專(zhuān)利名稱(chēng)：人源化抗淀粉樣-b寡聚體抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及特異性地與淀粉樣(以下也稱(chēng)為Αβ)蛋白寡聚體結(jié)合的抗體及其用途。
背景技術(shù)：
基于多項(xiàng)證據(jù)，認(rèn)為阿爾茨海默病(以下稱(chēng)為AD)中記憶衰退是由于淀粉樣-β蛋白的可溶性寡聚體(以下，淀粉樣-β蛋白也稱(chēng)為Αβ，并且淀粉樣-β蛋白寡聚體也稱(chēng)為Αβ寡聚體)所引起的突觸功能障礙(非專(zhuān)利文獻(xiàn)1和2)。因此，有可能Αβ寡聚體在腦部的過(guò)度積累或沉積引發(fā)可能導(dǎo)致AD的一系列病理級(jí)聯(lián)反應(yīng)。這表明有可能靶向Αβ寡聚體的醫(yī)學(xué)治療可以有效地延緩或預(yù)防AD疾病階段的發(fā)作和進(jìn)展。但是，有關(guān)由作為造成該淀粉樣-級(jí)聯(lián)假說(shuō)的核心因素的分子、特別是Αβ寡聚體所導(dǎo)致的神經(jīng)退行性病變的知識(shí)主要在體外實(shí)驗(yàn)中被證明(非專(zhuān)利文獻(xiàn)幻，而在體內(nèi)沒(méi)有被直接證明。由于在以前已經(jīng)報(bào)道的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有研究Αβ寡聚體的特異性結(jié)構(gòu)(非專(zhuān)利文獻(xiàn)4)，所以尚未闡明由內(nèi)源性A β寡聚體所導(dǎo)致的突觸毒性。另外，雖然已經(jīng)對(duì)多種AD模型小鼠進(jìn)行了研究，但是尚未揭示A β寡聚體在AD患者腦部的神經(jīng)毒性。此外，尚未查明為什么神經(jīng)原纖維纏結(jié)(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為NFT)的形成和神經(jīng)細(xì)胞的損失在人類(lèi)內(nèi)嗅皮質(zhì)中的神經(jīng)炎性斑發(fā)病之前發(fā)生，以及Αβ寡聚體如何與這些組織變性和功能障礙相關(guān)。作為抗Αβ寡聚體的抗體，已知抗Αβ寡聚體小鼠單克隆抗體ΝΑΒ61(非專(zhuān)利文獻(xiàn)4)、1Α9, 2C3, Ε12, IClO 和 4D3 (專(zhuān)利文獻(xiàn) 1)。已知當(dāng)向人施用諸如小鼠抗體的非人抗體時(shí)，其通常被識(shí)別為外來(lái)物質(zhì)使得在人體內(nèi)誘發(fā)對(duì)小鼠抗體的人抗體(人抗小鼠抗體ΗΑΜΑ)。已知HAMA與被施用的小鼠抗體反應(yīng)從而引起副作用(非專(zhuān)利文獻(xiàn)5至8)，加速小鼠抗體從人體消失(非專(zhuān)利文獻(xiàn)6，9和10)并且降低小鼠抗體的療效(非專(zhuān)利文獻(xiàn)11和12)。為了解決這些問(wèn)題，已經(jīng)嘗試用基因重組技術(shù)從非人抗體制備重組抗體，如人嵌合抗體和人源化抗體。與諸如小鼠抗體的非人抗體相比，人嵌合抗體、人源化抗體等在對(duì)于人的臨床應(yīng)用方面具有多種優(yōu)勢(shì)。例如，已經(jīng)報(bào)道，在使用猴的實(shí)驗(yàn)中，與小鼠抗體相比，其免疫原性降低并且其血液半衰期延長(zhǎng)(非專(zhuān)利文獻(xiàn)13)。也就是說(shuō)，由于人嵌合抗體、人源化抗體等對(duì)人產(chǎn)生的副作少于非人抗體，預(yù)期其療效維持更長(zhǎng)時(shí)間。此外，由于使用重組技術(shù)制備重組抗體，如人嵌合抗體、人源化抗體和人抗體，所以可以將其制備為多種分子形式。
例如，可以將Y 1亞類(lèi)作為人抗體的重鏈(以下稱(chēng)為“H鏈”)恒定區(qū)(以下稱(chēng)為“C區(qū)”)(H鏈C區(qū)稱(chēng)為“CH”)，從而產(chǎn)生具有高效應(yīng)子功能、如抗體依賴(lài)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(以下稱(chēng)為“ADCC”活性)的重組抗體。此外，可以講Y2或Y4亞類(lèi)作為重鏈，從而產(chǎn)生效應(yīng)子功能降低，并且預(yù)期與小鼠抗體相比其血液半衰期延長(zhǎng)的重組抗體。尤其是，由于細(xì)胞毒活性、如補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒作用(以下稱(chēng)為“CDC活性”)和經(jīng)由抗體Fc區(qū)(在抗體重鏈鉸鏈區(qū)之后的區(qū)域)的ADCC活性對(duì)于療效是重要的，所以與諸如小鼠抗體的非人動(dòng)物抗體相比，優(yōu)選人嵌合抗體、人源化抗體或人抗體(非專(zhuān)利文獻(xiàn)15和 16)。此外，隨著在蛋白質(zhì)工程和基因工程方面的近期進(jìn)展，也可以將重組抗體制備為小分子量的抗體片段，如Fab、Fab，、F(ab，)2、單鏈抗體(以下稱(chēng)為“scFv”)(非專(zhuān)利文獻(xiàn)17)、二聚化V區(qū)片段(以下稱(chēng)為“雙價(jià)抗體”)(非專(zhuān)利文獻(xiàn)18)、二硫鍵穩(wěn)定的V區(qū)片段(以下稱(chēng)為“dsFv”)(非專(zhuān)利文獻(xiàn)19)和含有⑶R的肽(非專(zhuān)利文獻(xiàn)20)。這些抗體片段與整個(gè)抗體分子相比在向靶組織轉(zhuǎn)移方面具有更強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)(非專(zhuān)利文獻(xiàn)21)。上述事實(shí)表明，作為用于對(duì)人的臨床應(yīng)用的抗體，與諸如小鼠抗體的非人動(dòng)物抗體相比，更優(yōu)選人嵌合抗體、人源化抗體、人抗體或其抗體片段。引文列表專(zhuān)利文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)1 :WQ2009/051220非專(zhuān)利文獻(xiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)1 =Klein WL, Trends Neurosci 24 :219-224,2001.非專(zhuān)利文獻(xiàn)2 =Selkoe DJ, Science 298 :789-791，2002.非專(zhuān)利文獻(xiàn)3 =Hass C et al，Nature Review 8 :101-12,2007.非專(zhuān)利文獻(xiàn)4:Lee EB, et al, J. Biol. Chem. 281 :4292-4299,2006.非專(zhuān)利文獻(xiàn)5 :J. Clin. Oncol.，2，881 (1984)非專(zhuān)利文獻(xiàn)6 :Blood. 65,1349(1985)非專(zhuān)利文獻(xiàn)7 :J. Natl. Cancer Inst.，80，932 (1988)非專(zhuān)利文獻(xiàn)8 :Proc. Natl. Acad. Sci.，USA, 82，1242 (1985)非專(zhuān)利文獻(xiàn)9 J.Nucl. Med, 26,1011 (1985)非專(zhuān)利文獻(xiàn)10 :J. Natl. Cancer Inst.，80，937 (1988)非專(zhuān)利文獻(xiàn)11 J. Immunol, 135,1530(1985)非專(zhuān)利文獻(xiàn)12 =Cancer Res.，46，6489 (1986)非專(zhuān)利文獻(xiàn)13 =Cancer Res.，56，1118 (1996)非專(zhuān)利文獻(xiàn)14 Jmmunol, 85,668 (1995)非專(zhuān)利文獻(xiàn)15 J. Immunol, 144，1382(1990)非專(zhuān)利文獻(xiàn)16 =Nature, 322，323 (1988)非專(zhuān)利文獻(xiàn)17 =Science, 242,423 (1988)非專(zhuān)利文獻(xiàn)18 =Nature Biotechnol.，15，629 (1997)非專(zhuān)利文獻(xiàn)19 =Molecular Immunol.，32，249 (1995)非專(zhuān)利文獻(xiàn)20 J. Biol. Chem. ,271,2966(1996)
非專(zhuān)利文獻(xiàn)21 =Cancer Res.，52，3402 (1992)發(fā)明概述技術(shù)問(wèn)題以上非專(zhuān)利文獻(xiàn)4和專(zhuān)利文獻(xiàn)1公開(kāi)了抗A β寡聚體的抗體。但是這些抗體不僅與Αβ寡聚體結(jié)合，也與Αβ單體結(jié)合。因此存在抗體在AD的抗體治療期間的主要副作用的問(wèn)題，所述問(wèn)題靶向腦部的病變。因此，本發(fā)明的目的是提供不與A β單體結(jié)合而僅與A β寡聚體特異性結(jié)合的人源化抗體，及其用途。更具體地，其目的是提供與A β寡聚體特異性結(jié)合的抗體、使用該抗體測(cè)定A β寡聚體的方法、使用該抗體診斷AD的方法和含有該抗體的藥物。由于對(duì)以上問(wèn)題的深入研究，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了不與Αβ單體結(jié)合而僅與Αβ寡聚體特異結(jié)合的人源化抗體，并且完成了本發(fā)明。問(wèn)題的解決方案S卩，本發(fā)明涉及以下。1.人源化抗體，其不與Αβ蛋白單體結(jié)合而與Αβ寡聚體結(jié)合，并且其含有以下的(a)抗體重鏈可變區(qū)和(b)抗體輕鏈可變區(qū)(a)抗體重鏈可變區(qū)，其含有由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列或者對(duì)由SEQ IDNO 12所示的氨基酸序列進(jìn)行了以下氨基酸修飾中的至少一種修飾的氨基酸序列以Arg取代第18位的Leu，以Glu取代第46位的Gln，以Val取代第48位的Met，以Ala取代第49位的Val，以Asn取代第77位的kr，以Met取代第93位的Val，和以Gly取代第98位的 Arg,(b)抗體輕鏈可變區(qū)，其含有由SEQ ID NO :14所示的氨基酸序列或者對(duì)由SEQ IDNO 14所示的氨基酸序列進(jìn)行了以下氨基酸修飾中的至少一種修飾的氨基酸序列以Val取代第2位的異亮氨酸，以Leu取代第3位的Val，以Leu取代第15位的ft~o，以Lys取代第50位的Gln和以Gly取代第105位的Gin。2.以上1的人源化抗體，其中抗體重鏈可變區(qū)含有由SEQ ID NO :12,15或16所示的氨基酸序列，并且抗體輕鏈可變區(qū)含有由SEQ IDNO :14,17或18所示的氨基酸序列。3.抗認(rèn)知功能障礙的藥劑，其含有以上1或2的人源化抗體作為活性成分。4.用于治療阿爾茨海默病的藥物，其含有以上1或2的人源化抗體作為活性成分。5.用于抑制神經(jīng)炎性斑形成的藥劑，其含有以上1或2的人源化抗體作為活性成分。6. Αβ淀粉樣纖維形成的抑制劑，其含有以上1或2的人源化抗體作為活性成分。7.用于預(yù)防和治療認(rèn)知功能障礙的至少一種方法，其包括施用以上1或2的人源化抗體。8.用于預(yù)防和治療阿爾茨海默病的至少一種方法，其包括施用以上1或2的人源化抗體。9.用于抑制阿爾茨海默病進(jìn)展的方法，其包括施用以上1或2的人源化抗體。發(fā)明的有益效果預(yù)期本發(fā)明的抗體可以建立用于預(yù)防和治療AD的方法，以及可以建立靶向AD的致病分子Aβ蛋白的早期診斷標(biāo)記。
存在靶向腦部病變的抗體在AD的抗體治療期間，抗體腦內(nèi)轉(zhuǎn)移的問(wèn)題。但是，有可能本發(fā)明的抗體通過(guò)外周靜脈給藥可以應(yīng)用于臨床治療，并且認(rèn)為可以立刻加速AD的抗體治療的發(fā)展。


圖1顯示H鏈可變區(qū)4H5HV0的氨基酸序列和在HV2、HV3、HV4、HV5a、HV5b、HV6和HV7中從由SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列修飾的氨基酸殘基。圖中第一和第二行表示H鏈可變區(qū)的氨基酸編號(hào)，并且其它各行中的字母表示被取代的氨基酸(用單字母代碼表示)°圖2顯示L鏈可變區(qū)4H5LV0的氨基酸序列和在LVla、LVlb, LVlc, LV3和LV5中從由SEQ ID NO :14所示的氨基酸序列修飾的氨基酸殘基。圖中第一和第二行表示L鏈可變區(qū)的氨基酸編號(hào)，并且其它各行中的字母表示被改變的氨基酸(用一個(gè)字母表示)。圖3顯示通過(guò)使用Biacore系統(tǒng)測(cè)定抗A β寡聚體人源化抗體HVOLVO、HV5aVL0、HV5aLVlb和HVfeLV3對(duì)A β單體的結(jié)合活性而獲得的傳感圖。圖4顯示通過(guò)使用Biacore系統(tǒng)測(cè)定抗A β寡聚體人源化抗體HV6LV0、HV6LVlb和HV6LV3對(duì)A β單體的結(jié)合活性而獲得的傳感圖。實(shí)施方案詳述本發(fā)明的抗Αβ寡聚體人源化抗體(以下也稱(chēng)為本發(fā)明的抗體或者本發(fā)明的人源化抗體)是特征為與Αβ寡聚體結(jié)合而不與Αβ單體結(jié)合的人源化抗體。本發(fā)明的抗體優(yōu)選為分離的抗體、純化抗體或者抗體組合物。分離的抗體、純化抗體或者抗體組合物是基本上含有100%的所需抗體并且不含有任何雜質(zhì)、如在抗體生產(chǎn)中源自產(chǎn)生抗體的細(xì)胞和組織、產(chǎn)生抗體的動(dòng)物等的污染物蛋白質(zhì)的抗體?？贵w是有兩條重鏈(H鏈)和兩條輕鏈(L鏈)構(gòu)成的異四聚體蛋白質(zhì)。抗體被分為多克隆抗體和識(shí)別單一抗原的單克隆抗體。多克隆抗體是識(shí)別單一抗原的抗體的混合物。多克隆抗體的實(shí)例包括用抗原免疫的宿主動(dòng)物的抗血清。單克隆抗體是由產(chǎn)生抗體的細(xì)胞的單一克隆所分泌的抗體，其僅僅識(shí)別一個(gè)表位(也稱(chēng)為抗原決定簇)，并且在氨基酸序列(一級(jí)結(jié)構(gòu))方面具有一致性。本發(fā)明的抗體優(yōu)選為單克隆抗體。本發(fā)明的單克隆抗體的實(shí)例包括抗體重鏈(以下稱(chēng)為H鏈)的互補(bǔ)決定區(qū)(以下稱(chēng)為⑶Rs)l至3分別含有由SEQ ID N0:1至3所示的氨基酸序列、L鏈的⑶Rs 1至3分別含有由SEQ ID NO :4至6所示的氨基酸序列的單克隆抗體，抗體的H鏈可變區(qū)(以下稱(chēng)為VH)含有由SEQ ID NO :8所示的氨基酸序列且L鏈可變區(qū)(以下稱(chēng)為VL)含有由SEQ ID NO 10所示的氨基酸序列的單克隆抗體，和抗Aβ寡聚體小鼠單克隆抗體4Η5。作為表位，即被單克隆抗體識(shí)別并結(jié)合的單個(gè)氨基酸序列，示例可以是含有以上氨基酸序列、結(jié)合糖鏈的以上氨基酸序列的構(gòu)象，和含有結(jié)合糖鏈的以上氨基酸序列的構(gòu)象。被本發(fā)明的抗體識(shí)別的表位可以是任意蛋白質(zhì)，只要其包括至少一種Αβ蛋白和其片段、并且存在于形成復(fù)合體的Αβ寡聚體上即可。本發(fā)明的抗體所結(jié)合的表位的實(shí)例包括含有暴露于Αβ寡聚體上的Αβ —級(jí)氨基酸序列的表位、含有Αβ寡聚體的構(gòu)象等的表位。已知作為淀粉樣的主要成分的Αβ蛋白是含有40至42個(gè)氨基酸的肽，并且是由被稱(chēng)為淀粉樣前體蛋白(以下稱(chēng)為APP)的前體蛋白經(jīng)過(guò)蛋白酶的作用而產(chǎn)生。由APP所產(chǎn)生的淀粉蛋白分子包括可溶性單體和可溶性寡聚體的非纖維狀聚合物以及在超離心沉淀組分中所收集的淀粉樣纖維。在本發(fā)明中，Αβ寡聚體是非纖維狀聚合物，并且是含有至少一種A β蛋白與其片段并且形成復(fù)合體的Aβ寡聚體。具體地，A β寡聚體的實(shí)例包括A β 40 (Α β 1-40)寡聚體、A β 42 (Α β 1-42)寡聚體和含有Αβ40和Αβ42的至少一種的Αβ寡聚體。此外，本發(fā)明的Αβ寡聚體的實(shí)例包括含有在Αβ40和Αβ42的至少一個(gè)中Αβ的N端缺失的Aβ片段的Aβ寡聚體。具體地，本發(fā)明的A β 42寡聚體是用SDS-PAGE測(cè)定的分子量為45至160kDa并且用藍(lán)色非變性PAGE測(cè)定的分子量為22. 5至1，035kDa的分子。主要通過(guò)分子篩中> IOOkDa的保持液回收Aβ寡聚體。此外，Αβ寡聚體在原子力顯微鏡下顯示為由高度為1. 5至3. Inm的粒狀分子、珠狀分子和圓形分子組成的混合構(gòu)象。此外，用凝膠過(guò)濾法洗脫以上Αβ 42寡聚體，獲得空隙體積分?jǐn)?shù)為8的分子量680kDa以上，以及分?jǐn)?shù)為15的界于17_44kDa的分子量。可以使用本發(fā)明的抗體，只要其是與Αβ寡聚體結(jié)合而不與Αβ單體結(jié)合的人源化抗體即可，并且不限定其衍生物及其形狀。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體不識(shí)別作為生理分子的可溶性淀粉樣β (Αβ)單體，并且僅僅與可溶性Aβ寡聚體反應(yīng)。在本發(fā)明中，僅僅與可溶性Αβ寡聚體結(jié)合而不與可溶性Αβ單體結(jié)合的意思是在用超濾法和分子篩法分離的Aβ單體和Αβ寡聚體中，抗體不識(shí)別單體(約4. 5kDa)，但是特異性地識(shí)別等于或大于Aβ 二聚體的可溶性Αβ寡聚體。因此，優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體特異性地與等于或大于Aβ 二聚體的可溶性Aβ寡聚體結(jié)合。本發(fā)明的抗體優(yōu)選具有下列(1)至(5)中的至少一種活性(1)抗神經(jīng)毒活性；(2)抑制A β淀粉樣纖維形成的活性；(3)僅僅識(shí)別A β寡聚體的特異性；(4)在AD腦中捕獲A β寡聚體的能力；(5)在API^swe轉(zhuǎn)基因小鼠(Tg2576)中預(yù)防AD樣病變(記憶衰退、腦中的Aβ積累水平)的能力?？梢杂肳O 2009/051220中所公開(kāi)的方法證實(shí)與以上(1)至(5)相關(guān)的本發(fā)明的抗體的活性?？梢詫⒈景l(fā)明的抗體制備為重組抗體。在本發(fā)明中，重組抗體包括通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生的抗體，如人嵌合抗體、人源化抗體(或人CDR移植抗體)、人抗體及其抗體片段。優(yōu)選用具有單克隆抗體的特征、低免疫原性和較長(zhǎng)血液半衰期的重組抗體作為治療劑。重組抗體的實(shí)例包括通過(guò)使用重組技術(shù)修飾本發(fā)明的單克隆抗體而衍生的抗體。人嵌合抗體是含有非人動(dòng)物抗體的重鏈可變區(qū)(以下稱(chēng)為“VH”)和輕鏈可變區(qū)(以下稱(chēng)為“VL”)以及人抗體的重鏈恒定區(qū)(以下稱(chēng)為“CH”)和輕鏈恒定區(qū)(以下稱(chēng)為“CL”)的抗體?？梢酝ㄟ^(guò)以下方法制備人嵌合抗體從產(chǎn)生與Αβ寡聚體特異性結(jié)合的單克隆抗體的雜交瘤獲取編碼以上VH和VL的cDNA，將每個(gè)cDNA插入含有編碼人抗體CH和CL的DNA的動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體中，從而構(gòu)建表達(dá)人嵌合抗體的表達(dá)載體，并且然后將該載體導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞以表達(dá)抗體。作為以上人嵌合抗體的CH，可以使用任意CH，只要其屬于人免疫球蛋白(以下稱(chēng)為“hlg”)即可，并且其優(yōu)選屬于hlgG類(lèi)，并且可以使用屬于hlgG類(lèi)的任一亞類(lèi)，如hlgGl、hIgG2、hIgG3 禾口 hIgG4。作為以上人嵌合抗體的CL，可以使用任意CL，只要其屬于hlg類(lèi)即可，并且可以使用屬于κ類(lèi)或者λ類(lèi)的CL。本發(fā)明的人源化抗體是源自非人動(dòng)物抗體的VH和VL的CDR的氨基酸序列被移植入人抗體的VH和VL的適當(dāng)位置的抗體。可以通過(guò)以下方法生產(chǎn)人源化抗體設(shè)計(jì)V區(qū)的氨基酸序列，其中由非人動(dòng)物雜交瘤所產(chǎn)生的并且與A β寡聚體特異性結(jié)合的單克隆抗體的VH和VL的CDR的氨基酸序列分別被移植入任意人抗體VH和VL的框架區(qū)(以下稱(chēng)為“FR”)，構(gòu)建編碼V區(qū)的cDNA，將每個(gè)cDNA插入含有編碼人抗體的CH和CL的基因的動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體中，從而構(gòu)建表達(dá)人源化抗體的載體，并且將其導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞，從而表達(dá)且產(chǎn)生人源化抗體。作為人源化抗體的VH和VL的FR的氨基酸序列，可以使用任意氨基酸序列，只要其分別是源自人抗體的VH和VL的氨基酸序列即可。實(shí)例包括登記在諸如ftOtein Data Bank的數(shù)據(jù)庫(kù)中的人抗體的VH和VL的FR的氨基酸序列、Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health andHuman Services (1991)中所述的人抗體的VH和VL的FR的每個(gè)亞組的共有氨基酸序列，等寸。本發(fā)明的人源化抗體的實(shí)例包括抗體的VH的⑶R 1至3分別含有由SEQ ID NO 1至3所示的氨基酸序列、并且抗體的VL的⑶R 1至3分別含有由SEQ ID NO :4至6所示的氨基酸序列的人源化抗體。本發(fā)明的人源化抗體優(yōu)選為含有以下(a) VH和(b)VL的至少一種的人源化抗體。此外，在以下(a)和(b)中不限定所引入的取代的數(shù)量(a)VH，其含有由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列，或者含有由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列的以下氨基酸殘基中至少一個(gè)氨基酸殘基被另一個(gè)氨基酸殘基取代的氨基酸序列第18位的Leu、第46位的Gin、第48位的Met、第49位的Val、第77位的kr、第93位的Val和第98位的Arg ；(b)VL，其含有由SEQ ID NO 14所示的氨基酸序列，或者含有由SEQ ID N0:14所示的氨基酸序列的以下氨基酸殘基中的至少一個(gè)氨基酸殘基被另一個(gè)氨基酸殘基取代的氨基酸序列第2位的lie、第3位的Val、第15位的ft~o、第50位的Gln和第105位的Gin。本發(fā)明的人源化抗體所含有的VH的優(yōu)選實(shí)例包括，例如，含有在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以下氨基酸殘基被其它氨基酸殘基取代的氨基酸序列的VH:第18位的Leu、第46位的Gin、第48位的Met、第49位的Val、第77位的kr、第93位的Val和第98位的Arg。此外，選自以下(1)至(6)的VH也優(yōu)選作為本發(fā)明的人源化抗體所含有的VH (1)VH，其含有在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以下氨基酸殘基被其它氨基酸殘基取代的氨基酸序列第46位的Glru第48位的Met、第49位的Val、第77位的kr、第93位的Val和第98位的Arg ；Q)VH，其含有在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以下氨基酸殘基被其它氨基酸殘基取代的氨基酸序列第46位的Glru第48位的Met、第49位的Val、第93位的Val和第98位的Arg; (3) VH，其含有在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以下氨基酸殘基被其它氨基酸殘基取代的氨基酸序列第46位的Glru第48位的Met、第49位的Val、第77位的Ser和第98位的Arg ；(4) VH，其含有在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以下氨基酸殘基被其它氨基酸殘基取代的氨基酸序列第46位的Glru第48位的Met、第49位的Val和第98位的Arg ； VH，其含有在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以下氨基酸殘基被其它氨基酸殘基取代的氨基酸序列第46位的Glru第48位的Met和第49位的Val ；(6) VH，其含有在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以下氨基酸殘基被其它氨基酸殘基取代的氨基酸序列第48位的Met和第49位的Val。VH的氨基酸序列的實(shí)例包括在由SEQ ID NO :12所示的氨基酸序列中引入以下修飾中的至少一種修飾的氨基酸序列以Arg取代第18位的Leu，以Glu取代第46位的Gln，以Val取代第48位的Met，以Ala取代第49位的Val，以Asn取代第77位的kr，以Met取代第93位的Val和以Gly取代第98位的Arg。VH的氨基酸序列的更具體實(shí)例包括引入了以下7至1處修飾的氨基酸序列。引入了 7處取代的VH的氨基酸序列的具體實(shí)例包括在由SEQ IDNO 12所示的氨基酸序列中引入以下取代的氨基酸序列以Arg取代第18位的Leu，以Glu取代第46位的Gln,以Val取代第48位的Met，以Ala取代第49位的Val，以Asn取代第77位的kr，以Met取代第93位的Val和以Gly取代第98位的Arg。引入了 6處取代的VH的氨基酸序列的具體實(shí)例包括以下(1)至(7)的氨基酸序列(1)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Glu取代第46位的Gln，以Val取代第48位的Met，以Ala取代第49位的Val，以Asn取代第77位的kr，以Met取代第93位的Val和以Gly取代第98位的Arg ；( 氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO :12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Val取代第48位的Met，以Ala取代第49位的Val，以Asn取代第77位的kr，以Met取代第93位的Val和以Gly取代第98位的Arg ；C3)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Glu取代第46位的Gln，以Ala取代第49位的Val，以Asn取代第77位的kr，以Met取代第93位的Val和以Gly取代第98位的Arg ；
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(4)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Glu取代第46位的Gln，以Val取代第48位的Met，以Asn取代第77位的kr，以Met取代第93位的Val和以Gly取代第98位的Arg ；( 氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Glu取代第46位的Gln，以Val取代第48位的Met，以Ala取代第49位的Val，以Met取代第93位的Val和以Gly取代第98位的Arg ；(6)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Glu取代第46位的Gln，以Val取代第48位的Met，以Ala取代第49位的Val，以Asn取代第77位的Ser和以Gly取代第98位的Arg ；(7)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Glu取代第46位的Gln，以Val取代第48位的Met，以Ala取代第49位的Val，以Asn取代第77位的Ser和以Met取代第93位的Val。引入了 5處取代的VH的氨基酸序列的具體實(shí)例包括以下⑴至的氨基酸序列(1)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Val取代第48位的Met，以Ala取代第49位的Val，以Asn取代第77位的kr，以Met取代第93位的Val和以Gly取代第98位的Arg;(2)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Glu取代第46位的Gln，以Ala取代第49位的Val，以Asn取代第77位的kr，以Met取代第93位的Val和以Gly取代第98位的Arg;(3)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Glu取代第46位的Gln，以Val取代第48位的Met，以Asn取代第77位的kr，以Met取代第93位的Val和以Gly取代第98位的Arg;(4)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Glu取代第46位的Gln，以Val取代第48位的Met，以Ala取代第49位的Val，以Met取代第93位的Val和以Gly取代第98位的Arg;(5)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Glu取代第46位的Gln，以Val取代第48位的Met，以Ala取代第49位的Val，以Asn取代第77位的Ser和以Gly取代第98位的Arg;(6)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Glu取代第46位的Gln，以Val取代第48位的Met，以Ala取代第49位的Val，以Asn取代第77位的Ser和以Met取代第93位的Val ；(7)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Ala取代第49位的Val，以Asn取代第77位的kr，以Met取代第93位的Val和以Gly取代第98位的Arg;(8)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Val取代第48位的Met，以Asn取代第77位的kr，以Met取代第93位的Val和以Gly取代第98位的Arg;(9)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Val取代第48位的Met，以Ala取代第49位的Val，以Met取代第93位的Val和以Gly取代第98位的Arg;(10)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Val取代第48位的Met，以Ala取代第49位的Val，以Asn取代第77位的Ser和以Gly取代第98位的Arg;(11)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Val取代第48位的Met，以Ala取代第49位的Val，以Asn取代第77位的Ser和以Met取代第93位的Val ；(12)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Glu取代第46位的Gln，以Asn取代第77位的kr，以Met取代第93位的Val和以Gly取代第98位的Arg;(13)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Glu取代第46位的Gln，以Ala取代第49位的Val，以Met取代第93位的Val和以Gly取代第98位的Arg;(14)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Glu取代第46位的Gln，以Ala取代第49位的Val，以Asn取代第77位的Ser和以Gly取代第98位的Arg;(15)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Glu取代第46位的Gln，以Ala取代第49位的Val，以Asn取代第77位的Ser和以Met取代第93位的Val ；(16)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Glu取代第46位的Gln，以Val取代第48位的Met，以Met取代第93位的Val和以Gly取代第98位的Arg;(17)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Glu取代第46位的Gln，以Val取代第48位的Met，以Asn取代第77位的Ser和以Gly取代第98位的Arg;(18)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Glu取代第46位的Gln，以Val取代第48位的Met，以Asn取代第77位的Ser和以Met取代第93位的Val ；(19)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Glu取代第46位的Gln，以Val取代第48位的Met，以Ala取代第49位的Val和以Gly取代第98位的Arg;(20)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Glu取代第46位的Gln，以Val取代第48位的Met，以Ala取代第49位的Val和以Met取代第93位的Val ；(21)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Glu取代第46位的Gln，以Val取代第48位的Met，以Ala取代第49位的Val和以Asn取代第77位的kr。引入了 4處取代的VH的氨基酸序列的具體實(shí)例包括以下(1)至(35)的氨基酸序列(1)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Glu取代第46位的Gln，以Val取代第48位的Met和以Ala取代第49位的Val ；( 氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO :12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Glu取代第46位的Gln，以Val取代第48位的Met和以Asn取代第77位的kr ；C3)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Glu取代第46位的Gln，以Val取代第48位的Met和以Met取代第93位的Val ；(4)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Glu取代第46位的Gln，以Val取代第48位的Met和以Gly取代第98位的Arg ；( 氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Glu取代第46位的Gln，以Ala取代第49位的Val和以Asn取代第77位的kr ；(6)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Glu取代第46位的Gln，以Ala取代第49位的Val和以Met取代第93位的Val ；(7)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Glu取代第46位的Gln，以Ala取代第49位的Val和以Gly取代第98位的Arg ；(8)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Glu取代第46位的Gln，以Asn取代第77位的Ser和以Met取代第93位的Val ；(9)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Glu取代第46位的Gln，以Asn取代第77位的Ser和以Gly取代第98位的Arg ；(10)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Glu取代第46位的Gln，以Met取代第93位的Val和以Gly取代第98位的Arg ；(11)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Val取代第48位的Met，以Ala取代第49位的Val和以Asn取代第77位的Ser ；(12)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Val取代第48位的Met，以Ala取代第49位的Val和以Met取代第93位的Val ；(13)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Val取代第48位的Met，以Ala取代第49位的Val和以Gly取代第98位的Arg ；(14)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Val取代第48位的Met，以Asn取代第77位的Ser和以Met取代第93位的Val ；(15)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Val取代第48位的Met，以Asn取代第77位的Ser和以Gly取代第98位的Arg ；(16)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Val取代第48位的Met，以Met取代第93位的Val和以Gly取代第98位的Arg ；(17)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Ala取代第49位的Val，以Asn取代第77位的Ser和以Met取代第93位的Val ；(18)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Ala取代第49位的Val，以Asn取代第77位的Ser和以Gly取代第98位的Arg ；(19)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Ala取代第49位的Val，以Met取代第93位的Val和以Gly取代第98位的Arg ；(20)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Asn取代第77位的kr，以Met取代第93位的Val和以Gly取代第98位的Arg ；(21)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Glu取代第46位的Gln，以Val取代第48位的Met，以Ala取代第49位的Val和以Asn取代第77位的Ser ；(22)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Glu取代第46位的Gln，以Val取代第48位的Met，以Ala取代第49位的Val和以Met取代第93位的Val ；(23)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Glu取代第46位的Gln，以Val取代第48位的Met，以Ala取代第49位的Val和以Gly取代第98位的Arg ；(24)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Glu取代第46位的Gln，以Val取代第48位的Met，以Asn取代第77位的Ser和以Met取代第93位的Val ；(25)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Glu取代第46位的Gln，以Val取代第48位的Met，以Asn取代第77位的Ser和以Gly取代第98位的Arg ；(26)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Glu取代第46位的Gln，以Val取代第48位的Met，以Met取代第93位的Val和以Gly取代第98位的Arg ；(27)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Glu取代第46位的Gln，以Ala取代第49位的Val，以Asn取代第77位的Ser和以Met取代第93位的Val ；(28)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Glu取代第46位的Gln，以Ala取代第49位的Val，以Asn取代第77位的Ser和以Gly取代第98位的Arg ；(29)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Glu取代第46位的Gln，以Ala取代第49位的Val，以Met取代第93位的Val和以Gly取代第98位的
(30)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Glu取代第46位的Gln，以Asn取代第77位的kr，以Met取代第93位的Val和以Gly取代第98位的Arg ；(31)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Val取代第48位的Met，以Ala取代第49位的Val，以Asn取代第77位的Ser和以Met取代第93位的Val ；(32)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Val取代第48位的Met，以Ala取代第49位的Val，以Asn取代第77位的Ser和以Gly取代第98位的Arg ；(33)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Val取代第48位的Met，以Ala取代第49位的Val，以Met取代第93位的Val和以Gly取代第98位的Arg ；(34)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Val取代第48位的Met，以Asn取代第77位的kr，以Met取代第93位的Val和以Gly取代第98位的Arg ；(35)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Ala取代第49位的Val，以Asn取代第77位的kr，以Met取代第93位的Val和以Gly取代第98位的Arg0引入了 3處取代的VH的氨基酸序列的具體實(shí)例包括以下(1)至(35)的氨基酸序列(1)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu，以Glu取代第46位的Gln和以Val取代第48位的Met ；(2)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第118位的Leu，以Glu取代第46位的Gln和以Ala取代第49位的Val ；(3)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第118位的Leu，以Glu取代第46位的Gln和以Asn取代第77位的kr ；(4)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第118位的Leu，以Glu取代第46位的Gln和以Met取代第93位的Val ；(5)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第118位的Leu，以Glu取代第46位的Gln和以Gly取代第98位的Arg ；(6)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第118位的Leu，以Val取代第48位的Met和以Ala取代第49位的Val ；(7)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第118位的Leu，以Val取代第48位的Met和以Asn取代第77位的kr ；(8)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第118位的Leu，以Val取代第48位的Met和以Met取代第93位的Val ；(9)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第118位的Leu，以Val取代第48位的Met和以Gly取代第98位的Arg ；
(10)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第118位的Leu，以Ala取代第49位的Val和以Asn取代第77位的kr ；(11)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第118位的Leu，以Ala取代第49位的Val和以Met取代第93位的Val ；(12)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第118位的Leu，以Ala取代第49位的Val和以Gly取代第98位的Arg ；(13)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第118位的Leu，以Asn取代第77位的Ser和以Met取代第93位的Val ；(14)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第118位的Leu，以Asn取代第77位的Ser和以Gly取代第98位的Arg ；(15)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第118位的Leu，以Met取代第93位的Val和以Gly取代第98位的Arg ；(16)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Glu取代第146位的Gln，以Val取代第48位的Met和以Ala取代第49位的Val ；(17)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Glu取代第146位的Gln，以Val取代第48位的Met和以Asn取代第77位的kr ；(18)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Glu取代第146位的Gln，以Val取代第48位的Met和以Met取代第93位的Val ；(19)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Glu取代第146位的Gln，以Val取代第48位的Met和以Gly取代第98位的Arg ；(20)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Glu取代第146位的Gln，以Ala取代第49位的Val和以Asn取代第77位的kr ；(21)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Glu取代第146位的Gln，以Ala取代第49位的Val和以Met取代第93位的Val ；(22)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Glu取代第146位的Gln，以Ala取代第49位的Val和以Gly取代第98位的Arg ；(23)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Glu取代第146位的Gln，以Asn取代第77位的Ser和以Met取代第93位的Val ；(24)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Glu取代第146位的Gln，以Asn取代第77位的Ser和以Gly取代第98位的Arg ；(25)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Glu取代第146位的Gln，以Met取代第93位的Val和以Gly取代第98位的Arg ；(26)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Val取代第148位的Met，以Ala取代第49位的Val和以Asn取代第77位的kr ；(27)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO :12所示的氨基酸序列中以Val取代第148位的Met，以Ala取代第49位的Val和以Met取代第93位的Val ；(28)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO :12所示的氨基酸序列中以Val取代第148位的Met，以Ala取代第49位的Val和以Gly取代第98位的Arg ；(29)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO :12所示的氨基酸序列中以Val取代第148位的Met，以Asn取代第77位的Ser和以Met取代第93位的Val ；(30)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO :12所示的氨基酸序列中以Val取代第148位的Met，以Asn取代第77位的Ser和以Gly取代第98位的Arg ；(31)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Val取代第148位的Met，以Met取代第93位的Val和以Gly取代第98位的Arg ；(32)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO :12所示的氨基酸序列中以Ala取代第149位的Val，以Asn取代第77位的Ser和以Met取代第93位的Val ；(33)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO :12所示的氨基酸序列中以Ala取代第149位的Val，以Asn取代第77位的Ser和以Gly取代第98位的Arg ；(34)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Ala取代第149位的Val，以Met取代第93位的Val和以Gly取代第98位的Arg ；(35)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Asn取代第177位的kr，以Met取代第93位的Val和以Gly取代第98位的Arg。弓丨入了2處取代的VH的氨基酸序列的具體實(shí)例包括以下⑴至的氨基酸序列(1)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu和以Glu取代第46位的Gln ；(2)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu和以Val取代第48位的Met ；(3)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu和以Ala取代第49位的Val ；(4)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu和以Asn取代第77位的kr ；(5)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu和以Met取代第93位的Val ；(6)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu和以Gly取代第98位的Arg ；(7)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Glu取代第46位的Gln和以Val取代第48位的Met ；(8)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Glu取代第46位的Gln和以Ala取代第49位的Val ；(9)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Glu取代第46位的Gln和以Asn取代第77位的kr ；(10)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Glu取代第46位的Gln和以Met取代第93位的Val ；(11)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Glu取代第46位的Gln和以Gly取代第98位的Arg ；(12)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Val取代第48位的Met和以Ala取代第49位的Val ；
(13)氨基酸序列，其中在由SEQ位的Met和以Asn取代第77位的kr ；(14)氨基酸序列，其中在由SEQ位的Met和以Met取代第93位的Val ；(1幻氨基酸序列，其中在由SEQ位的Met和以Gly取代第98位的Arg ；(16)氨基酸序列，其中在由SEQ位的Val和以Asn取代第77位的kr ；(17)氨基酸序列，其中在由SEQ位的Val和以Met取代第93位的Val ；(18)氨基酸序列，其中在由SEQ位的Val和以Gly取代第98位的Arg ；(19)氨基酸序列，其中在由SEQ位的Ser和以Met取代第93位的Val ；(20)氨基酸序列，其中在由SEQ位的Ser和以Gly取代第98位的Arg ；(21)氨基酸序列，其中在由SEQ位的Val和以Gly取代第98位的Arg。
列
的 Leu ；(2)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Glu取代第46位的Gln和以Val取代第48位的Met ；(3)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中以Ala取代第49位的Val和以Asn取代第77位的kr ；的Val
ID NO 12所示的氨基酸序列中以Val取代第48ID NO 12所示的氨基酸序列中以Val取代第48ID NO 12所示的氨基酸序列中以Val取代第48ID NO: 12所示的氨基酸序列中以Ala取代第49ID NO: 12所示的氨基酸序列中以Ala取代第49ID NO: 12所示的氨基酸序列中以Ala取代第49ID NO :12所示的氨基酸序列中以Asn取代第77ID NO :12所示的氨基酸序列中以Asn取代第77ID NO: 12所示的氨基酸序列中以Met取代第93引入了 1處取代的VH的氨基酸序列的具體實(shí)例包括以下(1)至(5)的氨基酸序(1)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO :12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位
(4)氨基酸序列，其中在由SEQID NO :12所示的氨基酸序列中以Met取代第93位
(5)氨基酸序列，其中在由SEQID NO :12所示的氨基酸序列中以Gly取代第98位
的 Arg0在以上VH的氨基酸序列中，優(yōu)選由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列，和在由SEQID NO :12所示的氨基酸序列中進(jìn)行了以下取代的氨基酸序列以Glu取代第46位的Gln，以Met取代第93位的Val和以Gly取代第98位的Arg，和在由SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列中進(jìn)行了以下取代的氨基酸序列以Glu取代第46位的Gln，以Asn取代第77位的Ser,以Met取代第93位的Val和以Gly取代第98位的Arg。本發(fā)明的人源化抗體所含有的VL的優(yōu)選實(shí)例例如，包括含有在由SEQ ID NO 14所示的氨基酸序列中第2位的lie，第3位的Val，第15位的Wio，第50位的Gln和第105位的Gln被其它氨基酸殘基取代的氨基酸序列的VL。此外，含有選自以下⑴至(6)的氨基酸序列的VL也優(yōu)選作為本發(fā)明的人源化抗
17體所含有的VL (I) VL，其含有由SEQ ID NO :14所示的氨基酸序列的第2位的He，第15位的Pro， 第50位的Gln和第105位的Gln被其它氨基酸殘基取代的氨基酸序列；(2) VL，其含有由SEQ ID NO :14所示的氨基酸序列的第2位的He，第15位的Pro 和第50位的Gln被其它氨基酸殘基取代的氨基酸序列；(3)VL，其含有由SEQ ID NO 14所示的氨基酸序列的第15位的Pro和第50位的 Gln被其它氨基酸殘基取代的氨基酸序列；(4)VL，其含有由SEQ ID NO :14所示的氨基酸序列的第2位的Ile被其它氨基酸殘基取代的氨基酸序列；(5) VL，其含有由SEQ ID NO : 14所示的氨基酸序列的第15位的Pio被其它氨基酸殘基取代的氨基酸序列；(6)VL，其含有由SEQ ID NO : 14所示的氨基酸序列的第50位的Gln被其它氨基酸殘基取代的氨基酸序列。VL的以上氨基酸序列例如，包括在由SEQ ID NO :14所示的氨基酸序列中引入以下修飾中的至少一種修飾的氨基酸序列以Val取代第2位的He，以Leu取代第3位的 Val，以Leu取代第15位的Pro，以Lys取代第50位的Gln和以Gly取代第105位的Gin。引入以上修飾的本發(fā)明抗體的VL氨基酸序列的更具體實(shí)例例如，包括引入了以下5處至I處取代的VL的氨基酸序列。引入了 5處取代的VL的氨基酸序列的具體實(shí)例包括在由SEQ IDNO 14所示的氨基酸序列中以Val取代第2位的He，以Leu取代第3位的Val，以Leu取代第15位的Pro， 以Lys取代第50位的Gln和以Gly取代第105位的Gln的氨基酸序列。引入了 4處取代的VL的氨基酸序列的具體實(shí)例包括以下⑴至(5)的氨基酸序列(I)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO : 14所示的氨基酸序列中以Leu取代第3位的Val，以Leu取代第15位的Pro，以Lys取代第50位的Gln和以Gly取代第105位的Gln ；(2)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 14所示的氨基酸序列中以Val取代第2位的He，以Leu取代第15位的Pro，以Lys取代第50位的Gln和以Gly取代第105位的Gln ；(3)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 14所示的氨基酸序列中以Val取代第2位的He，以Leu取代第3位的Val，以Lys取代第50位的Gln和以Gly取代第105位的Gln ；(4)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 14所示的氨基酸序列中以Val取代第2位的He，以Leu取代第3位的Val，以Leu取代第15位的Pro和以Gly取代第105位的Gln ；(5)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 14所示的氨基酸序列中以Val取代第2位的He，以Leu取代第3位的Val，以Leu取代第15位的Pro和以Lys取代第50位的Gin。引入了 3處取代的VL的氨基酸序列的具體實(shí)例包括以下⑴至(10)的氨基酸序列(I)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO : 14所示的氨基酸序列中以Val取代第2位的He，以Leu取代第3位的Val和以Leu取代第15位的Pro ；(2)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO : 14所示的氨基酸序列中以Val取代第2位的He，以Leu取代第3位的Val和以Lys取代第50位的Gln ；
(3)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 14所示的氨基酸序列中以Val取代第2位的He，以Leu取代第3位的Val和以Gly取代第105位的Gln ；(4)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO : 14所示的氨基酸序列中以Val取代第2位的He，以Leu取代第15位的Pro和以Lys取代第50位的Gln ；(5)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO : 14所示的氨基酸序列中以Val取代第2位的He，以Leu取代第15位的Pro和以Gly取代第105位的Gln ；(6)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 14所示的氨基酸序列中以Val取代第2位的He，以Lys取代第50位的Gln和以Gly取代第105位的Gln ；(7)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO : 14所示的氨基酸序列中以Leu取代第3位的Val，以Leu取代第15位的Pro和以Lys取代第50位的Gln ；(8)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO : 14所示的氨基酸序列中以Leu取代第3位的Val，以Leu取代第15位的Pro和以Gly取代第105位的Gln ；(9)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO : 14所示的氨基酸序列中以Leu取代第3位的Val，以Lys取代第50位的Gln和以Gly取代第105位的Gln ；(10)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 14所示的氨基酸序列中以Leu取代第15 位的Pro，以Lys取代第50位的Gln和以Gly取代第105位的Gin。引入了 2處取代的VL的氨基酸序列的具體實(shí)例包括以下⑴至(10)的氨基酸序列(I)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO : 14所示的氨基酸序列中以Val取代第2位的Ile和以Leu取代第3位的Val ；(2)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 14所示的氨基酸序列中以Val取代第2位的Ile和以Leu取代第15位的Pro ；(3)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO : 14所示的氨基酸序列中以Val取代第2位的He，以Lys取代第50位的Gln ；(4)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 14所示的氨基酸序列中以Val取代第2位的Ile和以Gly取代第105位的Gln ；(5)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO : 14所示的氨基酸序列中以Leu取代第3位的Val和以Leu取代第15位的Pro ；(6)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO : 14所示的氨基酸序列中以Leu取代第3位的Val和以Lys取代第50位的Gln ；(7)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO : 14所示的氨基酸序列中以Leu取代第3位的Val和以Gly取代第105位的Gln ；(8)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO : 14所示的氨基酸序列中以Leu取代第15位的Pro和以Lys取代第50位的Gln ；(9)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO : 14所示的氨基酸序列中以Leu取代第15位的Pro和以Gly取代第105位的Gln ；(10)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 14所示的氨基酸序列中以Lys取代第50 位的Gln和以Gly取代第105位的Gin。引入了 I處取代的VL的氨基酸序列的具體實(shí)例包括以下⑴至(5)的氨基酸序列(1)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO : 14所示的氨基酸序列中以Val取代第2位 的 lie ；(2)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO : 14所示的氨基酸序列中以Leu取代第3位 的 Val ；(3)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO : 14所示的氨基酸序列中以Leu取代第15位 的 Pro ；(4)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO : 14所示的氨基酸序列中以Lys取代第50位 的 Gin ；(5)氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO 14所示的氨基酸序列中以Gly取代第105 位的Gin。在以上VL的氨基酸序列中，優(yōu)選由SEQ ID NO :14所示的氨基酸序列，在由SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列中以Leu取代第15位的Pro的氨基酸序列，和在由SEQ ID NO 14 所示的氨基酸序列中以Val取代第2位的lie、以Leu取代第15位的Pro以及以Lys取代 第50位的Gin的氨基酸序列。本發(fā)明的抗體的具體實(shí)例包括通過(guò)分別組合上述VH和VL而獲得的任意抗體。本發(fā)明的抗體的優(yōu)選實(shí)例包括例如，以下(1)至⑷的抗體(1)人源化抗體，其包括含有由SEQ ID NO : 12所示的氨基酸序列的VH和含有由 SEQ ID NO : 14所示的氨基酸序列的VL;(2)人源化抗體，其包括含有由SEQ ID NO : 12所示的氨基酸序列的VH和含有圖2 所示的任一氨基酸序列的VL ；(3)人源化抗體，其包括含有圖1所示的任一氨基酸序列的VH和含有由SEQ ID NO 14所示的氨基酸序列的VL ；(4)人源化抗體，其包括含有圖1所示的任一氨基酸序列的VH和含有圖2所示的 任一氨基酸序列的VL。在圖1所示的VH的氨基酸序列中，優(yōu)選4H5HV0、HV5a和HV6。此外，在圖2所示 的VL的氨基酸序列中，優(yōu)選4H5LV0、LVlb和LV3。因此，作為包括含有圖1所不的任一氨基酸序列的VH和含有圖2所不的任一氨基 酸序列的VL的人源化抗體，優(yōu)選包括含有圖1所示的4H5HV0、HV5a和HV6中任一氨基酸序 列的VH和含有圖2所示的4H5LV0、LVlb和LV3中任一氨基酸序列的VL的人源化抗體。具體地，實(shí)例包括含有以下VH和VL的人源化抗體含有由SEQID N0 :12、15和16 所示的任一氨基酸序列的VH和含有由SEQ ID N0:14、17和18所示的任一氨基酸序列的 VL。作為圖1所示的VH的氨基酸序列與圖2所示的VL的氨基酸序列的組合，優(yōu)選HV0 與 LV0、HV5a 與 LV0、HV5a 與 LVlb、HV5a 與 LV3、HV6 與 LV0、HV6 與 LVlb 和 HV6 與 LV3 的組
八
口 o因此，作為本發(fā)明的抗體，更優(yōu)選以下(1)至(7)的人源化抗體(1)人源化抗體(HV0LV0)，其包括含有圖1中HV0所示的氨基酸序列的VH和含有 圖2中LV0所示的氨基酸序列的VL ；
(2)人源化抗體(HV5aLV0)，其包括含有圖I中HV5a所示的氨基酸序列的VH和含有圖2中LVO所示的氨基酸序列的VL ；(3)人源化抗體(HV5aLVlb)，其包括含有圖I中HV5a所示的氨基酸序列的VH和含有圖2中LVlb所示的氨基酸序列的VL ；(4)人源化抗體(HV5aLV3)，其包括含有圖I中HV5a所示的氨基酸序列的VH和含有圖2中LV3所示的氨基酸序列的VL ； (5)人源化抗體(HV6LV0)，其包括含有圖I中HV6所示的氨基酸序列的VH和含有圖2中LVO所示的氨基酸序列的VL ；(6)人源化抗體(HV6LVlb)，其包括含有圖I中HV6所示的氨基酸序列的VH和含有圖2中LVlb所示的氨基酸序列的VL ；(7)人源化抗體(HV6LV3)，其包括含有圖I中HV6所示的氨基酸序列的VH和含有圖2中LV3所示的氨基酸序列的VL。以上抗體的具體實(shí)例包括VH和VL所含有的氨基酸序列組合為以下(I)至(7)的人源化抗體(I)由SEQIDNO:12所示的氨基酸序列和由SEQIDNO:14所示的氨基酸序列
⑵由SEQIDNO:15所示的氨基酸序列和由SEQIDNO:14所示的氨基酸序列
⑶由SEQIDNO: 15所示的氨基酸序列和由SEQIDNO:17所示的氨基酸序列
⑷由SEQIDNO:15所示的氨基酸序列和由SEQIDNO:18所示的氨基酸序列
(5)由SEQIDNO:16所示的氨基酸序列和由SEQIDNO:14所示的氨基酸序列
(6)由SEQIDNO:16所示的氨基酸序列和由SEQIDNO:17所示的氨基酸序列
(7)由SEQIDNO:16所示的氨基酸序列和由SEQIDNO:18所示的氨基酸序列。此外，本發(fā)明的人源化抗體的實(shí)例包括與以上人源化抗體競(jìng)爭(zhēng)與Αβ寡聚體結(jié)合的人源化抗體，和與以上人源化抗體所識(shí)別的表位相同的表位結(jié)合的人源化抗體。在本發(fā)明中，人抗體最初是天然存在于人體內(nèi)的抗體，并且其還包括從人抗體噬菌體庫(kù)、產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等中獲得的抗體，其中所獲得的抗體是基于在基因工程、 細(xì)胞工程和發(fā)育工程技術(shù)方面的近期進(jìn)展而制備的。例如可以通過(guò)以下方法制備存在于人體內(nèi)的抗體分離人外周血淋巴細(xì)胞，通過(guò)用EB病毒等感染而使其永生化，并然后將其進(jìn)行克隆，從而獲得能夠產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞，培養(yǎng)由此獲得的淋巴細(xì)胞，并且從培養(yǎng)上清液中純化抗體。人抗體噬菌體庫(kù)是通過(guò)將從人B細(xì)胞制備的編碼抗體的基因插入噬菌體基因而將諸如Fab和scFV的抗體片段表達(dá)在噬菌體表面的庫(kù)。用與固定化抗原基質(zhì)結(jié)合的活性作為指標(biāo)，可以從該庫(kù)中回收表達(dá)具有所需的細(xì)胞表面上的抗原結(jié)合活性的抗體片段的噬菌體。通過(guò)基因工程技術(shù)可以進(jìn)一步將該抗體片段轉(zhuǎn)化成含有兩個(gè)完整H鏈和兩個(gè)完整L鏈的人抗體分子中。產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是人抗體基因被整合入細(xì)胞的動(dòng)物。具體地，可以通過(guò)以下方法制備產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物將編碼人抗體的基因?qū)胄∈驟S細(xì)胞，將該ES細(xì)胞移植入其它小鼠的早期胚胎，并且然后使其發(fā)育成為完整動(dòng)物。可以通過(guò)以下方法制備源自產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的人抗體通過(guò)通常在非人動(dòng)物中進(jìn)行的雜交瘤制備方法獲得產(chǎn)生人抗體的雜交瘤，培養(yǎng)所獲得的雜交瘤，并且在培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生和積累人抗體。本發(fā)明的抗體或抗體片段還包括在構(gòu)成以上抗體或抗體片段的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸、活性與以上抗體或抗體片段類(lèi)似的抗體或其抗體片段。缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸殘基的數(shù)量是一個(gè)或者多個(gè)，并且沒(méi)有特殊限定，但是其在用已知方法可以實(shí)現(xiàn)的缺失、取代或添加的范圍內(nèi)，所述已知方法如 Molecular Cloning,第二 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)； Current Protocols in Molecular Biology, John ffilly&Sons(1987-1997) ；Nucleic Acids Research, 1￡, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79., 6409 (1982) Gene, 34, 315(1985), Nucleic Acids Research, 13., 4431 (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488(1985)等中所述的定點(diǎn)突變。例如，該數(shù)量為I至數(shù)十，優(yōu)選為I至20，更優(yōu)選為I至 10，并且最優(yōu)選為I至5。在以上抗體的氨基酸序列中缺失、取代、插入、添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的意思如下。即，其是指在抗體的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列的單一序列中的任意位置存在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的缺失、取代、插入或添加。此外，缺失、取代、插入或添加可以同時(shí)發(fā)生，并且被取代、插入或添加的氨基酸可以是天然型或非天然型的。 天然型的氨基酸包括L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴(lài)氨酸、L-精氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸、L-半胱氨酸
坐寸ο可互相取代的氨基酸的優(yōu)選實(shí)例如下。同一組中的氨基酸可以互相取代A組亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、甲硫氨酸、O-甲基絲氨酸、t- 丁基甘氨酸、t- 丁基丙氨酸、環(huán)己基丙氨酸B組天門(mén)冬氨酸、谷氨酸、異天門(mén)冬酸、異谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸C組天冬酰胺、谷氨酰胺D組賴(lài)氨酸、精氨酸、鳥(niǎo)氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3 二氨基丙酸E組脯氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸F組絲氨酸、蘇氨酸、高絲氨酸G組苯丙氨酸、酪氨酸本發(fā)明的抗體片段包括Fab、F (ab，)2、Fab、scFv、雙價(jià)抗體、dsFv、含有CDR的肽，
坐坐寸寸οFab是分子量為約50，000且具有抗原結(jié)合活性的抗體片段，其中在通過(guò)用蛋白酶、木瓜蛋白酶(在H鏈的第224位氨基酸殘基處切割)處理IgG抗體分子而獲得的片段中，H鏈的約一半N端與整個(gè)L鏈通過(guò)二硫鍵結(jié)合在一起?？梢酝ㄟ^(guò)用蛋白酶、木瓜蛋白酶處理特異性識(shí)別Αβ寡聚體并與其胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的單克隆抗體獲得本發(fā)明的Fab。此外，也可以通過(guò)以下方法制備Fab :將編碼抗體的Fab 的DNA插入原核生物的表達(dá)載體或真核生物的表達(dá)載體，并且將該載體導(dǎo)入原核生物或真核生物，從而表達(dá)Fab。F(ab’ )2是具有約100，000的分子量和抗原結(jié)合活性、并且含有兩個(gè)Fab區(qū)的抗體片段，其中兩個(gè)Fab區(qū)在通過(guò)用酶、胃蛋白酶消化IgG鉸鏈區(qū)的二硫鍵的較低部位而獲得的鉸鏈部位結(jié)合?？梢酝ㄟ^(guò)用蛋白酶、胃蛋白酶處理特異性識(shí)別Αβ寡聚體并與其胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的單克隆抗體獲得本發(fā)明的F(ab’)2。此外，可以通過(guò)用硫醚鍵或二硫鍵結(jié)合以下所述的 Fab，而制備 F(ab’)2。Fab’是分子量為約50，000并且具有抗原結(jié)合活性的抗體片段，其是通過(guò)切割以上F(ab’)2的鉸鏈區(qū)的二硫鍵而獲得?？梢酝ㄟ^(guò)用還原劑、二硫蘇糖醇處理特異性識(shí)別Αβ寡聚體并與其胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的F (ab’)2獲得本發(fā)明的Fab’。此外，可以通過(guò)以下方法制備Fab’ 將編碼抗體的Fab’片段的DNA插入原核生物的表達(dá)載體或真核生物的表達(dá)載體，并且將該載體引入原核生物或真核生物，從而表達(dá) Fab，。scFv是VH-P-VL或者VL-P-VH多肽并且是具有抗原結(jié)合活性的抗體片段，其中利用適當(dāng)?shù)碾慕宇^(以下稱(chēng)為“P”)連接VH鏈和VL鏈?？梢酝ㄟ^(guò)以下方法制備本發(fā)明的scFv :獲得編碼特異性識(shí)別Αβ寡聚體并與胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的單克隆抗體的VH和VL的cDNA，構(gòu)建編碼scFv的DNA，將該DNA插入原核生物的表達(dá)載體或真核生物的表達(dá)載體，并且將該表達(dá)載體導(dǎo)入原核生物或真核生物，從而表達(dá)ScFv0雙價(jià)抗體是scFv 二聚化的抗體片段，并且其具有二價(jià)抗原結(jié)合活性。在其二價(jià)抗原結(jié)合活性中，兩個(gè)抗原可以是相同的或不同的。可以通過(guò)以下方法制備本發(fā)明的雙價(jià)抗體獲得編碼特異性識(shí)別Αβ寡聚體并與其胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的單克隆抗體的VH和VL的cDNA，構(gòu)建編碼scFv的DNA使得P的氨基酸序列長(zhǎng)度是8個(gè)或更少殘基，將該DNA插入原核生物的表達(dá)載體或真核生物的表達(dá)載體，并且然后將該載體導(dǎo)入原核生物或真核生物，從而表達(dá)雙價(jià)抗體。通過(guò)將VH和VL各有一個(gè)氨基酸殘基被取代為半胱氨酸殘基的多肽通過(guò)半胱氨酸之間的二硫鍵結(jié)合而獲得dsFv?？梢园凑誖eiter等[Protein Engineering, 7,697 (1994)] 所示方法基于抗體的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)選擇被半胱氨酸殘基取代的氨基酸殘基?？梢酝ㄟ^(guò)以下方法制備本發(fā)明的dsFv :獲得編碼特異性識(shí)別Αβ寡聚體并與胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的單克隆抗體的VH和VL的cDNA，構(gòu)建編碼dsFv的DNA，將該DNA插入原核生物的表達(dá)載體或真核生物的表達(dá)載體，并且然后將該載體導(dǎo)入原核生物或真核生物，從而表達(dá)dsFv。通過(guò)包含VH或VL的⑶R的至少一個(gè)區(qū)域或多個(gè)區(qū)域，構(gòu)建含有⑶R的肽。通過(guò)將CDR直接連接或通過(guò)適當(dāng)?shù)碾慕宇^連接，可以制備含有多個(gè)CDR的肽。可以通過(guò)以下方法制備本發(fā)明的含有CDR的肽構(gòu)建編碼特異性識(shí)別本發(fā)明的 A β寡聚體的人源化抗體的VH和VL的⑶R的DNA，將該DNA插入原核生物的表達(dá)載體或真核生物的表達(dá)載體，并且然后將該表達(dá)載體導(dǎo)入原核生物或真核生物，從而表達(dá)該肽。也可以通過(guò)諸如Fmoc方法和tBoc方法的化學(xué)合成方法產(chǎn)生含有⑶R的肽。本發(fā)明的抗體包括抗體衍生物，所述抗體衍生物中，本發(fā)明的抗Αβ寡聚體人源化抗體或者其抗體片段與放射性同位素、低分子劑、高分子劑、蛋白質(zhì)、治療抗體等以化學(xué)方式或基因方式連接。可以通過(guò)以下方法制備本發(fā)明的抗體衍生物將放射性同位素、低分子劑、高分子劑、蛋白質(zhì)、治療抗體等與本發(fā)明的抗Αβ寡聚體人源化抗體或其抗體片段的H鏈或L鏈的 N端或C端、抗體或其抗體片段的適當(dāng)?shù)娜〈騻?cè)鏈、抗體或其抗體片段的糖鏈等化學(xué)連接[抗體工學(xué)入門(mén)，地人書(shū)館(1994)]。此外，可以通過(guò)以下方法用基因方法產(chǎn)生本發(fā)明的抗體衍生物將編碼本發(fā)明的抗A β寡聚體人源化抗體或其抗體片段的DNA與編碼待連接的蛋白質(zhì)的其它DNA或者編碼治療抗體的DNA連接，將該DNA插入表達(dá)載體，并且將該表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。如果以上抗體衍生物被分別用作檢測(cè)方法、定量方法或診斷方法的檢測(cè)劑、定量測(cè)定劑或診斷劑，本發(fā)明的抗Αβ寡聚體人源化抗體或其抗體片段所連接的藥劑的實(shí)例包括通常被用于免疫檢測(cè)或測(cè)定方法的標(biāo)記。該標(biāo)記包括諸如堿性磷酸酶、過(guò)氧化物酶和熒光素酶的酶、諸如吖啶酯和洛粉堿的發(fā)光物質(zhì)、諸如熒光素異硫氰酸酯(FITC)和四甲基羅丹明異硫氰酸酯(RITC)的熒光物
質(zhì)7等等。以下描述產(chǎn)生抗體的方法。I.抗Αβ寡聚體單克隆抗體的產(chǎn)生在本發(fā)明中，可以用以下方法制備抗Αβ寡聚體單克隆抗體。(I)抗原的制備制備作為抗原的Αβ寡聚體的方法如下將合成的Aβ 1-42 (P印tide Institute, Inc.大阪)溶解于去離子蒸餾水或10mmol/L的磷酸鹽緩沖液中，并且在37°C溫育18小時(shí)，用4至12 %的SDS-PAGE分離該肽，用CBB染色使所產(chǎn)生的物質(zhì)顯影，然后僅收集沒(méi)有被 Αβ 1-42單體污染的Aβ 1-42四聚體，從而可以制備Aβ 1-42寡聚體?？梢酝ㄟ^(guò)以下方法制備含有多個(gè)寡聚體的Αβ 1-40寡聚體在合成的 A β 1-40 (Peptide Institute, Inc.大阪)的聚合反應(yīng)之后，用常規(guī)方法化學(xué)連接6-羧基四甲基羅丹明(6-TAMRA) (SIGMA)與合成的A β 1-40肽的N端。(2)動(dòng)物的免疫首先，用弗氏完全佐劑將2. 5μ g的Αβ 1-42四聚體或A β 1-40寡聚體乳化。然后， 在Balb-c小鼠的足墊上免疫接種該抗原。接著，進(jìn)行另外6次免疫接種?？梢允褂靡阎椒ㄟM(jìn)行產(chǎn)生抗體細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞之間的融合，如使用Kohler和Milstein等(Kohler. G 和Milstein, C. ,Methods Enzymol. (1981)73,3-46)等的方法。具體地，從已經(jīng)被免疫接種抗原的小鼠的腹股溝淋巴結(jié)中獲得產(chǎn)生抗體的免疫細(xì)胞。通過(guò)皮下、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)注射向動(dòng)物一起施用抗原和適當(dāng)?shù)淖魟┤绺ナ贤耆魟┖蜌溲趸X凝膠與百日咳疫苗的組合，從而進(jìn)行免疫。當(dāng)用部分肽作為抗原時(shí)，生產(chǎn)與諸如BSA (牛血清白蛋白)和KLH (鑰孔血藍(lán)蛋白) 的載體蛋白的結(jié)合物用作抗原。用抗原免疫的動(dòng)物可以是任何動(dòng)物，只要可以制備雜交瘤即可，優(yōu)選使用小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、雞、兔等。此外，本發(fā)明的抗體包括由雜交瘤產(chǎn)生的抗體，其中所述雜交瘤是通過(guò)將骨髓瘤細(xì)胞與源自體外免疫后的動(dòng)物的具有產(chǎn)生抗體活性的細(xì)胞融合而獲得。(3)骨髓瘤細(xì)胞的制備
用源自小鼠的成熟細(xì)胞系作為雜交瘤細(xì)胞。實(shí)例包括8-氮雜鳥(niǎo)嘌呤抗性鼠源骨髓瘤細(xì)胞株(源自 BALB/c)P3-X63Ag8_Ul (P3-U1) [Current Topics in Microbiology and Immunology,18, I(1978) ]、P3_NSl/l_Ag41 (NS-I) [European J. Immunology, 6,511 (1976)], SP2/0-Agl4(SP-2) [Nature, 276, 269 (1978) ], P3_X63_Ag8653 (653) [J. Immunology, 123,1548(1979) I、P3~X63~Ag8 (X63) [Nature, 256,495 (1975)]等。在常規(guī)培養(yǎng)基(含有谷氨酰胺、2-巰基乙醇、慶大霉素、FBS和8-氮鳥(niǎo)嘌呤的 RPMI1640培養(yǎng)基)中將該骨髓瘤細(xì)胞繼代培養(yǎng)。在細(xì)胞融合3或4天前，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移入常規(guī)培養(yǎng)基，從而確保融合當(dāng)天的細(xì)胞數(shù)為2X107以上。(4)細(xì)胞融合與產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤的制備可以用聚乙二醇1500將步驟⑵中所獲得的用于融合的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞和步驟
(3)中所獲得的骨髓瘤細(xì)胞融合，從而產(chǎn)生雜交瘤。在培養(yǎng)后，對(duì)部分培養(yǎng)上清液取樣并進(jìn)行雜交瘤篩選方法，如斑點(diǎn)印跡和結(jié)合分析，從而鑒定產(chǎn)生如下文所述的與Αβ寡聚體反應(yīng)且不與Αβ單體反應(yīng)的抗體的細(xì)胞群。然后，用有限稀釋法[第一輪中使用HT培養(yǎng)基(沒(méi)有氨基喋呤的HAT培養(yǎng)基)，第二輪中使用常規(guī)培養(yǎng)基]克隆兩次，并且選擇穩(wěn)定顯示出高抗體效價(jià)的雜交瘤作為產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤。(5)純化單克隆抗體的制備通過(guò)腹膜內(nèi)注射向8至10周齡的小鼠或裸鼠施用步驟⑷中所獲得的產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，其中小鼠或裸鼠被用降植烷預(yù)處理(經(jīng)腹膜內(nèi)施用0. 5mL的2，6，10， 14-四甲基十五烷(降植烷)，隨后飼養(yǎng)2周)。雜交瘤在10至21天內(nèi)形成腹水腫瘤。從小鼠中收集腹水液，離心除去固體，用 40-50 %硫酸銨進(jìn)行鹽析，然后用辛酸沉淀，過(guò)DEAE-瓊脂糖凝膠柱、蛋白A柱或凝膠過(guò)濾柱，從而收集IgG或IgM級(jí)分作為純化的單克隆抗體。(6)單克隆抗體的選擇作為篩選抗體的方法，可以示例的是利用抗體與Αβ寡聚體的結(jié)合活性作為指標(biāo)選擇抗體的方法。本發(fā)明的抗體對(duì)抗原(Αβ寡聚體)的結(jié)合活性可以用以下方法中的至少一種方法進(jìn)行分析，如吸光度測(cè)定法、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(斑點(diǎn)印跡法，ELISA)、酶免疫分析法(ELA)、放射免疫分析法(RIA)、免疫熒光法和使用表面等離子體共振方法(SPR法)的 Biacore (Biacore Life Science)。具體地，可以用斑點(diǎn)印跡法測(cè)定抗Αβ寡聚體的單克隆抗體與Αβ寡聚體的結(jié)合，其中將2.5yL的Αβ 1-42(2. 5 μ g/點(diǎn))預(yù)溫育18小時(shí)，接著將其固定在硝酸纖維素膜上。在用含有5%低脂乳、I % BSA和0.05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液將膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)封閉之后，用培養(yǎng)上清液溫育該膜，并從而使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光 (ECL)試劑盒和LAS3000mini (Fujitsu, Tokyo, Japan)用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠F (ab’)2 (I : 3000 ；Amersham)檢測(cè)培養(yǎng)上清液中結(jié)合抗體的A β寡聚體(W0 2009/051220)。如下進(jìn)行ELISA :將抗體固定在平板上，向平板上加入針對(duì)該抗體的抗原，并且加入含有所需抗體的樣品、如產(chǎn)生該抗體的細(xì)胞的培養(yǎng)上清液和純化的抗體。接著，向其中加入識(shí)別一抗并且被用諸如堿性磷酸酶的酶標(biāo)記的二抗，并且將該平板溫育。在清洗后，向平板加入諸如對(duì)硝基苯磷酸鹽的酶底物，并且測(cè)定吸光度從而評(píng)價(jià)靶樣品的抗原結(jié)合能力。另外，在本發(fā)明中，為了特異性檢測(cè)Αβ寡聚體，而不檢測(cè)Αβ單體，還可以使用采用化學(xué)發(fā)光的夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(化學(xué)發(fā)光ELISA)測(cè)定抗體的反應(yīng)性(W0 2009/051220)。另外，為了評(píng)價(jià)已經(jīng)被體內(nèi)施用到小鼠外周的單克隆抗體的效力，可以進(jìn)行HPR 標(biāo)記的4Η5 (Senetek PLC, Napa, CA，美國(guó))人特異性寡聚體ELISA，從而分析從本發(fā)明的被給藥小鼠收集的血漿和器官的Αβ寡聚體(W0 2009/051220)。此外,通過(guò)用含有大量Aβ寡聚體的淀粉樣蛋白級(jí)分(Matsubara E等Neurobiol Aging, 2004)進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)(Ghiso J等Biochem J, 1993),可以測(cè)定本發(fā)明的抗A β 寡聚體的人源化抗體是否可以與AD腦中的A β寡聚體結(jié)合(W0 2009/051220)。(7)抗Αβ寡聚體抗體活性的評(píng)價(jià)在本發(fā)明中，通過(guò)用于硫磺素(ThT)分析的Αβ溫育、Αβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性分析和對(duì)具有由超濾或者凝膠過(guò)濾分離的多種分子尺寸的Αβ寡聚體的反應(yīng)性測(cè)定，可以確定抗 Αβ寡聚體抗體與Αβ寡聚體特異性結(jié)合，并且具有細(xì)胞保護(hù)活性，Yamamoto N等J. Biol. Chem. ,282 :2646-2655,2007 或者 WO 2009/051220 中公開(kāi)了全部所述方法。此外，可以利用ThT檢測(cè)和電子顯微鏡分析測(cè)定抑制A β淀粉樣纖維形成的活性。在本發(fā)明中，通過(guò)利用抗A β寡聚體的人源化抗體測(cè)定免疫沉淀中的SDS穩(wěn)定的 4_，5_，8_，12-聚體的存在，可以測(cè)定兩種抗體在AD腦中捕獲A β寡聚體的能力。此外，在本發(fā)明中，在APPswe轉(zhuǎn)基因小鼠中測(cè)定預(yù)防AD樣病變的能力的方法的實(shí)例包括如下方法將本發(fā)明的人源化抗體施用給小鼠，從而檢測(cè)是否可以預(yù)防AD樣病變， 如記憶障礙、神經(jīng)炎性斑病變、突觸功能障礙和Aβ的積累(W0 2009/051220)。2.重組抗體的制備產(chǎn)生穩(wěn)定表達(dá)重組抗體的轉(zhuǎn)化子和產(chǎn)生該重組抗體的方法可以如下進(jìn)行。(I)用于表達(dá)重組抗體的載體的構(gòu)建用于表達(dá)重組抗體的載體是動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體，其中已經(jīng)被插入了編碼人抗體的CH和CL的DNA，并且其是通過(guò)將編碼人抗體的CH和CL的各DNA克隆入動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體而構(gòu)建。人抗體的C區(qū)可以是任意人抗體的CH和CL。實(shí)例包括屬于Y I亞類(lèi)的CH、屬于 K類(lèi)的CL等?？梢允褂煤型怙@子和內(nèi)含子的染色體DNA或cDNA作為編碼人抗體的CH 和CL的DNA?？梢允褂萌我獗磉_(dá)載體作為動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體，只要編碼人抗體C區(qū)的基因可以被插入其中并在其中表達(dá)即可。實(shí)例包括pAGE107[Cytotechnol. ,3,133(1990)], pAGE103 [J. Biochem. , 101,1307 (1987) ]、pHSG274 [Gene, 27, 223 (1984) ]、pKCR[Proc. Nail. Acad. Set USA,78, 1527 (1981)]、pSGlbd2-4[Cytotechnol. ,4,173 (1990)]、 pSElUKlSedl-3 [Cytotechnol. ,13, 79 (1993)]等。用于動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的實(shí)例包括SV40早期啟動(dòng)子 [J. Biochem. , 101,1307 (1987) ]、Moloney 小鼠白血病病毒 LTR[Biochem. Biophys. Res. Commun. , 149,960 (1987) I、免疫球蛋白 H 鏈啟動(dòng)子[CelI， ，479 (1985)]和增強(qiáng)子[Cell，33,717(1983)]等。用于表達(dá)重組抗體的載體可以是編碼抗體H鏈的基因和編碼抗體L鏈的基因存在于不同載體上的類(lèi)型或者兩個(gè)基因都存在于相同載體上的類(lèi)型(串聯(lián)型)。對(duì)于構(gòu)建表達(dá)重組抗體的載體的簡(jiǎn)便性、導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞的簡(jiǎn)便性和動(dòng)物細(xì)胞中抗體H和L鏈的表達(dá)量的平衡而言，更優(yōu)選用于表達(dá)重組抗體的串聯(lián)型載體[J. Immunol. Methods, 167，271 (1994)]。用于表達(dá)重組抗體的串聯(lián)型載體的實(shí)例包括pKANTEX93 (W097/10354)、 pEE18 [Hybridoma,17, 559 (1998)]等。(2)編碼非人動(dòng)物源抗體V區(qū)的cDNA的制備和氨基酸序列分析從產(chǎn)生非人動(dòng)物源抗體的雜交瘤細(xì)胞中提取mRNA以合成cDNA。將所合成的cDNA 克隆入載體，并使用DNA測(cè)序儀進(jìn)行序列分析，從而測(cè)定編碼VH和VL的核苷酸序列?？梢杂萌缦路椒ㄗC實(shí)所獲得的cDNA是否編碼含有分泌信號(hào)序列的抗體VH和VL 的完整氨基酸序列從所測(cè)定的核苷酸序列中評(píng)估VH和VL氨基酸序列的全長(zhǎng)，并將其與已知抗體VH和VL的全長(zhǎng)氨基酸序列進(jìn)行比較[Sequences of Proteins of Immunological Interest, USDept. Health and Human Services(1991)]。通過(guò)將含有分泌信號(hào)序列的抗體的VH和VL的全長(zhǎng)氨基酸序列與已知抗體VH和 VL的全長(zhǎng)氨基酸序列進(jìn)行比較[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept. Health and Human Services (1991)],可以推斷分泌信號(hào)序列和N端氨基酸序列的長(zhǎng)度，并且還可以知道其所屬亞組。此外，通過(guò)將所獲得的氨基酸序列與已知抗體VH和VL的氨基酸序列進(jìn)行比較[Sequences of Proteins of Immunological Interest, USDept. Health and Human Services (1991)],可以找出VH和VL的各個(gè)Q)R的氨基酸序列。(3)用于表達(dá)人嵌合抗體的載體的構(gòu)建將編碼非人動(dòng)物抗體的VH和VL的cDNA克隆入以上(I)中所述表達(dá)重組抗體的載體中編碼人抗體CH或CL的基因的上游，從而構(gòu)建用于表達(dá)人嵌合抗體的載體。例如，設(shè)計(jì)和構(gòu)建編碼VH和VL的cDNA，使得其含有編碼適當(dāng)?shù)陌被岵⒕哂羞m當(dāng)?shù)南拗菩悦缸R(shí)別位點(diǎn)的接頭序列，使得可以在源自非人動(dòng)物抗體的VH或VL的cDNA的 3’ -末端與源自人抗體的CH或CL的5’ -末端之間產(chǎn)生連接?？寺∷a(chǎn)生的編碼VH和VL的每個(gè)cDNA，使得每個(gè)cDNA在以上(I)中所述用于表達(dá)人源化抗體的載體中編碼人抗體CH或CL的基因的上游以適當(dāng)?shù)男问奖磉_(dá)，從而構(gòu)建用于表達(dá)人嵌合抗體的載體。此外，使用在兩端具有合適的限制性酶識(shí)別序列的合成DNA，用PCR方法擴(kuò)增編碼非人動(dòng)物的VH或VL的cDNA，并且將每個(gè)cDNA克隆到以上⑴中所述的用于表達(dá)重組抗體的載體。(4)編碼人源化抗體V區(qū)的cDNA的構(gòu)建可以如下獲得編碼人源化抗體的VH或VL的cDNA。首先，選擇人抗體VH或VL中的框架區(qū)的氨基酸序列(以下稱(chēng)為“FR”)，其中所述人抗體中被移植了源自非人動(dòng)物抗體的抗體VH或VL中的CDR氨基酸序列?？梢允褂萌丝贵wVH或VL中的任意FR氨基酸序列，只要其源自人即可。實(shí)例包括諸如Protein Data Bank的數(shù)據(jù)庫(kù)中所登記的人抗體VH或VL中的FR氨基酸序列，人抗體VH或VL的FR亞組的共有氨基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)],等等。為了抑制抗體的結(jié)合活性，選擇與原抗體VH或VL的FR氨基酸序列的具有高同源性(至少60%或更高)的氨基酸序列。然后，分別將原抗體VH或VL的CDR氨基酸序列移植到所選擇的人抗體VH或VL 中的FR氨基酸序列，從而設(shè)計(jì)人源化抗體的每個(gè)VH或VL氨基酸序列。通過(guò)考慮在抗體基因的核苷酸序列中所發(fā)現(xiàn)的密碼子使用頻率，將所設(shè)計(jì)的氨基酸序列轉(zhuǎn)化為 DNA 序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)],并且設(shè)計(jì)編碼人源化抗體VH或VL的氨基酸序列的 DNA序列。(5)人源化抗體V區(qū)的氨基酸序列的修飾已知的是，當(dāng)通過(guò)僅僅將源自非人動(dòng)物抗體VH和VL的⑶R簡(jiǎn)單移植入人抗體VH 和VL的FR而構(gòu)建人源化抗體時(shí)，人源化抗體的抗原結(jié)合活性低于源自原非人動(dòng)物的抗體的抗原結(jié)合活性[BI0/TECHN0L0GY，9，266 (1991)]。對(duì)于人源化抗體，在人抗體VH和VL的FR氨基酸序列中，鑒定與結(jié)合抗原直接相關(guān)的氨基酸殘基、與CDR的氨基酸殘基相互作用的氨基酸殘基以及維持抗體的三維結(jié)構(gòu)并且與結(jié)合抗原間接相關(guān)的氨基酸殘基，并將其修飾為在原非人抗體中所發(fā)現(xiàn)的氨基酸殘基，從而增強(qiáng)已經(jīng)降低的抗原結(jié)合活性。為了鑒定FR中與抗原結(jié)合活性相關(guān)的氨基酸序列，構(gòu)建抗體的三維結(jié)構(gòu)，用于X 射線結(jié)晶學(xué) Γ.Τ. Mol. Biol, 112, 535 (1977) I、計(jì)算坑模型分析[Protein Engineering, 7, 1501(1994)]等。此外，通過(guò)反復(fù)嘗試產(chǎn)生每個(gè)抗體的數(shù)種修飾并且檢測(cè)被修飾抗體與其抗原結(jié)合活性之間的關(guān)系，可以鑒定具有合適的抗原結(jié)合活性的被修飾人源化抗體。使用用于修飾的根據(jù)⑷中所述PCR的各種合成DNA，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)人抗體VH和VL 的FR的氨基酸序列的修飾。按照(2)中所述的方法測(cè)定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列，使得確認(rèn)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)目的修飾。(6)表達(dá)人源化抗體的載體的構(gòu)建將編碼所構(gòu)建重組抗體的VH或VL的每個(gè)cDNA克隆入(I)中所述的表達(dá)重組抗體的載體中編碼人抗體的CH或CL的每個(gè)基因的上游，可以構(gòu)建表達(dá)人源化抗體的載體。例如，在(4)和(5)中的用于構(gòu)建人源化抗體VH或VL的合成DNA中，將合適的限制線酶的識(shí)別序列導(dǎo)入位于兩端的合成DNA的5’末端，使得可以將該VH或VL克隆入以上
(I)中所述人源化抗體表達(dá)載體中編碼人抗體的CH或CL的每個(gè)基因的上游，從而將其以合適的形式進(jìn)行表達(dá)。(7)重組抗體的瞬時(shí)表達(dá)為了有效評(píng)價(jià)所產(chǎn)生的各種人源化抗體的抗原結(jié)合活性，可以用如⑶和(6)中所述的表達(dá)重組抗體的載體或其經(jīng)修飾的表達(dá)載體瞬時(shí)表達(dá)重組抗體?？梢杂萌我饧?xì)胞作為用于導(dǎo)入表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，只要該宿主細(xì)胞可以表達(dá)重組抗體即可。通常使用 C0S-7 細(xì)胞(ATCC CRL1651) [Methods in Nucleic AcidsRes.， CRC Press，283 (1991)]。將表達(dá)載體導(dǎo)入C0S-7細(xì)胞的方法的實(shí)例包括DEAE-葡聚糖方法[Methods inNucleic Acids Res. ,CRC Press, 283 (1991)]、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法]Proc. Natl Acad Sci. USA，M，7413 (1987)]、等等。(8)穩(wěn)定表達(dá)重組抗體的轉(zhuǎn)化子的建立和重組抗體的制備通過(guò)將⑶和(6)中所述的用于表達(dá)重組抗體的載體導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞，可以獲得穩(wěn)定表達(dá)重組抗體的轉(zhuǎn)化子。將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法的實(shí)例包括電穿孔法[日本特開(kāi)平2-257891號(hào)公報(bào)、Cytotechnology, 3,133 (1990)]等?？梢杂萌我饧?xì)胞作為被導(dǎo)入表達(dá)重組抗體的載體的宿主細(xì)胞，只要其是可以表達(dá)重組抗體的宿主細(xì)胞即可。實(shí)例包括CHO-Kl (ATCCCCL-61)、DUKXBl 1(ATCC CCL-9096)、 Pro-5 (ATCC CCL-1781)、CHO-S (Life Technologies,目錄號(hào) 11619)、大鼠 YB2/3HL. P2. Gil. 16Ag. 20細(xì)胞(也稱(chēng)為YB2/0 ；ATCC CRL1662)、鼠源骨髓瘤NS0、鼠源骨髓瘤 SP2/0-Agl4 細(xì)胞(ATCC CRL1581)、鼠源 P3X63_Ag8. 653 細(xì)胞(ATCC CRL1580)、缺失二氫葉酸還原酶基因(以下稱(chēng)為“dhfr “)的CHO細(xì)胞[Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.， 77,4216 (1980)]、凝集素抗性株 Lecl3 [Somatic Cell and Molecular genetics, 12, 55(1986)]、a 1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因缺失的 CHO 細(xì)胞(W0 2005/35586, WO 02/31140)
坐寸ο此外，還可以使用諸如與胞內(nèi)糖核苷酸、GDP-巖藻糖的合成有關(guān)的酶的蛋白質(zhì)、諸如與糖鏈修飾有關(guān)的酶的蛋白質(zhì)、或者與胞內(nèi)糖核苷酸、GDP-巖藻糖向高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的蛋白質(zhì)的活性被降低或消除的宿主細(xì)胞，如W005/35586、W002/31140中所述的缺失a 1， 6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因的CHO細(xì)胞，其中所述糖鏈中復(fù)合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的 I-位與N-乙酰葡萄糖胺的6-位在還原末端通過(guò)α鍵結(jié)合。在引入表達(dá)載體后，通過(guò)在含有諸如G418硫酸鹽(以下也稱(chēng)為“G418”)等的試劑的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，從而選擇穩(wěn)定表達(dá)重組抗體的轉(zhuǎn)化子(日本國(guó)特開(kāi)平2-257891 號(hào)公報(bào))。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的實(shí)例包括RPMI1640培養(yǎng)基(Invitrogen制造)、GIT培養(yǎng)基(日本制藥社制造)、EX-CELL301培養(yǎng)基(JRH制造)、IMDM培養(yǎng)基(Invitrogen制造)、雜交瘤-SFM培養(yǎng)基(Invitrogen制造)、其含有多種諸如FBS的添加劑的衍生培養(yǎng)基。通過(guò)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所選擇的轉(zhuǎn)化子，可以在培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生和積累重組抗體?？梢杂肊LISA等測(cè)定培養(yǎng)上清液中的重組抗體的表達(dá)量和抗原結(jié)合活性。此外，在轉(zhuǎn)化子中，可以按照日本特開(kāi)平2-257891號(hào)公報(bào)所公開(kāi)的方法用DHFR擴(kuò)增系統(tǒng)等增加重組抗體的表達(dá)量?？梢杂玫鞍譇柱從轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)上清液中純化重組抗體[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,第三版，Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]。例如，可以結(jié)合凝膠過(guò)濾、離子交換層析、超濾等組合純化重組抗體。用聚丙烯酰胺凝膠電泳(以下稱(chēng)為“SDS-PAGE，，) [Nature, 227,680 (1970)]、 Western 印跡[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, 第三 版， Academic Press(1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]等測(cè)定被純化的重組抗體的H鏈或L鏈、或者整個(gè)抗體分子的分子量。
3.控制抗體的效應(yīng)子活性的方法作為控制本發(fā)明的抗A β寡聚體人源化抗體的效應(yīng)子活性的方法，已知有控制巖藻糖(以下也稱(chēng)為“核心巖藻糖”)的數(shù)量的方法，所述巖藻糖通過(guò)α-1，6鍵與位于復(fù)合型N-連接糖鏈的還原末端的N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合,所述N-連接糖鏈與抗體Fe區(qū)的第297 位天冬酰胺(Asn)結(jié)合(W02005/035586、W02002/31140 和 W000/61739);通過(guò)修飾抗體 Fe 區(qū)的氨基酸基團(tuán)而控制單克隆抗體的效應(yīng)子活性的方法；改變抗體的亞類(lèi)的方法，等等?？梢杂眠@些方法中的任意方法控制本發(fā)明的抗Aβ寡聚體人源化抗體的效應(yīng)子活性?！靶?yīng)子活性”指由抗體Fe區(qū)所誘導(dǎo)的抗體依賴(lài)的活性。作為效應(yīng)子活性，已知有抗體依賴(lài)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC活性)，補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒作用(CDC活性)，由諸如巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞的吞噬細(xì)胞介導(dǎo)的抗體依賴(lài)的吞噬作用(ADP活性)，等等。通過(guò)控制抗體Fe的復(fù)合型N-連接糖鏈的核心巖藻糖的含量，可以增強(qiáng)或降低抗體的效應(yīng)子活性。作為降低與抗體Fe所結(jié)合的復(fù)合型N-連接糖鏈結(jié)合的巖藻糖的含量的方法，可以通過(guò)用編碼α 1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的基因缺失的CHO細(xì)胞表達(dá)抗體，而獲得未結(jié)合巖藻糖的抗體。未結(jié)合巖藻糖的抗體具有高ADCC活性。另一方面，根據(jù)增加與抗體Fe所結(jié)合的復(fù)合型N-連接糖鏈結(jié)合的巖藻糖的含量的方法，可以通過(guò)用導(dǎo)入了編碼α 1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的基因的宿主細(xì)胞表達(dá)抗體，獲得結(jié)合巖藻糖的抗體。結(jié)合巖藻糖的抗體的ADCC活性低于未結(jié)合巖藻糖的抗體。另外，通過(guò)修飾抗體Fe區(qū)的氨基酸殘基，可以增強(qiáng)或降低ADCC活性或⑶C活性。 例如，通過(guò)使用US2007/0148165中所述的Fe區(qū)的氨基酸序列，可以增強(qiáng)抗體的⑶C活性。 此外，通過(guò)如美國(guó)專(zhuān)利Nos. 6，737，056或7，297，775或7，317，091所述修飾氨基酸，可以增強(qiáng)或降低ADCC活性或⑶C活性。此外，已知在人源IgG亞類(lèi)中，IgG2和IgG4亞類(lèi)的效應(yīng)子活性低于IgGl和IgG3 亞類(lèi)。因此，通過(guò)用效應(yīng)子活性較低的抗體亞類(lèi)的Fe區(qū)取代Fe區(qū)，可以制備效應(yīng)子活性較低的抗體。對(duì)于IgG2和IgG4亞類(lèi)抗體的穩(wěn)定性，可以使用W02006/075668、W02006/035586 等所述的方法制備效應(yīng)子活性受控的穩(wěn)定的IgG2或IgG4抗體。此外，通過(guò)對(duì)一種抗體使用以上所述方法的組合，可以獲得抗體的效應(yīng)子活性受控的抗體。4.使用本發(fā)明的抗A β寡聚體抗體的治療方法已經(jīng)表明，伴隨AD的記憶衰退與可溶性Αβ寡聚體引起的突觸功能障礙有關(guān) [Klein WL. , 2001. Trends Neurosci ；Selkoe DJ. 2002, Science]。因此，Αβ 寡聚體的過(guò)度積累和沉積引發(fā)導(dǎo)致AD的復(fù)雜的下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)。在本發(fā)明中，治療并不必須對(duì)由于障礙或疾病而顯示出癥狀的器官和組織具有徹底的治療作用或預(yù)防作用，而可以提供部分所述效果。本發(fā)明中的AD治療是指改善可能由于AD而發(fā)生的至少一種癥狀。實(shí)例包括改善或抑制認(rèn)知功能障礙，改善或抑制神經(jīng)炎性斑形成，改善或抑制突觸功能障礙，和降低或抑制腦組織、血液等中的Aβ積累。本文的認(rèn)知功能障礙包括，例如，受損的長(zhǎng)期/短期記憶、受損的物體識(shí)別記憶、 受損的空間記憶、和受損的聯(lián)合情感記憶。
此外，作為使用本發(fā)明的抗Αβ寡聚體人源化抗體的治療方法，實(shí)例包括抑制認(rèn)知功能障礙的方法，抑制AD的方法，抑制AD進(jìn)展的方法，抑制神經(jīng)炎性斑形成的方法，抑制 A β積累的方法，中和(抑制)神經(jīng)毒性活性的方法，抑制A β淀粉樣纖維形成的方法，和中和(抑制)突觸毒性活性的方法。此外，其它形式的實(shí)例包括至少一種預(yù)防和治療認(rèn)知功能障礙的方法，和至少一種預(yù)防和治療AD的方法。含有本發(fā)明的單克隆抗體或抗體片段或其衍生物的治療劑可以?xún)H僅由作為活性成分的抗體或者抗體片段或者其衍生物組成，優(yōu)選地，通過(guò)將其與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體混合，以用藥學(xué)技術(shù)領(lǐng)域公知的適當(dāng)方法所產(chǎn)生的藥物制劑的形式提供該治療劑。給藥途徑的實(shí)例包括口服和腸胃外給藥，如口腔，氣管、直腸、皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥。劑型的實(shí)例包括噴霧劑、膠囊、片劑、粉劑、顆粒劑、糖漿、乳劑、栓劑、注射劑、軟
膏、膠帶等。適合口服的藥物制劑包括乳劑、糖漿、膠囊、片劑、粉劑、顆粒即等。可以使用以下物質(zhì)作為添加劑制備諸如乳劑和糖漿的液體制劑水；糖類(lèi)，如蔗糖、山梨糖醇和果糖；二醇類(lèi)，如聚乙二醇和丙二醇；油類(lèi)，如芝麻油、橄欖油和大豆油；防腐劑，如對(duì)羥基苯甲酸酯；香料，如草莓香料和胡椒薄荷；等等。可以用以下物質(zhì)作為添加劑制備膠囊、片劑、粉劑、顆粒劑等賦形劑，如乳糖、葡萄糖、蔗糖和甘露醇；崩解劑，如淀粉和海藻酸鈉；潤(rùn)滑劑，如硬脂酸鎂和滑石粉；粘合劑， 如聚乙烯醇、羥基丙基纖維素和明膠；表面活性劑，如脂肪酸酯；增塑劑，如甘油；等等。適合于腸胃外給藥的藥物制劑包括注射劑、栓劑、噴霧劑等?？梢杂弥T如鹽溶液、葡萄糖溶液和二者的混合物的載體制備注射劑?？梢杂弥T如可可脂、氫化脂肪或羧酸的載體制備栓劑?？梢允褂帽景l(fā)明的抗體或抗體片段本身，或者將其與不刺激患者的口腔或氣道粘膜并能夠通過(guò)將化合物分散成為細(xì)顆粒而促進(jìn)該化合物吸收的載體一起使用，制備噴霧劑。載體包括乳糖、甘油等。可以產(chǎn)生諸如氣霧劑和干粉的藥物制劑。此外，也可以將作為口服制劑的添加劑示例的組分添加到腸胃外制劑。實(shí)施例I抗Αβ寡聚體人源化抗體的制備(I)抗A β寡聚體人源化抗體的VH和VL氨基酸序列的設(shè)計(jì)如下設(shè)計(jì)抗A β寡聚體人源化抗體的VH的氨基酸序列。首先，基于Kabat 等人的報(bào)道[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)],將該氨基酸序列的(SEQ ID NO: 8)的CDR序列確定為在參考例中制備的抗Αβ寡聚體小鼠單克隆抗體4Η5抗體的VH。因此，將VH的⑶Rl至3的氨基酸序列設(shè)定為SEQ ID NO :1至3所示的序列。然后，為了植入VH的⑶R I至3的氨基酸序列(SEQ ID NO : I至3)，選擇人源化抗體中VH的FR的氨基酸序列?；谝阎鞍踪|(zhì)的氨基酸數(shù)據(jù)庫(kù)，利用GCG包(Geneticscomputer Group)作為序列分析系統(tǒng),用 BLASTP 方法[Nucleic Acid Res. , 25, 3389 (1997)] 搜索與4H5VH具有強(qiáng)同源性的人源化抗體。當(dāng)比較同源性分值與實(shí)際的氨基酸序列之間的同源性時(shí)，SWISSPR0T數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)為CAA67407的免疫球蛋白Y重鏈(以下稱(chēng)為CAA67407)顯示出80. 5%的同源性，且是同源性最高的人抗體，從而選擇該抗體的FR的氨基酸序列。將4H5的VH的CDR氨基酸序列(SEQ ID NO :1至3)移植在由此獲得的人源化抗體的FR氨基酸序列中的適當(dāng)位置。用這種方式，設(shè)計(jì)了抗Αβ寡聚體4Η5人源化抗體的VH 的氨基酸序列 4H5HV0(SEQID NO :12)。接著，以與H鏈相同的方式，將VL氨基酸序列(SEQ ID NO 10)的⑶R I至3的序列分別確定為SEQ ID NO :4至6的氨基酸序列，并且如下設(shè)計(jì)抗A β寡聚體4Η5人源化抗體的VL的氨基酸序列。為了分別移植4Η5抗體VL的⑶R I至3的氨基酸序列(SEQ ID NO :4至6)，選擇人抗體VL的FR氨基酸序列。Kabat等人已經(jīng)基于氨基酸序列的同源性將各種已知人抗體的VL分為亞組(HSG I至IV),并且已經(jīng)報(bào)道了各個(gè)亞組的共有序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)]。因此，研究了人抗體VL的I至IV亞組中共有序列的FR氨基酸序列與4H5VL的FR 氨基酸序列之間的同源性。同源性搜索的結(jié)果是，HSGI, HSGII, HSGIII和HSGIV的同源性分別是68. 8%，86. 3%，68. 8%和76. 3%。因此，4H5VL的FR氨基酸序列與II亞組具有最高的同源性。基于以上結(jié)果，將4H5VL的每個(gè)⑶R氨基酸序列(SEQ ID NO 4至6)移植在人抗體VL的II亞組的共有序列的FR氨基酸序列的適當(dāng)位置。但是，4H5VL氨基酸序列的第109位Leu不是在Kabat等人所示例的人抗體的FR 氨基酸序列的相應(yīng)位點(diǎn)最經(jīng)常使用的氨基酸殘基，而是以相對(duì)高頻率使用的氨基酸殘基。因此，采用在以上4H5的氨基酸序列中所見(jiàn)到的氨基酸殘基。如上所述，設(shè)計(jì)抗Αβ寡聚體4Η5人源化抗體的VL氨基酸序列(SEQ ID NO 14)4H5LV0。所設(shè)計(jì)的抗A β寡聚體4Η5人源化抗體的VH氨基酸序列4H5HV0和VL氨基酸序列4H5LV0是通過(guò)僅將抗A β寡聚體小鼠單克隆抗體4Η5的CDR氨基酸序列移植到被選擇的人抗體FR的氨基酸序列而構(gòu)建的序列。但是，一般在人源化抗體的構(gòu)建中，在僅將小鼠抗體的CDR氨基酸序列植入到人抗體的FR時(shí)，很多情況下降低了結(jié)合活性。因此，為了防止結(jié)合活性的降低，在移植CDR氨基酸序列時(shí)，同時(shí)對(duì)被認(rèn)為影響結(jié)合活性的氨基酸殘基進(jìn)行修飾，所述氨基酸殘基位于人抗體的FR并且與小鼠抗體的相應(yīng)氨基酸殘基不同。因此，在本實(shí)施例中，以實(shí)施例中的以下方式鑒定被認(rèn)為影響結(jié)合活性的FR的氨
基酸殘基。首先，用計(jì)算機(jī)模型技術(shù)構(gòu)建抗體V區(qū)(以下稱(chēng)為HV0LV0)的三維結(jié)構(gòu)，所述抗體 V區(qū)含有如上所述而設(shè)計(jì)的抗A β寡聚體4Η5人源化抗體的VH氨基酸序列4H5HV0和VL氨基酸序列4H5LV0。
使用Discovery Studio (Accelrys, Inc.),按照其中所附的說(shuō)明進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的構(gòu)建和三維結(jié)構(gòu)的顯示。也用同樣方法構(gòu)建抗Αβ寡聚體小鼠單克隆抗體4H5V區(qū)的三維結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)模型。此外，在HVOLVO的VH和VL的FR氨基酸序列中選擇與4Η5中不同的氨基酸殘基， 制備具有4Η5的氨基酸殘基修飾的氨基酸序列，并且用同樣方法構(gòu)建其三維結(jié)構(gòu)模型。比較所產(chǎn)生的這些4H5、HV0LV0和修飾形式的V區(qū)的三維結(jié)構(gòu)，鑒定被認(rèn)為影響抗體的結(jié)合活性的氨基酸殘基。因此，在HVOLVO中的FR的氨基酸殘基中，作為被認(rèn)為改變抗原結(jié)合位點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)且影響抗體的結(jié)合活性的氨基酸殘基，分別選擇由SEQ ID NO :12所示的氨基酸序列中 4H5HV0的第18位的Leu、第46位的Gin、第48位的Met、第49位的Val、第77位的Ser、第 93位的Val，和第98位的Arg，以及4H5LV0的第2位的He、第3位的Val、第15位的Pro、 第50位的Gln和105位的Gin。在這些被選擇的氨基酸殘基中，將至少一個(gè)氨基酸序列修飾為存在于4H5的相同位點(diǎn)的氨基酸殘基，從而設(shè)計(jì)含有包括多種修飾的氨基酸序列的人源化抗體的VH和VL。具體地，在VH中，引入以下氨基酸修飾中的至少一種修飾在由SEQIDN0 :12所示的氨基酸序列中以Arg取代第18位的Leu、以Glu取代第46位的Gin、以Val取代第48位的Met、以Ala取代第49位的Val、以Asn取代第77位的Ser、以Met取代第93位的Val和以Gly取代第98位的Arg。此外，在VL中，引入以下氨基酸修飾中的至少一種修飾在由SEQ ID NO :14所示的氨基酸序列中以Val取代第2位的He、以Leu取代第3位的Pro、以Leu取代第15位的 Pro、以Lys取代第50位的Gln和以Gly取代第105位的Gin。作為HV0LV0的FR中至少一個(gè)氨基酸殘基被修飾的抗A β寡聚體4Η5人源化抗體的抗體 V 區(qū)，設(shè)計(jì)了 HV0LV0、HV0LVla、HV0LVlb、HV0LVlc、HV0LV3、HV0LV5、HV2LV0、HV2LVla、 HV2LVlb、HV2LVlc、HV2LV3、HV2LV5、HV3LV0、HV3LVla、HV3LVlb、HV3LVlc、HV3LV3、HV3LV5、 HV4LV0、HV4LVla、HV4LVlb、HV4LVlc、HV4LV3、HV4LV5、HV5aLV0、HV5aLVla、HV5aLVlb、 HV5aLVlc、HV5aLV3、HV5aLV5、HV5bLV0、HV5bLVla、HV5bLVlb、HV5bLVlc、HV5bLV3、HV5bLV5、 HV6LV0、HV6LVla、HV6LVlb、HV6LVlc、HV6LV3、HV6LV5、HV7LV0、HV7LVla、HV7LVlb、HV7LVlC、 HV7LV3、和 HV7LV5。圖I和圖2分別顯示了 H鏈可變區(qū)HV2、HV3、HV4、HV5a、HV5b、HV6和HV7的氨基酸序列，以及L鏈可變區(qū)LVla、LVlb, LVlc, LVld, LV3和LV4的氨基酸序列。(2)抗Αβ寡聚體人源化抗體的產(chǎn)生利用在編碼4H5VH和4H5VL氨基酸序列的DNA (SEQ ID NO :7至9)中所使用的密碼子，設(shè)計(jì)編碼抗Αβ寡聚體人源化抗體可變區(qū)的氨基酸序列的DNA。在氨基酸修飾中，用哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的頻繁使用的密碼子設(shè)計(jì)DNA。SEQ ID NO : 11和13分別顯示了編碼抗A β寡聚體4Η5人源化抗體的4H5HV0和 4H5LV0的氨基酸序列的DNA序列。此外，用在編碼4H5VH和4H5VL的氨基酸序列的DNA中所用的密碼子設(shè)計(jì)具有氨基酸修飾的可變區(qū)。利用這些氨基酸序列，構(gòu)建人源化抗體的表達(dá)載體，并且表達(dá)人源化抗體。(3)編碼抗A β寡聚體人源化抗體VH的cDNA的構(gòu)建
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用完全化學(xué)合成法產(chǎn)生編碼SEQ ID NO 12中所顯示的已經(jīng)在以上(I)中設(shè)計(jì)的抗Αβ寡聚體人源化抗體VH的氨基酸序列4H5HV0和圖I所顯示的在以上方法⑵中已經(jīng)設(shè)計(jì)的HV5a和HV6的cDNA。(4)編碼抗A β寡聚體人源化抗體VL的cDNA的構(gòu)建用完全化學(xué)合成法產(chǎn)生編碼SEQ ID NO 14中所顯示的已經(jīng)在以上(I)中設(shè)計(jì)的抗A β寡聚體人源化抗體VL的氨基酸序列4H5LV0和圖2所顯示的在以上方法(2)中已經(jīng)設(shè)計(jì)的LVlb和LV3的cDNA。(5)抗Αβ寡聚體人源化抗體表達(dá)載體的構(gòu)建將以上(3)和⑷中所獲得的編碼4H5LV0、HV5a和HV6任一項(xiàng)的cDNA和編碼4H5LV0、LVlb和LV3任一項(xiàng)的cDNA插入W097/10354所公開(kāi)的人源化抗體表達(dá)載體 PKANTEX93的適當(dāng)位置，從而構(gòu)建各種抗A β寡聚體人源化抗體表達(dá)載體。(6)使用動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)抗A β寡聚體人源化抗體由常規(guī)方法[Antibody Engineering, A Practical Guide, W. H. Freeman and Company (1992)]在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)抗A β寡聚體人源化抗體，該方法用以上(5)中所獲得的抗Αβ寡聚體人源化抗體表達(dá)載體進(jìn)行來(lái)獲得用于產(chǎn)生抗Αβ寡聚體人源化抗體 (HV0LVV0、HV5aLV0、HV5aLVlb,、HV5aLV3、HV6LV0、HV6LVlb 和 HV6LV3)的轉(zhuǎn)化子。作為動(dòng)物細(xì)胞株，使用由雙敲除α 1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因(FUT8)而得到的 CH0/DG44細(xì)胞株(以下稱(chēng)為FUT8敲除的CHO細(xì)胞)。已知用該宿主細(xì)胞株所表達(dá)抗體的復(fù)合型N-連接糖鏈的核心部分沒(méi)有加入巖藻糖(W0 2002/31140)。(7)純化的抗A β寡聚體人源化抗體的制備用常規(guī)培養(yǎng)方法培養(yǎng)本實(shí)施例的￠)中所獲得的轉(zhuǎn)化子，之后收集細(xì)胞懸液。然后，在3000rpm和4°C的條件下離心20分鐘。在收集后，用孔徑為O. 22yn^^Millex GV過(guò)濾器將培養(yǎng)上清液過(guò)濾滅菌。將O. 5ml Prosep vA High Capacity (MiIlipore Corporation 制造)填充到直徑為0. 8cm的柱中，接著使5. Oml純凈水和5. 0ml PBS緩沖液(pH7. 4)通過(guò)其中從而使載體平衡。然后，在使培養(yǎng)上清液通過(guò)柱子之后，用5. 0ml PBS緩沖液(pH7. 4)清洗柱子。清洗后，以2. Oml O. lmol/L的檸檬酸鹽緩沖液(ρΗ5· 0)、2· 0ml O. lmol/L的檸檬酸鹽緩沖液 (pH3. 5)和2. Oml 0. lmol/L的檸檬酸鹽緩沖液(pH3. 0)的順序洗脫被載體吸附的抗體。獲得500 μ L 4個(gè)以上級(jí)分的洗脫物。之后，對(duì)由此獲得的純化級(jí)分進(jìn)行SDS-PAGE 分析。收集被檢測(cè)到目的蛋白的洗脫物級(jí)分，并且在4°C下用150mmol/L的NaCl和IOmmol/ L的檸檬酸鈉溶液對(duì)其進(jìn)行一整天的透析。在透析之后，收集抗A β寡聚體人源化抗體溶液，并用孔徑為0. 22μπι的Millex GV (Mi I lipore Corporation)對(duì)其進(jìn)行過(guò)濾滅菌。用吸光度測(cè)定儀(SHIMADZU UV-1700)測(cè)定其在280nm的吸光度，從而計(jì)算各純化的抗A β寡聚體人源化抗體的密度。因此，產(chǎn)生了七種類(lèi)型的抗Αβ寡聚體人源化抗體，其由以下組成含有作為抗體 VH的4H5HV0和作為抗體VL的4H5LV0的HV0LV0，含有作為抗體VH的HV5a和作為抗體VL 的LVO的HV5aLV0，含有作為抗體VH的HV5a和作為抗體VL的LVlb的HV5aLVlb，含有作為抗體VL的HV5a和作為抗體VL的LV3的HV5aLV3，含有作為抗體VH的HV6和作為抗體VL的LVO的HV6LV0，含有作為抗體VH的HV6和作為抗體VL的LVlb的HV6LVlb，和含有作為抗體VH的HV6和作為抗體VL的LV3的HV6LV3。實(shí)施例2抗原的產(chǎn)生(1)Αβ寡聚體的制備用六氟異丙醇將淀粉樣β蛋白人1-42肽(Peptide Institute, Inc.制造)溶解為lmmol/L。超聲處理10分鐘后，在室溫下將所制備的溶液空氣干燥過(guò)夜。之后，向其中加入4 μ L 二甲亞砜，并進(jìn)行3分鐘的超聲處理。向所制備的溶液中加入200 μ L醋酸溶液 (ρΗ4. 5)，并將所產(chǎn)生的物質(zhì)以靜置方式在4°C下保持過(guò)夜，從而產(chǎn)生Αβ寡聚體。(2)Αβ單體的制備用O. I %的氨水將生物素淀粉樣蛋白人l_40(AnaSpec，Inc.制造)溶解為 250 μ mol/L。在將所制備的溶液進(jìn)行超聲處理5分鐘后，在16，OOOrpm和4°C的條件下將所產(chǎn)生的物質(zhì)離心60分鐘。從而，通過(guò)收集上清液而制備A β單體。實(shí)施例3抗Αβ寡聚體人源化抗體的活性評(píng)價(jià)(I)用Biacore評(píng)價(jià)抗A β寡聚體人源化抗體對(duì)A β寡聚體的結(jié)合活性為了以化學(xué)動(dòng)力學(xué)方式分析每個(gè)抗A β寡聚體人源化抗體(HV0LV0、HV5aLV0、 HV5aLVlb、HV5aLV3、HV6LV0、HV6LVlb，和HV6LV3)對(duì)Αβ寡聚體的結(jié)合活性，使用表面等離子體共振方法(SPR方法)測(cè)定結(jié)合活性。以下所有操作都使用Biocore TlOO (GE Healthcare Bio-sciences 制造)進(jìn)行。用胺耦合法將實(shí)施例2的(I)中所獲得的A β寡聚體固定到CM5傳感器芯片(GE Healthcare Bio-sciences)上。在被固定了 Αβ寡聚體用于測(cè)定的芯片上，依次注入經(jīng)二倍稀釋法從30 μ g/mL開(kāi)始逐步稀釋制備的 8 個(gè)濃度的樣品(HV0LV0、HV5aLV0、HV5aLVlb、HV5aLV3、HV6LV0、HV6LVlb 和HV6LV3)，并且從較低濃度開(kāi)始基于多動(dòng)力學(xué)自動(dòng)程序進(jìn)行測(cè)定。使用儀器所附的分析軟件Biacore T100評(píng)價(jià)軟件(Biacore Life Science制造)，用二價(jià)分析物模型(Bivalent Analyte model)進(jìn)行分析,從而計(jì)算每個(gè)針對(duì)Aβ寡聚體的抗體的結(jié)合速率常數(shù)ka和解離速率常數(shù)kd。表I中分別顯示了由此獲得的每個(gè)抗體的結(jié)合速率常數(shù)kal、解離速率常數(shù)kdl和解離常數(shù)KD(kdl/kal)。表I抗Αβ寡聚體人源化抗體對(duì)A β寡聚體的結(jié)合活性
抗體 ka (1/Ms) kd (1/s) KD (mol/L)
HV0LV01.4χ1041.4><10_31.0><10_7
HV5aLV0 I.IxlO46.3χ10_45.5χ10_8HV5aLVlb9.8x10'8.8χ10'49.0x10HV5aLV38.OxlO39.7χ10'41.2x10HV6LV07.9χ1038.6χ10'41.1x10HV6LVlb7.5χ1036.8χ10'49.0x10HV6LV38.2χ1039.2χ10'41.1x10如表I所示，所有抗A β寡聚體人源化抗體(HV0LV0、HV5aLV0、HV5aLVlb、HV5aLV3、 HV6LV0、HV6LVlb 和 HV6LV3)都顯示出親和力為 I. 2X 1(Γ7 至 5. 5Χ l(T8mol/L 的對(duì) Αβ 寡聚體的結(jié)合能力。(2)用Biacore評(píng)價(jià)抗A β寡聚體人源化抗體對(duì)A β單體的結(jié)合活性為了分析各抗A β 寡聚體人源化抗體(HV0LV0、HV5aLV0、HV5aLVlb、HV5aLV3、 HV6LV0、HV6LVlb和HV6LV3)對(duì)Αβ單體的結(jié)合活性，用與本實(shí)施例的(I)中相同的方式測(cè)定結(jié)合活性。此外，測(cè)定抗A β抗體6E10(C0NVANCE制造)的結(jié)合活性作為對(duì)照抗體。用生物素捕獲方法將實(shí)施例(2)的(2)中所獲得的Αβ單體固定到SA傳感器芯片上(GE Healthcare Bio-sciences制造)。在被固定了 Αβ單體的芯片上，依次注入經(jīng)二倍稀釋法從30 μ g/mL開(kāi)始逐步稀釋被制備為5級(jí)濃度的用于測(cè)定的樣品(HV0LV0、HV5aLV0、 HV5aLVlb、HV5aLV3、HV6LV0、HV6LVlb和HV6LV3)，并且從較低濃度開(kāi)始基于多動(dòng)力學(xué)模式自動(dòng)程序進(jìn)行測(cè)定。圖3和4中顯示了其傳感圖。如圖3和4所示，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)四類(lèi)抗Αβ寡聚體人源化抗體(HV0LV0、HV5aLV0、 HV5aLVlb、HV5aLV3、HV6LV0、HV6LVlb和HV6LV3)對(duì)A β單體都沒(méi)有顯示出結(jié)合能力。參考例I.抗原的制備合成Αβ 1-40肽以產(chǎn)生N端被化學(xué)結(jié)合了 6-羧基四甲基羅丹明(6-TAMRA) (SIGMA)的突光異硫氰酸酯的化合物,用Αβ 1-40肽(Peptide Institute, Inc)進(jìn)行該化合物的聚合反應(yīng)，從而制備含有大量寡聚體的制劑(Αβ 1-40寡聚體)。2.產(chǎn)生抗體的雜交瘤的建立用以上述方式制備的抗原免疫接種Balb-c小鼠的足墊，并且接著進(jìn)行另外6次免疫接種。通過(guò)使用聚乙二醇1500用腹股溝淋巴結(jié)與Sp2/0-Agl4細(xì)胞融合而產(chǎn)生雜交瘤。3.斑點(diǎn)印跡分析用斑點(diǎn)印跡分析進(jìn)行初步篩選，所述斑點(diǎn)印跡分析中將已經(jīng)被預(yù)溫育18小時(shí)的2. 5yL A β 1-42(2. 5 μ g/點(diǎn))固定在硝酸纖維素膜上。用含有5%低脂乳、I % BSA和
O.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖溶液封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，并且用培養(yǎng)上清液溫育非特異性結(jié)合位點(diǎn)。用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠F(ab’)2(1 : 3000 ;Amersham)檢測(cè)培養(yǎng)上清液中與Αβ寡聚體結(jié)合的抗體,并且使用LAS3000mini (Fujitsu,Tokyo,日本)用靈敏的化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒顯示所述抗體。通過(guò)這樣的操作，建立了抗Αβ寡聚體小鼠單克隆抗體4Η5。PCT/JP 2009/52039 (W02009/099176)中公開(kāi)了以上參考例。雖然已經(jīng)詳細(xì)說(shuō)明并參照具體實(shí)施方案說(shuō)明了本發(fā)明，但對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯然可以在其中作出多種變動(dòng)和修改而不背離其精神和范圍。本申請(qǐng)是基于2009年8月7日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)(No. 61/232，038)，通過(guò)引用將所述臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容并入本文。并入本文所引用的所有參考文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容。序列表中的自由文本SEQIDNO:1-人工序列的說(shuō)明；HCDR1氨基酸序列
SEQIDNO:2_人工序列的說(shuō)明；HCDR2氨基酸序列
SEQIDNO:3_人工序列的說(shuō)明；HCDR3氨基酸序列
SEQIDNO:4_人工序列的說(shuō)明；LCDR1氨基酸序列
SEQIDNO:5_人工序列的說(shuō)明；IXDR2氨基酸序列
SEQIDNO:6_人工序列的說(shuō)明；LCDR3氨基酸序列
SEQIDNO11-人工序列的說(shuō)明；編碼4H5HV0的DNA序列
SEQIDNO:12-人工序列的說(shuō)明；4H5HV0可變區(qū)的氨基酸序列
SEQIDNO13-人工序列的說(shuō)明；編碼4H5LV0可變區(qū)的DNA序列
SEQIDNO:14-人工序列的說(shuō)明；4H5LV0可變區(qū)的氨基酸序列
SEQIDNO:15-人工序列的說(shuō)明；HV5a可變區(qū)的氨基酸序列
SEQIDNO:16-人工序列的說(shuō)明；HV6可變區(qū)的氨基酸序列
SEQIDNO:17-人工序列的說(shuō)明；LVlb可變區(qū)的氨基酸序列
SEQIDNO:18-人工序列的說(shuō)明；LV3可變區(qū)的氨基酸序列
權(quán)利要求
1.人源化抗體，其不與淀粉樣β蛋白單體結(jié)合而與淀粉樣β寡聚體結(jié)合，并且其含有以下的(a)抗體重鏈可變區(qū)和(b)抗體輕鏈可變區(qū)(a)抗體重鏈可變區(qū)，其含有由SEQID NO :12所示的氨基酸序列，或者在由SEQ ID NO12所示的氨基酸序列中進(jìn)行了以下氨基酸修飾中的至少一種修飾的氨基酸序列以Arg取代第18位的Leu，以Glu取代第46位的Gln，以Val取代第48位的Met，以Ala取代第49位的Val，以Asn取代第77位的kr，以Met取代第93位的Val和以Gly取代第98位的Arg,(b)抗體輕鏈可變區(qū)，其含有由SEQID NO: 14所示的氨基酸序列，或者在由SEQ ID NO14所示的氨基酸序列中進(jìn)行了以下氨基酸修飾中的至少一種修飾的氨基酸序列以Val取代第2位的Ile，以Leu取代第3位的Val，以Leu取代第15位的ft~o，以Lys取代第50位的Gln，和以Gly取代第105位的Gin。
2.權(quán)利要求1的人源化抗體，其中抗體重鏈可變區(qū)含有由SEQIDNO :12、15或16所示的氨基酸序列，且抗體輕鏈可變區(qū)含有由SEQ IDNO :14,17或18所示的氨基酸序列。
3.抗認(rèn)知功能障礙劑，其含有權(quán)利要求1或2的人源化抗體作為活性成分。
4.用于治療阿爾茨海默病的藥物，其含有權(quán)利要求1或2的人源化抗體作為活性成分。
5.用于抑制神經(jīng)炎性斑形成的藥劑，其含有權(quán)利要求1或2的人源化抗體作為活性成分。
6.淀粉樣β淀粉樣纖維形成的抑制劑，其含有權(quán)利要求1或2的人源化抗體作為活性成分。
7.用于認(rèn)知功能障礙的預(yù)防和治療中的至少一種的方法，其包括施用權(quán)利要求1或2的人源化抗體。
8.用于阿爾茨海默病的預(yù)防和治療中的至少一種的方法，其包括施用權(quán)利要求1或2的人源化抗體。
9.用于抑制阿爾茨海默病進(jìn)展的方法，其包括施用權(quán)利要求1或2的人源化抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了人源化抗體和包含所述抗體作為活性成分的抗體藥物，所述人源化抗體不能與Aβ單體結(jié)合而只能與Aβ寡聚體特異性結(jié)合，所述抗體藥物可以特異性地結(jié)合淀粉樣β蛋白寡聚體(Aβ寡聚體)(其被認(rèn)為是認(rèn)知功能障礙或阿爾茨海默病的致病蛋白)，因此可以治療阿爾茨海默病。本發(fā)明公開(kāi)了能與Aβ寡聚體特異性結(jié)合的人源化抗-Aβ寡聚體抗體；以及用該人源化抗體治療阿爾茨海默病的方法。本發(fā)明具體公開(kāi)了阿爾茨海默病的治療藥劑，神經(jīng)炎性斑形成的抑制劑，或者Aβ淀粉樣纖維形成的抑制劑；預(yù)防和/或治療認(rèn)知功能障礙或阿爾茨海默病的方法，其包括施用該抗體的步驟；和阻止阿爾茨海默病進(jìn)展的方法，其包括施用該抗體的步驟。
文檔編號(hào)A61K39/395GK102597233SQ201080035019
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2010年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月7日
發(fā)明者久保田麗夫, 鈴木伸之 申請(qǐng)人:協(xié)和發(fā)酵麒麟株式會(huì)社