專利名稱：凝血蛋白綴合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使水溶性聚合物綴合于凝血蛋白的材料和方法。
技術(shù)背景
治療性多肽例如凝血蛋白(包括因子IX(FIX)、因子VIII (FVIII)、因子 VIIa(FVIIa)、馮威利布蘭德因子(Von Willebrand Factor，VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、 因子XI (FXI)、因子XII (FXII)、凝血酶(FII)、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、tPA、PAI-I、組織因子 (TF)及ADAMTS 13蛋白酶)，會被蛋白水解酶快速降解并被抗體中和。這會縮短其半衰期及循環(huán)時間，從而限制其治療效果。必需相對較高劑量及頻繁施用來達到并維持這些凝血蛋白的期望治療或預防效果。因此，難以實現(xiàn)適當?shù)膭┝空{(diào)節(jié)，且對頻繁靜脈內(nèi)施用的需要給患者的生活方式造成限制。
多肽藥物的聚乙二醇化在循環(huán)中對所述藥物進行保護，且改善其藥效學及藥物動力學特性(Harris 和 Chess，Nat Rev Drug Discov. 2003:2:214-21)。聚乙二醇化過程使乙二醇重復單元(聚乙二醇(PEG))連接至多肽藥物。PEG分子具有大流體動力學體積(球狀蛋白大小的5-10倍)，具有高度水溶性且為水合的、無毒性、非免疫原性的，并快速自身體內(nèi)清除。分子的聚乙二醇化可增強藥物對酶促降解的抗性，增加體內(nèi)半衰期、減少給藥頻率、降低免疫原性、增強物理及熱穩(wěn)定性、增強溶解性、增強液體穩(wěn)定性及減少聚集。第一種聚乙二醇化藥物在20世紀90年代早期獲得FDA批準。此后，F(xiàn)DA批準了數(shù)種聚乙二醇化藥物用于口服、注射及局部施用。
聚唾液酸(PSA)(也稱為多聚乙酰神經(jīng)氨糖酸(colominic acid, CA))為天然存在的多糖。其為含α Q —8)酮苷鍵合的N-乙酰基神經(jīng)氨糖酸的同聚物且在其非還原末端含有鄰二醇基團。其帶負電且為人體的天然組成部分。其可容易地由細菌以大量及預定生理特征制造(美國專利第5，846，951號)。因為細菌產(chǎn)生的PSA在化學及免疫方面與人體所產(chǎn)生的PSA相同，所以細菌PSA即使與蛋白質(zhì)偶聯(lián)也是非免疫原性的。不同于某些聚合物，聚唾液酸為生物可降解的。多聚乙酰神經(jīng)氨糖酸與過氧化氫酶及天門冬酰胺酶的共價偶聯(lián)已顯示增強在蛋白水解酶或血漿存在下的酶穩(wěn)定性。用聚唾液酸化天門冬酰胺酶與未經(jīng)修飾的天門冬酰胺酶進行的體內(nèi)比較研究揭示聚唾液酸化增加酶的半衰期(Femandes 禾口 Gregoriadis， Int Biochimica Biophysica Acta 134126-34，1997)。
通過在水溶性聚合物與治療性蛋白質(zhì)之間形成共價鍵聯(lián)來制備綴合物可利用多種化學方法進行。舉例而言，Roberts等人(Adv Drug Deliv Rev 2002 :54:459-76)回顧了 PEG衍生物與肽或蛋白質(zhì)的偶聯(lián)。一種使水溶性聚合物與治療性蛋白質(zhì)偶聯(lián)的方法為使聚合物經(jīng)由蛋白質(zhì)的碳水化合物部分綴合。可容易地用過碘酸鈉(NaIO4)氧化蛋白質(zhì)中碳水化合物的鄰羥基(OH)以形成活性醛基(Rothfus和Smith，J Biol Chem 1963 238:1402-10 ；van Lenten 和 Ashweli，J Biol Chem 1971:246:1889-94)。接著，可通過使用含有例如活性酰胼基的試劑使聚合物與碳水化合物的醛基偶聯(lián)(Wilchek M和Bayer EA, Methods Enzymol 1987 138 429-42)。新近技術(shù)為使用含有與醛反應(yīng)形成肟鍵合的氨氧基的試劑(WO 96/40662、W02008/025856)。
描述使水溶性聚合物綴合于治療性蛋白質(zhì)的其它實例描述于以下文獻中W0 06/071801，教導氧化馮威利布蘭德因子中的碳水化合物部分，并接著使用酰胼化學與PEG 偶聯(lián)；美國公開第2009/0076237號，教導氧化rFVIII，并接著使用酰胼化學與PEG及其它水溶性聚合物(例如PSA、HES、葡聚糖)偶聯(lián)；WO 2008/025856，教導氧化不同凝血因子(例如rFIX、FVIII及FVIIa)，并接著使用氨氧基化學經(jīng)由形成肟鍵合與例如PEG偶聯(lián)；及美國專利第5，621，039號，教導氧化FIX，并接著使用酰胼化學與PEG偶聯(lián)。
最近，描述了一種改良方法，所述方法包括以過碘酸鹽適度氧化唾液酸以產(chǎn)生醛，接著在催化量的苯胺存在下與含氨氧基的試劑反應(yīng)(Dirksen A和Dawson ΡΕ, Bioconjugate Chem. 2008 19，2543-8 ；及 Zeng Y 等人，Nature Methods 2009:6:207-9)。 苯胺催化作用顯著加速肟連接，從而允許使用極低濃度的所述試劑。
縱使存在可用于使水溶性聚合物綴合于治療性蛋白質(zhì)的方法，但仍需要開發(fā)改良蛋白質(zhì)的藥效學和/或藥物動力學性質(zhì)同時使與各種試劑相關(guān)的成本降至最低的使水溶性聚合物綴合于蛋白質(zhì)的材料和方法。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供使聚合物綴合于蛋白質(zhì)的材料和方法，其改善蛋白質(zhì)的藥效學和/或藥物動力學性質(zhì)同時使與各種試劑相關(guān)的成本降至最低。
在本發(fā)明的一個實施方案中，使水溶性聚合物綴合于凝血蛋白的氧化的碳水化合物部分的方法包括使氧化的碳水化合物部分與活化的水溶性聚合物在允許綴合的條件下接觸；所述凝血蛋白選自由以下所組成的組因子IX(FIX)、因子VIII (FVIII)、因子Vila(FVIIa)、馮威利布蘭德因子(VffF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI (FXI)、因子 XII (FXII)、凝血酶(FII)、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、tPA、PAI-I、組織因子(TF)及ADAMTS 13 蛋白酶或其生物活性片段、衍生物或變異體；所述水溶性聚合物含有活性氨氧基且選自由以下所組成的組聚乙二醇(PEG)、分支PEG、聚唾液酸(PSA)、碳水化合物、多糖、普魯蘭 (pullulane)、殼聚糖、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、 聚環(huán)氧烷(PAO)、聚亞烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯?；鶈徇?、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥基甲基亞乙基-羥基甲基縮甲醛)(PHF)、磷酸2-甲基丙烯酰氧基-2’-乙基三甲基銨(MPC)；且所述碳水化合物部分通過用包含氧化劑的緩沖液孵育而氧化，所述氧化劑選自由以下所組成的組過碘酸鈉(NaI04)、四乙酸鉛(Pb(0Ac)4) 及過釕酸鉀(KRu04)；其中肟鍵合在氧化的碳水化合物部分與水溶性聚合物上的活性氨氧基之間形成。
在本發(fā)明的另一實施方案中，根據(jù)上述方法的水溶性聚合物為PSA。在相關(guān)實施方案中，PSA包含約5-500或10-300個唾液酸單元。在又一實施方案中，根據(jù)上述方法的凝血蛋白為FIX。在另一實施方案中，根據(jù)上述方法的凝血蛋白為FVIIa。在又一實施方案中， 根據(jù)上述方法的凝血蛋白為FVIII。在又一實施方案中，提供一種上述方法，其中氧化劑為過碘酸鈉(NaI04)。在另一實施方案中，根據(jù)上述方法的凝血蛋白的氧化的碳水化合物部分位于凝血蛋白的活化肽中。
在本發(fā)明的又一實施方案中，提供一種上述方法，其中所述PSA通過使活化的氨氧基連接基團與氧化的PSA反應(yīng)來制備；其中所述氨氧基連接基團選自由以下所組成的組 下式的3-氧雜-戊烷-1，5- 二羥基胺連接基團
權(quán)利要求
1.一種使水溶性聚合物綴合于凝血蛋白的氧化的碳水化合物部分的方法，所述方法包括使所述氧化的碳水化合物部分與活化的水溶性聚合物在允許綴合的條件下接觸；所述凝血蛋白選自由以下所組成的組因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子 Vila (FVIIa)、馮威利布蘭德因子(VffF)、因子FV (FV)、因子X (FX)、因子XI (FXI)、因子 XII (FXII)、凝血酶(FII)、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、tPA、PAI-1、組織因子(TF)及ADAMTS 13蛋白酶或其生物活性片段、衍生物或變異體；所述水溶性聚合物含有活性氨氧基且選自由以下所組成的組聚乙二醇(PEG)、分支 PEG、聚唾液酸(PSA)、碳水化合物、多糖、普魯蘭、殼聚糖、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚環(huán)氧烷(PAO)、聚亞烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、 聚噁唑啉、聚丙烯?；鶈徇⒕垡蚁┐?PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥基甲基亞乙基-羥基甲基縮甲醛)(PHF)、磷酸2-甲基丙烯酰氧基_2’ -乙基三甲基銨(MPC)；且所述碳水化合物部分通過用包含氧化劑的緩沖液孵育而氧化，所述氧化劑選自由以下所組成的組過碘酸鈉(NaIO4)、四乙酸鉛(Pb(OAc)4)及過釕酸鉀(KRuO4)；其中肟鍵合在所述氧化的碳水化合物部分與所述水溶性聚合物上的活性氨氧基之間形成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述水溶性聚合物為PSA。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述PSA包含約10-300個唾液酸單元。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述凝血蛋白為FIX。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述凝血蛋白為FVIIa。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述凝血蛋白為FVIII。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的方法，其中所述氧化劑為過碘酸鈉(NaIO4)。
8.根據(jù)權(quán)利要求4至7中任一項所述的方法，其中所述凝血蛋白的氧化的碳水化合物部分位于凝血蛋白的活化肽中。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述PSA通過使活化的氨氧基連接基團與氧化的 PSA反應(yīng)來制備；其中所述氨氧基連接基團選自由以下所組成的組a)下式的3-氧雜-戊烷-1，5-二羥基胺連接基團
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述氨氧基連接基團為3-氧雜-戊烷-1，5-二羥基胺。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述氧化劑為NaI04。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項所述的方法，其中所述氧化的碳水化合物部分與所述活化的水溶性聚合物的接觸在包含選自由苯胺及苯胺衍生物所組成的組的親核性催化劑的緩沖液中進行。
13.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其進一步包括通過在包含選自由氰基硼氫化鈉 (NaCNBH3)及抗壞血酸(維生素C)所組成的組的還原化合物的緩沖液中孵育綴合的凝血蛋白來還原所述綴合的凝血蛋白中的肟鍵合的步驟。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述還原化合物為氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)15
15.一種經(jīng)修飾凝血蛋白，其為利用根據(jù)權(quán)利要求第1至12項中任一項所述的方法產(chǎn)生。
16.一種經(jīng)修飾FIX，其包含(a)FIX分子或其生物活性片段、衍生物或變異體；及(b)至少一個結(jié)合至(a)的FIX分子的氨氧基PSA，其中所述氨氧基PSA經(jīng)由一個或多個碳水化合物部分連接至所述FIX。
17.一種經(jīng)修飾FVIIa，其包含(a)FVIIa分子或其生物活性片段、衍生物或變異體；及(b)至少一個結(jié)合至(a)的FVIIa分子的氨氧基PSA，其中所述氨氧基PSA經(jīng)由一個或多個碳水化合物部分連接至所述FVIIa。
18.一種經(jīng)修飾FVIII，其包含(a)FVIII分子或其生物活性片段、衍生物或變異體；及(b)至少一個結(jié)合至(a)的FVIII分子的氨氧基PSA，其中所述氨氧基PSA經(jīng)由一個或多個碳水化合物部分連接至所述FVIII。
19.一種經(jīng)修飾FIX，其包含(a)FIX分子或其生物活性片段、衍生物或變異體；及(b)至少一個結(jié)合至(a)的FIX分子的氨氧基PEG，其中所述氨氧基PEG經(jīng)由一個或多個碳水化合物部分連接至所述FIX。
20.一種經(jīng)修飾FVIIa，其包含(a)FVIIa分子或其生物活性片段、衍生物或變異體；及(b)至少一個結(jié)合至(a)的FVIIa分子的氨氧基PEG，其中所述氨氧基PEG經(jīng)由一個或多個碳水化合物部分連接至所述FVIIa。
21.一種經(jīng)修飾FVIII，其包含(a)FVIII分子或其生物活性片段、衍生物或變異體；及(b)至少一個結(jié)合至(a)的FVIII分子的氨氧基PEG，其中所述氨氧基PEG經(jīng)由一個或多個碳水化合物部分連接至所述FVIII。
22.—種水溶性聚合物，其包含活性氨氧基連接基團；所述水溶性聚合物選自由以下所組成的組聚乙二醇(PEG)、分支PEG、聚唾液酸(PSA)、碳水化合物、多糖、普魯蘭、殼聚糖、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚環(huán)氧烷(PAO)、聚亞烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯酰基嗎啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥基甲基亞乙基-羥基甲基縮甲醛)(PHF)、磷酸2-甲基丙烯酰氧基-2’-乙基三甲基銨(MPC)；所述活性氨氧基連接基團選自由以下所組成的組a)下式的3-氧雜-戊烷-1，5-二羥基胺連接基團
全文摘要
本發(fā)明涉及使水溶性聚合物綴合于凝血蛋白的氧化的碳水化合物部分的材料和方法，所述方法包括使所述氧化的碳水化合物部分與活化的水溶性聚合物在允許綴合的條件下接觸。更具體地，本發(fā)明涉及上述材料和方法，其中所述水溶性聚合物含有活性氨氧基，且其中肟鍵合在所述氧化的碳水化合物部分與所述水溶性聚合物上的活性氨氧基之間形成。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述綴合在親核性催化劑苯胺存在下進行。另外，所產(chǎn)生的肟鍵合可通過用NaCNBH3還原形成烷氧基胺鍵合來穩(wěn)定。
文檔編號A61K47/48GK102497884SQ201080037002
公開日2012年6月13日 申請日期2010年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月27日
發(fā)明者H·羅騰斯坦納, J·思科曼, P·圖雷切克, S·海德爾 申請人:巴克斯特醫(yī)療保健股份有限公司, 巴克斯特國際公司