專利名稱：新型肽及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及有效治療和/或預防退變性椎間盤疾病、治療身體器官纖維化、治療癌癥、治療腎小球硬化癥或類似疾病的新型肽。
背景技術：
退變性椎間盤疾病(DDD)是慢性下背疼痛的原因，是一種伴隨下背疼痛的病理狀態(tài)，由于椎間盤(特別是在髓核中)老化脫水，使椎間盤退變或椎間盤縮短，從而導致椎間盤的破裂和裂紋，因此引起所述下背疼痛。椎間盤退變的特征在于異常的神經增加和血管增生，以及細胞數(shù)量和功能的變化(細胞簇生成、壞死、凋亡等)。退變的椎間盤的分子學特征之一是聚集蛋白聚糖的減少。聚集蛋白聚糖對椎間盤的承重起重要作用，聚集蛋白聚糖的丟失導致椎間盤滲透壓下降從而不再能保持水分，因此加劇了既有的椎間盤退變，椎間盤包括存在的纖維環(huán)，并對其他的脊柱結構和功能產生重大的影響，如小面關節(jié)和黃韌帶的退變和肥大。作為目前治療包括退變性椎間盤疾病的病理性慢性下背疼痛的療法，有包括止痛、康復訓練治療及類似的醫(yī)療方法。遺憾的是，這些治療方法都遭遇疾病頻繁復發(fā)，需要花長時間和巨大的努力來治療有關的疾病，以及由于延長的藥物治療引起的可能的并發(fā)癥的風險。如果即使用這種長期的、保守的療法治療疾病后，仍沒有良好的效果，患者將不可避免地接受手術療法。典型的手術治療包括常規(guī)的腰椎融合手術以及最近設計的人造椎間盤嵌入，常規(guī)的腰椎融合手術包括徹底去除受影響的椎間盤組織以及將骨移植物嵌入到目標損傷部位。然而，這些手術方法具有各種缺陷，例如相對昂貴并且還有手術引起的手術早期和晚期并發(fā)癥的潛在的風險。例如，由于鄰近的椎間盤的退變，腰椎融合手術往往需要定期重做。為了減小這種缺點而研發(fā)的人造椎間盤在長期的后續(xù)研究中并沒有提供令人滿意的結果。所以，目前并沒有普遍進行人造椎間盤手術。如上所述，治療由退變性椎間盤疾病引起的慢性下背疼痛非常困難。為了處理這種情況，作為保守療法和手術療法的替換方法， 已經嘗試了各種實驗性的療法，以在使椎間盤自身的退變最小化的同時實現(xiàn)椎間盤再生。近年來，已經嘗試了一些治療椎間盤退變的生物療法，例如，上調重要的基質蛋白質(例如聚集蛋白聚糖)生成的方法、下調由促炎細胞因子(例如白介素-l(IL-l)、腫瘤壞死因子 α (TNF- α ))誘導的分解代謝的方法(Ahn，SH et al.，Spine 27 :911-917,2002 ； Burke JG et al.，Spine 28 :2685-2693,2003 ；Kang JD et al.，Spine 21 :271-277,1996 ； Weiler C et al.，Spine 30 :44-53,2005 ；Igarashi T et al.，Spine 25:2975—2980， 2000 ；Olmarker K et al.，Spine 23 :2538-2544,1998 ；Le Maitre CL et al.，Arthritis Res Ther 7 :R732R745，2005 ；以及 Seguin CA et al.，Spine 30 1940-1948，2005)。這些生物治療方法主要一直在國外進行。引起極大興趣的、受歡迎的方法是直接將骨生長因子(骨形態(tài)發(fā)生蛋白，BMP)注射到椎間盤里或移植注射了治療基因的椎間盤細胞(Masuda K et al.，Spine 31 :742-745,2006 ；Imai Y et al.，Spine 32 :1197-1205,2007 ；Zhang Y et al·，Spine 33:831-838,2008)。然而，這種方法僅僅是一種通過人體再生達到椎間盤結構的物理改變的方法，并不能緩解或解除患者的疼痛，并且如果椎間盤過度生長，由于擠壓到神經，可導致神經狀態(tài)的惡化。同時，已知TGF-β 1信號途徑與纖維化、凋亡、血管再生、腫瘤細胞的侵入和轉移有關，因此抑制TGF- β 1信號途徑可能是治療身體器官纖維化、癌癥和/或腎小球硬化癥的可行措施(Prud' homme GJ, Lab Invest 87 :1077-1091,2007) 為此，需要研發(fā)新的生物材料，所述新的生物材料通過在使椎間盤自身的退變最小化的同時促進椎間盤再生而對退變性椎間盤疾病有療效，且并能夠通過抑制TGF-β 1信號途徑來治療身體器官纖維化、癌癥、腎小球硬化癥、或類似的疾病。

發(fā)明內容
技術問題本發(fā)明意圖提供一種能夠在使椎間盤自身的退變最小化的同時，促進椎間盤再生的新型肽。進一步地，本發(fā)明意圖提供一種治療身體器官纖維化、癌癥、或腎小球硬化癥的有效組合物。技術方案本發(fā)明提供一種包括SEQ ID NO 1的氨基酸序列(LQVVYLH)的肽或其變體或藥學上可接受的鹽。在SEQ ID NO 1的氨基酸序列中，L、Q、V、Y和H分別代表亮氨酸(Leu)、谷氨酸 (Gin)、纈氨酸(Val)、酪氨酸(Tyr)和組氨酸(His)。所述肽的各個氨基酸組分可以是L型、D型、和/或DL型，它們都包含在本發(fā)明的肽的氨基酸組分中。變體是一種形式，其中本發(fā)明的肽結構由于自發(fā)變化或人工變化而部分地改變且同時不引起肽的主要活性的任何改變。例如，可以是此種形式，即，其中SEQ ID N0:1的氨基酸序列中的谷氨酰胺、酪氨酸和組氨酸中的一個或多個氨基酸被其它氨基酸替代。優(yōu)選的一種形式是在SEQ ID NO :1的氨基酸序列中用天冬酰胺替代谷酰胺、用苯丙氨酸或色氨酸替代酪氨酸，和/或用賴氨酸或精氨酸替代組氨酸。谷氨酰胺和天冬酰胺屬于含有末端酰胺基的氨基酸組。酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸屬于含有芳香側鏈的芳香氨基酸組。組氨酸、賴氨酸和精氨酸屬于含有強極性側鏈的堿性氨基酸組，所述極性側鏈使它們高度親水。 同組的氨基酸被認為具有相同或相似的生化特征(大小、形狀、電荷、形成氫鍵的能力或化學反應性)。肽及其變體可具有通式(I)L-X1-VV-X2-L-X3 (I)其中，&是Q或N成是Y、F或W ;)(3是H、K或R ;L是亮氨酸、Q是谷氨酰胺、N是天冬酰胺、V是纈氨酸、Y是酪氨酸、F是苯丙氨酸、W是色氨酸、H是組氨酸、K是賴氨酸以及 R是精氨酸。藥學上可接受的鹽的實例可包括氫氯化物、硫酸鹽、磷酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、延胡索酸鹽、草酸鹽、甲磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽等。
進一步地，本發(fā)明提供一種本發(fā)明的肽或其變體或藥學上可接受的鹽的醫(yī)藥的應用。醫(yī)藥應用包括退變性椎間盤疾病的治療和/或預防應用、身體器官纖維化的治療應用、 癌癥的治療應用，和腎小球硬化癥的治療應用。通過抑制轉化生長因子M(TGF-M)的信號途徑來治療身體器官纖維化、癌癥、或腎小球硬化癥。已知TGF-β是一種高度多效性的細胞因子，在細胞凋亡調控、血管再生、傷口愈合、免疫調節(jié)和腫瘤生物學中起重要作用。TGF-β存在三種亞型TGF-i3 1、TGF-i3 2和 TGF-β 3。三種亞型都使用相同的受體。TGF-β受體具有三個組分1型(RI或ALK5)、11型 (RII)和III型(RIII或β聚糖)。TGF-β (所有亞型)結合RIII并募集RII，然后使RI 磷酸化以形成異型四聚體絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復合物。RI依次使Smad2和Smad3 (受體關聯(lián)的Smads (R-Smads))磷酸化，然后與Smad4形成異聚復合物，所述異聚復合物轉位到細胞核中與 DNA 結合并調節(jié)轉錄(Prud' homme GJ, Lab Invest 87 :1077-1091,2007) 本發(fā)明使用術語“抑制TGF-β 1信號途徑”是指TGF-β 1未能結合受體，然后Smad2 和Smad3未能經歷磷酸化，因此未能與Smad4形成復合物，結果該復合物未能轉位到細胞核中和調節(jié)轉錄。本發(fā)明提供一種治療和/或預防退變性椎間盤疾病的組合物，所述組合物包括本發(fā)明的肽或其變體或藥學上可接受的鹽。進一步地，本發(fā)明提供一種治療身體器官纖維化的組合物，所述組合物包括本發(fā)明的肽或其變體或藥學上可接受的鹽。進一步地，本發(fā)明提供一種治療癌癥的組合物，所述組合物包括本發(fā)明的肽或其變體或藥學上可接受的鹽。進一步地，本發(fā)明提供一種治療腎小球硬化癥的組合物，所述組合物包括本發(fā)明的肽或其變體或藥學上可接受的鹽。本發(fā)明的肽能夠通過常用于肽合成的方法來制備。例如，所述肽能夠通過 Schroder 禾口 Lubke (The Peptides, Vol. 1, Academic Press, New York, 1965)所述的那些方法及類似的方法來制備，并且能夠通過液相合成法或固相合成法來制備。形成肽鍵的方法的實例包括疊氮物法、酰氯法、對稱酸酐法、混合酸酐法、碳二亞胺法、碳二亞胺-添加劑法、活化酯法、羰基二咪唑法、氧化-還原法和使用伍德沃德氏試劑 K的方法。在肽的合成中，能夠通過使用胱氨酸衍生物來形成胱氨酸基團，或通過常規(guī)方法形成肽鏈后，使肽鏈中的半胱氨酸基團轉化成胱氨酸基團。進行合成反應之前，能夠將不參與反應的羧基、氨基、胍基、羥基等基團保護起來， 并且能夠通過本領域已知的方法將參與合成反應的羧基和氨基活化。羧基的保護基團的實例可包括形成酯的基團，例如甲基、乙基、苯甲基、對硝基苯甲基、叔丁基和環(huán)己基。氨基的保護基團的實例可包括苯甲基氧羰基、叔丁氧羰基、異冰片基氧羰基和/ 或9-芴甲氧羰基。胍基的保護基團的實例可包括硝基、苯甲基氧羰基、甲苯磺?；?、對甲氧苯磺?；?或4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基。羥基的保護基團實例可包括叔丁基、苯甲基、四氫吡喃基和/或乙?；ｔ然罨问降膶嵗砂▽ΨQ的酸酐、疊氮物和活化酯(與醇形成的酯，例如五氯苯酚、2，4- 二硝基酚、羥基乙腈、對硝基酚、N-羥基-5-降冰片烯_2，3- 二甲酰亞胺、 N-羥基琥珀酰亞胺、N-羥基鄰苯二甲酰亞胺和1-羥基苯并三唑)?；罨陌被囊粋€實例是磷酸胺。反應在諸如氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、嘧啶、二氧雜環(huán)己烷、四氫呋喃、水、甲醇或它們的混合物的溶劑中進行。反應的溫度可在大約-30至50°C的所述反應通常采用的范圍內。去除本發(fā)明的肽的保護基團的反應可根據(jù)保護基團的類型而不同，但應該是能夠去除保護基團且不帶給肽鍵合任何影響的反應。保護基團能夠通過酸處理來去除，例如用氯化氫、溴化氫、氟化氫、甲磺酸、三氟甲磺酸、三氟醋酸或這些酸的混合物進行處理。進一步地，能夠用液態(tài)氨中的金屬鈉進行還原或用鈀碳進行催化原還。在通過上述酸處理來去除保護基團的反應中，可采用諸如苯甲醚、苯酚或茴香硫醚的添加劑。反應完成之后，本發(fā)明所制備的肽能夠通過肽純化的常規(guī)工藝進行回收，例如，提取、分配、再沉淀、再結晶或柱層析。進一步地，能夠用常規(guī)的方法將本發(fā)明的肽轉化成如上所述的肽的變體、或肽的藥學上可接受的鹽。本發(fā)明的肽可通過自動肽合成儀合成，或可通過基因工程技術生成。例如，可以通過基因操作來制備編碼融合蛋白的融合基因，所述融合蛋白由融合伴侶和本發(fā)明的肽組成，用所述融合基因轉染寄主微生物，在寄主微生物中以融合蛋白的形式表達期望的肽，并用蛋白酶或化合物從融合蛋白中分開并分離本發(fā)明的肽。本發(fā)明使用的氨基酸根據(jù)IUPAC_IUB命名法，縮寫如下氨基酸縮寫
丙氨酸A
精氨酸R
天冬酰胺N
天冬氨酸E
半胱氨酸C
谷氨酸D
谷氨酰胺Q
甘氨酸G
組氨酸H
異亮氨酸I
亮氨酸L
賴氨酸K
甲硫氨酸M
苯丙氨酸F
脯氨酸P
絲氨酸S
蘇氨酸T
色氨酸W
酪氨酸Y
纈氨酸V所述肽或其變體或藥學上可接受的鹽的劑量范圍為每天50 μ g至lmg，優(yōu)選非經腸道給藥每天0. 5mg至lmg。對于口服給藥，劑量是非經腸道給藥劑量的1. 2至1. 5倍。對于直腸給藥，劑量是非經腸道給藥劑量的2至5倍。本發(fā)明的肽主要是通過非經腸道途徑給藥，例如局部注射(針對退變性椎間盤疾病的椎間盤內注射，以及針對其它身體器官纖維化和癌癥的局部病灶內注射)、靜脈/肌肉或皮下注射、腦室內或脊柱內給藥或經鼻給藥和直腸內給藥。進一步地，如果需要，可采用口服給藥。本發(fā)明的肽或組合物，與藥學上可接受的載體結合能夠配制成期望的劑型，例如注射劑、栓劑、散劑、鼻滴劑、顆粒劑、片劑等。藥學上可接受的載體能夠根據(jù)本領域技術人員公知的若干因素來制備，例如，考慮到以下非限制性的因素要使用的特殊生理活性的材料及其濃度、穩(wěn)定性和預期的生物利用度；治療的疾病、失調或健康狀況；治療的受試者及其年齡、體重和整體狀況；以及組合物的預期的給藥途徑，例如經鼻的、口服的、經眼的、局部的、經皮的和肌肉內的。通常，除口服施藥途徑外，用于生理活性材料給藥的、藥學上可接受的載體的實例可包括D5W(5%葡萄糖水)，一種含有5%體積或更少的葡萄糖的水溶液，以及生理鹽水。如果是局部病灶內注射，可用各種可注射的水凝膠來加強治療效果和增長藥效的持續(xù)時間。此外，藥學上可接受的載體可含有能夠增強活性成分的穩(wěn)定性的額外成分，例如防腐劑和抗氧化劑。優(yōu)選地， 根據(jù)要治療的疾病和組合物的組分，用本領域公知的任何適當?shù)姆椒?，例如“Remington' s Pharmaceutical Sciences" (Mack Publishing Co. , Easton, PA( MIflK^ )) 43^^ ' 法，可將本發(fā)明的肽或組合物配制成期望的劑型。本發(fā)明的肽能夠貯存在生理鹽水溶液中，并且加入甘露醇和山梨醇后，能夠在安瓿中冷凍干燥。使用前可將已冷凍干燥的肽溶解在生理鹽水或類似物中進行復原。進一步地，本發(fā)明提供作為藥物的一種肽或其變體或藥學上可接受的鹽。進一步地，本發(fā)明提供一種肽或其變體或藥學上可接受的鹽作為藥物的應用，所述藥物治療和/或預防退變性椎間盤疾病、身體器官纖維化、癌癥和/或腎小球硬化癥。進一步地，本發(fā)明提供一種治療和/或預防退變性椎間盤疾病、身體器官纖維化、 癌癥和/或腎小球硬化癥的方法，包括向受試者(哺乳動物，包括人類)給予本發(fā)明的肽或其變體或藥學上可接受的鹽?？赏ㄟ^抑制TGF-β 1信號途徑來治療身體器官纖維化、癌癥、和/或腎小球硬化癥。有益效果本發(fā)明的新型肽或其變體或藥學上可接受的鹽有效治療和/或預防退變性椎間盤疾病、身體器官纖維化、癌癥和/或腎小球硬化癥，并且有效抑制TGF-β 1信號途徑。


圖1示出正常椎間盤組織、給予了 DMSO的退變性椎間盤組織、以及給予了實施例 1的肽的退變性椎間盤組織染色后所攝的圖片。圖2示出表示與作為參照的正常椎間盤組相比較，在椎間盤退變性模型中，給予了 DMSO的退變性椎間盤組的以及給予了實施例1的肽的退變性椎間盤組的聚集蛋白聚糖基因的表達水平的圖。圖3示出蛋白質印跡分析的結果，所述蛋白質印跡分析用來證實在未處理的 !fepG2細胞中、在TGF-β 1處理的細胞中、在TGF-β 1/SB431542處理的細胞中、在TGF-β 1/ 實施例1的肽處理的細胞中，以及在TGF-β 1/DMS0處理的細胞中表達的磷酸化的Smad2。
具體實施例方式現(xiàn)在，將參考以下實施例，更詳細地描述本發(fā)明。提供這些實施例僅用來說明本發(fā)明，并不應理解為限制本發(fā)明的范圍和精神。實施例1 肽的制備Peptron公司(韓國)在本發(fā)明人的要求下制備具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列的肽(LQVVYLH =SEQ ID NO :1)。具體地，通過Fmoc SPPS (9-芴甲氧羰基固相多肽合成法)， 使用自動肽合成儀(ASP48S，Peptron公司)從C末端起將氨基酸單元一個一個地連接。
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采用NH2-His (Trt) _2_氯代-三苯甲基樹脂，其中肽的C末端的第一個氨基酸粘附到樹脂上。用于合成肽的所有氨基酸都是用三苯甲基(Trt)、叔丁氧羰基(Boc)、叔丁基 (t-Bu)等保護的氨基酸，因此N末端是用9-芴甲氧羰基進行保護的，并在酸中去除所有殘基。采用2-(1Η-苯并三唑-1-基)-1，1，3' 3'-四甲基硫尿六氟磷酸鹽(HBTU)/羥基苯并三唑(HOBt)/N-甲基嗎啉(NMM)作為偶聯(lián)劑。(1)將被保護的氨基酸(8當量)和偶聯(lián)劑HBTU (8當量)/HOBt (8當量)/NMM (16當量)溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中，在室溫下反應2小時。(2)通過加入含20%哌啶的DMF，然后在室溫下反應5分鐘，并重復兩次來去除 9-芴甲氧羰基。重復進行反應(1)和O)以制備基本的肽骨架，并用三氟醋酸(TFA)/1， 2-乙烷二硫醇(EDT)/苯硫基甲烷/三異丙基硅烷(TIS)/H2O = 90/2. 5/2. 5/2. 5/2. 5將肽與樹脂分離。通過反相高壓液相色譜，使用Vydac Everest C18柱Q50mm 22mm, 10 μ m)來純化肽，然后通過含0.1% (ν/ν)三氟醋酸的水-乙腈線性梯度(10-75% (ν/ν)的乙腈) (洗脫)進行分離。使用LC/MS(Agilent HP1100 series)來確認已純化的肽的分子量，然后進行冷凍干燥。實施例2 椎間盤的再牛效果的確認2-1、制備椎間盤退變的動物模型以及收集實驗的椎間盤準備30只重3至3. 5kg的兔(新西蘭白兔，Orient Bio公司)，不論雌雄。向兔通過肌肉注射5mg/kg的甲苯噻嗪(Rompun，Bayer)以及35mg/kg的鹽酸氯胺酮(Ketalar，Pfizer)進行麻醉。程序開始之前，先用熒光檢查裝置(型號VPX-200 ；To shiki公司)獲得側位X光片以確立椎間盤的注射前基線高度?；€對照是指用于椎間盤間隙的測量的標準。將兔放置在實驗桌上后，用所述儀器確認椎間盤節(jié)段L23、L34、L45和 L56，并用18G的針將纖維環(huán)刺入到椎間盤節(jié)段L23、L45和L56的后側。動物從麻醉中復蘇后，在以下條件下飼養(yǎng)于籠子中溫度為20至25°C、濕度為10%至50%、以及明/暗(L/ D)周期(08:00a.m.至20:00p.m.為明)。所有動物每天喂食一次。在初次刺環(huán)后的2和 4周拍攝X光片。X光片在麻醉后拍攝。根據(jù)X光片的結果，測得椎間盤高度(IVD高度)。 由測量的結果，通過對Lu等公開的方法(Spine. 22 =1828-34,1997.)的改進對椎間盤的退變程度進行定量。此后，對兩個獨立的組，即給予了 DMSO的對照組和給予了實施例1的肽的實驗組進行實驗，并根據(jù)計劃的時間表，通過注射克他命(25mg/kg)和戊巴比妥鈉(1.2g/kg， Nembutal,Ovation)將兔無痛處死，然后取出椎間盤分別進行組織學分析和生物化學分析。2-2、通過椎間盤組織染色來測定椎間盤的再生效果將2-1節(jié)中的椎間盤退變的兔分成兩組。一組通過兩次局部椎間盤內注射給予二甲基亞砜(DMSO) (0. 5mM/只)，一組通過兩次局部椎間盤內注射給予實施例1的肽(0. 5mM/ 只)。每組的給藥時間點是在誘導椎間盤退變后4周和再往后2周。第二次給藥后，動物分別飼養(yǎng)2、4和8周。在初次分別給予實施例1的肽和DMSO后的4、6和10周，取出相應的各個椎間盤組織并固定在福爾馬林中。將已固定的椎間盤組織埋入石碏中，然后制備沿矢狀面有4μπι厚的連續(xù)切片。這些切片中的兩個中間矢狀面切片用蘇木素與伊紅(Η&Ε)進行染色。為了與正常的椎間盤組織對比，根據(jù)上述相同的方法，從未經椎間盤退變誘導的兔中取出椎間盤、進行處理并染色。圖1是在第10周時取出和染色的單個椎間盤組織的顯微結果。A和B 正常椎間盤組織，C和D 給予了 DMSO的退變的椎間盤組織，以及E和F 給予了實施例1的肽的退變的椎間盤組織。A、C和E 40倍放大，B、D和F :400倍放大。在400倍放大的圖片中，箭頭指示椎間盤細胞核。結果，觀察到在正常椎間盤細胞中可明確區(qū)分髓核和纖維環(huán)，而且有大量的細胞外基質成分(圖1中的A和B)。另外，在正常的椎間盤組織中觀察到細胞核獨特的染色(圖 1中的B)。另一方面，給予了 DMSO的椎間盤組織顯示出椎間盤的縮小、纖維環(huán)和髓核間模糊不清，而且細胞外基質成分稀少(圖1中的C和D)。進一步地，在髓核區(qū)域難以找到染色的細胞核(圖1中的D)。即，這些結果表明曾經存在于髓核里的是死細胞。已知細胞死亡是由于椎間盤退變，且細胞的缺乏導致無細胞外基質成分的生成，因此進一步惡化椎間盤退變。給予了實施例1的肽的椎間盤組織與給予了 DMSO的椎間盤組織相比，顯示出椎間盤增大、顯示出可辨別髓核和纖維環(huán)、且有大量的細胞外基質成分(圖1中的E和F)。此夕卜，在髓核區(qū)域觀察到細胞核的鮮艷的染色(圖1中的F)。這些結果證明實施例1的肽通過防止由于椎間盤退變導致的細胞外基質成分的減少和細胞死亡而具有治療椎間盤的效果。棚列3 ■織、汰·白爐人進行實時PCR以檢測聚集蛋白聚糖基因的表達水平，所述聚集蛋白聚糖是椎間盤組織中的代表性的細胞外基質成分。以與實施例2-1中的方法相同的方法準備動物并分成兩組，一組通過局部椎間盤內注射給予DMS0(0. 5mM/只)，一組通過局部椎間盤內注射給予實施例1的肽(0. 5mM/只)。 各組的給藥時間點是在椎間盤退變誘導后4周和再往后2周，第二次給藥后，動物分別飼養(yǎng) 2、4和8周。在初次分別給予實施例1的肽和DMSO后的第4、6和10周，取出相應的各個椎間盤組織，將髓核和纖維環(huán)分離并放置在試管中，然后在液氮中快速冷凍并貯存在-70°C的超低溫冰箱中。用Trizol試劑(Invitrogen)從被快速冷凍并貯存的椎間盤組織中提取總RNA。 用提取的總RNAQ μ g)、寡脫氧胸苷酸(oligo dT)以及MMLV-反轉錄酶(Invitrogen)合成 cDNA。M Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems ^w] ), Prism 7900HT (ABI)來檢測GAPDH和聚集蛋白聚糖的mRNA的量。將25ng的cDNA、3 μ 1的10 μ M 引物以及2 X PowerSTOR Green PCR Master Mix混合，使總體積為ΙΟμΙ。在以下反應條件下進行實時PCR 在50°C下2分鐘并且在95°C下10分鐘以誘導酶活性；然后進行45個循環(huán)，每個循環(huán)由在95°C下15秒的反應和在60°C下1分鐘的反應組成；然后是測量各閾值循環(huán)(CT)值。選擇GAPDH作為對照基因，并計算對照基因和聚集蛋白聚糖之間的CT值差異 (ACT)0此外，還計算了正常椎間盤和給予了實施例1的肽的椎間盤(或給予了 DMSO的椎間盤)間的CT值差異(Δ Δ CT)‘。然后，計算2(_Δ Δετ)并表達為相對于正常椎間盤數(shù)值的百分數(shù)。圖2給出實時PCR的結果。圖2是表示與作為參照的正常椎間盤組相比較，在椎間盤退變模型中，給予了 DMSO的椎間盤組的以及給予了實施例1的肽的椎間盤組的聚集蛋白聚糖基因表達水平隨時間變化的圖。如上述圖所示，能夠看出在4周時，與給予了 DMSO 的椎間盤組織相比較，給予了實施例1的肽的椎間盤組織顯示出聚集蛋白聚糖基因表達的增強。在6周和10周時，給予了實施例1的肽的椎間盤組織顯示出的聚集蛋白聚糖表達水平與給予了 DMSO的椎間盤組織的相似。因為只在0周和2周時給予動物實施例1的肽，然后不再給藥，所以可以說，在4周時的聚集蛋白聚糖基因表達的增強是由于實施例1的肽的效力所致，然而實施例1的肽的效力沒有將聚集蛋白聚糖的基因表達維持到6周和10周。 從這些結果能夠看出，本發(fā)明的肽通過增強聚集蛋白聚糖的基因表達，顯示出椎間盤再生的作用，所述聚集蛋白聚糖是椎間盤組織中對椎間盤再生非常重要的一種代表性細胞外基質成分；并且所述肽增強聚集蛋白聚糖基因表達的作用的持續(xù)時間不會過長，從而排除由于聚集蛋白聚糖基因表達過度增強而導致的可能的副作用。實施例4 =TGF- β 1信號涂徑抑制的確認按以下實驗方法來確認實施例1的肽抑制TGF- β 1信號途徑。已知用TGF- β 1處理H印G2細胞導致細胞凋亡，其間，Smad2最先被磷酸化(Park TJ. et al.，Mol Carcinog. 47 :784-796,2008 ；以及 Gressner AM. et al.，J Hepatol. 26 1079-1092,1997)。利用這些性質，實驗如下進行。將IxlO6個H印G2細胞(ATCC ；美國標準生物品收藏中心)接種于60mm的培養(yǎng)皿中，穩(wěn)定過夜，然后用無血清的培養(yǎng)基(SFM)培養(yǎng) 24小時以耗盡營養(yǎng)素。在用實施例1的肽處理細胞之前，將5ng/mL的TGF- β 1 (PromoKine, 德國)和上述肽(1、5和25 μ Μ)在37 °C下預孵化1小時。而且，DMS0(2y 1/mL)也和 TGF- β 1 (5ng/mL)在37°C下預孵化1小時。然后，用所述預孵化過的溶液處理細胞30分鐘， 然后提取蛋白質。此外，細胞僅用10 μ M SB431542(T0CRIS，美國)預先處理，然后孵化1小時，然后用TGF- β 1 (5ng/mL)處理30分鐘，所述SB431542是TGF- β受體的抑制劑。然后， 細胞在放射性免疫沉淀(RIPA)的裂解緩沖液(Millipore) {50mM Tris-HCl (pH 7. 4)、150mM NaCl,0. 25%去氧膽酸、NP-40、lmM乙二胺四乙酸(EDTA)、ImM苯甲基磺酰氟(PMSF)、 40mM NaFUmM Na3V04、ImM 二硫蘇糖醇(DTT)}中、于冰上混勻。勻漿用 BRANSON S0NIFIER 450超聲處理5次，輸出控制為2. 56、占空比(％)為20、時間設定為6。細胞的裂解產物在4°C下、12000rpm離心10分鐘，并將上清液用于蛋白質印跡分析。用Bradford法測定蛋白質濃度。將30yg的蛋白質加入到含2-巰基乙醇的SDS樣品緩沖液中。在95°C下放置 5分鐘后，用10%的SDS-PAGE進行分離，然后進行蛋白質印跡分析。為了進行蛋白質印跡分析，將分離的蛋白質轉移到硝化纖維膜(Bio-Rad Lab)上，并用含5%脫脂牛奶的PBS-T 進行封閉，然后與用含5%脫脂牛奶的PBS-T、按1 3000稀釋的第一抗體在4°C下反應過夜。然后用PBS-T洗滌膜三次，每次5分鐘，再用用含5%脫脂牛奶的PBS-T、按1 5000 稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)結合的抗兔第二抗體(Bio-Rad Lab, 1706515)在室溫下處理 1小時，并用ECL(Amersham Pharmacia)顯色。因為Smad2最先被磷酸化的同時，TGF-β 1 與TGF-β受體結合，因此將能夠檢測磷酸化的Smad2的磷-Smad2(Ser465/467)抗體(Cell Signaling, 3101，8)用作第一抗體。結果在圖3中示出。圖3示出蛋白質印跡的結果(泳道1 未處理的H印G2細胞； 泳道2 :TGF-0 1處理的細胞；泳道3 =TGF-β 1/SB431542處理的細胞；泳道4、5和6 分別用 1、5禾Π 25 μ M的肽/TGF- β 1處理的細胞；以及泳道7 =TGF- β 1/DMS0處理的細胞)。在圖3 中，符號‘ + ’代表經對象材料處理的，和‘_’代表未經對象材料處理的。圖3的底部示出在蛋白質印跡中使用的膜的考馬斯藍染色結果，表明所有泳道中的蛋白質的量是相同的。參照圖3，泳道1顯示出提取自未處理的IfepG2細胞的蛋白質的非常少的磷酸化， 而泳道2顯示出由于TGF-β 1的緣故導致的蛋白質的顯著的磷酸化。此外，還觀察到泳道3 顯示出SB431542完全抑制磷酸化。當分別用1 μ Μ、5 μ M和25 μ M濃度的實施例1的肽處理時，證實了磷酸化程度以劑量依賴的方式下降。DMSO處理的泳道7顯示出和TGF-β 1處理相同的譜圖。從這些結果能夠看出，由于本發(fā)明的肽顯示出對TGF-β 1信號途徑的劑量依賴性的抑制，所以能夠治療通過上述對TGF-βΙ信號途徑的抑制可治愈的疾病，例如身體器官纖維化、癌癥、和 / 或腎小球硬化癥(Prud' homme GJ, Lab Invest 87 :1077-1091,2007)。 進一步地，能夠看出實施例1的肽，不像SB431542那樣完全抑制TGF-β 1信號途徑。由于 TGF-β 1信號途徑是人體內重要的調節(jié)機制，像用SB431542那樣對TGF-β 1信號途徑完全抑制可導致副作用。然而，本發(fā)明的肽以劑量依賴的方式減弱TGF-β 1信號途徑，因此當所述肽用于治療相關疾病時，能夠有利地調節(jié)所述肽的濃度，從而減少可能的副作用。工業(yè)應用本發(fā)明的新型肽或其變體或藥學上可接受的鹽有效地治療和/或預防退變性椎間盤疾病、身體器官纖維化、癌癥和/或腎小球硬化癥，并有效抑制TGF- β 1信號途徑，因此是工業(yè)適用的。
1權利要求
1.一種包括SEQ ID NO :1的氨基酸序列的肽或其變體或藥學上可接受的鹽。
2.根據(jù)權利要求1所述的肽或其變體或藥學上可接受的鹽，其中所述肽或其變體具有通式(I)L-X1-VV-X2-L-X3 (I)其中 是Q或N J2是Y、F或W ;)(3是H、K或R ；L是亮氨酸、Q是谷氨酰胺、N是天冬酰胺、V是纈氨酸、Y是酪氨酸、F是苯丙氨酸、W是色氨酸、H是組氨酸、K是賴氨酸以及R是精氨酸。
3.一種治療和預防退變性椎間盤疾病的組合物，所述組合物包括權利要求1或2所述的肽或其變體或藥學上可接受的鹽。
4.一種治療身體器官纖維化的組合物，所述組合物包括權利要求1或2所述的肽或其變體或藥學上可接受的鹽。
5.根據(jù)權利要求4所述的組合物，其中身體器官纖維化的治療是通過抑制TGF-β1信號途徑來進行的。
6.一種治療癌癥的組合物，所述組合物包括權利要求1或2所述的肽或其變體或藥學上可接受的鹽。
7.根據(jù)權利要求6所述的組合物，其中癌癥的治療是通過抑制TGF-β1信號途徑來進行的。
8.一種治療腎小球硬化癥的組合物，所述組合物包括權利要求1或2所述的肽或其變體或藥學上可接受的鹽。
9.根據(jù)權利要求8所述的組合物，其中腎小球硬化癥的治療是通過抑制TGF-β1信號途徑來進行的。
10.權利要求1或2所述的肽或其變體或藥學上可接受的鹽作為藥物的應用。
11.權利要求1或2所述的肽或其變體或藥學上可接受的鹽在制備用于治療和預防退變性椎間盤疾病的藥物中的應用。
12.權利要求1或2所述的肽或其變體或藥學上可接受的鹽在制備用于治療身體器官纖維化的藥物中的應用。
13.權利要求1或2所述的肽或其變體或藥學上可接受的鹽在制備用于治療癌癥的藥物中的應用。
14.權利要求1或2所述的肽或其變體或藥學上可接受的鹽在制備用于治療腎小球硬化癥的藥物中的應用。
15.一種治療以及預防退變性椎間盤疾病的方法，包括向受試者給予權利要求1或2所述的肽或其變體或藥學上可接受的鹽。
16.一種治療身體器官纖維化的方法，包括向受試者給予權利要求1或2所述的肽或其變體或藥學上可接受的鹽。
17.一種治療癌癥的方法，包括向受試者給予權利要求1或2所述的肽或其變體或藥學上可接受的鹽。
18.一種治療腎小球硬化癥的方法，包括向受試者給予權利要求1或2所述的肽或其變體或藥學上可接受的鹽。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種包括SEQ ID NO1的氨基酸序列的肽、其變體及藥學上可接受的鹽。本發(fā)明的新型肽、其變體及藥學上可接受的鹽有效治療和/或預防退變性椎間盤疾病，治療身體器官纖維化、治療癌癥和/或治療腎小球硬化癥，并且有效抑制TGF-β1信號途徑。
文檔編號A61K38/08GK102482323SQ201080035995
公開日2012年5月30日 申請日期2010年2月12日 優(yōu)先權日2009年8月14日
發(fā)明者文銀貞, 權永準, 金亮瑄, 金海鎮(zhèn) 申請人:因首太克株式會社