專利名稱：用于預測c型肝炎的治療效果的標記物和預測c型肝炎的治療效果的方法以及c型肝炎的 ...的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及在整個宿主基因組進行了全面驗證的、用于預測C型肝炎的治療效果的標記物，使用其的以更高精度預測C型肝炎的治療效果方法，以及在該預測中使用的探針、引物或包含它們的試劑盒，以及C型肝炎的預防或治療劑等。本申請請求通過參照而在此引用的日本申請?zhí)卦?009-192615號的優(yōu)先權。
背景技術：
以往針對預測C型肝炎的治療效果的方法進行了各種研究，但其中大多數(shù)情況下，以根據(jù)患者感染的“病毒因子”進行判斷的方法為主流。具體而言，通過病毒基因型或特定區(qū)域(核心區(qū)或非結構區(qū)(NS5A))的變異來預測干擾素(IFN)的治療效果。近年報道了利用“患者(宿主)本身的單堿基多態(tài)性(SNP)，，的方法，但均是預測 “ IFN單獨療法”中的治療效果的方法，不是以現(xiàn)在正成為主流的“PEG化IFN/RBV并用療法” 為基準的方法，不可能直接轉用(專利文獻1，非專利文獻1，2等)。這是由于“IFN單獨療法”和“PEG化IFN/RBV并用療法”中，成為SNP的判斷基準的治愈效率(顯著效率)本身完全不同，因此，不能將針對“ IFN單獨療法”所導出的SNP 轉用到以“PEG化IFN/RBV并用療法”為對象的SNP中。另外，這些以往的方法只不過是將特定的基因作為候補來進行研究，并不是對整個宿主基因組進行了全面驗證，因此在精度方面還存在問題。這是由于大多數(shù)情況下，藥物的治療效果與多種因素相關，如果不對整個基因組進行全面的SNP驗證，則不能稱為對治療效果的正確預測。專利文獻專利文獻1 日本專利特開2004-298011號公報非專利文獻非專利文獻1 :Matsuyama，N.等· H印atol Res 25，221-225，2003非專利文獻2 =Tsukada, H.等· Gastroenterology 136，1796-1805，2009

發(fā)明內容
本發(fā)明人等為了解決上述問題，在以日本人為中心的亞洲系人群中，對整個宿主基因組全面實施了關于“PEG化IFN/RBV并用療法”的SNP分析(全基因組關聯(lián)研究 (Genome-Wide Association Mudy :GWAS))，結果發(fā)現(xiàn)了大量危險率高(難以獲得治療效果)的SNP，同時發(fā)現(xiàn)了該SNP集中的基因區(qū)域，于是達到了本發(fā)明，本發(fā)明的目的在于提供利用了 SNP或其他的基因多態(tài)性的精度更高的C型肝炎治療效果預測用標記物、該預測中使用的探針、引物或試劑盒、使用了該標記物的C型肝炎治療效果的預測方法以及該治療效果預測標記物的搜索用基因、及使用了本發(fā)明的SNP或其他基因多態(tài)性的集中區(qū)域所編碼的蛋白質的C型肝炎的預防或治療劑。上述的目的是通過下述的第一方面發(fā)明至第十四方面的發(fā)明而達到的。〈第一方面發(fā)明〉一種用于預測C型肝炎的治療效果的標記物，其是人基因組上存在的寡核苷酸或多核苷酸，包括選自下述的基因多態(tài)性或與它們處于連鎖不平衡狀態(tài)(R2 > 0. 8)的基因多態(tài)性中的1種或2種以上rsl2043519、rsl986953、rsl3392065、rsl6987149、rsl6987155、rs2374341、 rs2374342、rs7566701、rsl2713624、rsl0208788、rsl0208883、rs9876122、rs2036081、 rsl3122167、rs4488950、rsl3150115、rs7663113、rsl379606、rs913500、rs6458003、 rs6906840、rs2224068、rs9390164、rs4512312、rs757844、rs4876271、rs7942675、 rsl7787293、rs917334、rs6489019、rs6489020、rs6489021、rsll610391、rs9528038、 rs341554、rs2325219、rsl353348、rs2076954、rsl2907066、rs8075713、rs4795794、 rs955155、rsl2972991、rsl2980275、rs8105790、rsll881222、rs8103142、rs28416813、 rs4803219、rs8099917、rs7248668、rsl0853728、rs4803223、rsl2980602、rs4803224、序列編號59所示的存在于多核苷酸內的基因多態(tài)性。〈第二方面發(fā)明〉根據(jù)第一方面發(fā)明所述的用于預測C型肝炎的治療效果的標記物，其中，寡核苷酸或多核苷酸的長度為40k堿基長以下?！吹谌矫姘l(fā)明〉根據(jù)第一方面發(fā)明或第二方面發(fā)明所述的用于預測C型肝炎的治療效果的標記物，其中，C型肝炎的治療效果是基于使用了干擾素和/或PEG化干擾素進行治療的治療效^ ο〈第四方面發(fā)明〉根據(jù)第一方面發(fā)明至第三方面發(fā)明中任一項所述的用于預測C型肝炎的治療效果的標記物，其中，C型肝炎的治療效果是基于PEG化干擾素/RBV并用療法的治療效果?！吹谖宸矫姘l(fā)明〉一種寡核苷酸或多核苷酸或其標識物，其與包含選自第一方面發(fā)明所述基因多態(tài)性中的1種或2種以上的人基因組上存在的寡核苷酸或多核苷酸雜交。〈第六方面發(fā)明〉一種探針，其含有第五方面發(fā)明所述的寡核苷酸或多核苷酸或其標識物?！吹谄叻矫姘l(fā)明〉一種引物，其含有第五方面發(fā)明所述的寡核苷酸或多核苷酸或其標識物?！吹诎朔矫姘l(fā)明〉一種C型肝炎的治療效果預測用試劑盒，其中包括第六方面發(fā)明所述的探針和/或第七方面發(fā)明所述的引物。〈第九方面發(fā)明〉一種預測C型肝炎的治療效果的方法，其具有下述(1)及O)的工序(1)根據(jù)從患者得到的樣品確定下述(X)的基因型的工序；(X)第一方面發(fā)明所述基因多態(tài)性中的至少1種(2)從由(1)確定的基因型對C型肝炎的治療效果進行預測的工序。
〈第十方面發(fā)明〉根據(jù)第九方面發(fā)明所述的預測C型肝炎的治療效果的方法，其中，C型肝炎的治療效果是基于使用了干擾素和/或PEG化干擾素進行治療的治療效果。〈第十一方面發(fā)明〉根據(jù)第十方面發(fā)明所述的預測C型肝炎的治療效果的方法，其中，C型肝炎的治療效果是基于PEG化干擾素/RBV并用療法的治療效果?！吹谑矫姘l(fā)明〉一種C型肝炎的治療效果預測標記物的搜索用基因，其具有下述(A)或(B)的序列(A)、含有序列編號59所示的多核苷酸的至少一部分的寡核苷酸或多核苷酸，(B)、(A)中1個至數(shù)個核苷酸經缺失、替代、添加和/或插入后的寡核苷酸或多核苷酸?！吹谑矫姘l(fā)明〉—種C型肝炎治療藥的篩選方法，其使用下述㈧至(C)中的至少1種(A)、含有序列編號59所示的多核苷酸中的至少一部分的寡核苷酸或多核苷酸，(B)、(A)中1個至數(shù)個核苷酸經缺失、替代、添加和/或插入后的寡核苷酸或多核苷酸，(C)、人基因組上存在的包含rs8103142的寡核苷酸或多核苷酸?！吹谑姆矫姘l(fā)明〉一種C型肝炎的預防或治療劑，其含有IL28B蛋白質和/或編碼其的基因。發(fā)明效果由于本發(fā)明的“用于預測C型肝炎的治療效果的標記物”基于在整個宿主基因組進行了全面驗證的結果，因此成為能夠更加正確預測C型肝炎的治療、特別是干擾素療法、 其中尤其作為最新治療的“PEG化IFN/RBV并用療法”的治療效果。另外，危險度值比以往的標記物更明確(P值非常小)，容易判斷。通過本發(fā)明的“探針”、“引物”、使用它們的“C型肝炎的治療效果預測用試劑盒”以及“預測C型肝炎的治療效果的方法”，能夠更加正確地預測C型肝炎的治療、特別是干擾素療法、其中尤其作為最新治療的“PEG化IFN/RBV并用療法”的治療效果。通過更加詳盡地研究本發(fā)明的“C型肝炎的治療效果預測標記物的搜索用基因”內部，可以更加迅速地發(fā)現(xiàn)C型肝炎治療效果預測用的新標記物。通過本發(fā)明的“C型肝炎治療藥的篩選方法”，也可以進行除干擾素或RBV以外的 C型肝炎治療藥的篩選。通過本發(fā)明的預防或治療劑，可以期待對C型肝炎的有效的預防或治療。


[圖1]是對分別從PEG-IFN/RBV并用療法中治療無效的患者以及有效的患者的末梢血單核細胞提取的RNA中的IU8 mRNA水平進行比較的圖。[圖2]是示出作為序列編號59所示的多核苷酸的一部分的“TATA的重復序列(以 IL28B的起始密碼子為起點的-595 -568位)”的位置以及在該序列中的2個SNP的位置(主要等位基因)的圖。[圖3]是示出作為序列編號59所示的多核苷酸中的一部分的2個SNP的位置(主要等位基因)的圖(圖2的續(xù)圖)。
具體實施例方式以下，對本發(fā)明詳細地進行說明。另外，本發(fā)明中的“基因”、“寡核苷酸”及“多核苷酸”含有腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G) 等嘌呤堿基，胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)等嘧啶堿基或它們的修飾堿基作為構成要素；其是指單鏈或雙鏈的DNA、單鏈或雙鏈的RNA、包含單鏈DNA和單鏈RNA的雜合體、RNA 與DNA結合而形成單鏈的嵌合體中的任一種或數(shù)種。另外，DNA中也包括cDNA。[本發(fā)明的用于預測C型肝炎的治療效果的標記物]《標記物的定義》本發(fā)明的“用于預測C型肝炎的治療效果的標記物”成為用于預測C型肝炎的治療效果的指標，其是在人基因組上存在的寡核苷酸或多核苷酸，包括選自下述所示基因多態(tài)性或與它們處于連鎖不平衡狀態(tài)(R2 > 0. 8)的基因多態(tài)性中的1種或2種以上。另外，與特定的基因多態(tài)性“處于連鎖不平衡狀態(tài)(R2>0.8)的基因多態(tài)性” 是指可以與該特定的基因多態(tài)性進行同樣的治療效果預測的基因多態(tài)性，例如可以利用 Haploview軟件等按照公知的方法來檢測。具體而言，標記物是指在C型肝炎的感染者或疑似感染的對象者的血液等樣品中存在的基因或基因片段，其成為用于利用后述的探針等而被測出、通過研究其基因型(SNP 等基因多態(tài)性)來預測C型肝炎的治療效果的試劑。rsl2043519、rsl986953、rsl3392065、rsl6987149、rsl6987155、rs2374341、 rs2374342、rs7566701、rsl2713624、rsl0208788、rsl0208883、rs9876122、rs2036081、 rsl3122167、 rs4488950、 rsl3150115、 rs7663113、 rsl379606、 rs913500、 rs6458003、 rs6906840、rs2224068、rs9390164、rs4512312、rs757844、rs4876271、rs7942675、 rsl7787293, rs917334, rs6489019, rs6489020, rs648902U rsll61039U rs9528038、 rs341554、rs2325219、rsl353348、rs2076954、rsl2907066、rs8075713、rs4795794、 rs955155、rsl2972991、rsl2980275、rs8105790、rsll881222、rs8103142、rs28416813、 rs4803219、rs8099917、rs7248668、rsl0853728、rs4803223、rsl2980602、rs4803224 (SNP 編號1 55 :參考表1、3)、序列編號59所示的存在于多核苷酸內的基因多態(tài)性。上述rs編號所示的基因多態(tài)性表示SNP。另外，序列編號59是人基因組中存在的編碼IL28B的基因及包含其周邊的序列的一個示例。另外，IL28B是在2條染色體中的所謂反義鏈中載有的基因。另一方面，表3中等位基因利用染色體的有義鏈來表現(xiàn)。因此，序列編號 59 內存在的 4 個 SNP(rsll881222、rs8103142、rs28416813、 rs4803219)的主要等位基因的記載(被圖2、3的框包圍的部分)與表3所示的主要等位基因互補。上述“基因多態(tài)性”是與普通基因型不同的基因型，其頻率是指群體的以上，不僅包括SNP，還包括除了 1個至數(shù)個核苷酸的缺失、替代、添加和/或插入等變異之外的 VNTR (variable number of tandemrepeat 可變數(shù)目串聯(lián)重復序列)或 STRP (short tandem repeatpolymorphism 短串聯(lián)重復序列多態(tài)性)等，也包括重復多態(tài)性部分的一部分經缺失、替代、添加和/或插入等變異后的基因多態(tài)性。這樣的SNP以外的基因多態(tài)性也包含于本發(fā)明的標記物是由于以下原因在序列編號59所示的多核苷酸的啟動子區(qū)有時會存在缺失數(shù)個核苷酸的情況，可以看到該缺失與上述SNP中的一部分SNP的風險等位基因的連鎖，很有可能會被認為是與對C型肝炎治療的抵抗性相關的基因多態(tài)性。具體而言，在存在于序列編號59內的、存在于IL28B基因的起始密碼子上游的啟動子區(qū)的“TATA的重復序列(-595 -568位)”(圖2中被框包圍的第300號 第327號的序列)中，有時可以看到缺失4個，而且可以看到，該缺失與上述SNP中P值非常低的 rsll881222、rs8103142、rs28416813、rs4803219的低頻等位基因(風險等位基因)的連鎖。另外，“序列編號59所示的存在于多核苷酸內的基因多態(tài)性”是“序列編號59所示的存在于多核苷酸內的各種基因多態(tài)性中，除上述列舉的SNP之外的基因多態(tài)性”，是指其它的公知或未知的SNP以外的基因多態(tài)性。包含上述基因多態(tài)性是由于認為上述SNP大多存在于序列編號59的多核苷酸區(qū)域內，因此，序列編號59本身與C型肝炎的治療效果相關的可能性高，如果為該區(qū)域內的基因多態(tài)性，則與C型肝炎的治療效果預測相關的可能性高。另外，包含“序列編號59所示的存在于多核苷酸內的基因多態(tài)性”的本發(fā)明的標記物中，當然也包括序列編號59所示的多核苷酸中(表示基因多態(tài)性部分以外的)1個至數(shù)個核苷酸經缺失、替代、添加和/或插入后的寡核苷酸或多核苷酸。原則而言，序列編號59所示的基因是存在于人基因組中的編碼IL28B的基因及包含其周圍的序列的一個示例(染色體的反義鏈)，這是因為在人基因組上這些變異體(缺失、替代、添加和/或插入)的存在因人而異。另外，表示上述SNP的數(shù)值(rs編號)或序列表中記載的序列酌量了 NCBI的數(shù)據(jù)庫(Build 35)中公開的人的基因信息。在上述中，認為rs955155、rsl2972991、rsl2980275、rs8105790、rsll881222、rs8103142、 rs28416813、rs4803219、rs8099917、rs7248668、rsl0853728 (SNP 編號 42 52 :參照表 3)的IlSNPs的作為治療效果的重要指標的所謂P值(P value)小(="-log P” 大)，在C型肝炎的治療效果中容易出現(xiàn)差別，因此優(yōu)選作為標記物，其中，rs8105790、rsll881222、rs8103142、rs28416813、rs4803219、rs8099917、 rs7248668 (SNP 編號 45 51 :參照表 3)的TSNI3S滿足全基因組關聯(lián)研究的有意義水平(Bonferroni criterion P < 8. 05X 10_8(0· 05/621，220))，并且存在于相同的單倍型塊(haploblock)內，因此特別優(yōu)選作為重要的標記物。P值與有意義的概率意思相同，是用于表示統(tǒng)計學檢驗的有意義性的概率值。
除此之外，包含序列編號59所示的存在于多核苷酸內的基因多態(tài)性的寡核苷酸或多核苷酸作為優(yōu)選的標記物的一個示例被列舉。選擇包含序列編號59所示的存在于多核苷酸內的基因多態(tài)性的寡核苷酸或多核苷酸作為優(yōu)選的標記物的一例是由于如下原因如上所述，序列59所示的多核苷酸即 IL28B區(qū)域內及其附近發(fā)現(xiàn)了 SNP編號1 55的SNP中的大多數(shù)(SNP編號42 55)。SNP等的基因多態(tài)性連鎖的情況很多，因此并不是僅1個SNP等基因多態(tài)性而是組合相鄰并連鎖的多個SNP等基因多態(tài)性，而在制作單倍體型后來進行研究是非常重要的。 這是因為例如通過將表現(xiàn)該標記物(基因)內的單倍體型的tag(代表)SNP等基因多態(tài)性組合來進行驗證，C型肝炎的治療效果的預測很可能進一步變得高效且可靠。這些包含寡核苷酸或多核苷酸的C型肝炎的治療效果預測標記物可以利用從患者樣品采集以及根據(jù)需要精制而得的寡核苷酸或多核苷酸，但當所得樣品中存在的基因或基因片段為mRNA時，可以用逆轉錄酶制備cDNA，作為C型肝炎的治療效果的標記物使用?！稑擞浳锏拇笮　纷鳛樯鲜霰景l(fā)明的標記物的寡核苷酸或多核苷酸的大小，優(yōu)選為 40k堿基長 (或堿基對(bp))，更優(yōu)選為 1 堿基長(或bp)，再更優(yōu)選為1500 3000堿基長(或 bp)?！稑擞浳锏姆N類》包含選自上述的1種或2種以上的基因多態(tài)性的、存在于人基因組上的寡核苷酸或多核苷酸只要是包含至少1種的基因多態(tài)性的寡核苷酸或多核苷酸即可，多個基因多態(tài)性可以存在于1個寡核苷酸或多核苷酸中，也可以分散存在于多個寡核苷酸或多核苷酸中?！冻蔀槔脴擞浳镱A測治療效果的對象的治療方法》成為使用本發(fā)明的用于預測C型肝炎的治療效果的標記物來預測治療效果的對象的具體的治療方法，可以舉出IFN單獨療法、PEG化IFN單獨療法、PEG化IFN/RBV (2劑并用)療法、PEG化IFN/RBV/其他的藥劑(3劑或4劑并用)療法等使用了 IFN或PEG化IFN 的治療等。這是因為本發(fā)明的標記物是從2劑并用療法的實際結果發(fā)現(xiàn)的，然而有報告指出，這些標記物中的若干個存在于IU8B蛋白質的基因區(qū)域，該IL28B通過 ISG(interferon-stimulated genes，干擾素刺激基因)誘導及 TLRCToll-Like Receptor, Toll 樣受體)發(fā)揮抗病毒效果(Ank, N.等.J Immunol 180，2474-2485 (2008) ；Marcello, T.等.Gastroenterologyl31,1887-1898 (2006)),因此對于以IFN為基礎的治療整體產生影響的可能性高，在使用了 IFN的治療方法的效果確認中有用的可能性非常高。在本發(fā)明的標記物包含的基因多態(tài)性中，在IU8B區(qū)域內及其周邊存在的 SNP (SNP編號42 55)或其他基因多態(tài)性的上述可能性特別高。另外，使用了“PEG化IFN/RBV/其他的藥劑1種或2種”的3劑并用療法或4劑并用療法是以PEG化IFN/RBV2劑并用療法為基礎的治療法，這是指，其是PEG化IFN/RBV2劑并用療法的一種。但是，當本發(fā)明的標記物包含除上述IL28B關聯(lián)寡(或多)核苷酸之外的編碼蛋白質的區(qū)域時，有可能在除了 IFN以外的其他的C型肝炎治療藥的效果判定中也能夠使用。
這是由于這些基因多態(tài)性所編碼的蛋白質本身有可能與C型肝炎相關。[本發(fā)明的寡核苷酸或多核苷酸、或其標識物]本發(fā)明的“寡核苷酸或多核苷酸、或其標識物”與含有選自上述基因多態(tài)性中1種或2種以上的人基因組上存在的寡核苷酸或多核苷酸雜交?！吧鲜龅幕蚨鄳B(tài)性”是指本發(fā)明的標記物中包含的各種基因多態(tài)性。這些寡核苷酸或多核苷酸、或其標識物具有在含有上述基因多態(tài)性的區(qū)域雜交的性質，因此，在預測C型肝炎的治療效果時，可以作為從擴增患者樣品中的基因時使用的引物或擴增后的基因中釣取本發(fā)明的預測標記物用的探針來使用。標識物是指通過使其與探針或引物等結合，可以容易地檢測出目標標記物基因。作為標識物，可列舉如生物素、地高辛配基(digoxigenin)、放射性標識、酶標識、 熒光標識等。[本發(fā)明的探針]本發(fā)明的探針含有上述本發(fā)明的寡核苷酸或多核苷酸、或其標識物。標識物對寡核苷酸或多核苷酸的結合可以通過公知的方法來進行。《探針的定義》探針用于釣取特定的寡核苷酸或多核苷酸(在本申請中，相當于包含基因多態(tài)性的標記物)，與成為檢測目標的寡(或多)核苷酸進行特異性雜交。探針的序列優(yōu)選與目標堿基序列完全形成互補對，但雜交程度只要與完全的互補對具有同源性即可?！短结樀淖饔谩繁景l(fā)明的探針可以在預測C型肝炎的治療效果時，用于檢測相當于標記物的寡 (或多)核苷酸?！短结樀拇_定方法》可以對照成為檢測目標的寡(或多)核苷酸(標記物)的堿基序列，以與其進行雜交的方式，對探針進行適當設計?！短结樀拇笮　诽结樀拇笮「鶕?jù)成為檢測目標的寡(或多)核苷酸而不同，不能一概而論，例如為 1000堿基長，優(yōu)選為5 500堿基長，更優(yōu)選10 40堿基長左右即可。另外，通常作為探針，從核酸分子的穩(wěn)定性方面等考慮，適合使用DNA，但在使用實時PCR法之一的循環(huán)探針(cycling probe)法來擴增目標時，使用嵌合探針(chimeric probe)?！短结樀氖纠纷鳛榫唧w的探針，例如當作為檢測目標的寡(或多)核苷酸為IL28B關聯(lián)寡(或多)核苷酸時，可列舉如下表3所示的探針。[本發(fā)明的引物]本發(fā)明的引物含有上述本發(fā)明的寡核苷酸或多核苷酸、或其標識物?！兑锏亩x》引物是在擴增特定的寡核苷酸或多核苷酸(本申請中，相當于包含基因多態(tài)性的標記物)時使用，是指與成為檢測目標的寡(或多)核苷酸的反義鏈及有義鏈的3’末端分別特異性雜交的同義(正向)引物和反義(反向)引物。引物的序列優(yōu)選與目標堿基序列完全形成互補對，但與目標的雜交程度只要與完全的互補對具有同源性即可。《引物的作用》本發(fā)明的引物能夠用于在預測C型肝炎的治療效果時，使樣品中與標記物相當?shù)墓?或多)核苷酸增幅、檢測容易進行?！兑锏拇_定方法》可以對照成為檢測目標的寡(或多)核苷酸(標記物)的末端堿基序列，適當設計引物?！兑锏拇笮　芬锏拇笮「鶕?jù)成為檢測目標的寡(或多)核苷酸而不同，不能一概而論，例如為 5 100堿基長，優(yōu)選為10 70堿基長，更優(yōu)選15 50堿基長左右即可。另外，通常作為引物，從核酸分子的穩(wěn)定性方面等考慮，適合使用DNA，但在等溫基因擴增法(ICAN法)中使用嵌合引物。《引物的示例》作為具體的引物，例如當作為檢測目標的寡(或多)核苷酸為IL28B關聯(lián)寡(或多)核苷酸時，可列舉如下表3所示的引物。[本發(fā)明的C型肝炎的治療效果預測用試劑盒]本發(fā)明的C型肝炎的治療效果預測用試劑盒的特征在于，包含上述本發(fā)明的探針和/或引物?！对噭┖械淖饔谩稢型肝炎的治療效果預測用試劑盒是用于預測C型肝炎的治療效果的試劑盒?！对噭┖械臉嫵梢亍繁景l(fā)明的試劑盒中可列舉如探針、引物、其他的PCR中必要的試劑(耐熱性DNA 聚合酶)，基因型分型中一般必需的裝置、試劑、軟件、計算機等，可以選擇這些中適當、必需的。[本發(fā)明的預測C型肝炎的治療效果的方法]本發(fā)明的預測C型肝炎的治療效果的方法的特征在于，具有下述(1)及O)的工序。(1)根據(jù)從患者得到的樣品，確定下述(X)的基因型的工序；(X)上述基因多態(tài)性中的至少1種(2)從由(1)確定的基因型對C型肝炎的治療效果進行預測的工序。(X)中，“上述基因多態(tài)性”是指本發(fā)明的標記物中包含的各種基因多態(tài)性。另外，⑴中包含的“序列編號59所示的存在于多核苷酸內的基因多態(tài)性”是指除上述SNP以外的在序列編號59的多核苷酸內存在的、包括其他公知或未知的SNP以外的基因多態(tài)性(包括多態(tài)性部分的缺失、替代、添加和/或插入)的基因多態(tài)性。這是由于如果是SNP集中的序列編號59的多核苷酸區(qū)域內的基因多態(tài)性，則與 C型肝炎的治療效果相關的可能性高?！痘颊叩亩x》
11
患者是指感染C型肝炎或疑似感染的患者，除人之外包括黑猩猩或人肝細胞移植嵌合體小鼠等，但由于本發(fā)明的標記物是利用以人為對象的GWAS而得到的，因此優(yōu)選人?！秮碜曰颊叩臉悠肥占椒ā窂纳鲜龌颊卟杉缛缦滤信e的樣品?！稑悠返亩x》樣品是指血液、血清、淋巴液、精液、尿、唾液(含有口腔粘膜細胞)、其他體液以及機體組織等，由于血液(淋巴細胞)最容易采集、侵襲性低，因此優(yōu)選?！秮碜詷悠返墓?或多)核苷酸或蛋白質的制備》由上述樣品制備寡(或多)核苷酸。作為寡(或多)核苷酸，可列舉如以基因組 DNA或mRNA為基礎利用逆轉錄酶而制備的cDNA等。另外，當基因多態(tài)性伴隨氨基酸替代時，使用以上述核酸為基礎而獲得的蛋白質也可以進行基因型的確認。寡(或多)核苷酸的制備利用公知的方法進行即可，但當寡(或多)核苷酸為DNA 時，可以例如從作為樣品的血液中的淋巴細胞或粒細胞等血細胞，通過鹽析、PCI (酚氯仿提取)法、使用市售的DNA提取試劑盒等的方法、其他公知的方法來進行。另外，當寡(或多)核苷酸為mRNA時，可以使用在PCI法中將溶液變?yōu)樗嵝詮乃畬犹崛〉姆椒?、利用Oligo-dT柱等的方法、使用市售的RNA提取試劑盒的方法、其他公知的方法?！逗怂岬臄U增》當從樣品獲得的核酸的量少時，可以根據(jù)需要利用公知的方法進行擴增。當核酸為DNA時，可以使用PCR法等。當核酸為mRNA時，可以使用RT-PCR法。另外，作為定量PCR法，也可以使用利用了 TaqMan探針或STOR綠(Power SYBR) 的實時PCR法等?！痘蛐偷拇_定方法》使用所得核酸確定基因多態(tài)性部分的基因型?；蛐偷拇_定方法可以使用公知的序列確定法等，例如除了使用測序儀等確定直接堿基序列的直接測序法(雙脫氧法)之外，可例舉如利用RELP(限制性片段長度多態(tài)性 (restriction fragment lengthpolymorphism))白勺 PCR—RELP 法、TaqMan 法、DigiTag2 法、 單核苷酸引物延伸法、SnaPshot法(ABI)，ASP-PCR法、PCR-SSO (聚合酶鏈反應-序列特異性寡核苷酸(sequence specific oligonucleotide))法、PCR-SSP(聚合酶鏈反應-序列特異性引物(specific sequence primer))法、PCR-SSCP(聚合酶鏈反應-單鏈構象多態(tài)性分析(single-strandedconformational polymorphism analysis))法、禾1J用電泳等的核酸長度的確認以及使用DNA芯片等基因多態(tài)性檢測用儀器等的方法等，但并不限定于這些方法?！独没蛐偷闹委熜Ч念A測方法》根據(jù)上述獲得的基因型的信息，參考后述的表1 表3等，從而可以預測C型肝炎的治療效果。即可以認為，在從患者獲得的樣品中，如檢測到各基因多態(tài)性的風險等位基因時，則治療效果低的可能性高，特別是越是P值低的基因多態(tài)性的風險等位基因，治療效果低的概率越高?！锻ㄟ^本發(fā)明的方法成為預測治療效果的對象的治療方法》通過本發(fā)明的預測C型肝炎的治療效果的方法而成為預測治療效果的對象的具體的治療方法可例舉如IFN單獨療法、PEG化IFN單獨療法、PEG化IFN/RBV(2劑并用)療法、PEG化IFN/RBV/其他藥劑(3劑或4劑并用)療法等使用了 IFN或PEG化IFN的治療寸。但是，本發(fā)明的標記物包含除上述IL28B關聯(lián)寡(或多)核苷酸之外的編碼蛋白質的區(qū)域時，也可以在IFN以外的其他的C型肝炎治療藥的效果的判定中使用。這是因為這些基因多態(tài)性編碼的蛋白質本身有可能與C型肝炎相關。[本發(fā)明的C型肝炎的治療效果預測標記物的搜索用基因]本發(fā)明的“C型肝炎的治療效果預測標記物的搜索用基因”的特征在于，具有下述 (A)或⑶的序列。(A)、含有序列編號59所示的多核苷酸的至少一部分的寡核苷酸或多核苷酸(B)、(A)中1個至數(shù)個核苷酸經缺失、替代、添加和/或插入后的寡核苷酸或多核苷酸序列編號59所示的基因是包含編碼L28B的基因及其周邊的序列(IL28B關聯(lián)寡 (或多)核苷酸)。將其選擇到標記物搜索用基因中是因為上述SNP中的多數(shù)在包含IL28B的該區(qū)域內被發(fā)現(xiàn)。這是由于可以認為，SNP連鎖的情況很多，因此左右C型肝炎的治療效果的未表達的基因多態(tài)性集中在該區(qū)域的可能性非常高。也包括(B)的變異體是因為，根據(jù)患者的不同，包括編碼IL28B的基因及其周邊的序列通過基因多態(tài)性或其他變異等，有時會與序列編號59的情況產生多少不同。[本發(fā)明的C型肝炎治療藥的篩選方法]本發(fā)明的C型肝炎治療藥的篩選方法的特征在于使用下述(A)至(C)中的至少1 種。(A)、含有序列編號59所示的多核苷酸中的至少一部分的寡核苷酸或多核苷酸(B)、(A)中1個至數(shù)個核苷酸經缺失、替代、添加和/或插入后的寡核苷酸或多核苷酸(C)、存在于人基因組上的包含rs8103142的寡核苷酸或多核苷酸這是因為作為 SNP的rs8103142存在的基因所編碼的蛋白質(IU8B)本身有可能與C型肝炎相關，因此含有IL28B等的rs8103142的寡(或多)核苷酸有可能在其他的C型肝炎治療藥的效果的判定中使用。另外，作為篩選方法，可以使用選擇將基因、蛋白質的表達量、蛋白質的活性增減的物質的各種公知的方法，也可以在“體內”、“體外”、“無細胞體系”等任一種實驗系統(tǒng)下進行。[本發(fā)明的C型肝炎的預防或治療劑]本發(fā)明的C型肝炎的預防或治療劑的特征在于，包括IL28B蛋白質和/或編碼其的基因。
這是因為，以純合或雜合具有本發(fā)明的SNP標記物的低頻等位基因(風險等位基因)的患者(治療效果低的組)，與以純合具有主要等位基因的患者(治療效果高的組)相比，IL28的mRNA表達水平有統(tǒng)計學意義地下降，因此，IL28B的表達量也有統(tǒng)計學意義地下降的可能性高，另外，如上所述，由于IL28B本身與C型肝炎相關的可能性高等，因此認為給予IL28B或編碼其的基因有助于C型肝炎治療的可能性高。實施例[利用GWAS對C型肝炎的治療效果預測]使用安裝了 90萬種以上的SNP分析用探針的AffymetrixGenome-Wide Human SNP Array 6. 0 (以下，稱為SNP Array 6. 0)，針對對C型慢性肝炎實施了 PEG-IFN/RBV并用療法的154人進行SNP分型，根據(jù)藥劑敏感性分成亞組(GWAS階段(GWAS Stage)第1板(1st panel)無效(NVR)組82人對有效(VR)組72人)，進行全基因組關聯(lián)研究(GWAS)。將選擇P值為10_5水平或其以下水平的情況的結果示于表1。另外，P值主要通過卡方檢驗算出。另外，無效組是指治療中病毒一次也沒有消失的示例。由其結果可知，尤其是位于染色體第19號的IU8B附近的SNPs(rsl2980275和 rs8099917)低頻等位基因而言，P值低，有助于治療無效(表2)。(分別為:P = 1. 93Χ1(Γ13 ；OR = 20. 3 和 3. IlXlO-15 ；OR = 30. 0)。因此，使用其他的樣品組，對于下述的14個SNP (序列編號42 5 進行驗證。(M)從IU8基因附近的HapMap數(shù)據(jù)獲得的、包含上述2個(rsU980275禾口 rs8099917)SNPs 的 llSNPs，以及(N)通過包括IU8B的區(qū)域的序列確認的3SNPs使用上述GWAS階段的巧4人以及與其不同的利用了 DigiTag2法的作為復制階段 (Replication Stage)的 172 人(NVR :50 人對 VR :122 人)的第 2 板(2nd panel)，計算將他們合并的314人的組合(combined)的P值，將結果示于表3。合計為314人是因為GWAS階段的IM人中，質量控制呼叫率OjCcall rate)未滿95%的12人(NVR 4人+VR 8人)被從GWAS階段排除，加到復制階段的172人中。質量控制呼叫率^jC call rat)是指可能分析SNP的比例。將其結果示于表3。表3所示的多個SNPs的P = 10_5以下，與治療無效相關。這些14SNPs 的驗證結果顯示，除了 rsU980275(SNP44)及 rs8099917 (SNP50) 之夕卜，位于 IL28B 的 9SNPs (rs955155 (SNP42)、rsl2972991 (SNP43)、rs8105790 (SNP45)、 rs 11881222 (SNP46)、rs8103142 (SNP47)、rs28416813 (SNP48)、rs480321 (SNP49)、 rs7248668 (SNP51)、rsl0853728 (SNP52))尤其與C型肝炎的治療無效緊密相關。另外，在上述驗證中，以GWAS數(shù)據(jù)的確認(Validation)以及復制application) 為目的，使用DigiTag2法確定了 SNP的基因型。DigiTag2法是對成為分析對象的每個SNP使用SNP特異的普通探針(common probe)以及等位基因特異的信息探針(query probe)可以一次性對多處的SNP確定基因型的多重 SNP 分型法的一種(AnalyticalBiochemistry vol. 364，No. 1,2007, P. 78-85 等)。檢測用探針分為與SNP位置鄰接、存在于下游的3'側探針(普通探針)及在3'
14末端包含SNP、存在于上游的5'側探針'(信息探針)。信息探針對每個SNP準備與等位基因對應的2種。根據(jù)與信息探針的3'末端對應的SNP的基因型，僅具有與其互補堿基的信息探針才可以與在3'側鄰接存在的普通探針相結合。在反義鏈設計的信息探針成為與NCBI數(shù)據(jù)庫的Fasta序列(hstasequence)相同的堿基序列，在有義鏈設計時，成為互補的堿基序列。另外，為了檢測，在各信息探針的5'末端連接有與等位基因對應的2種的查詢標簽(query tag)，另外在普通探針的3 ‘末端連接有每個SNP不同的普通標簽(common tag)。使用DNA芯片進行檢測。其中，該DNA芯片固定了具有與連接到普通探針的普通標簽相互補的堿基序列的寡聚DNA。與檢測體的基因型相對應生成的信息探針與普通探針的結合產物被具有與DNA芯片上的普通標簽相互補的堿基序列的寡聚DNA捕獲。對應于與等位基因相應的查詢標簽，導入2種熒光分子，從而確定各SNP的基因型。[表1]
權利要求
1.一種用于預測C型肝炎的治療效果的標記物，其是人基因組上存在的寡核苷酸或多核苷酸，包括選自下述的基因多態(tài)性或與它們處于連鎖不平衡狀態(tài)(R2 > 0. 8)的基因多態(tài)性中的1種或2種以上rsl2043519、 rsl986953、 rsl3392065、 rsl6987149、 rsl6987155、 rs2374341、 rs2374342、rs7566701、rsl2713624、rsl0208788、rsl0208883、rs9876122、rs2036081、 rsl3122167、rs4488950、rsl3150115、rs7663113、rsl379606、rs913500、rs6458003、 rs6906840、rs2224068、rs9390164、rs4512312、rs757844、rs4876271、rs7942675、 rsl7787293、rs917334, rs6489019, rs6489020, rs648902U rsll61039U rs9528038、 rs341554、rs2325219、rsl353348、rs2076954、rsl2907066、rs8075713、rs4795794、 rs955155、rsl2972991、rsl2980275、rs8105790、rsll881222、rs8103142、rs28416813、 rs4803219、rs8099917、rs7248668、rsl0853728、rs4803223、rsl2980602、rs4803224、序列編號59所示的存在于多核苷酸內的基因多態(tài)性。
2.根據(jù)權利要求1所述的用于預測C型肝炎的治療效果的標記物，其中，寡核苷酸或多核苷酸的長度為40k堿基長以下。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的用于預測C型肝炎的治療效果的標記物，其中，C型肝炎的治療效果是基于使用了干擾素和/或PEG化干擾素的治療的治療效果。
4.根據(jù)權利要求1 3中任一項所述的用于預測C型肝炎的治療效果的標記物，其中， C型肝炎的治療效果是基于PEG化干擾素/RBV并用療法的治療效果。
5.一種寡核苷酸或多核苷酸或其標識物，其與包含選自權利要求1所述基因多態(tài)性中的1種或2種以上的存在于人基因組上的寡核苷酸或多核苷酸雜交。
6.一種探針，其含有權利要求5所述的寡核苷酸或多核苷酸或其標識物。
7.一種引物，其含有權利要求5所述的寡核苷酸或多核苷酸或其標識物。
8.一種C型肝炎的治療效果預測用試劑盒，其包括權利要求6所述的探針和/或權利要求7所述的引物。
9.一種預測C型肝炎的治療效果的方法，其具有下述(1)及O)的工序(1)根據(jù)從患者得到的樣品確定下述(X)的基因型的工序；(X)權利要求1所述基因多態(tài)性中的至少1種(2)從由(1)確定的基因型對C型肝炎的治療效果進行預測的工序。
10.根據(jù)權利要求9所述的預測C型肝炎的治療效果的方法，其中，C型肝炎的治療效果是基于使用了干擾素和/或PEG化干擾素進行治療的治療效果。
11.根據(jù)權利要求10所述的預測C型肝炎的治療效果的方法，其中，C型肝炎的治療效果是基于PEG化干擾素/RBV并用療法的治療效果。
12.—種C型肝炎的治療效果預測標記物的搜索用基因，其具有下述(A)或(B)的序列(A)、含有序列編號59所示的多核苷酸的至少一部分的寡核苷酸或多核苷酸，(B)、(A)中1個至數(shù)個核苷酸經缺失、替代、添加和/或插入后的寡核苷酸或多核苷酸。
13.—種C型肝炎治療藥的篩選方法，其使用下述(A)至(C)中的至少1種(A)、含有序列編號59所示的多核苷酸中的至少一部分的寡核苷酸或多核苷酸，(B)、(A)中1個至數(shù)個核苷酸經缺失、替代、添加和/或插入后的寡核苷酸或多核苷酸，(C)人基因組上存在的包含rs8103142的寡核苷酸或多核苷酸。
14. 一種C型肝炎的預防或治療劑，其含有IU8B蛋白質和/或編碼其的基因。
全文摘要
本發(fā)明提供更高精度的治療效果預測標記物，以及使用其的在“PEG化IFN/RBV并用療法”中更高精度地預測C型肝炎治療效果的方法等；一種用于預測C型肝炎的治療效果的標記物，以及使用其的C型肝炎的治療效果預測方法，其是人基因組上存在的寡核苷酸或多核苷酸，包括選自下述的基因多態(tài)性或與它們處于連鎖不平衡狀態(tài)(R2＞0.8)的基因多態(tài)性中的1種或2種以上rs12043519、rs1986953、rs13392065、rs16987149、rs16987155、rs2374341、rs2374342、rs7566701、rs12713624、rs10208788、rs10208883、rs9876122、rs2036081、rs13122167、rs4488950、rs13150115、rs7663113、rs1379606、rs913500、rs6458003、rs6906840、rs2224068、rs9390164、rs4512312、rs757844、rs4876271、rs7942675、rs17787293、rs917334、rs6489019、rs6489020、rs6489021、rs11610391、rs9528038、rs341554、rs2325219、rs1353348、rs2076954、rs12907066、rs8075713、rs4795794、rs955155、rs12972991、rs12980275、rs8105790、rs11881222、rs8103142、rs28416813、rs4803219、rs8099917、rs7248668、rs10853728、rs4803223、rs12980602、rs4803224、序列編號59所示的存在于多核苷酸內的基因多態(tài)性。
文檔編號A61P31/14GK102482664SQ20108003659
公開日2012年5月30日 申請日期2010年8月5日 優(yōu)先權日2009年8月21日
發(fā)明者德永勝士, 溝上雅史, 田中靖人 申請人:公立大學法人名古屋市立大學, 財團法人日本健康科學振興財團