jīng)過吉姆薩染色(Giemsa staining)的長方形)組成。圖3.圖3顯示在不含(A，B，C)和含(D，E，F(xiàn))DBM的成骨培養(yǎng)基中的人AMSC分化。 在不含DBM的成骨培養(yǎng)基中形成了由單個骨結(jié)節(jié)(茜素紅染色，B)和結(jié)節(jié)內(nèi)膠原組織(C) 制成的單層結(jié)構(gòu)(A)。相反，具有中間結(jié)締組織(E)的蜂窩狀組織收縮(D)由礦化膠原(F， Von Kossa染色呈黑色左側(cè)長方形)與骨鈣蛋白表達細胞(F，右側(cè)長方形)制成。圖4.圖4顯示在裸大鼠的椎旁肌肉中植入后60天后的BM-MSC和AMSC活力。間充質(zhì)干細胞通過GFP和骨鈣蛋白抗體的免疫組織化學進行檢測。在單獨骨植入的情況下， 沒有發(fā)現(xiàn)GFP的表達和骨鈣蛋白染色細胞。在由“MSC—人骨移植物”制成的復合移植物的情況下，檢測到GFP和骨鈣蛋白細胞。圖5.圖5顯示在添加了 DBM的成骨(A-C)和軟骨形成(E-F)培養(yǎng)基中孵育的AMSC 形成的多維結(jié)構(gòu)。組織收縮(A，D)，DBM相互連接(B，E)以及骨鈣蛋白 和蛋白聚糖(F)蛋白的表達。圖6.圖6顯示AMSC相比于BM-MSC的血管生成能力。通過將兩種細胞在不同的氧濃度(0. 1、3、5和21% 02)下孵育發(fā)現(xiàn)了體外能力。在每個02濃度下，AMSC證明VEGF 的釋放顯著高于BM-MSC。
具體實施例方式實施例1根據(jù)本發(fā)明的多維牛物材料的制備臨床前模型中AMSC的動物來源綠色熒光轉(zhuǎn)基因豬用作骨髓和脂肪細胞干細胞的供體(Brimetti D，Cloning Stem Ceils, eupb 2008)。依照比利時農(nóng)業(yè)和動物管理部(Ministry of Agriculture and Animal Care)的指導方針圈養(yǎng)動物。所有程序獲得Universit6catholique de Louvain的動物管理地方倫理委員會批準。來自動物的AMSC的來源膠原酶(0. 075g)在Hank's平衡鹽液(含有鈣離子)中復配并在消化前在2_8°C 保存。用NaCl 0.009%洗滌脂肪組織(均值為15g)三次并在陪替氏培養(yǎng)皿中切割以去除血管和纖維結(jié)締組織。在消化之前對脂肪稱重并將其轉(zhuǎn)移至包含所述酶的50-ml Flacon試管中。將組織置于37°C的振蕩水浴中連續(xù)攪動60分鐘。消化后，膠原酶在添加有50ml的人血清、L-谷氨酰胺(5ml)和5ml抗生素(青霉素/鏈霉素)的DMEM(500ml)中滅活。收集的組織在室溫O0-25°C )下以1500rpm離心lOmin。吸取包含成熟脂肪細胞的上清液。 沉淀物重新懸浮在20ml由添加有10%的人血清和抗生素(100U/ml青霉素和100 μ g/ml鏈霉素)的DMEM制成的增殖培養(yǎng)基(MP)中并通過500 μ m網(wǎng)篩過濾。收集的組織(過濾后) 在室溫00-25°C )下以1500rpm離心lOmin，沉淀物重新懸浮在MP中，并被鑒定為基質(zhì)血管成分(SVF)細胞。此初代的原代細胞被稱為0代(PO)。在5% CO2在37°C下孵育M-48小時后，培養(yǎng)物用PBS洗滌并在MP中培養(yǎng)一直到P4 (第四代)，然后在特定培養(yǎng)基(見下) 中分化。來自人的AMSC的來源在常規(guī)外科手術(shù)(腹部和矯形外科手術(shù))期間取下人脂肪組織(小片皮下脂肪組織，l_2g，n = 4)，在冷的4°C生理溶液中保存一直到實驗室加工。如先前對豬脂肪組織加工所述的那樣進行人脂肪消化。消化后，人AMSC培養(yǎng)在MP中并在添加有(i)胎牛血清(10% ν/ν)或(ii)人血清(10% ν/ν)的特定培養(yǎng)基(確切組成見下)中分化。觀察到在包含F(xiàn)BS的分化培養(yǎng)基和包含人血清的分化培養(yǎng)基中AMSC均分化。脫礦質(zhì)骨基質(zhì)的來源人脫礦質(zhì)骨基質(zhì)由大學組織庫(University Tissue Bank) (Cliniques universitaires Saint-Luc,Brussels,Belgium)提供，并且由多器官人供體制備。切下股骨或脛骨的骨干并搗碎成1000 μ m以下的微粒用于脫礦質(zhì)處理(見下)。通過將來自所選擇的人供體的皮質(zhì)骨研磨來進行人DBM。首先，人骨組織通過丙酮 (99% )浴脫脂過夜，然后在脫礦質(zhì)水中洗滌2小時。通過在HCL 0. 6N中浸泡3小時QOml 溶液/克骨)并在室溫下攪動來進行脫鈣。然后，脫礦質(zhì)骨粉末用脫礦質(zhì)水漂洗2小時，并控制PH。如果pH酸性過大，則用0. IM的磷酸鹽溶液在攪動的條件下緩沖DBM。最后，將 DBM干燥并稱重。DBM在凍結(jié)溫度下通過γ照射以25kGray進行滅菌。干細胞分化和表征脂肪形成通過用脂肪細胞誘導培養(yǎng)基替換MP來誘導AMSC的鋪滿培養(yǎng)物發(fā)生脂肪形成，所述脂肪細胞誘導培養(yǎng)基由添加了 20%人血清、L-谷氨酰胺(5ml)、牛胰島素(5yg/ml)、 吲哚美辛(indomethacine) (50 μ M)、3_異丁基-1-甲基-黃嘌呤(ΙΒΜΧ,Ο. 5mM)、地塞米松(ΙμΜ)以及青霉素100U/ml和鏈霉素100 μ g/ml的Iscove改良杜氏培養(yǎng)基(Iscove modified Dulbecco's Medium)(IMDM)(Mauney JR,Biomaterials 2005，第 26 卷6167)組成。細胞保持在脂肪形成培養(yǎng)物中，每2天更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)物用PBS漂洗并在福爾馬林溶液中固定，通過用油紅染色中性脂質(zhì)來確定脂肪細胞分化。骨生成使用成骨培養(yǎng)基誘導AMSC的鋪滿培養(yǎng)物發(fā)生骨生成，所述成骨培養(yǎng)基通過向DMEM添加人血清(10% ν/ν)、地塞米松(ΙμΜ)、抗壞血酸鈉(50 μ g/ml)、磷酸二氫鈉 (36mg/ml)、青霉素(100U/ml)和鏈霉素(100 μ g/ml)(參見圖3_A、B、C)獲得。細胞保持在成骨培養(yǎng)物中，每2天更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)物用PBS漂洗并在70%乙醇中固定，通過用茜素紅染色磷酸鈣來確定成骨分化。另外，進行骨鈣蛋白的免疫組織化學和von Kossa染色以證實“骨”表型(參見圖4)。軟骨形成使用軟骨形成培養(yǎng)基誘導AMSC的鋪滿培養(yǎng)物發(fā)生軟骨形成，所述軟骨形成培養(yǎng)基通過向DMEM添加人血清(10% ν/ν)、地塞米松(1 μ Μ)、TGF_B3 (IOng)、L_脯氨酸(40 μ g/ ml)、抗壞血酸鈉(50 μ g/ml)、磷酸二氫鈉(36mg/ml)、丙酮酸鈉(100 μ g/ml)、ITS (胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒，例如來自可獲自Sigma的胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉培養(yǎng)基添加物凍干粉末)(100 μ g/ml)、青霉素(100U/ml)和鏈霉素(100 μ g/ml) ( Taipalcenmaki H，Experimental Cell Research 2008第314卷2400)獲得。細胞保持在軟骨形成培養(yǎng)物
中，每2天更換一次培養(yǎng)基。分化培養(yǎng)基的影響(對AMSC的成骨和軟骨形成的影響)生長細胞和培養(yǎng)條件AMSC生長在增殖培養(yǎng)基(MP)中并在37°C (95%空氣和5% CO2)下保持直至約 85-90%匯合。每兩天更換一次培養(yǎng)基。為懸浮細胞用于細胞毒性測定，用0.25%胰蛋白酶-EDTA混合物在37°C下使細胞從培養(yǎng)瓶上脫離持續(xù)IOmin并且將其重新懸浮在培養(yǎng)基中。細胞以1 χ IO4細胞/孔的密度接種在96孔微量滴定板中用于MTS(溴化3- ，5-二甲基噻唑-2-基]-5- [3-羧基甲氧基苯基]-2- [4-磺苯基]-2H-四唑)。它們在37°C下在 96小時生長接近匯合，然后接觸不同的測試培養(yǎng)基5天(i)MP，(ii)成骨培養(yǎng)基，和(iii) 軟骨形成培養(yǎng)基。MTS測定.提取物-細胞接觸對小時后，向含有ΙΟΟμΙ提取物培養(yǎng)基的每孑L 中直接力口入 20 μ 1 "Cell titer 96 AGjueousOne Solution Cell Proliferation Assay" (Promega, Madison, WI)。細胞在37°C下孵育3小時。使用微量滴定板分光光度計(Multiskan Ex, Labsystems, Brussels, Belgium)在 492nm 處測量吸光度?；鶞什ㄩL為 690nm。估計光密度差 OD = OD492mi-OD69tlni^觀察到僅當使用特定分化培養(yǎng)基時發(fā)生分化。多維結(jié)構(gòu)的形成在特定(成骨或軟骨形成)培養(yǎng)基中孵育AMSC (第4代傳代培養(yǎng)物)15-20天后， 將脫礦質(zhì)骨基質(zhì)(DBM)添加至成骨和軟骨形成培養(yǎng)基中持續(xù)另外20天的時間，以產(chǎn)生多維結(jié)構(gòu)(lmg DBM/ml分化培養(yǎng)基)。在不去除DBM的條件下每2天更換培養(yǎng)基一次。在分化結(jié)束時，培養(yǎng)物用PBS漂洗并在福爾馬林溶液中固定以通過骨鈣蛋白組織學、阿辛藍和吉姆薩染色表征骨和軟骨形成(圖2-C、D、E，圖3-D、E、F)。細胞沉淀物在4%多聚甲醛中固定過夜。連續(xù)切片(5μπι厚)與脫礦質(zhì)水被封固在載玻片上，在37°C干燥12小時，并通過經(jīng)典的免疫檢測或組織化學進行處理。通過將切片置于過氧化氫(0. 3% H2O2)中30min以封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性。在Tris-Triton緩沖鹽水(TBS-0. 05M，0. 05%，pH = 7. 4)中洗滌后，載玻片與正常山羊血清(1 10 ；BI0SYS, B0uSSens，F(xiàn)rance)在室溫下孵育30分鐘，并與稀釋度為1 100的用于染色骨鈣蛋白的一抗(抗骨鈣蛋白鼠單克隆抗體；ABCAM，Cambridge, UK)孵育過夜。在用Tris-TBS洗滌后， 載玻片與用于免疫過氧化物酶檢測的抗鼠IgG 二抗孵育1小時。通過對每個樣品的所有類型未分化/分化細胞的Masson’ s Trichrom來研究膠原結(jié)構(gòu)。在增殖和分化(成骨、軟骨形成和脂肪形成)培養(yǎng)基中孵育的成纖維細胞充當陰性對照。分泌蛋白聚糖的軟骨細胞用阿辛藍和吉姆薩染色法進行染色。AMSC用飽和量的與藻紅蛋白(PE)綴合的單克隆CD90抗體染色。采用Celiquest 軟件通過流式細胞儀(FACScan，BD Biosciences)分析至少15，000個事件。在成骨和軟骨形成分化培養(yǎng)基中，添加的DBM通過蜂窩狀結(jié)構(gòu)、膠原合成和脫礦質(zhì)骨基質(zhì)微粒的重組來誘導三維結(jié)構(gòu)形成(參見圖5A-E)。在顯微鏡下，分別在成骨(圖5C)和軟骨形成(圖5F)條件下顯示了骨鈣蛋白表達和蛋白聚糖分泌。體內(nèi)植入和組織學分析成骨細胞分化的GFP-豬AMSC接種在由大學組織庫(University clinical hospital Saint-Luc,Brussels,Belgium)提供的人經(jīng)處理的 / 脫細胞骨基質(zhì)(Dufrane D， Eur Cell Mater，第1卷52，2001)上。復合移植物經(jīng)皮下植入至裸大鼠O個植入物/受體且n= 10)(雄性，6-8周齡)的椎旁區(qū)中。60天后，將動物處死，將植入物移出用于免疫組織化學處理。然后將植入物在HCL中脫鈣，處理并在石蠟中包埋并切片(5μπι)。然后進行Masson’ s Trichrom和免疫組織化學以分析骨鈣蛋白和“綠熒光蛋白”(單克隆抗體)。實施例2 來源于脂肪間充質(zhì)干細胞的多維骨樣移棺物的能力材料和方法豬和人AMSC分離為了實驗的目的，如實施例1中公開的那樣進行豬和人AMSC分離。AMSC的血管牛成能力體外為了評估干細胞在含氧量正常和低氧條件下的體外促血管生成能力，豬骨髓-MSC 和脂肪-MSC在低氧室中在0. 1、3、5和21 % O2下放置24、48和72hr，并通過ELISA測試定量VEGF的釋放。用脫礦質(zhì)骨基質(zhì)優(yōu)化多維結(jié)構(gòu)通過對MP添加胎牛血清(FBS，10% ν/ν)、地塞米松(1 μ Μ)、抗壞血酸鈉(50 μ g/ ml)、磷酸二氫鈉以及青霉素100U/ml和鏈霉素100 μ g/ml誘導AMSC發(fā)生骨生成。細胞保持在成骨培養(yǎng)物中，培養(yǎng)基每兩天更換一次(Post等.Bone 2008，43，1 ;32_39⑷??！等h Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 2007 ；43 ；95-100)。培養(yǎng)物用PBS漂洗并在70%乙醇中固定，通過用茜素紅染色磷酸鈣來確定成骨分化。另外，進行骨鈣蛋白的免疫組織化學和von Kossa染色以證實“骨”表型。多維結(jié)構(gòu)與AMSC在存在由大學組織庫(Universityclinical hospital St-Luc, Brussels,Belgium)獲得的“脫礦質(zhì)骨基質(zhì)(DBM) ”的情況下進行共孵育。脫礦質(zhì)骨基質(zhì)的制備公開在實施例1)脫礦質(zhì)骨的來源中。DBM的功效通過以下評估(i)在脫礦質(zhì)過程后測量的殘留鈣濃度(> 97% [鈣] 減少)和(ii)在植入后1月時的體內(nèi)(在裸大鼠中)成骨能力。在成骨細胞培養(yǎng)基中孵育AMSC(第4代傳代培養(yǎng)物)平均15-18天后，在特定的分化培養(yǎng)基中加入不同濃度 (0/1/5/10和20mg/ml)的DBM。在不去除DBM的條件下每兩天更換一次培養(yǎng)基。評估3D結(jié)構(gòu)、蜂窩狀結(jié)構(gòu)、骨鈣蛋白表達和Von Kossa染色(用于鈣沉積)的程度來選擇用于3D骨樣結(jié)構(gòu)的適宜DBM濃度。H有脫,礦質(zhì)骨基質(zhì)禾Π AMSC的多維結(jié)構(gòu)的棺入t藥作禾Π_ 方。收集從具有最適DBM濃度(用于多維結(jié)構(gòu))的成骨培養(yǎng)物(第4代)中獲得的 AMSC用于植入。-裸大鼠(Charles River Laboratories International, Inc. , Wilmington,Massachusetts, USA)用作受體。細胞植入至椎旁肌中。在脊柱上作縱向正中切口，切開皮下組織以暴露筋膜。多維結(jié)構(gòu)(大學組織庫，Universit6Catholique de Louvain,Brussels, Belgium)直接植入至椎旁肌群中。通過在同一大鼠的對側(cè)椎旁肌中僅植入凍干的松質(zhì)骨作為對照。使用不可吸收的縫合線縫合筋膜以便于植入部位恢復。將動物處死并在移植后 30天時通過T61心內(nèi)注射(Intervet Int. GmbH-D,Germany)的方式在全麻下移出植入物。 然后收獲并處理植入物以用于組織學和計算機體層攝影。移植物在兩種不同的外科模型中測試。本發(fā)明分析⑴它們在股骨皮質(zhì)骨缺損中的橋接能力和(ii)它們在前腰椎體間融合(ALIF)中的融合能力。-(i)皮質(zhì)骨缺損模型在實驗性矯形外科中是為人所熟知的并且在我們實驗室中主要通過C. Delloye教授的工作獲得。豬用于類似的模型中，在所述模型中在長骨上建立節(jié)段性骨干骨缺損，然后填充移植材料或使其空置。在我們的實驗中，在豬的兩根股骨上進行操作。制造1.5-cm皮質(zhì)骨缺損并通過標準的4.5-mm鈦鎖定加壓鋼板進行穩(wěn)定。使一個股骨缺損空置，將AMSC移植物植入至對側(cè)腿中。-(ii)在豬實驗外科中ALIF模型已得到公認。我們的技術(shù)包含通過后外側(cè)入路的 4水平ALIF操作。借助于椎體間聚醚醚酮(PEEK)籠獲得融合。打開椎間盤并取出髓核，刮除軟骨以暴露軟骨下骨，然后插入PEEK籠。這些籠被設(shè)計為是空的但可以填充各種實驗材料。在此情況下，每個水平將接受不同的移植組織，從而建立4個不同的組一個籠空置作為陰性對照，一個籠填充以凍干的輻照松質(zhì)骨(如在臨床場所中經(jīng)常實施的那樣)，一個籠包含自體松質(zhì)骨移植物(在融合手術(shù)操作中被認為是金標準，因此作為我們的陽性對照)， 最后一個籠是AMSC移植物。將動物處死并在移植后7周時通過T61心內(nèi)注射(Intervet Int. GmbH-D,Germany)的方式在全麻下移出植入物。然后收獲并處理植入物以用于組織學和計算機體層攝影。膽裸大鼠移出的植入物在HCl中脫鈣，處理，包埋在石蠟中并切片(5μπι)。利用Hemalun 伊紅、Masson’s Green Trichrom、骨鈣蛋白和Von Kossa染色的標準顯色用于組織學染色。如通過Envision Rsystem單克隆抗體(Dako，Denmark)顯示，借助于單克隆抗體 (0C4-30, Abeam, Cambrige)獲得骨鈣蛋白染色。使用pQCT(外圍定量計算機體層攝影機 (Peripheral quantitative computed tomography machine),型號 XCT Research SA, Stratec, Pforzheim, Germany)分析收獲的植入物的顯微結(jié)構(gòu)。在每個植入物的多個載片上測量皮質(zhì)骨和總骨密度。通過在von Willebrandt染色(見上)后定量新形成的血管來進行體內(nèi)新生血管生成的定量。豬豬單獨地圈養(yǎng)，自由進食和飲水。遵循實驗動物管理的標準實驗方案提供術(shù)后護理和止痛。在自體移植物模型中，生物學隨訪將包含借助于血樣的炎癥評估。放射學隨訪使我們能夠通過在植入后1、5和7周時進行計算機體層攝影(CT)掃描來比較體內(nèi)骨形成。臨床CT掃描的高分辨率和多維平面重建如此精確使得發(fā)明人可以分析體內(nèi)PEEK籠的內(nèi)容物，由此能夠評價融合過程。同樣的操作用于股骨上，通過一次掃描采集所有信息。在安樂死后通過以顯微-CT處理移出的移植物來獲得甚至更好的分辨率。對移出的移植物進行組織學和免疫組織化學研究，從而與天然皮質(zhì)橋接和融合能力相比較，評估新骨形成和移植物血運重建(血管內(nèi)皮生長因子、CD51、von Willebrand因子)、硬化(骨鈣蛋白)和礦化(von Kossa)。脫鈣過程允許對移植的材料進行組織學和免疫組織化學研究。組織學、組織形態(tài)測量學和顯微射線照相術(shù)要求保持組織鈣化；因此不脫鈣的處理也是可以的。統(tǒng)計學組間差異的統(tǒng)計學顯著性通過使用Bonferroni事后檢驗的單因素方差分析來檢驗。統(tǒng)計檢驗采用Systat 8. 0版來進行。ρ < 0. 05時認為差異是顯著的。MM肺敲舌DBM搬考慮到回避AMSC細胞移植的生物學支持問題，結(jié)合DBM開發(fā)了多維結(jié)構(gòu)。具有在體內(nèi)促進裸大鼠(質(zhì)量控制要求先前接觸AMSC使用)中的成骨分化的能力的脫礦質(zhì)骨基質(zhì)(平均粒徑為700 μ m)對于與AMSC共孵育以實現(xiàn)體外細胞重塑是必需的。在兩種成骨分化培養(yǎng)基中，與不添加DBM的單獨AMSC相比，添加的DBM通過細胞收縮、膠原合成和DBM微粒的重組誘導三維結(jié)構(gòu)形成。考慮到優(yōu)化多維結(jié)構(gòu)的形成，測試遞增的DBM劑量。發(fā)現(xiàn)極端濃度(超過20mg/ml)不適用。lmg/ml不會形成最適3-D結(jié)構(gòu)以用于進行外科應用的移植物處理。相反，發(fā)現(xiàn)5和10mg/ml形成最適的組織收縮以用于移出移植物和外科應用。在顯微鏡下，使用最后面的這些DBM濃度顯示了骨鈣蛋白表達和礦化過程(Von Kossa染色)。與DBM共孵育平均20 士 3天對于在成骨條件下獲得具有AMSC 的三維結(jié)構(gòu)是必需的。具有最適DBM濃度的多維結(jié)構(gòu)的概念驗證體內(nèi)骨生成裸大鼠在裸大鼠中植入后30天后，不添加DBM的單獨AMSC不會誘導新的骨樣結(jié)構(gòu)形成。 僅有通過Von Kossa染色的小骨結(jié)節(jié)(骨鈣蛋白+)零星地分布在裸大鼠肌群中。相反，在植入部位的良好定位下容易進行多維結(jié)構(gòu)的植入。在植入后30天后，發(fā)現(xiàn)緊密的/堅固的骨樣結(jié)構(gòu)進入了肌肉中，在顯微鏡下為DBM微粒內(nèi)的致密結(jié)締組織。發(fā)現(xiàn)具有骨鈣蛋白染色的結(jié)締組織和礦化過程的骨樣結(jié)構(gòu)。豬受體在植入后5周后，通過CT-掃描顯示在豬中沒有發(fā)現(xiàn)股骨缺損的自發(fā)性硬化(未治療)。在不使用任何支架的條件下，容易將該多維結(jié)構(gòu)插入至骨缺損中。該后一個移植物采用橋接原始皮質(zhì)骨缺損的骨樣結(jié)構(gòu)顯著地改善了植入后早期(移植后5周)時的骨硬化。具有最適DBM濃度的多維結(jié)構(gòu)的概念驗證體內(nèi)血管生成為了評估干細胞在含氧量正常和低氧條件下的體外促血管生成能力，臨床前的豬骨髓-MSC和脂肪MSC在低氧室中在0. 1、3、5和21 % &下放置對、48和72hr，并通過ELISA 定量VEGF的釋放。在低氧條件下BM-MSC釋放的VEGF比在含氧量正常的條件下多，并且在所述時間內(nèi)維持此分泌，在48和72hr時的VEGF水平高于Mhr時(ρ < 0. 05)。相反，在不同的培養(yǎng)條件下從AMSC的VEGF釋放相似，但由AMSC釋放的VEGF水平顯著高于BM-MSC (分別為:11274士679 相比于 2364士94pg/ml ；ρ < 0. 05)(圖 6)。
這些結(jié)果在移植BM-MSC和AMSC后在體內(nèi)得到證實。發(fā)現(xiàn)與BM-MSC相比，在成骨 AMSC移植的情況下血管生成顯著較多(ρ < 0. 05)。
權(quán)利要求
1.一種生物材料，其具有多維結(jié)構(gòu)并且包含分化的MSC組織和脫礦質(zhì)骨基質(zhì)，其中所述脫礦質(zhì)骨基質(zhì)分散在所述分化的MSC組織內(nèi)，并且其中所述MSC是脂肪組織來源的干細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物材料，其中用來制備所述分化的MSC組織的MSC是人或動物來源的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生物材料，其中所述MSC是傳代晚期的脂肪組織來源的干細胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一權(quán)利要求所述的生物材料，其是三維的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述的生物材料，其特征在于其包含涂覆以礦物涂層的骨細胞，和包含膠原的中間結(jié)締組織。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述的生物材料，其特征在于其包含軟骨細胞和包含膠原和蛋白聚糖的細胞外基質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一權(quán)利要求所述的生物材料，其中所述脫礦質(zhì)骨基質(zhì)為平均粒徑為50-2500 μ m的粒子形式。
8.—種植入物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一權(quán)利要求所述的生物材料。
9.一種制備根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一權(quán)利要求所述的多維生物材料的方法，所述方法包含在15-25天期間在成骨細胞培養(yǎng)基和/或軟骨形成培養(yǎng)基中孵育MSC，然后在所述培養(yǎng)基中加入脫礦質(zhì)骨基質(zhì)并維持孵育另外15-30天的時間。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述成骨細胞培養(yǎng)基是添加了人血清、地塞米松 (dexamethasone)、抗壞血酸鈉、磷酸二氫鈉、青霉素和鏈霉素的標準培養(yǎng)基。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述軟骨形成培養(yǎng)基是添加了人血清、地塞米松、TGF-B3、L-脯氨酸、抗壞血酸鈉、磷酸二氫鈉、丙酮酸鈉、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒、青霉素和鏈霉素的標準培養(yǎng)基。
12.根據(jù)權(quán)利要求9-11中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述脫礦質(zhì)骨基質(zhì)以5至 10mg/ml的量加入所述培養(yǎng)基中。
13.—種多維生物材料，其能夠通過根據(jù)權(quán)利要求8-12中任一權(quán)利要求所述的方法獲得。
14.一種醫(yī)療設(shè)備，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-7和13中任一權(quán)利要求所述的生物材料。
15.一種試劑盒，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-7和13中任一權(quán)利要求所述的生物材料和合適的固定裝置。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-7和13中任一權(quán)利要求所述的生物材料，其在用于減輕或治療骨缺損或軟骨缺損的方法中使用。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-7和13中任一權(quán)利要求所述的生物材料，其在用于支持或糾正關(guān)節(jié)、顱-面-上頌骨的先天性或獲得性異常，正畸程序，手術(shù)、創(chuàng)傷或其它先天性或獲得性異常后的骨或軟骨置換，或用于支持其它肌肉骨骼植入物、尤其是人工和合成植入物的方法中使用。
全文摘要
具有多維結(jié)構(gòu)并且包含分化的MSC組織和脫礦質(zhì)骨基質(zhì)的生物材料，其中所述脫礦質(zhì)骨基質(zhì)分散在所述分化的MSC組織內(nèi)，所述生物材料的制備方法及其用途。
文檔編號A61L27/38GK102458495SQ201080032356
公開日2012年5月16日 申請日期2010年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月4日
發(fā)明者C·德魯葉, 丹尼斯·杜夫拉內(nèi) 申請人:盧萬天主教大學, 圣-呂克診所大學