專利名稱：Casb7439構(gòu)建體的制作方法
CASB7439構(gòu)建體背景
哺乳動物無剛毛鱗甲同系物(Achaete-Scute homolog)是果蠅無剛毛鱗甲復合物的保守哺乳動物同源物。它們是堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH或HLH)基因家族的成員，其充當對于發(fā)育必需的譜系特異性轉(zhuǎn)錄因子。該家族的一個鼠成員MASH2是胎盤發(fā)育必需的，但對于胚體發(fā)育并不重要。HASH2,MASH2基因的人直向同源物，在1997年由Alders等人進行克隆(由該作者指名為〃ASCL2〃)。Alders 等人(1997)戰(zhàn)皿 Molec. Genet. 6:859-867。如W001/62778中所述，表達研究揭示與相鄰正常結(jié)腸和其他測試的正常組織比較，HASH2轉(zhuǎn)錄物(其中稱為CASB7439)在結(jié)腸直腸腫瘤中是超表達的。這種基因在具有I 至IV期腺癌的患者中是超表達的。因此，該蛋白質(zhì)可以視為在用于改善受試者的癌癥的免疫治療方法中有用的癌抗原，例如通過使用重組CASB7439作為抗原特異性癌免疫治療劑 (ASCI)0發(fā)明概述
用于增加CASB7439多肽的重組產(chǎn)生的化合物和方法在本文中提供。在某些實施方案中，提供了修飾的CASB7439多肽，以及包含此類修飾的CASB7439多肽的蛋白質(zhì)構(gòu)建體。所述修飾的CASB7439多肽包含用于CASB7439增強產(chǎn)生的至少一個修飾。申請人還公開了包含編碼修飾的CASB7439多肽的多核苷酸序列的核酸分子和包含如本文描述的此類修飾的 CASB7439多肽的蛋白質(zhì)構(gòu)建體。在特定方面，申請人如下公開了具有氨基酸(aa)序列的蛋白質(zhì)構(gòu)建體和編碼其的核苷酸序列(DNA)
LVL055 [SEQ ID N0:1 (aa) ；SEQ ID NO:2 (DNA)]；
LVLlll [SEQ ID NO:3 (aa) ；SEQ ID NO:4 (DNA)]；
LVL137 [SEQ ID NO:5 (aa) ；SEQ ID NO:6 (DNA)]；
LVL141 [SEQ ID NO:7 (aa) ；SEQ ID NO:8 (DNA)]；
LVL144 [SEQ ID NO:9 (aa) ；SEQ ID NO:10 (DNA)]；和
LVL168 [SEQ ID NO:11 (aa) ；SEQ ID N0:12 (DNA)]。還公開了利用本文描述的核酸分子用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)構(gòu)建體的方法和過程。申請人:還公開了免疫原性組合物，這些組合物包含本文描述的一種或多種修飾的 CASB7439多肽或構(gòu)建體、和藥學可接受的載體或賦形劑，其中載體或賦形劑可以任選包含緩沖劑。在某些實施方案中，公開了本文描述的修飾的CASB7439多肽或蛋白質(zhì)構(gòu)建體一或編碼其的核酸分子一在制備用于治療結(jié)腸直腸癌的藥物中的應用。在某些實施方案中， 公開了如本文公開的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其用于治療、特別是結(jié)腸直腸癌治療。在某些實施方案中，公開了用于引發(fā)針對具有結(jié)腸直腸癌的受試者中的CASB7439的免疫應答的方法，該方法包括(a)選擇具有結(jié)腸直腸癌的受試者；和(b)給受試者施用有效量的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含如本文描述的修飾的CASB7439多肽或構(gòu)建體、和藥學可接受的載體或賦形劑，其中載體或賦形劑可以任選包含緩沖劑。附圖簡述

圖1/35。該圖呈現(xiàn)了描述CASB7439多肽的各個區(qū)域的示意圖，具體地DNA特異性 (DNA結(jié)合)結(jié)構(gòu)域、bHLH結(jié)構(gòu)域和富含脯氨酸的區(qū)域。關于細節(jié)參見實施例2。圖示還顯示了下述區(qū)域核靶向(灰色箭頭)；α螺旋(灰色圓柱體)；卷曲螺旋(黑色圓柱體)；固有無序(黑色箭頭)；和低復合性(灰色框)。圖2/35。該圖呈現(xiàn)了描述與完全CASB7439多肽比對的CASB7439多肽的多個截短 (黑色箭頭)的示意圖。關于細節(jié)參見實施例4。圖3/35。該圖呈現(xiàn)了 CASB7439的示意圖，顯示富含脯氨酸的區(qū)域的近似定位，以及鑒定和預測的表位。各種實施方案包含通過去除富含脯氨酸的區(qū)域內(nèi)的某些或所有氨基酸修飾的CASB7439多肽。此類修飾的CASB7439多肽保留在CASB7439多肽內(nèi)的高部分表位。圖4/35。顯示了在未修飾的CASB7439多肽(SEQ ID NO: 13)序列和起因于對于 CASB7439多肽的下列2個可能修飾的多肽序列之間的比對在第一個可能修飾中21個鄰接氨基酸殘基(133-153，包括133和153)被缺失；在第二個可能修飾中21個鄰接氨基酸殘基(131-151，包括131和151)被缺失。進一步地，可以設想對于CASB7439多肽的第三個修飾，其中21個鄰接氨基酸殘基(132-152，包括132和152)被缺失。如該圖中所示，在缺失區(qū)域中所得到的修飾的CASB7439多肽序列(插入，有圓圈的)對于所有3個修飾是相同的。 這是因為在SEQ ID NO: 13的位置131-132和152-153上重復的RG氨基酸殘基。圖5/35。該圖呈現(xiàn)了在實施例6的蛋白質(zhì)構(gòu)建體之間的氨基酸序列比對。 CASB7439 = HASH2 氨基酸序列(SEQ ID NO: 13);LVL088 (SEQ ID N0:27);LVL111 (SEQ ID NO:3) ；LVL137 (SEQ ID NO:5) ；LVL138 (SEQ ID NO:33) ；LVL168 (SEQ ID N0:11)。圖6/；35。該圖呈現(xiàn)了在HASH2 (CASB7439)氨基酸序列(SEQ ID N0:13)和下述蛋白質(zhì)構(gòu)建體之間的比對LVL168 (SEQ ID N0:ll);pDl/3 (SEQ ID NO:39)；和 LVL144 (SEQ ID N0:9)。圖7/35。在正常(12個)和結(jié)腸直腸癌(83個)組織中CASB7439 mRNA表達的實時qPCR分析。參見實施例9。圖8/35。在各種人結(jié)腸直腸(CRC)樣品中CASB7439 mRNA和蛋白質(zhì)表達之間的對應。 (黑色圓圈)代表在結(jié)腸癌樣品中的CASB7439 mRNA表達，而〇(空心圓圈)代表在正常相鄰組織中的CASB7439 mRNA表達。通過免疫熒光檢測的CASB7439蛋白質(zhì)的相應水平在每種樣品上方指出(-無表達，+/"極低表達，+低表達，++強表達和+++極強表達)。 CRC 原發(fā)性腫瘤，METS 轉(zhuǎn)移性，NAT 正常相鄰組織。除其為粘液癌的樣品2M40和M762 夕卜，所有樣品是結(jié)腸腺癌。參見實施例9。圖9/35:在這個表中闡述了在用各種CASB7439構(gòu)建體免疫接種后用于脾細胞再刺激的覆蓋整個CASB7439蛋白質(zhì)序列的肽庫。參見實施例10。圖10/35。顯示了用于T細胞免疫原性研究的CASB7439肽矩陣。參見實施例10。圖11/35。在用CASB7439重疊肽(庫，矩陣法)再刺激后，在用LVLlll + AS01B 免疫接種的近交小鼠的4個品系(C57BL6、BALBC、CB6F1和C3H)中表示為雙重陽性百分比 (IFNY/TNFa)⑶4 T細胞的⑶4應答。參見實施例10，近交小鼠多品系比較實驗。圖12/35。在用CASB7439重疊肽(庫，矩陣法)再刺激后，在用LVLlll + AS15免疫接種的近交小鼠的4個品系中表示為雙重陽性百分比(IFNY/TNFa )⑶4 T細胞的⑶4應答。參見實施例10，近交小鼠多品系比較實驗。圖13/35。在先前段落中討論的4種近交小鼠品系中⑶4免疫原性CASB7439肽的鑒定。淡灰色=0.2-0.4 %雙重陽性(IFN γ/TNFa )⑶4 T細胞；深灰色彡0. 5%雙重陽性(IFNY/TNFa )⑶4 T細胞。參見實施例10，近交小鼠多品系比較實驗。圖14/35。在遠交CDl小鼠(AS01B上圖；AS15下圖)中CD4免疫原性CASB7439肽的鑒定。淡灰色=0.2-0.4 %雙重陽性(IFN γ/TNFa )⑶4 T細胞；深灰色彡0. 5%雙重陽性(IFNy/TNFa ) T-⑶4細胞。參見實施例10，CASB7439在小鼠中的免疫原性在遠交小鼠中的CASB7439 T細胞免疫原性。圖15/35。在用CASB7439重疊肽(免疫顯性肽的庫)再刺激后，在用由AS15配制的 LVL111、LVL168或LVL144免疫接種的個別CDl遠交小鼠中表示為雙重陽性(IFN γ/TNF a ) 百分比的⑶4和⑶8 T細胞應答。參見實施例10，在遠交小鼠中的LVL111、LVL168和LVL144研究。圖16/35。在用CASB7439重疊肽(7種肽/庫的7個庫+肽M (SEQ ID NO:76)) 再刺激后，從用由AS15配制的LVL168 (SEQ ID NO: 11)或LVL144 (SEQ ID N0:9)免疫接種的HLA A2. 1/DR-1轉(zhuǎn)基因小鼠中分離的合并外周血淋巴細胞(PBL)中的⑶4 T細胞應答 (表示為雙重陽性百分比(IFN γ/TNF a ))。圖17/35。在用CASB7439重疊肽(7種肽的7個庫+肽24 (SEQ ID NO:76))再刺激后，從用由AS15配制的LVL168 (SEQ ID NO: 11)或LVL144 (SEQ ID N0:9)免疫接種的 HLA A2. 1/DR-1轉(zhuǎn)基因小鼠中分離的合并PBL中的⑶8 T細胞應答(表示為雙重陽性百分比 (IFN y/TNF a ))。圖18/35。在用CASB7439重疊肽(7種肽的7個庫+肽24 (SEQ ID NO:76))再刺激后，從用由AS15配制的LVL168 (SEQ ID NO: 11)或LVL144 (SEQ ID N0:9)免疫接種的 HLA A2. 1/DR-1轉(zhuǎn)基因小鼠中分離的脾細胞中的CD4 T細胞應答(表示為雙重陽性百分比 (IFN y/TNF a ))。圖19/35。在用CASB7439重疊肽(7種肽的7個庫+肽24 (SEQ ID NO:76))再刺激后，從用由AS15配制的LVL168 (SEQ ID NO: 11)或LVL144 (SEQ ID N0:9)免疫接種的 HLA A2. 1/DR-1轉(zhuǎn)基因小鼠中分離的脾細胞中的CD8 T細胞應答(表示為雙重陽性百分比 (IFN y/TNF a ))。圖20/35。在 LVLlll + ASOlB 或 LVLlll + AS15 免疫接種后觸發(fā)的，在 CB6f 1 近交小鼠中的CASB7439特異性抗體應答(IgGl和IgGh)的時間-過程分析。參見實施例10， 在小鼠中CASB7439的免疫原性CASB7439介導的體液應答。圖21/35。在用由AS15佐劑配制的LVL111、LVL168或LVL144或用單獨的AS15佐劑免疫接種后，在近交CB6fl小鼠中的CASB7439特異性體液應答(IgGl和IgG^i)。參見實施例10，在小鼠中CASB7439的免疫原性CASB7439介導的體液應答。圖22/35。在用由AS15佐劑配制的LVL111、LVL168或LVL144或用單獨的AS15佐劑免疫接種的CDl遠交小鼠中的CASB7439特異性體液免疫應答(IgG滴度);首次用于實驗的小鼠用作對照。參見實施例10，CDl小鼠研究。圖23/35。在用由ASOlB (上)或AS15 (下)配制的LVLlll免疫接種的CB6fl小鼠中的TC1/CASB7439 #14腫瘤移植物。參見實施例11，研究#1. 1。在上圖中，從上到下在曲線圖上的曲線次序是‘緩沖液，、LVLlll (10μδ),LVLlll (IOPg)+ AS01B、和 LVLlll ( μδ) + ASOlB0在下圖中，在下部的曲線是LVLlll (IOPg)+ AS15。圖對/35。來自實施例11，研究#1.2的存活曲線呈現(xiàn)于上、中和下圖中。TF 無腫瘤。(上)用鹽水緩沖液、不含佐劑的LVLlll或單獨的佐劑(AS01或AS15)免疫接種且用 TC1/CASB7439 #14細胞攻擊的CB6fl小鼠的存活曲線。來自用LVLlll免疫接種的組的最后一個存活小鼠首先死亡，隨后為來自ASOlB組的最后一只存活小鼠，隨后為來自AS15組的最后一只存活小鼠，和來自緩沖液組的最后一只存活小鼠。(中)用單獨的AS15或用由 AS15配制的所示劑量的LVLlll免疫接種且用TC1/CASB7439 #14細胞攻擊的CB6fl小鼠的存活曲線。來自AS15組的最后一個存活小鼠首先斷氣。在其他組中，組具有最少存活者，隨后為Wg組，隨后為IOPg組，其具有最多的存活者。(下)用單獨的ASOlB或用由 ASOlB配制的所示劑量的LVLlll免疫接種且用TC1/CASB7439 #14細胞攻擊的CB6fl小鼠的存活曲線。在該小圖中，來自IOPg和ASOlB的組的最后一個存活小鼠在同一天斷氣。Wg 和30μβ組在最后一天具有相同存活百分率。圖25/35。呈現(xiàn)了來自實施例11，研究#1.3的存活曲線。TF 無腫瘤。(上)關于用由AS15配制的LVL111、LVL144或LVL168或單獨的AS15免疫接種且用TC1/CASB7439#14 細胞攻擊的CB6fl小鼠的存活曲線。(下)關于用由AS15配制的LVL111、LVL144或LVL168 或單獨的AS15免疫接種且用MC38/CASB7439#35細胞攻擊的CB6fl小鼠的存活曲線。圖沈/35。呈現(xiàn)了來自實施例11，研究#1.4的存活曲線。TF 無腫瘤。(上)用由 AS15配制的LVL144或LVL168或單獨的AS15免疫接種且用TC1/CASB7439 #14細胞攻擊的 CB6fl小鼠的存活曲線。用LVL144免疫接種的組具有邊緣更大的存活百分比。(中)關于用由AS15配制的LVL144或LVL168或單獨的AS15免疫接種且用TC1/CASB7439 #14-2細胞攻擊的CB6fl小鼠的存活曲線。用LVL144接種的小鼠具有略微更高的存活百分比。(下) 關于用由AS15配制的LVL144或LVL168或單獨的AS15免疫接種且用MC38/CASB7439 #35 細胞攻擊的CB6fl小鼠的存活曲線。用LVL144接種的小鼠不具有存活者。圖27/35。呈現(xiàn)了來自實施例11，研究#2. 1的存活曲線。TF 無腫瘤。(上)用由 AS15配制的6. 25 Pg LVL168和10 Pg LVL144或單獨的AS15免疫接種且用TC1/CASB7439 #14-2細胞攻擊的CB6fl小鼠的存活曲線。用LVL168接種的小鼠具有略微更高的存活百分比。(中上)用由AS15配制的3. 1 μδ LVL168和5 μδ LVL144或單獨的AS15免疫接種且用TC1/CASB7439 #14-2細胞攻擊的CB6fl小鼠的存活曲線。用LVL144接種的小鼠具有略微更高的存活百分比。(中下)用由AS15配制的1.55 μδ LVL168和2. 5 μδ LVL144或單獨的AS15免疫接種且用TC1/CASB7439 #14-2細胞攻擊的CB6fl小鼠的存活曲線。用LVL144 接種的小鼠具有最高的存活百分比。(下)用由AS15配制的0.77 μg LVL168和1. 25 μg LVL144或單獨的AS15免疫接種且用TC1/CASB7439 #14-2細胞攻擊的CB6f 1小鼠的存活曲線。用LVL168接種的小鼠具有略微更高的存活百分比。圖觀/35。呈現(xiàn)了來自實施例11，研究#2. 2的存活曲線。TF 無腫瘤。(上)用由 AS15配制的6. 25 Pg LVL168或10 Pg LVL144或單獨的AS15免疫接種且用TC1/CASB7439 #14-2細胞攻擊的C57B1/6小鼠的存活曲線。(中上)用由AS15配制的3. 1 Pg LVL168或5 μδ LVL144或單獨的AS15免疫接種且用TC1/CASB7439 #14-2細胞攻擊的C57B1/6小鼠的存活曲線。(中下)用由AS15配制的1. 55 Pg LVL168或2. 5 Pg LVL144或單獨的AS15免疫接種且用TC1/CASB7439 #14-2細胞攻擊的C57B1/6小鼠的存活曲線。(下)用由AS15配制的 0. 77 μδ LVL168 或 1. 25 μδ LVL144 或單獨的 AS15 免疫接種且用 TC1/CASB7439 #14-2 細胞攻擊的C57B1/6小鼠的存活曲線。圖四/35。呈現(xiàn)了來自實施例11，研究#2. 3的存活曲線。TF 無腫瘤。(上)用由 AS15 配制的 6. 25 μδ LVL168 或 10 μδ LVL144 免疫接種且用 TC1/CASB7439 #14-2 細胞攻擊的CB6fl小鼠的存活曲線。接受LVL168的小鼠組具有最高存活百分比，隨后為接受 LVL144的組。在僅接受AS15的組中沒有存活者。(中)用由AS15配制的3. 1 μδ LVL168和 5 μδ LVL144免疫接種且用TC1/CASB7439 #14-2細胞攻擊的CB6fl小鼠的存活曲線。接受 LVL168的小鼠組具有最高存活百分比，隨后為接受LVL144的組。在僅接受AS15的組中沒有存活者。(下)用由AS15配制的1.55 μδ LVL168和2. 5 μδ LVL144免疫接種且用TCl/ CASB7439 #14-2細胞攻擊的CB6fl小鼠的存活曲線。接受LVL168的小鼠組具有最高存活百分比，隨后為接受LVL144的組。在僅接受AS15的組中沒有存活者。鹽水緩沖液或單獨的AS15用作對照。圖30/35。來自實施例11，研究#2. 3的存活曲線。TF 無腫瘤。(上)用由AS15配制的0. 77 μδ LVL168或1. 25 μδ LVL144免疫接種且用TC1/CASB7439 #14-2細胞攻擊的 CB6fl小鼠的存活曲線。接受LVL168的小鼠組具有最高存活百分比，隨后為接受LVL144 的組。在僅接受AS15的組中沒有存活者。(中)用由AS15配制的0. 19 μδ LVL168或0. 31 Pg LVL144免疫接種且用TC1/CASB7439 #14-2細胞攻擊的CB6fl小鼠的存活曲線。接受 LVL168的小鼠組具有最高存活百分比。來自接受LVL144的組的最后一個存活小鼠活得比來自AS15組和緩沖液組的最后一個存活者久。(下)用由AS15配制的0. 048 μδ LVL168或 0.078 μδ LVL144免疫接種且用TC1/CASB7439 #14-2細胞攻擊的CB6fl小鼠的存活曲線。 接受LVL168的小鼠組具有最高存活百分比。來自接受LVL144的組的最后一個存活小鼠活得比來自AS15組和緩沖液組的最后一個存活者久。鹽水緩沖液或單獨的AS15用作對照。圖31/35。在用由AS15配制的1 Pg LVL168免疫接種的雄性和雌性CB6fl小鼠中的TC1/CASB7439 #14-2腫瘤移植物；單獨的AS15用作對照(上)。在用由AS15配制的1 Pg LVL168免疫接種的C57B1/6小鼠中的TC1/CASB7439 #14-2腫瘤移植物；單獨的AS15用作對照(下)。圖32/35。上圖用由 AS15 配制的 1 Pg LVL168 免疫接種且用 TC1/CASB7439 #14-2 細胞攻擊的雄性和雌性CB6fl小鼠的存活曲線。單獨的AS15在雄性和雌性CB6fl小鼠中用作對照。在用LVL168加上AS15免疫接種的CB6fl小鼠中，存在7只無腫瘤(TF)雄性和3 只TF雌性。在接受單獨的AS15的小鼠中不存在TF。下圖用由AS15配制的1 Pg LVL168 免疫接種且用TC1/CASB7439 #14-2攻擊的C57B1/6小鼠的存活曲線。單獨的AS15在雄性和雌性C57B1/6小鼠中用作對照。在用LVL168加上AS15免疫接種的C57B1/6小鼠中，存在2只TF雄性和1只TF雌性。在接受單獨的AS15的小鼠中，存在5只TF雄性和1只TF 雌性。圖33/35。在用由AS15配制的1 Pg LVL168免疫接種或用單獨的AS15免疫接種的雄性(黑色圓圈)和雌性(灰色圓圈)CB6F1小鼠中的CASB7439特異性體液免疫應答(IgG 滴度)(左)。在用由AS15配制的1 Pg LVL168免疫接種或用單獨的AS15免疫接種的雄性 (黑色圓圈)和雌性(灰色圓圈)C57/BL6小鼠中的CASB7439特異性體液免疫應答(IgG滴度)(右)。圖34/35。在用覆蓋整個CASB7439蛋白質(zhì)序列的46種肽的肽庫(參見圖9)再刺激后，從用由AS15配制的1 Pg LVL168 (SEQ ID NO: 11)或單獨的AS15免疫接種的CB6F1 小鼠中分離的合并PBL中的⑶4 T細胞應答(表示為雙重陽性百分比(IFN γ/TNF α ))(上)。 在用CASB7439合并肽，覆蓋整個CASB7439蛋白質(zhì)序列的46種肽的肽庫(參見圖9)(下左)； CASB7439肽39 (SEQ ID Ν0:91)(中下)；或RPMI (下右)再刺激后，從用由AS15配制的1 ^g LVL168 (SEQ ID NO: 11)或單獨的AS15免疫接種的C57/BL6小鼠中分離的合并PBLs中的⑶4 T細胞應答(表示為雙重陽性百分比(IFN γ/TNFa ))(下)。圖35/35。在用覆蓋整個CASB7439蛋白質(zhì)序列的46種肽的肽庫(參見圖9)再刺激后，從用由AS15配制的1 Pg LVL168 (SEQ ID NO: 11)或單獨的AS15免疫接種的CB6F1 小鼠中分離的合并PBL中的⑶8 T細胞應答(表示為雙重陽性百分比(IFN γ/TNF a ))(上)。 在用覆蓋整個CASB7439蛋白質(zhì)序列的46種肽的肽庫(參見圖9)(下左)；CASB7439肽39 (SEQ ID N0:91)(中下);或RPMI (下右)再刺激后，從用由AS15配制的1 Pg LVL168 (SEQ ID NO: 11)或單獨的AS15免疫接種的C57/BL6小鼠中分離的合并PBLs中的CD8 T細胞應答(表示為雙重陽性百分比(IFN γ/TNF a ))(下)。發(fā)明詳述
關于商業(yè)可接受的免疫治療劑的一個障礙是商業(yè)可接受量的重組癌抗原的產(chǎn)生。一般而言且非限制性的，關于重組多肽的商業(yè)可接受的生產(chǎn)水平是通過宿主細胞產(chǎn)生的總蛋白質(zhì)的大約5%，如在考馬斯藍染色的SDS-PAGE凝膠上估計的。存在當通過重組方法產(chǎn)生時天然多肽序列為何可僅獲得小量的眾多原因。增加多肽產(chǎn)生的方法包括改變宿主表達系統(tǒng)或密碼子最佳化。然而，這些標準方法并不一定導致可接受的多肽產(chǎn)生，并且關于某些多肽的生產(chǎn)仍是商業(yè)上禁止的。如下文更詳細地描述的， 申請人:研究修飾的CASB7439多肽是否將通過重組方法產(chǎn)生可接受的蛋白質(zhì)水平。在某些實施方案中，提供了修飾的CASB7439多肽，其中修飾由CASB7439多肽的 C末端截短組成，或包含CASB7439多肽的C末端截短，從而使得所有或部分富含脯氨酸的區(qū)域被去除。在某些實施方案中，CASB7439多肽修飾由所有或部分富含脯氨酸的區(qū)域的缺失組成，或包含所有或部分富含脯氨酸的區(qū)域的缺失。在某些實施方案中，提供了修飾的 CASB7439多肽，其保留SEQ ID NO: 13的至少氨基酸殘基193，但其中所有或部分富含脯氨酸的區(qū)域被缺失。在其他實施方案中，提供了包含如本文描述的修飾的CASB7439多肽的蛋白質(zhì)構(gòu)建體。在某些實施方案中，此類蛋白質(zhì)構(gòu)建體進一步包含一種或多種異源多肽。在某些實施方案中，異源多肽是融合配偶體，如其他地方更詳細地描述的。在特別合適的實施方案中， 此類蛋白質(zhì)構(gòu)建體包含定位于修飾的CASB7439多肽N末端的異源多肽。在進一步特別合適的實施方案中，提供了這樣的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其中異源多肽是定位于修飾的CASB7439多肽N末端的流感嗜血桿菌0 influenzae)蛋白質(zhì)D的片段(如下文更詳細地描述的)。在某些實施方案中，提供了其中異源多肽包含多組氨酸區(qū)域的蛋白質(zhì)構(gòu)建體。在進一步的實施方案中，多組氨酸序列定位于蛋白質(zhì)構(gòu)建體的C末端部分。在其他實施方案中，多組氨酸序列定位于蛋白質(zhì)構(gòu)建體的C末端。在進一步的實施方案中，多組氨酸序列定位于蛋白質(zhì)構(gòu)建體的N末端部分。在其他實施方案中，多組氨酸序列定位于蛋白質(zhì)構(gòu)建體的N末端。在合適的實施方案中，多組氨酸區(qū)域包含10個或更多連續(xù)組氨酸殘基。在特別合適的實施方案中，多組氨酸區(qū)域包含定位于修飾的CASB7439多肽N末端的10個或更多連續(xù)組氨酸殘基。在某些實施方案中，超過一個多組氨酸區(qū)域可以包括在本文描述的一個或多個位置上。在某些實施方案中，提供了其中異源多肽是與修飾的CASB7439多肽化學綴合的載體蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)構(gòu)建體。在某些實施方案中，提供了包含為多組氨酸區(qū)域的異源多肽和為載體蛋白質(zhì)的異源多肽的蛋白質(zhì)構(gòu)建體。在某些實施方案中，提供了包含為多組氨酸區(qū)域的異源多肽和為融合配偶體的異源多肽的蛋白質(zhì)構(gòu)建體。在某些實施方案中，提供了包含為多組氨酸區(qū)域的異源多肽、為融合配偶體的異源多肽和為載體蛋白質(zhì)的異源多肽的蛋白質(zhì)構(gòu)建體。申請人:還公開了本文段落中描述的每種構(gòu)建體的實施方案，其中任何異源多肽例如多組氨酸區(qū)域中的一些或所有已被去除。用于去除異源多肽的組合物和方法是本領域已知的，包括但不限于用內(nèi)或外肽酶消化、化學修飾或在異源多肽和分子其余部分之間的鍵的斷裂等。申請人:在本文中還公開了免疫原性組合物，這些組合物包含任何修飾的CASB7439 多肽或包含如本文描述的修飾的CASB7439多肽的蛋白質(zhì)構(gòu)建體、和藥學可接受的載體或賦形劑，其中載體或賦形劑可以任選包含緩沖劑。在特定方面，這些組合物進一步包含佐齊U。在特定方面，這些組合物包含引發(fā)至少THl免疫應答的佐劑。在特定方面，本文描述的佐劑包含下述中的至少一種3D-MPL、QS21和CpG。在某些實施方案中，組合物包含3D-MPL。 在其他實施方案中，組合物包含CpG。在某些實施方案中，組合物包含QS21。在某些實施方案中，組合物包含QS21和膽固醇。在某些實施方案中，組合物包含在脂質(zhì)體制劑中的膽固醇、3D-MPL 和 QS21。申請人:在本文中還公開了包含編碼如本文描述的修飾的CASB7439多肽和構(gòu)建體的多核苷酸序列的核酸分子。在某些實施方案中，公開了包含如本文描述的此類核酸分子的載體。在某些實施方案中，載體包含原核表達載體。在某些實施方案中，載體包含真核表達載體。在某些實施方案中，編碼構(gòu)建體的多核苷酸序列已就在宿主細胞中的表達進行密碼子最佳化。申請人:還公開了包含下述的宿主細胞(i)如本文描述的核酸分子，或(ii)包含如本文描述的核酸分子的載體。在某些實施方案中，宿主細胞選自細菌細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。某些實施方案提供了包含下述的免疫原性組合物(i)本文描述的核酸分子，或 (ii)包含如本文描述的核酸分子的載體，以及藥學可接受的載體或賦形劑。在某些實施方案中，提供了本文描述的修飾的CASB7439多肽或蛋白質(zhì)構(gòu)建體(或編碼其的核酸分子)在制備用于治療結(jié)腸直腸癌的藥物中的應用。在某些實施方案中，公開了用于治療、特別是結(jié)腸直腸癌治療的本文描述的修飾的CASB7439多肽或蛋白質(zhì)構(gòu)建體(或編碼其的核酸分子)。在某些實施方案中，提供了用于在具有結(jié)腸直腸癌的受試者中引發(fā)針對CASB7439的免疫應答的方法，該方法包括(i)選擇具有結(jié)腸直腸癌的受試者；和 (b)給受試者施用有效量的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含如本文描述的修飾的CASB7439多肽或蛋白質(zhì)構(gòu)建體、和藥學可接受的載體或賦形劑，其中載體或賦形劑可以任選包含緩沖劑。在本文公開的方法的某些實施方案中，免疫原性組合物進一步包含佐劑。 在本文公開的方法的某些實施方案中，佐劑引發(fā)至少THl免疫應答。在本文公開的方法的某些實施方案中，佐劑包含下述中的至少一種3D-MPL、QS21和CpG。在本文公開的方法的某些實施方案中，受試者是人受試者。蛋白質(zhì)構(gòu)建體 CASB7439 多肽
如其已在本文中命名的，CASB7439也稱為HASH2或ASCL2。HASH2是人起源的193氨基酸殘基多肽(SEQ ID NO: 13)。參見例如，登記號AAB86993。此處，對CASB7439特征的提及將就SEQ ID NO: 13中提供的多肽序列而言進行。富含脯氨酸的區(qū)域
高脯氨酸周期性的區(qū)域在SEQ ID NO: 13中在氨基酸127-158的區(qū)域中發(fā)現(xiàn)。申請人將包括133和153在內(nèi)的從氨基酸133到氨基酸153的SEQ ID NO: 13區(qū)域命名為“富含脯氨酸的”、“多脯氨酸”、“多脯氨酸樣的”或“polypro”區(qū)域或結(jié)構(gòu)域。相應地，如本文使用的， “富含脯氨酸的”、“多脯氨酸”、“多脯氨酸樣的”和“polypro”指CASB7439蛋白質(zhì)的這個區(qū)域(或結(jié)構(gòu)域)。修飾
本公開內(nèi)容提供了包含CASB7439多肽的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，所述CASB7439多肽包含至少一個表達增強修飾。在某些實施方案中，CASB7439多肽的部分被去除，所述部分包含所有或部分富含脯氨酸的區(qū)域。在某些實施方案中，CASB7439多肽的整個C末端部分被去除，導致包含SEQ ID N0:13的氨基酸殘基1_117的截短的CASB7439多肽。在某些實施方案中， 異源多肽置于CASB7439多肽的N末端。如本文使用的，在修飾的CASB7439多肽背景中的“表達增強”或“增強的表達”指， 與包含SEQ ID N0:13的未修飾的CASB7439多肽的其他方面等價的蛋白質(zhì)構(gòu)建體的表達比較，即相同載體、宿主細胞等，預期增加包含所述修飾的CASB7439多肽的蛋白質(zhì)構(gòu)建體的表達水平的修飾。用于測定蛋白質(zhì)數(shù)量的本領域已知的任何方法可應用于測定，與包含未修飾的CASB7439多肽的其他方面等價的蛋白質(zhì)構(gòu)建體比較，包含修飾的CASB7439多肽的給定構(gòu)建體是否具有增加的表達水平。在某些實施方案中，使用SDS-PAGE和考馬斯藍染色可以評價生產(chǎn)。富含脯氨酸的區(qū)域的去除
在某些實施方案中，CASB7439多肽的修飾包含某些富含脯氨酸的區(qū)域的缺失。在某些實施方案中，CASB7439多肽的修飾包含所有富含脯氨酸的區(qū)域的缺失。在某些實施方案中， 除富含脯氨酸的區(qū)域的缺失外，CASB7439多肽的修飾還包含在富含脯氨酸的區(qū)域外的氨基酸的缺失。在某些實施方案中，修飾通過SEQ ID N0:13的C末端部分的截短來完成。因此， 在某些實施方案中，生成了蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其中修飾的CASB7439多肽的C末端氨基酸殘基對應于定位于SEQ ID N0:13的富含脯氨酸的區(qū)域N末端的殘基。在某些實施方案中，生成了蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其中修飾的CASB7439多肽的C末端氨基酸殘基對應于定位于SEQ ID N0:13的富含脯氨酸的區(qū)域中的殘基。在某些實施方案中，修飾的CASB7439多肽的C末端氨基酸殘基對應于 SEQ ID N0:13 的氨基酸殘基 117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、 145、146、147、148、149、150、151 或 152。在某些實施方案中，修飾包含部分或所有富含脯氨酸的區(qū)域的缺失。在某些實施方案中，修飾的CASB7439多肽序列對應于21個或更多鄰接氨基酸殘基已從其中缺失的 SEQ ID NO: 13。這21個或更多鄰接殘基對應于從包括端點在內(nèi)的殘基117、118、119、120、 121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、 140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151 或 152 中的任何一個開始的 SEQ ID NO: 13的鄰接氨基酸序列。在進一步的實施方案中，修飾的CASB7439多肽序列對應于21個鄰接氨基酸殘基已從其中缺失的SEQ ID NO: 13，所述21個鄰接殘基從殘基131、132和133 中的任何一個開始。在某些實施方案中，修飾的CASB7439多肽序列對應于殘基133、134、135、136、 137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153 中的一個或多個已從其中缺失的SEQ ID N0:13。在某些實施方案中，修飾的CASB7439多肽序列對應于從其中2個或更多鄰接氨基酸殘基已在包括133和153在內(nèi)的氨基酸殘基133-153的區(qū)域中缺失的SEQ ID NO: 13。在某些實施方案中，修飾的CASB7439多肽序列對應于SEQ ID NO: 13的包括133 和153在內(nèi)的殘基133到153已從其中缺失的SEQ ID N0:13。示例性非限制性實施方案包括下述
LVL055, SEQ ID N0:1 (aa)；
LVL111, SEQ ID NO:3 (aa)；
LVL137, SEQ ID NO:5 (aa)；
LVL141, SEQ ID NO:7 (aa)；
LVL144, SEQ ID NO:9 (aa)；禾口
LVL168, SEQ ID NO:11 (aa)。異源序歹Ij
在某些實施方案中，修飾的CASB7439多肽與異源多肽組合。術(shù)語“異源的”就核酸分子、多肽或另一種細胞組分而言，指示組分在它通常不在自然界中發(fā)現(xiàn)處出現(xiàn)和/或它源于與參考分子不同的來源或物種。如本文使用的，“異源”分子包括但不限于融合蛋白、載體蛋白質(zhì)和純化標簽。在某些實施方案中，異源多肽可以與修飾的CASB7439多肽，即載體蛋白質(zhì)化學綴合。在其他實施方案中，異源多肽和修飾的CASB7439多肽可以作為單一重組融合蛋白表達。在其他實施方案中，修飾的CASB7439多肽和異源多肽作為單一重組融合蛋白表達且與另一種異源多肽化學綴合。異源多肽可以幫助提供T輔助表位，包括由人識別的T輔助表位。在包含CASB7439 多肽和為融合蛋白的異源多肽的蛋白質(zhì)構(gòu)建體的情況下，異源多肽(融合配偶體)可以幫助提供此類表位，或幫助以比天然重組蛋白質(zhì)更高的收率表達蛋白質(zhì)(表達增強子)。融合配偶體可以是免疫學融合配偶體和表達增強配偶體。載體蛋白質(zhì)
載體蛋白質(zhì)與另一種目的多肽化學綴合。多肽與載體蛋白質(zhì)的化學偶聯(lián)可以以本領域已知的任何方式執(zhí)行。因此，對于直接共價偶聯(lián)，可以利用碳二亞胺、戊二醛或N_[ Y-馬來酰亞胺丁酰氧基]琥珀酰亞胺酯，利用普通商購可得的異雙功能接頭例如CDAP和SPDP (使用制造商的說明書)。在偶聯(lián)反應后，借助于透析法、凝膠過濾法、分級分離法等，可以容易地分離且純化多肽-載體蛋白質(zhì)綴合物。在某些實施方案中使用的載體蛋白質(zhì)的類型將是本領域技術(shù)人員容易已知的。某些載體蛋白質(zhì)的功能是提供細胞因子幫助，以便幫助誘導針對偶聯(lián)多肽的免疫應答。例如， 可以用于本發(fā)明中的載體蛋白質(zhì)的非詳盡列表包括鑰孔血藍蛋白(KLH)，血清白蛋白例如牛血清白蛋白(BSA)，滅活的細菌毒素例如破傷風或白喉毒素(TT和DT)、或其重組片段 (例如，TT的片段C的結(jié)構(gòu)域1、或DT的易位結(jié)構(gòu)域)，或結(jié)核菌素(PPD)的純化蛋白質(zhì)衍生物。融合配偶體
盡管存在眾多基因融合系統(tǒng)的可用性，在大腸埃希桿菌〈Escherichia coli )中的重組蛋白質(zhì)表達仍是困難的。建立最佳地增強難以表達的蛋白質(zhì)表達的融合配偶體仍是憑經(jīng)驗的。常見融合配偶體包括麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)的C末端、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)At 氧還蛋白(TRX)、NUS A、泛素⑶b)和小泛素樣修飾物(SUMO)標簽，其各自在文獻中得到描述。參見例如，Marblestone (2006)Prot. Sci. 15:182-7 ；Hunt (2QQ5)Protein Exp. & Purifm :1-22 ；Hammarstom 等 M2QQ2) Protein Sci. 11:313—321。免疫原性融合配偶體包括來自流感嗜血桿菌B的蛋白質(zhì)D和來自流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)NSl (血凝素)。另一種免疫學融合配偶體是稱為LYTA的蛋白質(zhì)。可以使用分子的C末端部分。LYTA衍生自肺炎鏈球菌(Sti^ptococcus pneumoniae)，其合成N-乙?；?L-丙氨酸酰胺酶、酰胺酶LYTA(由IytA基因編碼Garci a等人(1986 )GeneA , 265-272 )。 可以使用從殘基178開始的在C末端中發(fā)現(xiàn)的Lyta分子的重復部分，例如殘基188-305。 另一種合適的融合配偶體是腺苷酸環(huán)化酶(CyaA)蛋白質(zhì)或其片段，其中所述CyaA片段保留所述腺苷酸環(huán)化酶蛋白質(zhì)靶向抗原呈遞細胞的性質(zhì)。參見W02005089792。在本發(fā)明的一個實施方案中，異源多肽是來自流感嗜血桿菌的蛋白質(zhì)IYEP O 594 610 Bi)，或其片段。蛋白質(zhì)D是來自流感嗜血桿菌的IgD結(jié)合蛋白(W0 91/18926，授予EP O 594 610 Bi)。在某些情況下，例如在重組免疫原表達系統(tǒng)中，可能希望使用蛋白質(zhì)D的N 末端片段，例如包含蛋白質(zhì)D的約100 -約110個N末端氨基酸(GB 9717953. 5)(pDl/3， SEQ ID NO:39)。流感嗜血桿菌蛋白質(zhì)D作為具有18氨基酸信號序列的前體(SEQ ID N0:41，還參見登記號AAAM998)合成。當信號序列在分泌過程中進行加工時，在前體分子中在位置19 上的半胱氨酸殘基變成氨基末端殘基。在一個實施方案中，異源多肽序列包含經(jīng)加工的流感嗜血桿菌蛋白質(zhì)D分子的前約三分之一，或經(jīng)加工的蛋白質(zhì)D的N末端100-110個氨基酸。在一個實施方案中，異源蛋白質(zhì)包含與經(jīng)加工的蛋白質(zhì)D的N末端109個氨基酸連接的氨基酸殘基Met-Asp-Pro。在另一個實施方案中，異源蛋白質(zhì)包含與經(jīng)加工的蛋白質(zhì)D (SEQ ID N0:39)的氨基酸殘基 2-109連接的氨基酸殘基Met-Asp-Pro。在一個實施方案中，修飾的CASB7439多肽或蛋白質(zhì)構(gòu)建體與CyaA蛋白質(zhì)或其片段化學偶聯(lián)。參見W02005054851。在另一個實施方案中，修飾的CASB7439多肽或蛋白質(zhì)構(gòu)建體與志賀毒素的B亞單位或其免疫學功能等價物化學偶聯(lián)。參見美國專利號6，613，882 ； W002060937 ；W02005112991。多組氨酸標簽，無關氨基酸
包括異源多肽通常是有利的，所述異源多肽含有分泌或前導序列、前序列 (pro-sequence)、幫助純化的序列例如組氨酸標簽例如多組氨酸序列(包含多個組氨酸殘基)、或用于在重組生產(chǎn)過程中的穩(wěn)定性的另外序列。組氨酸標簽載體和試劑盒是商購可得的。例如，用于將6組氨酸標簽加入多肽中的載體可從Roche獲得。用于制備且使用加組氨酸標簽的多肽的試劑盒可從Qiagen、 Sigma,Thermo Scientific,GE Healthcare及其他獲得。組氨酸標簽還可以跟隨促進使用內(nèi)肽酶的多組氨酸序列去除的合適氨基酸序列。外肽酶例如Qiagen TAGZyme可以用于去除末端多組氨酸序列，而無需另外序列。在某些實施方案中，多組氨酸序列定位于蛋白質(zhì)構(gòu)建體的N末端區(qū)域中。在進一步的實施方案中，多組氨酸序列定位于蛋白質(zhì)構(gòu)建體的N末端上。在某些實施方案中，多組氨酸序列包含6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個或更多連續(xù)組氨酸。在進一步的實施方案中，多組氨酸序列包含10個連續(xù)組氨酸。在某些實施方案中，異源多肽包括多組氨酸序列和一個或多個無關氨基酸?！盁o關氨基酸”意指這樣的一個或多個氨基酸，其不是多組氨酸序列、或融合蛋白的部分，并且不是CASB7439多肽序列的天然部分。例如，無關氨基酸可以是包括以提供肽酶位點的那些， 它們可以僅僅是外來序列，例如克隆人工產(chǎn)物等。編碼CASB7439構(gòu)建體的核酸分子
本公開內(nèi)容的其他實施方案涉及編碼如本文描述的修飾的CASB7439多肽和蛋白質(zhì)構(gòu)建體的重組核酸。在特定實施方案中，重組核酸對于在所選原核或真核宿主細胞中的表達進行密碼子最佳化。為了促進復制和表達，核酸可以摻入載體內(nèi)，例如原核或真核表達載體。包括重組修飾的CASB7439多肽或蛋白質(zhì)構(gòu)建體-編碼核酸的宿主細胞也是本公開內(nèi)容的特征。有利的宿主細胞包括原核(即細菌)宿主細胞，例如大腸桿菌，以及眾多真核宿主細胞，包括真菌(例如酵母)細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞(例如HEK293、CH0和VERO細胞)。表達載體
為了促進復制和表達，核酸可以摻入載體內(nèi)，例如原核或真核表達載體。盡管本文公開的核酸可以包括在多種載體(包括例如細菌質(zhì)粒；噬菌體DNA ；桿狀病毒；酵母質(zhì)粒；衍生自質(zhì)粒和噬菌體DNA、病毒DNA組合的載體，所述病毒DNA例如牛痘、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病、腺病毒、腺相關病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒及許多其他)中的任何一種中，最通常地載體將是適合于生成多肽表達產(chǎn)物的表達載體。在表達載體中，編碼蛋白質(zhì)構(gòu)建體的核酸一般以對于合適轉(zhuǎn)錄控制序列(啟動子和任選地一個或多個增強子)的接近性和方向排列，以指導mRNA合成。即，目的多核苷酸序列與合適的轉(zhuǎn)錄控制序列可操作地連接。此類啟動子的例子包括 CMV的立即早期啟動子、LTR或SV40啟動子、桿狀病毒的多角體啟動子、大腸桿菌Iac或trp 啟動子、噬菌體T7和λ PL啟動子、和已知控制原核或真核細胞或其病毒中基因的表達的其他啟動子。表達載體一般還含有用于翻譯起始的核糖體結(jié)合位點、和轉(zhuǎn)錄終止子。載體任選包括用于擴增表達的合適序列。此外，表達載體任選地包含一種或多種選擇標記基因，以提供用于選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞的表型性狀，例如用于真核細胞培養(yǎng)的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，或例如在大腸桿菌中的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。足以指導本領域技術(shù)人員的通過重組CASB7439核酸產(chǎn)生的示例性程序可以在下述中發(fā)現(xiàn)Sambrook 等人’ Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第 2 片反， Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 ；Sambrook ^ Α Molecular Cloning: A Laboratory Manual, % 3 版，Cold Spring Harbor Press, 2001 ；Ausubel 等人，Current Pro toco Is in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992 (禾口對于 2003 年的增刊);和 Ausubel 等人，Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Pro toco Is in Molecular Biology4 IK, Wiley & Sons，1999。編碼蛋白質(zhì)構(gòu)建體的示例性核酸分子由SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 12表示。與示例性核酸分子共享序列同一性的另外序列變體可以由本領域技術(shù)人員產(chǎn)生。一般地，核酸變體將編碼相差不超過1%、或 2%、或5%、或10%、或15%、或20%氨基酸殘基的多肽。即，所編碼的多肽共享至少80%、 或85 %，更通常至少約90 %或更多，例如95 %、98 %、99 %、或99. 5 %序列同一性。本領域技術(shù)人員將立即理解，編碼蛋白質(zhì)構(gòu)建體的多核苷酸序列自身可以共享更少的序列同一性， 這是由于遺傳編碼的冗余。在某些情況下，相對于本文所示的示例性構(gòu)建體的氨基酸序列 (例如，除上述修飾外)，修飾的CASB7439多肽或蛋白質(zhì)構(gòu)建體具有一個或多個氨基酸修飾。 此類差異可以分別是一個或多個核苷酸或氨基酸的添加、缺失或置換。變體一般相差不超過約1%、或2%、或5%、或10%、或15%、或20%或25%或30%核苷酸殘基。例如，與SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 10 禾口 SEQ ID NO: 12 的示例性CASB7439多肽或蛋白質(zhì)構(gòu)建體編碼核酸比較，變體CASB7439多肽或蛋白質(zhì)構(gòu)建體編碼核酸可以包括1或2、或直到5、或直到約10、或直到約15、或直到約50、或直到約100個核苷酸差異。因此，在CASB7439多肽或蛋白質(zhì)構(gòu)建體編碼核酸背景中的變體，一般與參考序列共享至少70%、或75%、或80%、或85%、或90%、或95%、或98%、或99%、或99. 5%序列同一性，例如由 SEQ ID N0:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO: 10 和SEQ ID NO: 12舉例說明的參考序列，或本文公開的其他示例性CASB7439多肽、蛋白質(zhì)構(gòu)建體編碼核酸中的任何。另外變體可以通過遺傳漂變出現(xiàn)，或可以使用定點或隨機誘變、 或通過2個或更多預先存在的變體的重組人工產(chǎn)生。此類另外變體還適合于本文公開的 CASB7439多肽或蛋白質(zhì)構(gòu)建體背景中。除先前描述的變體核酸外，與由SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 12表示的一種或多種示例性核酸雜交的核酸也可以用于編碼本文公開的CASB7439多肽或蛋白質(zhì)構(gòu)建體。本領域技術(shù)人員應當理解除本文討論的序列同一性百分比(% )測量外，2個核酸之間的序列相似性的另一個標記是雜交的能力。2 個核酸的序列越相似，它們將在其下雜交的條件越嚴格。雜交條件的嚴格性是序列依賴性的，并且在不同環(huán)境參數(shù)下是不同的。因此，導致特定嚴格性程度的雜交條件將不同，這取決于雜交的性質(zhì)、選擇的方法、以及雜交核酸序列的組成和長度。一般地，雜交的溫度和雜交緩沖液的離子強度(特別是Na+和/或Mg++濃度)將決定雜交的嚴格性，盡管洗滌時間也影響嚴格性。一般地，嚴格條件選擇為低于在限定離子強度和PH下關于特定序列的熱解鏈溫度(Tm)約5°C - 20°C。1是在其下50%的靶序列與完全匹配的探針雜交的溫度(在限定離子強度和PH下)。對于核酸雜交和嚴格性計算的條件可以例如在下述中找到=Sambrook等 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Co\A Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001 ；Ti jssen,Hybridization With Nucleic Acid Probes,Part I: Theory and Nucleic Acid Preparation, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science LtcL，NY，NY，1993 禾口 Ausubel 等人 S^ri Pro toco Is in Molecular Biology,第 4 片反，John Wiley & Sons, Inc.，1999。為了本公開內(nèi)容的目的，“嚴格條件”涵蓋在其下雜交將僅在雜交分子和靶序列之間存在小于25%錯配的情況下發(fā)生的條件?！皣栏駰l件”可以分解成特定嚴格水平用于更精確的定義。因此，如本文使用的，“適度嚴格”條件是在其下具有超過25%序列錯配的分子將不雜交的那些；“中嚴格”的條件是在其下具有超過15%錯配的分子將不雜交的那些；并且“高嚴格”的條件是在其下具有超過10%錯配的序列將不雜交的那些。“極高嚴格”的條件是在其下具有超過6%錯配的序列將不雜交的那些。相比之下，在“低嚴格條件”下雜交的核酸包括具有少得多的序列同一性，或僅在核酸的短子序列上具有序列同一性的那些。 因此，應當理解由本公開內(nèi)容涵蓋的核酸的各種變體能夠在嚴格條件下在基本上其整個長度上與 SEQ ID N0:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO: 10 禾口 SEQ ID NO: 12中的至少一個雜交。蛋白質(zhì)構(gòu)建體的產(chǎn)生
本文公開的蛋白質(zhì)構(gòu)建體可以使用用于重組蛋白質(zhì)表達和純化的充分建立的程序來產(chǎn)生。足以指導本領域技術(shù)人員的程序可以在下述參考文獻中找到=Sambrook等人， Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Co1d Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY, 200 ；禾口 Ausubel ^A Short Pro toco Is in Molecular Biology, % 4 版，John Wiley & Sons, Inc.，999。另外和具體細節(jié)在下文中提供。編碼蛋白質(zhì)構(gòu)建體的重組核酸可以通過多種眾所周知程序中的任何引入宿主細胞內(nèi)，例如電穿孔、脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染(例如使用商購可得的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，例如 LIPOFECTAMINE 2000或TRANSFECTIN )、磷酸鈣沉淀、感染、轉(zhuǎn)染等，這取決于載體和宿主細胞的選擇。宿主細胞可以在適當修飾的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，用于激活啟動子、選擇轉(zhuǎn)化體或擴增插入的多核苷酸序列。培養(yǎng)條件例如溫度、PH等一般是對于選擇用于表達的宿主細胞先前使用的那些，并且對于本領域技術(shù)人員且在本文引用的參考文獻中將是顯而易見的，包括例如 Freshney Hm^ Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, W^Wi, Wiley- Liss, New ^rk和其中引用的參考文獻。在某些實施方案中， 合適的培養(yǎng)溫度是16°C ；在其他中37°C。對應于本發(fā)明的核酸的表達產(chǎn)物還可以在非動物細胞例如植物、酵母、真菌、細菌等中產(chǎn)生。除Sambrook、Berger和Ausubel外，關于細胞培養(yǎng)的細節(jié)可以在下述中找到Payne等人(1992)/ ^ Cell and Tissue Culture in Liquid Systems^o\m Wiley & Sons, Inc. New York, NY ;Gamborg 禾口 Phillips (編輯) (Plant Cell，Tissue and Organ Culture ；Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York)以及 Atlas 禾口 Parks (編輯 Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL0宿主細胞包括重組蛋白質(zhì)構(gòu)建體編碼核酸的宿主細胞因此也是本公開內(nèi)容的特征。有利的宿主細胞包括原核(即細菌)宿主細胞，例如大腸桿菌，以及眾多真核宿主細胞，包括真菌(例如酵母，例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )和巴斯德畢赤酵母QPicchia pas tor is))細胞、昆蟲細胞、植物細胞和哺乳動物細胞(例如CHO細胞)。例如經(jīng)由載體例如表達載體，將重組蛋白質(zhì)構(gòu)建體核酸引入(例如轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)宿主細胞內(nèi)。如本文描述的，載體最一般是質(zhì)粒，但此類載體還可以是例如病毒顆粒、噬菌體等。合適表達宿主的例子包括細菌細胞例如大腸桿菌、鏈霉菌屬和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium )；真菌細胞，例如釀酒酵母、巴斯德畢赤酵母和粗糙鏈孢霉(Murospora crassa )；昆蟲細胞例如果蠅(Mrosophila )和草地貪夜蛾(Spodop tera ；哺乳動物細胞例如 3T3、COS、CHO、BHK、HEK293 或 Bowes melanoma ；植物細胞包括藻類細胞等。宿主細胞任選就其調(diào)節(jié)插入序列表達或以所需方式加工表達蛋白質(zhì)的能力加以選擇。蛋白質(zhì)的此類修飾包括但不限于糖基化(以及例如乙?；?、羧化、磷酸化、脂質(zhì)化和?；?。例如將前體形式切割成成熟形式的蛋白質(zhì)的翻譯后加工(例如通過弗林蛋白酶)任選在宿主細胞背景中執(zhí)行。不同宿主細胞例如3T3、COS、CHO、HeLa, BHK、MDCK, HEK293、WI38 等具有用于此類翻譯后活性的特定細胞機制和特有機制，且可以選擇以確保所引入的異種蛋白質(zhì)的正確修飾和加工。對于本文公開的重組蛋白質(zhì)構(gòu)建體的長期、高收率生產(chǎn)，一般使用穩(wěn)定表達系統(tǒng)。 例如，使用含有病毒復制起點或內(nèi)源表達元件和選擇標記基因的表達載體，將穩(wěn)定表達蛋白質(zhì)構(gòu)建體的核酸分子引入宿主細胞內(nèi)。在引入載體后，在它們轉(zhuǎn)到選擇培養(yǎng)基之前，允許細胞在富集培養(yǎng)基中生長1-2天。選擇標記的目的是賦予對于選擇的抗性，并且它的存在允許成功表達所引入序列的細胞的生長和回收。例如，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細胞的抗性組或集落可以使用對于細胞類型合適的組織培養(yǎng)技術(shù)進行增殖。用編碼蛋白質(zhì)構(gòu)建體的核酸轉(zhuǎn)化的宿主細胞任選在適合于來自細胞培養(yǎng)的所編碼蛋白質(zhì)的表達和回收的條件下進行培養(yǎng)。表達的蛋白質(zhì)構(gòu)建體可以從重組細胞培養(yǎng)物中回收且純化，其通過本領域眾所周知的許多方法中的任何，包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸萃取、過濾、超濾、離心、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水作用層析、親和層析(例如使用本文指出的任何加標簽系統(tǒng))、羥磷灰石層析和凝集素層析。需要時，在成熟蛋白質(zhì)的完成構(gòu)型中，可以使用蛋白質(zhì)重折疊步驟。最后，高效液相層析(HPLC)可以用于最后純化步驟中。除本文指出的參考文獻外，多種純化法是本領域眾所周知的，包括例如下述中闡述的那些=Sandana (1997) Bioseparation of Proteins’ Academic Press, Inc.；禾口 Bollag 等 A(1996)Protein Methods，第 2 版Hey-\Ass,Wl ；Walker (1996 Pro tein Pro toco Is HandbookWxxmana Press, NJ, Harris 禾口 Angal (Λ990)Protein Purification Applications: A Practical ApproachVSL Press at Oxford, Oxford, U. K. ；Scopes (1993) VroteinPurification: Principles and PracticeM3M Springer Verlag,NY ；Janson 禾口 Ryden (199^)Protein Purification: Principles， High Resolution Methods and Applications, 第 2 版 Wiley-VCH，NY ；禾口 Walker (Λ998)Protein Protocols on OHKMumana Press，NJ0在特定例子中，經(jīng)由適合于在原核細胞例如大腸桿菌細胞中的引入和表達的載體將核酸引入細胞內(nèi)。例如，包括編碼蛋白質(zhì)構(gòu)建體的多核苷酸序列的核酸可以引入多種商購可得的或?qū)Ｓ械?proprietary)載體中的任何內(nèi)，例如表達載體的pET系列(例如pET9b 和pET2d)。編碼序列的表達可通過異丙基β-D-l-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)誘導，導致高水平的蛋白質(zhì)表達。編碼CASB7439蛋白質(zhì)構(gòu)建體的多核苷酸序列在噬菌體T7啟動子下轉(zhuǎn)錄。包括熱誘導型XpL啟動子的可替代載體例如pURV22也是合適的。將表達載體引入(例如通過電穿孔)合適的細菌宿主內(nèi)。大腸桿菌的眾多合適菌株是可獲得的，并且可以由本領域技術(shù)人員進行選擇(例如BLR DE3、BL21 DE3和Rosetta DE3 菌株已證明對于重組載體的表達是有利的，所述重組載體含有編碼蛋白質(zhì)構(gòu)建體的多核苷酸序列)。任選地，將編碼蛋白質(zhì)構(gòu)建體的多核苷酸摻入表達載體內(nèi)，所述表達載體適合于在真核生物(例如昆蟲或哺乳動物細胞)中引入和表達。有利地，此類核酸對于在所選載體 /宿主細胞中的表達進行密碼子最佳化。所選細胞可以是克隆擴增的且對于所需蛋白質(zhì)構(gòu)建體的表達進行表征。用于密碼子最佳化的技術(shù)是本領域已知的。此外，在其他常規(guī)技術(shù)服務中，商業(yè)分子生物學服務供應商提供密碼子最佳化。原核生物
在細菌系統(tǒng)中，取決于對于表達產(chǎn)物預期的用途，可以選擇許多表達載體。例如，當需要大量多肽或其片段用于抗體生產(chǎn)時，有利地采用指導容易純化的融合蛋白的高水平表達的載體。此類載體包括但不限于多功能大腸桿菌克隆和表達載體，例如BLUESCRIPT Gtratagene)，其中目的編碼序列例如如本文描述的本發(fā)明的多核苷酸可以與β -半乳糖苷酶的用于氨基末端翻譯起始甲硫氨酸和后續(xù)7個殘基的序列在框內(nèi)一起連接到載體內(nèi)， 產(chǎn)生催化活性的β半乳糖苷酶融合蛋白；ρΙΝ載體(Van Heeke & khuster (1989)/召iW Chenf2M 5503-5509);pET載體(Novagen，Madison WI)，其中氨基末端甲硫氨酸與組氨酸標簽一起在框內(nèi)連接；等。在某些實施方案中，合適的載體是PET19 ；在其他中是PET24 ；在其他中是PET26。真核生物
類似地，在酵母例如釀酒酵母中，含有組成型或誘導型啟動子例如α因子、醇氧化酶和PGH的許多載體可以用于所需表達產(chǎn)物的產(chǎn)生。關于綜述，參見Berger、AuSubel和例如 Grant等人(1987 -,Methods in Enzymologyl^ 516-544 ) 在哺乳動物宿主細胞中，可以利用許多表達系統(tǒng)，包括質(zhì)粒和基于病毒的系統(tǒng)。免疫原性組合物藥學可接受的載體或賦形劑
藥學可接受的載體和賦形劑是眾所周知的，并且可以由本領域技術(shù)人員加以選擇。例如，載體或賦形劑可以有利地包括緩沖劑。任選地，載體或賦形劑還含有穩(wěn)定可溶性和/ 或穩(wěn)定性的至少一種組分。增溶/穩(wěn)定劑的例子包括去污劑例如月桂酰肌氨酸和/或吐溫?？商娲鋈?穩(wěn)定劑包括精氨酸、和玻璃形成多元醇(例如蔗糖、海藻糖等)。眾多藥學可接受的載體和/或藥學可接受的賦形劑是本領域已知的，并且例如在 Pharmaceutical Sciences, Ε. W. Martin, Mack Publishing Co. , Easton, PA,第 5 版 (975)中描述。相應地，合適的賦形劑和載體可以由本領域技術(shù)人員加以選擇，以產(chǎn)生適合于通過所選施用途徑遞送給受試者的制劑。
合適的賦形劑包括但不限于甘油、聚乙二醇(PEG)、山梨糖醇、海藻糖、N-月桂酰肌氨酸鈉鹽、L-脯氨酸、非去污劑磺基甜菜堿、鹽酸胍、尿素、氧化三甲胺、KC1、Ca2+、Mg2+、 Mn2+Jn2+和其他二價陽離子相關的鹽、二硫蘇糖醇、二硫赤蘚醇和β-巰基乙醇。其他賦形劑可以是去污劑(包括Tween80、Tween20、Triton X-00、NP-40、Empigen BB、辛基葡糖苷、 月桂酉先麥芽糖苷、Zwittergent 3-08> Zwittergent 3-0> Zwittergent 3-2> Zwittergent 3-4、Zwittergent 3-6、CHAPS、脫氧膽酸鈉、十二烷基硫酸鈉、溴化十六烷基三甲銨)。佐劑
任選地，免疫原性組合物還包括佐劑。在適合于施用于受試者例如人受試者的免疫原性組合物背景中，用于引發(fā)針對CASB7439的免疫應答的目的，佐劑選擇為引發(fā)偏于 ThKThl biased)的免疫應答。佐劑一般選擇為增強組合物施用于其的受試者或受試者群體中偏于Thl的免疫應答。Thl免疫應答 “!1!1”型免疫應答的特征在于產(chǎn)生11^2和正^^的⑶4+ T輔助細胞的誘導。相比之
下，“Th2”型免疫應答的特征在于產(chǎn)生IL-4、IL-5和IL-13的CD4+輔助細胞的誘導。TLR影響因子(affec tors),包括但不限于3D-MPL
用于與修飾的CASB7439多肽組合使用的一種合適的佐劑是TLR-4調(diào)節(jié)劑。一個例子是脂質(zhì)A的無毒衍生物，例如單磷酰脂質(zhì)A或更具體而言3-脫?；鶈瘟柞?monophoshoryl) 月旨質(zhì) A(3D-MPL)。3D-MPL 在名稱 MPL 下由 GlaxoSmithKline Biologicals S. A.銷售，并且在文件中自始至終被稱為MPL或3D-MPL。參見例如美國專利號4，436，727 ；4, 877，611 ； 4，866，034和4，912，094。3D-MPL主要促進具有IFN-γ (Thl)表型的CD4+ T細胞應答。 3D-MPL可以根據(jù)GB2220211 A中公開的方法產(chǎn)生。在化學上，它是具有3、4、5或6條酰化鏈的3-脫?；鶈瘟柞Ｖ|(zhì)A的混合物。在本發(fā)明的組合物中，可以使用小顆粒3D-MPL。小顆粒3D-MPL具有這樣的粒度，使得它可以通過0. 22 μ m濾器進行無菌過濾。此類制劑在 W094/21292 中描述。在其他實施方案中，脂多糖可以是β (1-6)葡糖胺二糖，如美國專利號6，005，099 和EP專利號0 7 473 Bl中描述的。基于這些參考文獻的教導，本領域技術(shù)人員將容易地能夠產(chǎn)生多種脂多糖，例如3D-MPL。除上述免疫刺激劑(其在結(jié)構(gòu)中類似于LPS或MPL 或3D-MPL的那種)外，為本文MPL結(jié)構(gòu)的子部分的?；瘑翁呛投茄苌镆彩呛线m的佐齊U。在其他實施方案中，佐劑是脂質(zhì)A的合成衍生物，其中某些描述為TLR-4激動劑，并且包括但不限于0M174 (2-脫氧-6-o-[2-脫氧_2_[ (R) -3-十二烷酰氧基十四烷?；被鵠-4-0-膦酰基- β -D-吡喃葡萄糖基]-2-[ (R) -3-羥基十四烷酰氨基]-α -D-吡喃葡萄糖基二氫磷酸酯)，(W0 95/ 14026) ；OM 294 DP (3S，9 R) _3—[ (R)-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-4-氧代-5-氮雜-9 (R)-[ (R)-3-羥基十四烷酰氨基]癸-1，10-二醇，1，10-雙(二氫磷酸酯)(W0 99/64301 和 WO 00/0462)；和 OM 197 MP-Ac DP (3S-, 9R)-3-[ (R)-十二烷酰氧基十四烷酰基氨基]-4-氧代-5-氮雜-9-[ (R)_3_羥基十四烷酰氨基]癸-1，10-二醇，1 -二氫磷酸酯10- (6-氨基己酸酯)(W0 01/46127)?？梢允褂玫钠渌鸗LR-4配體是烷基氨基葡糖苷磷酸鹽(AGPs)，例如公開于WO 98/50399或美國專利號6，303，347 (還公開了用于制備AGPs的過程)中的那些，適當?shù)?RC527或或AGPs的藥學可接受的鹽，例如公開于美國專利號6，764，840中。某些AGPs是TLR-4激動劑，并且某些是TLR-4拮抗劑。兩者都認為作為佐劑是有用的。能夠通過TLR-4引發(fā)信號應答的其他合適的TLR-4配體(Sabroe等人，JI 2003 第1630-5頁)是例如來自革蘭氏陰性菌的脂多糖及其衍生物，或其片段，特別是LPS的無毒衍生物(例如3D-MPL)。其他合適的TLR激動劑是熱休克蛋白(HSP)10、60、65、70、75或 90 ；表面活性劑蛋白A、透明質(zhì)酸寡糖、硫酸肝素片段、纖連蛋白片段、纖維蛋白原肽、b-防御素-2和胞壁酰二肽(MDP)。在一個實施方案中，TLR激動劑是HSP 60,70或90。其他合適的 TLR-4 配體是如 WO 2003/011223 和 WO 2003/099195 中所述的，例如在 W02003/011223 的第4-5頁上或在W02003/099195的第3_4頁上公開的化合物I、化合物II和化合物III， 且特別是在 W02003/011223 中作為 ER803022、ER803058、ER803732、ER804053、ER804057、 ER804058、ER804059、ER804442、ER804680 和 ER804764 公開的那些化合物。例如，一種合適的 TLR-4 配體是 ER804057。阜苷佐劑
可以在免疫原性組合物中例如單獨或與3D-MPL或本文描述的另一種佐劑組合與 CASB7439 一起使用的其他佐劑是皂苷例如QS21。阜昔在LacaiIle-Dubois,MfPWagner H. (1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine 第 2 卷第 363-386 頁) 中教導。皂苷是廣泛分布于植物和海洋動物界中的類固醇或三萜糖苷。皂苷因在水中形成膠體溶液而出名，所述膠體溶液在振蕩后發(fā)泡，并且用于沉淀膽固醇。當皂苷接近細胞膜時，它們在膜中產(chǎn)生孔樣結(jié)構(gòu)，這引起膜爆裂。紅細胞的溶血是這種現(xiàn)象的一個例子，這是某些但并非全部皂苷的性質(zhì)。皂苷特別是免疫學活性的皂苷級分已知作為在用于全身施用的疫苗中的佐劑。 個別皂苷的佐劑和溶血活性已在本領域中得到廣泛研究(Lacaille-Dubois和Wagner，同上)。例如，Quil A (衍生自南美洲樹Quillaja Saponaria Molina的樹皮)及其級分在US 5，057，540 禾口〃Saponins as vaccine adjuvants〃，Kensil, C. R. , Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996,12( 1-2): 1-55 ；和 EP 0 362 279 Bl 中描述。包含 Quil A 級分的稱為免疫刺激復合物(ISCOMS)的特定結(jié)構(gòu)是溶血的，并且已用于疫苗制造中(Morein，B.，EP 0 109 942 Bl ；WO 96/11711 ；WO 96/33739)。溶血皂苷 QS21 和 QS17(Quil A 的 HPLC 純化級分)已描述為有效的全身佐劑，并且其生產(chǎn)方法公開于美國專利號5，057，540和EP 0 362 279 Bl中。已用于全身疫苗接種研究中的其他皂苷包括衍生自其他植物物種例如石頭花屬 (Gypsophila)和肥皂草屬(Saponaria)的那些(Bomford 等人，Vaccine，10 (9) :572-577, 1992)。當連同抗原一起配制時，包含QS21和膽固醇的此類制劑已顯示是成功的Thl刺激佐劑。因此，例如，CASB7439可以有利地與包含QS21和膽固醇的組合的佐劑一起用于免疫原性組合物中。免疫剌激性寡聚核酸
用于與CASB7439組合使用的一種合適佐劑是能夠通過TLR-9引起信號應答的細菌DNA TLR激動劑，即TLR-9激動劑，更具體而言含有非甲基化CpG核苷酸的DNA，特別是稱為CpG 基序的序列背景。含CpG寡核苷酸誘導占優(yōu)勢地Thl應答。此類寡核苷酸是眾所周知的， 并且例如在WO 96/02555，WO 99/33488以及美國專利號6，008，200和5，856，462中描述。適當?shù)?，CpG核苷酸是CpG寡核苷酸。用于在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的合適寡核苷酸是含CpG寡核苷酸，任選含有由至少3個、適當?shù)刂辽?個或更多核苷酸分開的2個或更多二核苷酸CpG基序。CpG基序是胞嘧啶核苷酸隨后為鳥嘌呤核苷酸。本發(fā)明的CpG寡核苷酸一般是脫氧核苷酸。在一個特定實施方案中，寡核苷酸中的核苷間是二硫代磷酸酯或適當?shù)亓虼蛩狨ユI，盡管磷酸二酯和其他核苷間鍵也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在某些實施方案中是具有混合的核苷間鍵合的寡核苷酸。用于產(chǎn)生硫代磷酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法在美國專利號5，666，153，5，278，302和WO 95/26204中描述。在一個可替代實施方案中，使用能夠通過TLR-9弓丨起信號應答的TLR激動劑。在一個實施方案中，能夠通過TLR-9弓丨起信號應答的TLR激動劑是HSP90。不同佐劑例如本文提及那些的組合也可以用于具有CASB7439的組合物中。例如，如已指出的，QS21可以連同 3D-MPL—起配制。QS21 3D-MPL的比值一般將在1 10至10 1的級別中，例如1:5至 5 1，且通常基本上1 1。一般地，比值在2. 5 1至1 1 3D-MPL: QS21的范圍中。 另一種組合佐劑是在脂質(zhì)體制劑中的3DMPL加上QS21，也與CpG組合。具有結(jié)腸直腸癌的受試者
用于參與本文描述的方法中的具有結(jié)腸直腸癌的受試者的選擇可以通過臨床診斷、分子診斷或其組合。在某些實施方案中，受試者進行測試，以測定其癌細胞是否表達CASB7439 (HASH2)。用于診斷結(jié)腸直腸癌的臨床方法是本領域已知的。用于測定癌細胞或組織是否表達CASB7439 (HASH2)的分子技術(shù)和方法公開于W001/62778中。實驗實施例實施例1
在pET19b載體中生成編碼包含CASB7439多肽的蛋白質(zhì)構(gòu)建體的2種核酸分子。His標簽與CASB7439序列的N末端并列。這些克隆分別命名為LVL007 [SEQ ID NO: 15(aa);SEQ ID NO: 16 (DNA)]和 LVLOlO [SEQ ID NO: 17 (aa);SEQ ID NO: 18 (DNA)] 觀察到非故意突變已在LVL007克隆中出現(xiàn)，導致脯氨酸到亮氨酸的一個氨基置換(在就SEQ ID N0:13而言的氨基酸殘基17上)。核酸分子對于3種不同宿主細胞類型利用，即大腸桿菌菌株BLR DE3、BL21 DE3 和 Rosetta DE3。誘導以 2 個溫度 / 誘導(16°C或 37°C )且用 ImM IPTG 執(zhí)行。關于方案細節(jié)，參見下文材料與方法節(jié)段。對于每次誘導收獲蛋白質(zhì)，并且通過蛋白質(zhì)印跡和通過SDS-PAGE用考馬斯藍染色進行分析。在這些實驗中，蛋白質(zhì)的檢測僅在蛋白質(zhì)印跡中可見。實施例2
執(zhí)行CASB7439基因的生物信息學分析，揭示下述結(jié)構(gòu)特征 定位于SEQ ID NO: 14的核苷酸2 - 27之間的發(fā)夾RNA結(jié)構(gòu)元件 核苷酸序列的62% GC含量
富含精氨酸密碼子的核苷酸序列(編碼的26/193個氨基酸) 具有高水平的堿性氨基酸殘基的氨基酸序列 具有高等電點(11. 18)的氨基酸序列 在氨基酸序列內(nèi)的低復雜性區(qū)域(SEQ ID N0:13的殘基7-27 在氨基酸序列內(nèi)的螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域(HLH) (IPR000014) (SEQ ID N0:13的殘基 56-108) 在氨基酸序列內(nèi)的固有無序的第一個區(qū)域(SEQ ID NO: 13的殘基118-164) 在氨基酸序列內(nèi)的固有無序的第二個區(qū)域(SEQ ID NO: 13的殘基118-164)。申請人:還鑒定了從氨基酸127到158的具有高脯氨酸周期性的區(qū)域。申請人將 SEQ ID NO: 13 (aa)的包括133和153在內(nèi)的來自氨基酸133-153的區(qū)域指名為富含脯氨酸的區(qū)域。富含脯氨酸的區(qū)域連同這個實施例中提及的某些其他特征一起，連同在本文中其他地方提及的區(qū)域一起以示意方式在圖1/35中描述。實施例3
未修飾的CASB7439 DNA核苷酸序列(SEQ ID NO: 14)通過商業(yè)DNA合成服務供應商，Geneart (獨特標識符0606597)進行密碼子最佳化且克隆。Geneart AG, BioPark, Josef-Engert-Str. 11D-93053 Regensburg，德國。CASB7439 核苷酸序列通過 PCR 擴增得自克隆，且用于生成2種構(gòu)建體。在第一種構(gòu)建體LVL016 [SEQ ID N0:29 (aa)，SEQ ID NO:30 (DNA)]中，將CASB7439序列插入pET21b ( + )載體中與在CASB7439序列的N末端上的PD1/3蛋白質(zhì)(來自流感嗜血桿菌)融合。在第二種構(gòu)建體LVL018 [SEQ ID N0:31 (aa)； SEQ ID NO:32 (DNA)]中，將CASB7439插入pET21b ( + )載體中(不含任何蛋白質(zhì)D組分)。 這些構(gòu)建體就在16°C和37°C用ImM IPTG在BLR DE3大腸桿菌中的生產(chǎn)進行評估。生產(chǎn)是可通過蛋白質(zhì)印跡作為不溶性蛋白質(zhì)檢測的，主要在16°C產(chǎn)生。選擇4個CASB7439結(jié)構(gòu)域用于進一步研究，以改善蛋白質(zhì)生產(chǎn)核靶向結(jié)構(gòu)域、富含脯氨酸的區(qū)域、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和HLH結(jié)構(gòu)域。實施例4
選擇CASB7439的核靶向結(jié)構(gòu)域、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、bHLH結(jié)構(gòu)域和富含脯氨酸的區(qū)域， 以研究來自包含編碼CASB7439多肽的核苷酸序列的構(gòu)建體的蛋白質(zhì)生產(chǎn)。CASB7439核苷酸序列的不同區(qū)段由本文描述的密碼子最佳化的Geneart克隆進行PCR擴增且插入pET19b (+ )載體中，導致具有不同CASB7439序列的5種構(gòu)建體(以某些方式或完全截短)；每種構(gòu)建體在CASB7439序列的N末端具有多組氨酸尾部。參見圖2/35。在圖2/35上顯示的這些構(gòu)建體就在37°C和16°C用ImM IPTG在BLR DE3大腸桿菌菌株中的蛋白質(zhì)表達進行評估。如圖2/35中所述，這些構(gòu)建體包含全長CASB7439 [LVL060,SEQ ID NO: 19 (aa), SEQ ID NO: 20 (DNA)]；截短以去除核靴向結(jié)構(gòu)域的 CASB7439 [Const-1, SEQ ID N0:21 (aa), SEQ ID NO:22 (DNA)]；截短以去除富含脯氨酸的區(qū)域的 CASB7439 [LVL055, SEQ ID N0:1 (aa), SEQ ID NO:2 (DNA)]；截短以去除 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域的 CASB7439[LVL056，SEQ ID NO:23 (aa), SEQ ID NO:24 (DNA)]；截短以留下堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)結(jié)構(gòu)域的 CASB7439 [LVL057, SEQ ID N0:25 (aa), SEQ ID NO:26 (DNA)]。由于實驗誤差，Const-I缺乏終止密碼子，導致載體核苷酸序列的部分的翻譯(導致在C末端區(qū)域中具有另外21個氨基酸，從LED...開始)。在16°C溫育后LVL055的產(chǎn)生 (C末端截短的)在考馬斯藍染色的SDS-PAGE凝膠上是可明確檢測的。實施例5
基于實施例4中所述的結(jié)果，設計新構(gòu)建體，以(i)去除富含脯氨酸的區(qū)域，同時(ii) 保留多肽的C末端部分的其他區(qū)域。參見圖3/35和4/35的描述，這討論了(i)在多肽內(nèi)的各種鑒定或預測表位，和(ii )用于去除富含脯氨酸的區(qū)域的各種可替代方法。隨后由Geneart (獨特標識符0706840)定購編碼修飾的CASB7439多肽的密碼子最佳化的合成核酸基因序列，消化且平行插入2種不同載體中，以生成下述構(gòu)建體
(i)LVL088，包含具有21氨基酸富含脯氨酸的區(qū)域缺失的CASB7439基因，在pET26b (+ )載體中的C末端上與多組氨酸尾部融合(SEQ ID NO:27 (aa)，SEQ ID NO:28 (DNA))和
(ii)LVLlll，包含具有21氨基酸富含脯氨酸的區(qū)域缺失，以及在pET19b( + )載體中的 N末端和C末端的多組氨酸尾部的CASB7439基因(SEQ ID N0:3(aa)，SEQ ID N0:4(DNA))。LVLlll構(gòu)建體(參見SEQ ID NO:3)根據(jù)用于LVL055的相同策略進行克隆，S卩，使用包括由10個組氨酸組成的多組氨酸尾部隨后為腸激酶位點的PET19 ( + )載體。這導致在N末端的23氨基酸融合配偶體(SEQ ID NO:42)。生成具有實施例3 (獨特標識符0606597)中討論的密碼子最佳化的合成基因的其他構(gòu)建體，包括下述
LVL090 (包含(從N末端起)在pET21載體中的蛋白質(zhì)D、全長最佳化的CASB7439和 6-His 的蛋白質(zhì)構(gòu)建體)(SEQ ID NO:43 (aa) ；SEQ ID N0:44 (DNA))
LVLl 12(包含(從N末端起)在pSUMO載體中的SUMO蛋白質(zhì)、全長最佳化的CASB7439 的蛋白質(zhì)構(gòu)建體)(SEQ ID N0:45 (aa) ；SEQ ID N0:46 (DNA))
LVLl 13 (包含(從N末端起)在pSUMO載體中的SUMO蛋白質(zhì)、pDl/3蛋白質(zhì)、全長最佳化的 CASB7439 的蛋白質(zhì)構(gòu)建體)(SEQ ID N0:47 (aa) ；SEQ ID N0:48 (DNA))
LVLl 14 (包含(從N末端起)在pSUMO載體中的SUMO蛋白質(zhì)、在氨基酸117上截短的 CASB7439 的蛋白質(zhì)構(gòu)建體)(SEQ ID N0:49 (aa) ；SEQ ID N0:50 (DNA))
LVLl 15 (包含(從N末端起)在pSUMO載體中的SUMO蛋白質(zhì)、具有富含脯氨酸的區(qū)域去除的修飾的CASB7439的蛋白質(zhì)構(gòu)建體)(SEQ ID N0:51 (aa) ；SEQ ID N0:52 (DNA))
未觀察到生產(chǎn)改善，盡管執(zhí)行僅一次重復(數(shù)據(jù)未顯示)。LVL088的生產(chǎn)在37°C和在16°C用ImM IPTG過夜溫育后進行分析。當電泳分析時，LVL088生產(chǎn)僅通過蛋白質(zhì)印跡進行顯現(xiàn)。來自4個800 mL培養(yǎng)瓶的一個純化批次導致0.4 mg蛋白質(zhì)。另一方面，LVLlll在考馬斯藍染色后是可容易檢測的。產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)LVLl 11且經(jīng)過8個批次進行純化。估計LVLl 11的幾個批次(各自來自4個800 mL培養(yǎng)瓶)，以產(chǎn)生在3. 3 mg/批次到10 mg/批次范圍中的純化蛋白質(zhì)。因此，LVL088的生產(chǎn)低于對于LVLlll可見的那種。純化蛋白質(zhì)也就其與幾種抗CASB7439單克隆抗體的反應性進行測試，并且在所有情況下獲得陽性反應性。實施例6
研究了 C末端多組氨酸尾部從LVLlll構(gòu)建體中的去除。編碼polypro (-)CASB7439 多肽而無編碼C末端多組氨酸的部分的核酸分子通過PCR從LVLlll構(gòu)建體擴增，且克隆到pET19b載體內(nèi)。將這種構(gòu)建體指名為LVL137。LVL137構(gòu)建體基本上是LVL111，而無編碼C末端多組氨酸尾部的核苷酸序列。SEQ ID NO: 5 (aa);SEQ ID NO:6 (DNA)0 C末端多組氨酸尾部的去除對生產(chǎn)水平?jīng)]有明顯影響。如通過考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠分析的， LVL137產(chǎn)生與LVLlll相同水平的蛋白質(zhì)。編碼polypro (_)CASB7439 多肽的核酸分子隨后通過 PCR 從 Geneart (0706840) 合成的CASB7439序列進行擴增，且克隆到在N末端具有6多組氨酸標簽的pET26載體內(nèi) (LVL138)。SEQ ID N0:33 (aa);SEQ ID NO:34 (DNA)0這種構(gòu)建體顯示出明顯減少水平的蛋白質(zhì)生產(chǎn)，且難以通過蛋白質(zhì)印跡檢測。
在pETM卡那霉素抗性載體中生成編碼在polypro (_)CASB7439多肽的N末端上的6多組氨酸標簽的核酸分子。利用新接頭設計，以去除在多組氨酸標簽序列和CASB7439 基因的5’末端之間產(chǎn)生的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。具體地，關于蛋白質(zhì)構(gòu)建體的前8個氨基酸殘基的密碼子改變?yōu)橄率龊塑账嵝蛄?，ATG CAT CAT CAT CAT CAT CAT GAC- 3，(SEQ ID NO:35)。 (原始密碼子是 5，ATG CAC CAT CAC CAT CAC CAT GAT..· 3’ (SEQ ID N0:36)。)將這種構(gòu)建體指名為LVL160。SEQ ID NO:37 (aa) ；SEQ ID NO:38 (DNA)0通過凝膠和蛋白質(zhì)印跡分析，蛋白質(zhì)生產(chǎn)看起來與用LVL138獲得的那種一樣弱。在pETM卡那霉素抗性載體中生成編碼在polypro (_)CASB7439多肽的N末端上具有10多組氨酸標簽的蛋白質(zhì)構(gòu)建體的核酸分子。將這種構(gòu)建體鑒定為LVL168。SEQ ID NO: 11 (aa);SEQ ID NO: 12 (DNA)0生產(chǎn)水平與對于LVLlll觀察到的水平相當。這個實施例中討論的幾種構(gòu)建體的比對在圖5/35中發(fā)現(xiàn)。關于這個實施例和實施例1中討論的構(gòu)建體的結(jié)果在下表1中概括。
權(quán)利要求
1.包含至少一種表達增強修飾的修飾的CASB7439多肽，其中所述表達增強修飾包含至少SEQ ID NO: 13的部分或所有富含脯氨酸的區(qū)域的缺失。
2.蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求1的修飾的CASB7439多肽、且進一步包含一種或多種異源多肽。
3.權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其中所述蛋白質(zhì)構(gòu)建體包含選自下述的構(gòu)建體(a)LVL055 (SEQ ID N0:1)；(b)LVLlll (SEQ ID N0:3)；(c)LVL137 (SEQ ID N0:5)；(d)LVL141 (SEQ ID N0:7)；(e)LVL144 (SEQ ID N0:9)；和(f)LVL168 (SEQ ID NO:11)。
4.免疫原性組合物，其包含權(quán)利要求1-3中任一項的蛋白質(zhì)構(gòu)建體、和藥學可接受的載體或賦形劑，其中所述載體或賦形劑可以任選包含緩沖劑。
5.權(quán)利要求4的免疫原性組合物，其進一步包含佐劑。
6.權(quán)利要求5的免疫原性組合物，其中所述佐劑引發(fā)至少Thl免疫應答。
7.權(quán)利要求4、5或6的免疫原性組合物，其中所述佐劑包含下述中的至少一種TLR-4 激動劑、免疫學活性皂苷級分、TLR-9激動劑。
8.權(quán)利要求7的免疫原性組合物，其中所述TLR-4激動劑是3D-MPL。
9.權(quán)利要求7或8的免疫原性組合物，其中所述TLR-9激動劑是CpG寡核苷酸。
10.權(quán)利要求7、8或9的免疫原性組合物，其中所述免疫學活性皂苷級分是QS21。
11.權(quán)利要求7-10中任一項的免疫原性組合物，其包含3D-MPL。
12.權(quán)利要求7-11中任一項的免疫原性組合物，其包含CpG。
13.權(quán)利要求7-12中任一項的免疫原性組合物，其包含QS21。
14.權(quán)利要求13的免疫原性組合物，其進一步包含膽固醇。
15.核酸分子，其包含編碼權(quán)利要求1-3中任一項的蛋白質(zhì)構(gòu)建體的多核苷酸序列。
16.在人或非人動物中誘導針對CASB7439的免疫應答的方法，其包括給所述人或非人動物施用有效量的包含佐劑和蛋白質(zhì)的組合物，所述蛋白質(zhì)包含選自下述的多肽序列(a)SEQ ID NO:9中所示的多肽序列；和(b)SEQID NO: 11中所示的多肽序列。
17.治療人或非人動物的方法，其包括步驟(a)選擇具有表達CASB7439的癌細胞的人或非人動物；和(b)給所述人或非人動物施用有效量的包含佐劑和蛋白質(zhì)的組合物，所述蛋白質(zhì)包含選自下述的多肽(i)SEQ ID NO:9中所示的構(gòu)建體；禾口(ii)SEQID NO: 11中所示的構(gòu)建體。
18.如權(quán)利要求7-14中定義的免疫原性組合物，其在人或非人動物中誘導針對 CASB7439的免疫應答的方法中使用，所述方法包括施用有效量的所述免疫原性組合物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的免疫原性組合物，其包括包含選自下述的多肽的蛋白質(zhì) (a) SEQ ID NO:9中所示的構(gòu)建體；和(b)SEQ ID NO: 11中所示的構(gòu)建體。
20.如權(quán)利要求7-14中定義的免疫原性組合物在制備用于在人或非人動物中誘導針對CASB7439的免疫應答的方法中使用的藥物中的應用，所述方法包括施用有效量的所述免疫原性組合物。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的應用，其中所述免疫原性組合物包含 包含選自下述的多肽的蛋白質(zhì)(i)SEQ ID NO:9中所示的構(gòu)建體；禾口(ii)SEQID N0:11中所示的構(gòu)建體。
全文摘要
本公開內(nèi)容涉及用于增加CASB7439多肽的重組生產(chǎn)的化合物和方法，和利用其的方法。
文檔編號A61K39/00GK102459324SQ201080033569
公開日2012年5月16日 申請日期2010年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月27日
發(fā)明者皮羅爾蓋 A., 里瓦 C., 哈維 M., 布萊斯 N. 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司