專利名稱：針對表達天冬酰胺酰-β-羥化酶的腫瘤的樹突細胞疫苗的制作方法
針對表達天冬酰胺酰-β -羥化酶的腫瘤的樹突細胞疫苗相關(guān)申請本申請請求以下申請的權(quán)益2009年7月M日提交的U. S. S. N 61/228,429,2009 年 8 月 4 日提交的 U. S. S. N 61/231，127,2009 年 9 月 2 日提交的 U. S. S. N 61/239，288 和 2009年9月9日提交的U. S. S. N 61/240, 745，其內(nèi)容通過引用全文納入本文。
背景技術(shù)：
肝癌包括肝細胞癌和膽管細胞性肝癌，是世界上最常見癌癥中的ー種。在美國，肝癌在男性和女性的癌癥致死中分別是第五和第九大死因。盡管對肝癌的診斷和局部控制有顯著進展，但在美國的致死率仍在持續(xù)上升。死亡率升高的原因之一可能在干，與乳腺癌和結(jié)直腸癌在內(nèi)的其他癌癥不同，肝癌耐受全身治療如化療。因此，肝癌一旦成為全身疾病便沒有有效療法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為長期以來對診斷為癌癥的患者進行化療替代治療的問題提供了解決方案。降低對象內(nèi)表達天冬氨?；?天冬酰胺酰基)-β _羥化酶(AAH或ASPH)腫瘤的生長的方法包括給予對象分離的成熟載AAH樹突細胞或細胞群體。表達AAH的腫瘤的生長在給予此類樹突細胞疫苗后有降低。例如，腫瘤生長與腫瘤負荷降低10^,20^,50^,75%, 2倍、5倍、10倍或更多。所述方法用于降低和消除哺乳動物對象如人患者中表達AAH的腫瘤。所述組合物和方法也適用于伴侶動物和牲畜，如人、犬、貓、馬、?；蜇i對象。表達AAH的腫瘤包括大多數(shù)腫瘤類型，例如胃腸組織(如食道、胃、結(jié)腸)、胰腺、 肝(如膽管細胞性肝癌、肝細胞癌)、乳腺、前列腺、子宮頸、卵巣、輸卵管、喉、肺、甲狀腺、膽囊、腎、膀胱和腦(如成膠質(zhì)細胞瘤)的腫瘤以及下文描述的大量其他腫瘤。表達AAH的腫瘤包括相比正常組織表達且提高AAH水平的原發(fā)性腫瘤，以及通過所述過量表達AAH的原發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移所產(chǎn)生的腫瘤。所述免疫方法中所用的樹突細胞優(yōu)選在給予對象前用含GM-CSF和IFN- γ的細胞因子的組合離體激活。后一步驟導致樹突細胞群體的抗腫瘤活性改善。產(chǎn)生致敏樹突細胞的改進方法通過使分離的樹突細胞接觸抗原如AAH或腫瘤抗原的組合如AAH和甲胎蛋白(AFP)并處理細胞以得到成熟并活化的抗原呈遞細胞群進行。 抗原接觸步驟之后，樹突細胞與細胞因子組合接觸。例如，所述組合包括GM-CSF和IFN-γ。 在其他示例中，組合還包括IL-4?？蛇x地，組合包括CD40L。樹突細胞與細胞因子組合接觸至少10小時(例如，12、24、36、40、48小時或更久)?？乖瓰榭扇苄问交蚪Y(jié)合于固相載體。 例如，所述固相載體包括聚苯乙烯珠如生物可降解珠或顆粒。樹突細胞通過已知方法如白血球單采術(shù)或細胞分離法獲自對象。獲取細胞的對象患有癌癥或有發(fā)生癌癥的風險。例如，所述患者已診斷有腫瘤如表達AAH的腫瘤。有發(fā)生癌癥如載AAH腫瘤風險的患者包括已鑒定為有此類癌癥病患個體的家族史的對象。本發(fā)明還包括含有如上所述產(chǎn)生的致敏樹突細胞的疫苗組合物。所述疫苗有助于抑制腫瘤生長、預防腫瘤生長和抑制或減少轉(zhuǎn)移。抑制哺乳動物中腫瘤生長的方法通過下述步驟進行鑒定患有載AAH腫瘤的對象，并給予所述對象自體樹突細胞，所述細胞已經(jīng)按上述方法致敏。預防哺乳動物中腫瘤發(fā)生的方法包括以下步驟鑒定有發(fā)生載AAH腫瘤風險的對象(例如，有癌癥家族史的對象)，并給予所述對象經(jīng)抗原致敏并活化的自體樹突細胞。預防載AAH腫瘤轉(zhuǎn)移的方法通過鑒定患有載AAH腫瘤的對象，并給予所述對象如上所述的自體樹突細胞進行。本發(fā)明的多肽和其他組合物為純化的。例如，其中基本純的AAH多肽變體優(yōu)選通過表達編碼該多肽的重組核酸或通過化學合成所述蛋白來獲得。當多肽或蛋白與在天然狀態(tài)下與其共存的污染物(蛋白質(zhì)或其他天然產(chǎn)生的有機分子)分離時為基本純。通常，當多肽在制品的蛋白中至少占60重量％吋，所述多肽為基本純的。制品中的蛋白質(zhì)優(yōu)選以重量計至少75%，更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少99%為AAH。純度通過任何適當方法如柱層折、聚丙烯酰胺凝膠電泳或HPLC分析測定。因此，基本純的多肽包括衍生自真核細胞但在大腸桿菌或其他原核細胞內(nèi)或在不同于所述多肽原始來源的真核細胞內(nèi)生產(chǎn)的重組多肽。用于所述方法的樹突細胞或其他細胞，例如免疫細胞如巨噬細胞、B細胞、T細胞為純化或分離的。就細胞而言，術(shù)語"分離的"指細胞基本不含在天然條件下與其共存的其他細胞類型或細胞材料。例如，特定組織類型或表型的細胞樣品占細胞群體至少60%時為〃基本純的"。制品中優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少99%或100%為所述細胞群體。純度通過任何適當?shù)臉藴史椒y定，例如，通過熒光活化的細胞分選(FACS)。產(chǎn)生經(jīng)抗原致敏DC的方法相比此前的方法有多種優(yōu)勢。細胞不但加載抗原，還經(jīng)過后續(xù)的細胞因子孵育產(chǎn)生優(yōu)異的已活化的經(jīng)抗原致敏的抗原呈遞細胞，具有改善的抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移活性。在閱讀下列附圖、具體描述和權(quán)利要求書后將更充分理解本發(fā)明的這些和其他能力以及本發(fā)明本身。本文引用的所有文獻通過引用納入本文。附圖簡要說明

圖1的柱狀圖顯示分離DC的IL-12生產(chǎn)。圖2顯示分離DC上表達多種表面DC標記物的系列線圖。圖3的柱狀圖顯示表面DC標記物的平均熒光。圖4顯示細胞因子存在下生長的CD8+ DC群體増加的系列流式細胞分選圖和柱狀圖。圖5的柱狀圖顯示IFN- γ分泌。圖6的柱狀圖顯示IL-4分泌。圖7是顯示細胞毒性試驗結(jié)果的線圖。圖8為細胞表達AAH的示意圖。圖9為加載成熟抗原的DC的產(chǎn)生方法的示意圖。圖10為用AAH加載DC進行免疫的方案流程圖。圖11顯示AAH免疫對小鼠中腫瘤生長的治療效果的確定方法的示意圖。圖12顯示AAH免疫對小鼠中腫瘤生長的治療效果的線圖。
具體實施方式
AAH為蛋白質(zhì)，其表達與多種腫瘤類型相關(guān)(參見如USPN 6,815,415 ；USPN 6，812，206 ；USPN 6，797，696 ；USPN 6，783，758 ；USPN 6，835，370 和 USPN 7，094，556)。HAAH 過量表達已通過免疫組化染色(IHC)在多種肺癌(例如，腺癌、細支氣管肺泡癌和其他非小細胞肺癌如鱗狀細胞癌亞型(Luu等，2009，Hum. Pathol. 40 :639-644)，肝癌(如肝細胞癌和膽管癌和膽上皮細胞癌(Wang等，2010，Hepatology 52 :164-173)，胃腸組織(如結(jié)腸、 胃、食道)癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巣癌、膽管癌、乳腺癌、腎癌、膀胱癌和腦癌(如成膠質(zhì)細胞瘤和神經(jīng)母細胞瘤)中測得。腫瘤組織樣品和細胞系的另ー調(diào)查證實在以下其他癌癥中(與非癌組織相比)的AAH表達喉癌、宮頸癌、輸卵管癌、肝癌(如膽管癌)、腎癌、 乳腺癌、宮頸癌、卵巣癌、輸卵管癌、喉癌、肺癌、甲狀腺癌、胰腺癌、胸腺癌、前列腺癌、膀胱癌、食道癌、胃癌、膽囊癌、結(jié)腸癌和直腸癌(Song等，2010，Chinese J. of Cell, and Mol. Immunol. 26 :141-144)。HAAH為癌癥高度特異性，其已通過免疫組織化學在> 99%的測試腫瘤樣品(η > 1000)中測得，而在相鄰的未受侵襲組織或在正常個體的組織樣品中沒有。將使用經(jīng)AAH致敏的細胞的免疫治療給予患在細胞表面表達AAH的腫瘤患者。這類腫瘤包括肝癌如肝細胞癌和膽管癌以及乳腺和結(jié)腸的腺癌。這類治療策略不但可用于治療癌癥，也可用于預防癌癥。在本發(fā)明以前，盡管肝癌的診斷和局部控制有所發(fā)展，但尚無有效的全身治療法。 免疫治療因其特異性而用于治療全身和局部肝癌。發(fā)現(xiàn)使用AAH的樹突細胞疫苗治愈有免疫力小鼠內(nèi)已建立的肝細胞癌。AAH樹突細胞疫苗降低表達AAH的腫瘤的生長以降低腫瘤負荷井根除人體內(nèi)腫瘤。免疫治療惡性腫瘤的免疫治療在對腫瘤細胞的特異性響應方面引人關(guān)注。免疫治療的ー個原理是癌細胞充滿潛在抗原，當由抗原呈遞細胞呈遞給輔助與細胞毒性T細胞時這些抗原成為免疫原性。不論是否為全身性，肝癌的免疫治療是可行的臨床方法，因為肝癌細胞表達多種腫瘤相關(guān)蛋白，這些蛋白在正常組織內(nèi)不表達或僅少量表達。例如，在成人組織內(nèi)不表達的AFP在肝細胞癌(HCC)中廣泛表達。多項研究顯示AFP特異性免疫反應不單可在小鼠內(nèi)誘發(fā)還可在人體內(nèi)誘發(fā)。但是，靶向AFP的HCC免疫治療臨床試驗未顯示哪怕是部分的腫瘤應答。ー些可能的理由有因為AFP不參與癌的進展，不表達AFP的癌細胞在APP-靶向的免疫治療中占優(yōu)勢。為使HCC細胞被AFP響應T細胞識別，AFP應與I型主要組織相容性復合抗體(MHC)分子一起呈遞于細胞表面，因為AFP不分布在細胞表面。但是，由于I型 MHC分子通常在很多癌細胞中被下調(diào)，AFP可能不被T細胞恰當?shù)刈R別。為克服肝癌免疫治療的問題，進行研究以鑒定與肝癌相關(guān)的另一抗原以用來致敏細胞供基于細胞的治療?？紤]到用AFP作為抗原的結(jié)果，AAH的抗腫瘤結(jié)果出乎意料。AAH也稱為ASPH，在肝細胞癌和膽管細胞癌中強烈表達，但在這些組織類型的正常細胞對應體中不表達。因此，AAH是腫瘤相關(guān)蛋白。因其獨特性質(zhì)，AAH可用于肝癌的免疫治療。首先，AAH賦予癌細胞移動性，該移動性與癌轉(zhuǎn)移相關(guān)；因此，靶向表達AAH的細胞的治療能有效抑制轉(zhuǎn)移灶以及原發(fā)腫瘤。其次，由于AAH是膜蛋白，其大部分暴露于胞外空間，易于免疫細胞接觸所述蛋白，即使I型分子被下調(diào)。再次，除AAH以外，尚未知膽管細胞癌特異性的抗原蛋白。因此，AAH可獨特地作為針對肝癌的免疫治療的靶分子。免疫治療方法包括注射載有感興趣蛋白的樹突細胞(DC)。DC是捕獲、處理和呈遞抗原給T細胞以誘導和控制T細胞介導免疫的專門細胞。DC廣泛用于免疫，不單用于實驗動物也用于荷瘤患者。本文所述方法包括基于DC免疫接種以誘發(fā)針對AAH的免疫。本方法比此前所述產(chǎn)生載有感興趣蛋白的免疫原性小鼠DC的方法(Gehring等，2008，J. Immunol. Meth. 332:18-30)至少在兩方面有所改善。其ー為刺激DC吋，此前采用脂多糖(LPQ，這種強熱原可能不適于體內(nèi)使用。其ニ為根據(jù)DC的IL-12分泌和不同表面DC標記物的表達來判斷，DC刺激較弱。因此，對產(chǎn)生免疫原性DC的方法有所改進。樹突細胞疫苗最有前景的HCC免疫治療方法是利用DC的方法，因為DC具有誘導T細胞介導腫瘤免疫的強大能力。DC源自造血細胞，并專用于捕獲并處理抗原，將蛋白轉(zhuǎn)化成肽呈遞在 MHC分子上并由T細胞識別。DC強效誘導并控制T細胞免疫?；贒C的免疫治療是根據(jù)腫瘤充滿潛在抗原且這些抗原由DC呈遞時成為免疫原性這一事實。DC獲自對象，例如通過細胞分離法。這些細胞此時為離體，載有(即，接觸過) 腫瘤抗原(例如，腫瘤細胞裂解物；凋亡或壞死的腫瘤細胞；重組、合成或純化的腫瘤抗原肽或蛋白；或編碼腫瘤抗原的核酸如RNA)，經(jīng)刺激以成熟，并重注射入患者以誘導強T細胞免疫。AAH腫瘤抗原AAH是II型膜蛋白，在C-末端區(qū)域具有催化域。該蛋白大部分位于細胞膜外，使免疫細胞能接觸此蛋白。AAH蛋白在HCC、膽管癌和乳腺或結(jié)腸源的腺癌中強烈表達，而在正常組織對應體中很少測得或完全不可檢測。因此，AAH是HCC和其他荷AAH腫瘤的基于 DC的免疫治療的理想靶標分子。AAH在腫瘤細胞中的過量表達提高細胞移動性，該移動性使腫瘤細胞具有惡性表型。對HCC的臨床病理學研究發(fā)現(xiàn)AAH過量表達與組織學評級和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移有關(guān)。因此，靶向表達AAH的腫瘤細胞群體抑制載AAH腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。表1 人AAH的氨基酸序列
MAQRKNAKSSGNSSSSGSGSGSTSAGSSSPGARRETKHGGHKNGRKGGLSGTSFFTWFMV61エALLGVWTSVAWWFDLVDYEEVLGKLGIYDADGDGDFDVDDAKVLLGLKERSTSEPAVP121PEEAEPHTEPEEQVPVEAEPQNIEDEAKEQIQSLLHEMVHAEHVEGEDLQQEDGPTGEPQ181QEDDEFLMATDVDDRFETLEPEVSHEETEHSYHVEETVSQDCNQDMEEMMSEQENPDSSE241PWEDERLHHDTDDVTYQVYEEQAVYEPLENEGIEITEVTAPPEDNPVEDSQVIVEEVSエ301FPVEEQQEVPPETNRKTDDPEQKAKVKKKKPKLLNKFDKTIKAELDAAEKLRKRGKエEEA361VNAFKELVRKYPQSPRARYGKAQCEDDLAEKRRSNEVLRGAIETYQEVASLPDVPADLLK421LSLKRRSDRQQFLGHMRGSLLTLQRLVQLFPNDTSLKNDLGVGYLLIGDNDNAKKVYEEV481
LSVTPNDGFAKVHYGFILKAQNKIAESIPYLKEGIESGDPGTDDGRFYFHLGDAMQRVGN541KEAYKWYELGHKRGHFASVWQRSLYNVNGLKAQP麗TPKETGYTELVKSLERNWKLIRDE601GLAVMDKAKGLFLPEDENLREKGDWSQFTLWQQGRRNENACKGAPKTCTLLEKFPETTGC661RRGQIKYSIMHPGTHVWPHTGPTNCRLRMHLGLVIPKEGCKIRCANETRTWEEGKVLIFD721
DSFEHEVWQD ASSFRLIFIV DVWHPELTPQ QRRSLPAI (SEQ ID NO: 1; GENBANK 登錄號S83325 ；His基序帶下劃線；催化域內(nèi)的保守序列由粗體標出；催化域包含SEQ
ID NO 1 的 650-700 殘基)。表2 人 AAH cDNA 序列
cggaccgtgc aatggcccag cqtaagaatq ccaaaaqcaq cgacaacagc agcagcagca 61
gctccggcagcggtagcacgagtgcgggcagcagcagccccggggcccggagagagacaa121agcatggaggacacaagaatggg^ggaaaggcggactctcgggaacttcattcttcacgt181ggtttatggtgattgcattgctgggcgtctggacatctgtagctqtcgtttggtttgatc241ttgttaactatgaggaagttctaggaaaactaggaatctatgatgctgatggtgatggag301attttaatgtggatgatgccaaagttttattaggacttaaagagagatctacttcagagc361cagcaqtcccgccagaagaggctgagccacacactgagcccgaggagcaggttcctgtgg421SLggcaqaaccccagaatatcgaagatgaagcaaaagaacaaattcagtcccttctccatg481aaatgatacacgcagaacatgttgagggagaagacttgcaacaagaagatggacccacag541cragaaccacaacaaqaggatgatgagtttcttatggcgactgatgtagatgatagatttg601aaaccctqgaacctgaagtatctcatgaagaaaccgagcatagttaccacgtggaagaga661cagtttcacaagactgtaatcaggatatggaagagatgatgtctgagcagqaaaatccag721attccagtgaaccagtagtaqaagatgaaagattgcaccatgatacagatgatgtaacat781accaaqtctatgaggaacaagcagtatatgaacctctagaaaatgaagggatagaaatca841cagaagtaactgctccccctgaggataatcctgtagaagattcacaggtaattgtagaag901aaqtaaqcatttttcctgtggaagaacagcaggaagtaccaccaqaaacaaataqaaaaa961
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acctgctgaa gctgagtttg aagcgtcgct cagacaggca acaatttcta ggtcatataa 1321 gaggttccct gcttaccctg cagagattag ttcaactatt tcccaatgat acttccttaa 1381 aaaatgacct tggccrtggga tacctcttga taggagataa tgacaatgca aagaaagttt 1441 atgaagaggt gctgagtgtg acacctaatg atggctttgc taaaqtccat tatgacttca 1501 tcctgaaggc acagaacaaa attactaaga qcatcccata tttaaaggaa agaatagaat 1561 ccggaaatcc tggcactgat gatgggagat tttatttcca cctgggqgat gccatqcaga 1621 gggttgggaa caaagaggca tataagtggt atgagcttgg gcacaagaqa ggacactttg 1681 catctgtctg gcaacgctca ctctacaatg tgaatggact gaaagcacag ccttggtgga 1741 ccccaaaaga aacgcrqctac acagagttag taaagtcttt agaaaqaaac tggaagttaa 1801 tccgagatga aggccttgca gtgatggata aagccaaagg tctcttcctg cctgaggatg 1861 aaaacctgag ggaaaaaggg gactggagcc agttcacgct gtggcagcaa ggaagaagaa 1921 atgaaaatgc ctgcaaagga gctcctaaaa cctgtacctt actagaaaag ttccccgaga 1981 caacaggatg cagaagagga cagatcaaat attccatcat gcaccccggg actcacgtgt 2041 ggccqcacac agggcccaca aactgcaggc tccgaatgca cctgggcttg gtgattccca 2101 aggaaggctg caagattcga tgtgccaacg agaccaggac ctgggaggaa ggcaaggtgc 2161 tcatctttqa tqactccttt gagcacgagg tatggcagga tgcctcatct ttccggctga 2221 tattcatcgt ggatgtgtgg catccggaac tgacaccaca gcagagacgc agccttccag 2281
caatttagca tgaattcatg caagcttggg aaactctgga gaga(SEQ ID NO :2 ；GENBANK登錄號S83325 ；編碼起始甲硫氨酸的密碼子帶下劃線)。臨床應用抗原呈遞細胞(APC)如DC采用白血球單采術(shù)取自對象，如患有癌癥或有發(fā)生癌癥風險的人患者。此類過程通常在單采血液成分中心進行(第1天)。用已知方法純化的樹突細胞接觸抗原如AAH或AAH以及AFP。抗原接觸后，細胞在細胞因子混合物中培養(yǎng)(第 2-3天)。然后將經(jīng)抗原致敏并激活的DC給予患者(第3-4天)。治療的示范性過程包括在4周時間內(nèi)給予3次DC。用下列材料和方法產(chǎn)生本文所述數(shù)據(jù)。動物7-8 周齡的雌性 BALB/c(H_2d)小鼠購自 HSD 有限公司(Harlan Sprague Dawley, Inc.)，并保持在無特定病原條件下。制備磁性微珠免疫磁珠(1. 3 μ m ；卡巴開公司(Calbiochem))用50mM，pH 8. 5的硼酸鹽緩沖液清洗3遍，并重懸于pH 9. 0，含0. lmg/ml AAH或GFP蛋白的50mM硼酸鹽緩沖液中。然后， 懸液在不斷攪拌條件下室溫孵育過夜。離心珠粒，用PBS清洗并以固體含量30mg/ml的濃度重懸于PBS。DC 分離
DC 分離米用已知方法進行(例如(Gehring 等，2008，J. Immunol. Meth. 332 18-30))。可選由白血球單采術(shù)獲得細胞。在第0天和第6天將IOyg編碼Fms-樣酪氨酸激酶受體-3配體(FLT3L)的表達質(zhì)粒pUMVC3-hFLex注入小鼠尾靜脈。脾細胞由注射了 FLT3L的小鼠用NH4Cl紅細胞裂解緩沖液制備，5x IO7個細胞在含10 μ 1磁性微珠的無血清 DMEM中孵育4-6小吋。收集細胞，用MACS MS柱(美天旎公司(Miltenyi))通過磁場以富集攝取磁珠的細胞。然后，采用Lympholyte M(塞得蘭公司(Cedarlane))對細胞進行密度梯度離心以消除游離珠和死細胞。收集活細胞，用漢克斯(Hank' s)緩沖鹽溶液(HBSS)清洗2次，并用于后續(xù)實驗。分離細胞的活力>90%，且分離細胞中CDllc陽性群體的百分數(shù)為 70-80% ο細胞培養(yǎng)DC在HEPES緩沖的補充有10%小鼠血清(艾奎泰克生物公司(Equitech Bio))、 2mM L-谷氨酰胺、50 μ M 2-巰基乙醇、100U/ml青霉素、100 μ g/ml鏈霉素、20ng/ml GM-CSFU00ng/ml IL_4、20ng/ml IFN-γ 和 1 μ g/ml CD40L(所有細胞因子購自派普羅泰克公司(Peprotech))的RPMI1640中，在6孔超低貼附平板(康寧公司(Corning))上培養(yǎng)40 小吋。就細胞因子釋放而言，脾細胞生長于含2mM L-谷氨酰胺、50nM 2-巰基乙醇、100U/ ml青霉素和100 μ g/ml鏈霉素的無血清X-VIVO 15 (龍沙公司(Lonza))中。就細胞毒性試驗而言，脾細胞生長于HEPES緩沖的補充有10%胎牛血清(大西洋生物公司(Atlantic Bio))、2mM L-谷氨酰胺、50 μ M 2-巰基乙醇、100U/ml青霉素100 μ g/ml鏈霉素、Ix非必需氨基酸(龍沙公司)、0. 5x氨基酸溶液(英杰公司(Invitrogen)和ImM丙酮酸鈉的完全 RPMI1640中。SP2/0細胞培養(yǎng)于補充有20%胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和 100 μ g/ml鏈霉素的Dulbecco極限必需培養(yǎng)基中。酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)DC或脾細胞在含或不含AAH蛋白的無血清培養(yǎng)基中生長48小吋。然后收集細胞上清液，離心并進行ELISA實驗。IL-12、p70、IFN-γ和IL-4的ELISA采用ELISA Ready-SET-Go ！試劑盒(易生物科學公司(eBioscience))按照生產(chǎn)商說明書進行。流式細胞分析通過流式細胞術(shù)按此前所述(Gehring等，2008)分析細胞表面標記物的表達。用 3-6x IO5個細胞來染色。細胞用染色緩沖液(含5% FBS的HBSS)清洗，與2. 5 μ g/ml小鼠BD Fc Block(BD生物科學公司(BD Biosciences)) 一起4°C孵育5分鐘，再與染色抗體一起在4°C孵育30分鐘。所用抗體為抗-⑶llc(HL3 ；BD生物科學公司)、抗-⑶40 (3/23 ； BD生物科學公司)、抗-CM4(3E2 ；BD生物科學公司)、抗-CD80 (16-10A1 ；BD生物科學公司)、抗-⑶86 (GLI ；BD生物科學公司)、抗-I-Ad(AMS-32. 1 ；BD生物科學公司)和抗-CDSa (53-6. 7;易生物科學公司)，所有抗體均與熒光團偶聯(lián)。倉鼠、大鼠和小鼠免疫球蛋白G同種型匹配對照也用于染色對照。清洗2遍后，細胞重懸于染色緩沖液，并用 FACSCalibur (BD生物科學公司)進行流式細胞分析。通過用7-氨基-放線菌素D (易生物科學公司)的細胞染色將死細胞從分析中除去。用CellQuest軟件(BD生物科學公司)然后用FlowJo軟件(三星公司(Tree Star))處理數(shù)據(jù)。疫苗接種與細胞因子培養(yǎng)40小時后，在第0天和第14天將2. 5x IO5細胞皮下注射入右脅和左脅(每只小鼠5x IO5個細胞)。在第觀天，經(jīng)免疫的小鼠用于進一歩的實驗，包括細胞因子釋放和細胞毒性試驗。細胞毒件試騎從經(jīng)免疫小鼠制得脾細胞，將5x IO7個脾細胞在含0. 5 μ g/ml AAH蛋白的完全培養(yǎng)基中生長2天，并在添加lOng/ml IL-2后再生長2天。2x IO4個靶SP2/0細胞與6_60x IO4個效應脾細胞在無血清培養(yǎng)基中混合，200x g離心5分鐘，并在(X)2培養(yǎng)箱中孵育4小吋。收集培養(yǎng)上清液，上清液中釋放的乳酸脫氫酶活性通過按生產(chǎn)商的說明書使用LDH細胞毒性檢測試劑盒(羅氏公司(Roche))測定。用以下公式計算％靶細胞裂解((幾效應細胞+ IE細胞效應細胞_Λ Ε細胞)I^iii1 (Α 細胞+曲通)("Ae細胞))χ 100，其中A表示490nm的吸光度。由經(jīng)不同細胞因子體外刺激的分離DC分泌的IL-12此前所用的方法包括DC的體內(nèi)擴增，磁性微珠的攝取，所述微珠上涂覆有抗原和 DC刺激物包括LPS和抗-⑶40抗體，并由通過磁性柱來分離DC。不同于用涂覆于珠粒上的刺激物刺激DC，本改進方法涉及通過在多種細胞因子存在下生長兩天來刺激分離的DC，由于刺激物應與細胞表面的相應受體相互作用，而被DC攝取的珠粒上的刺激物不能有此相互作用。包括IL-4、IFN-y和⑶40L的一些細胞因子刺激并促進DC成熟。因此，檢查這些細胞因子對DC成熟的組合效應。進行DC的擴增、攝取和分離。分離的細胞在GM-CSF，和/ 或IL-4，和/或IFN- Y，和/或CD40L的存在下培養(yǎng)40小時。始終添加GM-CSF,因其為DC 存活所必需。成熟而非未成熟的DC強烈生產(chǎn)輔助與細胞毒性T細胞極化必需的IL-12。因此，IL-12水平用作DC刺激的指示劑。收集培養(yǎng)的上清液，通過ELISA測定IL_12p70的濃度。結(jié)果表明當DC培養(yǎng)中存在所有細胞因子時IL-12p70最高(圖1)。各細胞因子単獨或組合用于刺激。優(yōu)選用所有細胞因子刺激DC。但是，CD40L是可選的。成熟DC標記物在經(jīng)刺激DC表面的表達為研究細胞因子刺激對成熟DC標記物表達的影響，測定細胞因子存在下生長40 小時的DC與無培養(yǎng)DC的標記物表達。泛DC標記物⑶Ilc的表達在培養(yǎng)后未改變(圖2、 3)。但是，包括⑶40、CD54, CD80、CD86和II型MHC(I-Ad)在內(nèi)的所有成熟DC標記物在生長40小時的DC中都顯著上調(diào)(圖2、3)。⑶8a+ DC為能有效刺激CTL的DC子集。評估了細胞因子刺激對CDSa+DC群體的影響。如圖4所述，DC中CDSa+群體的百分數(shù)在刺激期間顯著上升。這些結(jié)果表明該方法不用LPS所產(chǎn)生的細胞具有基于DC免疫所需的充分品質(zhì)。AAH免疫小鼠的脾細胞響應AAH的IFN- γ分泌為檢查ThI應答是否被AAH免疫誘發(fā)，測定響應AAH蛋白的ThI細胞因子IFN-γ的生產(chǎn)。小鼠以2周間隔用DC免疫兩次，所用DC攝取了 AAH或GFP-涂覆珠?；驘o任何抗原的珠粒。后一次免疫2周后，從免疫小鼠制備脾細胞，在AAH存在下培養(yǎng)48小吋，并測定培養(yǎng)上清液中IFN-Y的濃度以檢查經(jīng)AAH免疫小鼠的脾細胞是否響應AAH刺激生產(chǎn)IFN-γ。 經(jīng)AAH免疫小鼠的脾細胞以劑量依賴性方式強烈生產(chǎn)IFN-Y (圖幻。盡管在伴刀豆球蛋白 A (Con Α)存在下，來自三組的脾細胞生產(chǎn)了可觀量的IFN-γ，但對照脾細胞在AAH刺激時僅生產(chǎn)微量IFN- Y (圖5)。這ー結(jié)果表明對在免疫小鼠中產(chǎn)生對AAH的ThI細胞響應。AAH免疫小鼠的脾細胞響應AAH的IL_4分泌為研究AAH負荷DC是否誘發(fā)針對AAH的體液免疫，測定在IFN- γ測定的相同樣品中Th2細胞因子IL-4的濃度。不論免疫與否，Con A刺激的脾細胞都產(chǎn)生大量IL_4(圖 6)。相反，用三種DC免疫的小鼠制得的脾細胞僅生產(chǎn)痕量IL-4(圖6)，表明針對AAH的TH2 細胞響應未被AAH免疫有效誘發(fā)。經(jīng)AAH免疫小鼠中針對AAH表汰細胞的CTL活件為確定在AAH免疫小鼠中是否誘發(fā)響應AAH的CTL，通過用表達AAH的SP2/0細胞為靶細胞評估細胞毒性。SP2/0細胞與AAH蛋白和IL-2活化后的來自免疫小鼠的脾細胞共培養(yǎng)4小吋。通過測定瀕死細胞釋放的乳酸脫氫酶活性評估靶細胞裂解效率。如圖7所述，經(jīng)AAH免疫小鼠的脾細胞的CTL活性高于其他對照脾細胞，表明AAH免疫誘發(fā)AAH響應性 CTL。經(jīng)AAH免疫小鼠中的AAH響應件T細胞當小鼠用載AAH的DC免疫吋，誘發(fā)AAH響應性ThI細胞和CTL?？乖禺愋訲細胞擴增是表明產(chǎn)生抗原響應性T細胞的另一重要指標。AAH體內(nèi)免疫的抗腫瘤效應用AAH致敏DC進行AAH免疫誘發(fā)抗腫瘤免疫。小鼠用載AAH的DC以2周間隔免疫兩次，后一次免疫2周后，SP2/0細胞植入皮下，測定植入腫瘤尺寸的生長。這一荷瘤模型所得數(shù)據(jù)反映免疫接種的預防效果。為評估AAH免疫的治療效果，SP2/0先行植入，然后當腫瘤生長至直徑5mm吋，用載AAH的DC免疫小鼠，并測定對腫瘤生長的效果。AAH靶向的免疫治療還抑制轉(zhuǎn)移。小鼠用載AAH的DC免疫，然后注射SP2/0細胞入尾靜脈。兩周后，切除肺，對形成的結(jié)節(jié)計數(shù)。免疫小鼠內(nèi)結(jié)節(jié)數(shù)量相對未免疫小鼠中數(shù)量的減少表明載AAH的DC免疫方案抑制荷AAH腫瘤的轉(zhuǎn)移。用載AAH的成熟樹突細胞免疫接種顯著降低表達AAH腫瘤的腫瘤負荷(腫瘤體積)。圖11和12顯示小鼠中AAH免疫接種對腫瘤生長的治療效果。5X IO5個BNL IME A. 7R. 1小鼠肝癌細胞皮下植入6周齡BALB/c小鼠脅部。在第10天和第15天，將5 X IO5個載有AAH或GFP的成熟DC或HBSS皮下注射入荷瘤小鼠。腫瘤尺寸每周測定。用如下公式確定腫瘤體積0. 52X (長)X (寬)2。各數(shù)據(jù)點代表平均腫瘤體積士標準誤差(n = 6)。 發(fā)現(xiàn)腫瘤體積在用載AAH的DC免疫后顯著減小。使用本領域已知腫瘤模型的這些數(shù)據(jù)表明用載AAH成熟DC的治療方法能在體內(nèi)有效減少和消除載有AAH的腫瘤。此類樹突細胞疫苗顯示針對任何表達AAH的腫瘤的有效抗腫瘤效果。通過AAH和AFP同時免疫增強抗腫瘤效果AFP是對小鼠和人為免疫原性的僅有的HCC相關(guān)蛋白。但是，也已顯示其抗腫瘤效果不足以用于人HCC患者。但是，用AAH和AFP同時免疫增強對同時表達AAH和AFP的腫瘤如HCC的免疫應答。表達AFP的SP2/0細胞的穩(wěn)定系通過導入AFP表達質(zhì)粒DNA產(chǎn)生。通過使用所述細胞，測定在經(jīng)載AFP和載AAH的DC免疫小鼠中的體外CTL活性。免疫后的細胞毒性增強表明免疫引起AAH和AFP聯(lián)合免疫對荷有AAH和/或AFP的腫瘤生長的抗腫瘤效果。
權(quán)利要求
1.一種降低對象內(nèi)表達天冬氨?；?天冬酰胺酰基)-β-羥化酶(AAH)腫瘤的生長的方法，包括給予所述對象分離的載AAH的成熟樹突細胞，其中所述表達AAH的腫瘤的生長在給予所述樹突細胞后降低。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在干，所述腫瘤選自下組肝癌、胃腸癌、胰腺癌、 乳腺癌、前列腺癌、宮頸癌、卵巣癌、輸卵管癌、喉癌、肺癌、甲狀腺癌、膽囊癌、腎癌、膀胱癌和腦癌。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在干，在向所述對象進行所述給予前，所述樹突細胞用含GM-CSF和IFN- γ的細胞因子組合離體激活。
4.一種產(chǎn)生致敏樹突細胞的方法，其包括使分離的樹突細胞接觸抗原，在所述抗原接觸步驟后，使所述樹突細胞接觸細胞因子的組合，所述組合包含GM-CSF和IFN- γ。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在干，所述組合還包括IL-4。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在干，所述組合還包括CD40L。
7.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在干，所述樹突細胞與所述細胞因子組合接觸至少10小時。
8.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在干，所述樹突細胞與所述細胞因子組合接觸至少40小時。
9.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在干，所述抗原包括ΑΑΗ。
10.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在干，所述抗原包括AAH和AFP。
11.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在干，所述抗原是可溶形式。
12.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在干，所述抗原連接于固相載體。
13.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在干，所述固相載體包括聚苯乙烯珠。
14.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在干，所述固相載體為生物可降解的。
15.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在干，所述樹突細胞通過白血球單采術(shù)從對象獲得。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在干，所述對象患有癌癥或有發(fā)生癌癥的風險。
17.一種疫苗組合物，其包含由權(quán)利要求4的方法產(chǎn)生的致敏樹突細胞。
18.一種含載AAH的成熟樹突細胞的疫苗，其用于治療哺乳動物對象中表達AAH的腫瘤。
19.ー種抑制哺乳動物中腫瘤生長的方法，其包括鑒定患有載AAH腫瘤的對象，并給予所述對象自體樹突細胞，其中所述自體樹突細胞按權(quán)利要求4所述方法致敏。
20.一種預防哺乳動物中腫瘤發(fā)生的方法，其包括鑒定有發(fā)生載AAH腫瘤風險的對象， 并給予所述對象自體樹突細胞，其中所述自體樹突細胞按權(quán)利要求3所述方法致敏。
21.ー種預防載AAH腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，其包括鑒定患有載AAH腫瘤的對象，并給予所述對象自體樹突細胞，其中所述自體樹突細胞按權(quán)利要求4所述方法致敏。
22.如權(quán)利要求1、15、16、18、19、20或21所述的方法，其特征在干，所述對象是人、犬、 貓、馬、?；蜇i對象。
全文摘要
一種含載AAH的成熟樹突細胞的疫苗用于治療哺乳動物對象中表達AAH的腫瘤。一種生產(chǎn)致敏樹突細胞的方法，通過使分離的樹突細胞接觸抗原如AAH來進行?？乖佑|步驟之后，樹突細胞與細胞因子組合如GM-CSF和IFN-γ接觸。
文檔編號A61K39/00GK102596234SQ201080033781
公開日2012年7月18日 申請日期2010年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月24日
發(fā)明者J·R·萬德斯, 下田雅史 申請人:羅得島醫(yī)院