專利名稱：使用副粘病毒載體的經(jīng)鼻噴霧型結(jié)核疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用副粘病毒載體的經(jīng)鼻噴霧型結(jié)核疫苗，特別涉及使用人的副流感病毒2型病毒載體(hPIV2)的經(jīng)鼻噴霧型結(jié)核疫苗。
背景技術(shù)：
結(jié)核是由屬于分枝桿菌屬的人型結(jié)核菌(結(jié)核分枝桿菌，Mycobacterium tuberculosis)引起的感染癥。即使在現(xiàn)在，結(jié)核也是導(dǎo)致大量感染者的疾病之一。在全世界，每年有800萬人患結(jié)核病，約200萬人死亡。這是由于現(xiàn)有的結(jié)核疫苗BCG (Bacil 1 e de Calmette et Guerin 卡介菌)疫苗對成人不具有效果，因此，在嬰幼兒期的疫苗接種只在年輕時得到預(yù)防結(jié)核效果，即使追加接種，也不能誘導(dǎo)對成人的預(yù)防結(jié)核效果。另外，在日本，每年產(chǎn)生2萬人以上的結(jié)核病患者(約20名患者/10萬人)，成為中等流行國家。在結(jié)核預(yù)防中使用的BCG疫苗以牛型結(jié)核菌(牛分枝桿菌，Mycobacterium bovis)為原型。通過將牛型結(jié)核菌經(jīng)過長時間傳代培養(yǎng)，失去對人的毒性，將僅殘留抗原性的細(xì)菌作為BCG疫苗使用。由對人體接種該活菌而獲得免疫，進(jìn)行對人型結(jié)核菌的感染防御。BCG疫苗是現(xiàn)在被實用化的唯一的結(jié)核預(yù)防疫苗，嬰幼兒結(jié)核的預(yù)防效果得到廣泛認(rèn)可。BCG疫苗的效果在十余年左右喪失，在成人后，通過自然免疫力的增加防止結(jié)核的發(fā)生。但是，依靠自然免疫力不能充分抑制成人結(jié)核的發(fā)病。對于該事態(tài)，可以考慮在成人后再接種BCG疫苗的方法，但是，已知BCG疫苗對成人結(jié)核的效果低(或幾乎無效)。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1 國際公開公報2002/066055專利文獻(xiàn)2 日本特開2008-074749號公報非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1 第52屆日本病毒學(xué)會學(xué)術(shù)集會，M蛋白欠損^ 7 7 ；^ > ι' 2 型々4卟7 (PIV2)及t/ 7々7 IL-4 f揷入L· tz PIV2乃性狀解析，2004年11月21日

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題對于上述事態(tài)，進(jìn)行了若干種成人結(jié)核疫苗的開發(fā)。例如，進(jìn)行了 MVA85A疫苗(在安卡拉痘苗病毒中表達(dá)抗酸桿菌85A抗原的疫苗),Aeras402疫苗(在35型腺病毒中表達(dá) 85A 抗原和 TB10. 4 的疫苗)和 M72F (別名 GSK TBlOl 是由 GSK (Glaxo Smith Kline)公司開發(fā)的疫苗，是將結(jié)核分枝桿菌的蛋白質(zhì)和GSK公司的AS02佐劑共同使用的疫苗)等的開發(fā)。但是，至今仍沒有得到具有充分效果的成人結(jié)核疫苗。本發(fā)明是鑒于上述事實而作出的，其目的在于提供在結(jié)核預(yù)防中具有效果的經(jīng)鼻噴霧型疫苗。
用于解決課題的方法hPIV2是屬于副粘病毒科的病毒，其基因組是約15000堿基的單鏈負(fù)鏈RNA。在該核酸結(jié)合核衣殼蛋白(NP)，形成螺旋對稱的核苷蛋白質(zhì)復(fù)合體(核衣殼，RNP)。編碼病毒基因組的蛋白質(zhì)中，M蛋白與病毒糖蛋白的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)區(qū)域、被膜脂質(zhì)雙層膜和RNP相互作用， 在病毒顆粒的出芽中是重要的。通過基因重組使M蛋白缺失的病毒基因組雖然感染細(xì)胞， 表達(dá)特定的病毒蛋白質(zhì)，但不能出芽。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，使M蛋白缺失的PIV2能夠作為用于在標(biāo)的細(xì)胞表達(dá)外來蛋白質(zhì)的載體使用(非專利文獻(xiàn)1)。另一方面，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌來源的α抗原在過敏性疾病的預(yù)防、治療中是有效的(專利文獻(xiàn)1)。構(gòu)建在CMV啟動子和TPA信號肽的下游中重組入有α抗原的表達(dá)載體PcDNA-α-K，在哮喘小鼠模型中進(jìn)行驗證。另外，發(fā)現(xiàn)為了有效地使用α抗原，作為表達(dá)量多的載體，使用PIV2，對過敏性疾病是有效的(專利文獻(xiàn)2)。本發(fā)明的發(fā)明人在研究上述技術(shù)在結(jié)核疫苗中是否能夠應(yīng)用時，吃驚地發(fā)現(xiàn)， 在現(xiàn)有的方法中，幾乎得不到效果的結(jié)核菌感染預(yù)防，在使M蛋白質(zhì)或F蛋白質(zhì)缺損的 hPIV2(rhPIV2)中重組入有α抗原的表達(dá)載體顯示結(jié)核預(yù)防效果，從而基本完成了本發(fā)明。這樣，第1發(fā)明涉及的經(jīng)鼻噴霧型結(jié)核疫苗，特征在于在使M基因、F基因或HN 基因缺損的副粘病毒基因中重組入有抗酸桿菌來源的α抗原(Ag85B)、其類似物、編碼具有與它們同樣的功能的它們的突變體(以下稱為“α抗原等”)的基因。另外，第2發(fā)明涉及的結(jié)核預(yù)防或治療方法，特征在于在使M基因、F基因或HN 基因缺損的副粘病毒基因中重組入有抗酸桿菌來源的α抗原、其類似物、編碼具有與它們同樣的功能的它們的突變體的基因，對包括人的哺乳動物進(jìn)行噴霧且經(jīng)鼻給藥。副粘病毒是指屬于副粘病毒科的病毒。副粘病毒在基因組中具有負(fù)鏈單鏈RNA，病毒粒是指顯示150nm 350nm多形性的病毒分類。副粘病毒顆粒被包于被膜中，在被膜表面排列有2種糖蛋白(F和HN)。副粘病毒中，例如，包括副流感病毒(PIV)、牛副流感病毒 3型、仙臺病毒、流行性腮腺炎病毒、犬瘟熱病毒、牛瘟病毒、麻疹病毒、小反芻動物瘟病毒、 新城雞瘟病毒、禽副粘病毒2 9型、亨德拉病毒、尼帕病毒、牛呼吸合胞體病毒(牛RS病毒)、人呼吸合胞體病毒(人RS病毒)、人偏肺病毒等。α抗原優(yōu)選是來自堪薩斯分枝桿菌(Mycobacterium kansasii)或牛分枝桿菌 BCG(Mycobacterium bovis BCG)的α抗原。另外，α抗原的類似物優(yōu)選為抗原85復(fù)合體結(jié)構(gòu)蛋白85Α或抗原85復(fù)合體結(jié)構(gòu)蛋白85C。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明，對成人結(jié)核也能夠提供預(yù)防、治療效果高的疫苗。本發(fā)明涉及的疫苗是充分利用作為骨架的副粘病毒(特別是hPIV2)具有的呼吸器感染中的高蛋白表達(dá)特性、并且給藥便利性高的經(jīng)鼻噴霧型的活疫苗。目前開發(fā)中的 MVA85A和Aeras 402的重組活疫苗均為注射劑，相對于此，本發(fā)明涉及的經(jīng)鼻疫苗為噴霧劑，目的蛋白的表達(dá)量也高于注射劑給藥。在結(jié)核預(yù)防中，在疾病表現(xiàn)部位的肺的局部免疫誘導(dǎo)被視為比全身免疫更重要。通過使用插入了具有細(xì)胞免疫(Thl)移動性功能的蛋白基因的副粘病毒載體，可以得到在肺中的高細(xì)胞性免疫誘導(dǎo)，因此，與其它載體相比，可以認(rèn)為對結(jié)核菌的疫苗效果更高。另外，即使在作為骨架的病毒的病原性中，對成人的安全性也特別高。另外，在制造方面，通過培養(yǎng)細(xì)胞的使用和噴霧化，能夠?qū)崿F(xiàn)高成品率和成本降低。


圖1是通過導(dǎo)入終止密碼子從而不表達(dá)M蛋白質(zhì)的反義rhPIV2基因組的簡要說明圖。圖2是從含有通過在T7啟動子的下游導(dǎo)入重組入的終止密碼子而得到的M基因缺損型反義rhPIV2基因組cDNA的質(zhì)粒載體回收病毒顆粒的方法的說明圖。圖3是表示使M蛋白基因或F蛋白基因缺失、將Ag85B等基因作為表達(dá)型重組入的 AM/rhPIV2 和 AF/rhPIV2 的結(jié)構(gòu)圖。圖4是確認(rèn)在rhPIV2_GFP經(jīng)鼻給藥的倉鼠的氣管中GFP的表達(dá)的顯微鏡照片圖。圖5是通過rhPIV2_Ag85B確認(rèn)有無基因產(chǎn)物的表達(dá)時蛋白免疫印跡的照片圖。圖6是表示在F表達(dá)細(xì)胞中含有GFP基因的Δ F/rhPIV2增殖從而出現(xiàn)GFP熒光的細(xì)胞增加的情況的圖。圖7是表示通過在Δ F/rhPIV2中導(dǎo)入BCG_Ag85B的載體表達(dá)BCG_Ag85B的情況的蛋白免疫印跡圖。圖8是以rhPIV2_Ag85B(M終止，M-stop)疫苗經(jīng)鼻給藥后的小鼠中確認(rèn)感染結(jié)核菌后的肺中結(jié)核菌的結(jié)節(jié)的照片圖。分別是(A)投與對照物(rhPIV2-GFP)4次后，(B)投與表達(dá)型 Ag85B-DNA 2 次、rhPIV2_Ag85B (Μ 終止)2 次后、(C)投與 rhPIV2_Ag85B (Μ 終止)4 次后，感染結(jié)核菌的小鼠的肺。圖9是表示圖8中所示的肺病變情況的顯微鏡照片圖。分別是㈧投與 rhPIV2-Ag85B (Μ終止)4次后、(B)投與對照物(rhPIV2_GFP) 4次后，感染結(jié)核菌的小鼠的月市。圖10是表示比較在rhPIV2_Ag85B(M終止)疫苗的結(jié)核感染預(yù)防試驗中的結(jié)核菌數(shù)的圖表。
具體實施例方式接著，邊參照圖表邊說明本發(fā)明的實施方式。本發(fā)明的技術(shù)范圍不受這些實施方式限定，能夠不改變發(fā)明要點地以各種方式實施。本發(fā)明的技術(shù)范圍覆蓋均等的范圍。在本發(fā)明中使用的人副粘病毒(特別是hPIV2)，病原性極低且蛋白質(zhì)表達(dá)量多。 因此，能夠制備直接重組入編碼外來蛋白質(zhì)的α抗原的基因的副粘病毒基因并使用。但是，除去病毒的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)基因，將該基因由細(xì)胞、質(zhì)粒等供給，供給更安全的非增殖型病毒載體的腺病毒載體等，在作為副粘病毒基因的一種的hPIV2載體中，使用使 hPIV2的M基因、F基因或HN基因缺損的rhPIV2，由此，雖然感染和蛋白質(zhì)的表達(dá)同等進(jìn)行， 但不產(chǎn)生感染性hPIV2，形成更安全的hPIV2載體。因此，在本發(fā)明中，在使M基因、F基因或HN基因缺損的hPIV2(rhPIV2)中重組入編碼α抗原等的基因。作為重組入α抗原等的部位，可以是rhPIV2基因組的任意位置，但是，通過在反義病毒基因組的5 ‘末端側(cè)重組入，外來蛋白質(zhì)的表達(dá)量變多，故而優(yōu)選。反義PIV2基因組是單鏈RNA，從5'末端向3'末端具有稱為前導(dǎo)序列(Leader 啟動子序列)、NP、V/P、M、F、HN、L、拖尾序列(Trailer)的結(jié)構(gòu)。因此，編碼α抗原等的基因優(yōu)選位于緊隨前導(dǎo)序列(啟動子序列)之后或者NP和 V/P之間等的靠近5'末端側(cè)的位置。為了使作為基質(zhì)蛋白的M基因和作為構(gòu)成膜蛋白質(zhì)基因的F基因或HN基因缺損， 可以例示將編碼M蛋白質(zhì)、F蛋白質(zhì)或HN蛋白質(zhì)的基因部分的全部或一部分敲除的方法， 或在編碼M蛋白質(zhì)、F蛋白質(zhì)或HN蛋白質(zhì)的基因某處重組入終止密碼子的方法等。通過在細(xì)胞中向使M基因、F基因或HN基因缺損的PIV2基因組基因中短暫性地導(dǎo)入分別表達(dá)M蛋白質(zhì)、F蛋白質(zhì)或HN蛋白質(zhì)的質(zhì)粒而使該基因表達(dá)的方法，或形成分別表達(dá)M基因、F基因或HN基因的細(xì)胞，在該細(xì)胞上使M基因、F基因或HN基因缺損的PIV2 增殖，由此，能夠在不表達(dá)這些基因的細(xì)胞、組織中制作不進(jìn)行多階段增殖的非增殖型的 PIV2。將完全缺損M基因、F基因或HN基因、不能自律增殖的病毒分別稱為AM/rhPIV2或 rhPIV2 ( Δ Μ)、Δ F/rhPIV2 或 rhPIV2 ( Δ F)、或 Δ HN/rhPIV2 或 rhPIV2 ( Δ ΗΝ)。在本發(fā)明中，α抗原(Ag85B)是在抗酸桿菌中普遍存在的蛋白之一，鑒定為作為抗原85復(fù)合體之一的抗原85復(fù)合體結(jié)構(gòu)蛋白85B。該抗原85復(fù)合體由分子量為30 32kD 左右的抗原 85 復(fù)合體結(jié)構(gòu)蛋白 85A(Ag85A Jnfect. Immun. 57 :3123-3130,1989)、抗原 85 復(fù)合體結(jié)構(gòu)蛋白 85B (Infect. Immun. 58 (2), 550-556, (1990). Accession No. X53897) 和抗原85復(fù)合體結(jié)構(gòu)蛋白85C(Ag85C Jnfect. Immun. 59 :5205-3212,1991)構(gòu)成。這些蛋白質(zhì)是抗酸桿菌的主要分泌蛋白。已知在結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌等的同屬細(xì)菌之間，這些分泌蛋白的基因、氨基酸序列超越種屬，顯示高同源性，顯示對單克隆抗體的交叉反應(yīng)性(Microbiol. Rev. 56 :648-661，1992)。作為α抗原(抗原85復(fù)合體結(jié)構(gòu)蛋白85Β :Ag85B)的類似物，可以列舉抗原85復(fù)合體結(jié)構(gòu)蛋白85A(Ag85A)、抗原85復(fù)合體結(jié)構(gòu)蛋白85C(Ag85C)等。在本發(fā)明中，編碼抗酸桿菌來源的α抗原或其類似物的基因是指能夠表達(dá)α 抗原蛋白或抗原85復(fù)合體結(jié)構(gòu)蛋白85Α、抗原85復(fù)合體結(jié)構(gòu)蛋白85C等α抗原蛋白的類似物的基因。具體而言，可以列舉含有處于編碼α抗原或其類似物的基因表達(dá)載體的形態(tài)的基因。作為編碼α抗原的基因，可以列舉編碼堪薩斯分枝桿菌(Infect. Immun. 58 :550-556. 1990)、牛分枝桿菌 BCG(J. Bacteriol. 170 :3847-3854. 1988)、鳥分枝桿菌(Infect. Immun. 61 :1173—1179，1993)、胞內(nèi)分枝桿菌(Biochem, Biophys. Res. Commun. 196 1466-1473，1993)、麻風(fēng)分枝桿菌(Mol. Microbiol. 6 153-163，1992)等抗酸桿菌來源的α抗原的基因。這些基因均能夠在本發(fā)明中使用。其中，作為編碼堪薩斯分枝桿菌的α抗原的基因，可以列舉具有序列序號1所示的第390 第1244的堿基序列的 DNA，作為編碼牛分枝桿菌BCG的α抗原的基因，可以列舉具有序列序號3所示的第121 第975的堿基序列的DNA。除了這些DNA以外，也能夠使用具有與該DNA互補(bǔ)的序列的DNA 和在嚴(yán)格條件下雜交的突變體DNA，編碼含有相對于由該DNA編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列使1個或多個(優(yōu)選數(shù)個)氨基酸殘基被取代、缺失和/或添加的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的 DNA;上述DNA是編碼具有與堪薩斯分枝桿菌或牛分枝桿菌BCG來源的α抗原同樣的功能的蛋白質(zhì)的突變體DNA。與堪薩斯分枝桿菌或牛分枝桿菌BCG來源的α抗原同樣的功能是指顯示對結(jié)核菌(結(jié)核分枝桿菌)的感染發(fā)揮同樣的預(yù)防效果。牛分枝桿菌BCG的α抗原包括285個氨基酸殘基的成熟蛋白質(zhì)，該氨基酸序列具有比堪薩斯分枝桿菌的α抗原更高的與結(jié)核分枝桿菌的氨基酸同源性(100%)，可以認(rèn)為通過導(dǎo)入該α抗原，發(fā)揮更高的結(jié)核發(fā)病預(yù)防效果。作為用于得到突變體DNA的具體方法，例如，可以列舉以下的方法。S卩，在50%甲酰胺、4XDenhardt、5XSSPE(SSPE 溶液EDTA 磷酸鈉鹽(SSPE)UXDenhardt 0. 02%水溶性聚蔗糖、0. 02%聚乙烯吡咯烷酮、0. 02%牛血清蛋白),0. 2% SDS、100y g/mL、ssDNA和 12. 5ng 的探針(使用 BcaBest DNA Labeling Kit (TakaRa)，通過[α-32P] dCTP (Amersham) 標(biāo)記12. 5ng具有序列序號1所示的第390號 第1244號的堿基序列或序列序號3所示的第121號 第975號的堿基序列得到的cDNA斷片)存在下，以45°C進(jìn)行14 16小時菌落雜交后，在1XSSPE、0. 5% SDS溶液中以45°C洗凈過濾器30分鐘，此后，在0. IXSSPE, 0. 5% SDS溶液中，以55°C洗凈過濾器1小時，最后，在0. 1XSSPE、0. 5% SDS溶液中，以65°C 洗凈過濾器1小時，消除背景后，在X射線膠片(Fuji)中以-80°c暴露72小時，確定對應(yīng)的菌落位置，將其單獨(dú)分離，由此能夠得到突變體DNA。它們的突變體所編碼的氨基酸序列相對于α抗原的氨基酸序列通常具有60%以上的同源性，優(yōu)選具有75%以上的同源性。在編碼堪薩斯分枝桿菌或牛分枝桿菌BCG以外的抗酸桿菌由來的α抗原的基因時，也可以同樣是它們的突變體。作為編碼α抗原類似物的抗原85復(fù)合體結(jié)構(gòu)蛋白85Α的基因，可以列舉與關(guān)于上述α抗原基因的各種抗酸桿菌同樣的抗酸桿菌來源的基因。更具體而言，可以列舉編碼結(jié)核分枝桿菌來源的抗原85復(fù)合體結(jié)構(gòu)蛋白85Α的DNA(Infect. Immun. 57 =3212-3130, 1989)。關(guān)于編碼抗原85復(fù)合體結(jié)構(gòu)蛋白85C的基因也同樣可以列舉各種抗酸桿菌來源的基因。更具體而言，可以列舉編碼結(jié)核分枝桿菌來源的抗原85復(fù)合體結(jié)構(gòu)蛋白85C的 DNAdnfect. Immun. 59 =3205-3212,1991)。關(guān)于這些DNA，也與上述同樣地，能夠使用具有與這些DNA互補(bǔ)的序列的DNA和在嚴(yán)格的條件下雜交的DNA，編碼含有相對于由該DNA編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列使1個或多個(優(yōu)選數(shù)個)氨基酸殘基被取代、缺失和/或添加的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA ；上述DNA是編碼具有與抗原85復(fù)合體結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)85Α或抗原 85復(fù)合體結(jié)構(gòu)蛋白85C同樣功能的蛋白質(zhì)的突變體。上述DNA能夠基于上述文獻(xiàn)中所記載的序列信息、Genbank等的序列信息等，使用適當(dāng)?shù)腄NA部分作為PCR引物，通過對抗酸桿菌來源的mRNA進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)等進(jìn)行克隆。 另外，也能夠基于氨基酸序列信息進(jìn)行化學(xué)合成。上述DNA的突變體，例如，能夠通過定點突變法、PCR法或通常的雜交法等容易地得到。在本發(fā)明中，在結(jié)核預(yù)防中也能夠使用抗酸桿菌來源的α抗原蛋白、作為其類似物的抗原85復(fù)合體結(jié)構(gòu)蛋白85Α或抗原85復(fù)合體結(jié)構(gòu)蛋白85C其本身或它們的突變體蛋白。作為這樣的α抗原，可以列舉由編碼上述α抗原的基因編碼的蛋白質(zhì)。具體而言，例如，可以列舉由具有序列序號1所示的堪薩斯分枝桿菌的堿基序列的DNA編碼的、具有序列序號2所示的氨基酸序列的α抗原，或由具有序列序號3所示的牛分枝桿菌BCG的堿基序列的DNA編碼的、具有序列序號4所示的氨基酸序列的α抗原等。后者的堿基序列和氨基 Ml^^i^SU^tiM URL(http//www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/X62397 ？ ordinalpos = l&amp ；itool = EntrezSystem2. PEntrez. Sequence. Sequence_ResultsPanel.Sequence_ RVDocSum)得到。除了具有這些氨基酸序列的α抗原以外，也可以是含有相對于序列序號2或序列序號4的氨基酸序列使1或多個(優(yōu)選數(shù)個)氨基酸殘基取代、缺失和/或添加的氨基酸序列的、與該α抗原具有同樣功能的突變體蛋白質(zhì)。除了堪薩斯分枝桿菌或牛分枝桿菌BCG 來源以外的抗酸桿菌的α抗原時，也同樣地是含有相對這些氨基酸序列使1或多個(優(yōu)選數(shù)個)氨基酸殘基取代、缺失和/或添加的氨基酸序列的、與該α抗原具有同樣功能的突變體蛋白質(zhì)。另外，關(guān)于抗原85復(fù)合體結(jié)構(gòu)蛋白85Α或抗原85復(fù)合體結(jié)構(gòu)蛋白85C，也可以列舉結(jié)核分枝桿菌來源的抗原85復(fù)合體結(jié)構(gòu)蛋白85Α (Infect. Immun. 57 =3213-3130, 1989)、結(jié)核分枝桿菌來源的抗原85復(fù)合體結(jié)構(gòu)蛋白85C(Infect. Immun. 59 :3205-3212, 1991)等。關(guān)于這些α抗原蛋白的類似物，可以是與α抗原蛋白突變體同樣的突變體。這樣的蛋白質(zhì)能夠通過使用編碼該蛋白質(zhì)的基因得到重組DNA法制造，另外也能夠通過化學(xué)合成制造?；蛘咭材軌蛞赃m當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基培養(yǎng)堪薩斯分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG等的抗酸桿菌，從其培養(yǎng)液通過公知的精制法精制而得到(kand. J. Immunol. 43 202-209，1996 J.Bacteriol. 170 :3847-3854,1988 ；Hiroshima J.Med. Sci. 32 :1-8,1983 ； J. Bacteriol. 170 :3847-3854,1988)。在本發(fā)明中，作為結(jié)核疫苗，在使用編碼抗酸桿菌來源的α抗原、其類似物或它們的突變體的基因時，具體而言，以含有編碼抗酸桿菌來源的α抗原、其類似物或它們的突變體的基因的hPIV2的形態(tài)使用。作為rhPIV2，能夠使用使M基因、F基因或HN基因缺失的hPIV2基因組。通過在編碼M基因、F基因或HN基因缺失的hPIV2(rhPIV2)基因組中重組入編碼α抗原等的基因，構(gòu)建表達(dá)α抗原等的rhPIV2載體。該表達(dá)載體通常能夠作為噴霧劑對包括人的哺乳動物給藥。噴霧劑能夠通過通常方法制備。例如，可以通過在適當(dāng)?shù)娜軇?PBS等的緩沖液、生理鹽水、穩(wěn)定劑等)中溶解后， 根據(jù)需要以過濾器等過濾滅菌，接著在無菌容器中填充而制備。在噴霧劑中，可以根據(jù)需要加入常用的載體等。為了將這樣得到的表達(dá)載體作為結(jié)核疫苗使用，能夠通過噴霧劑的通常使用方法給藥。作為結(jié)核疫苗的給藥量，能夠根據(jù)對象患者的體重等變化，通常，作為表達(dá)載體，1 次使用約IXlO3 IXIOki個病毒，優(yōu)選使用約IXlO4 IXlO9個病毒，優(yōu)選經(jīng)過數(shù)日 數(shù)周的間隔，合計給藥2 5次。以下，通過實施例具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受這些實施例任何限定。實施例1 通過導(dǎo)入終止密碼子構(gòu)建M蛋白缺失的反義rhPIV2 (Μ終止)基因組圖1中，表示在編碼M蛋白質(zhì)的基因的確定位置中重組入終止密碼子的反義 rhPIV2 (Μ終止)基因組的概要。表示在Τ7啟動子的下游作為cDNA重組入Δ 119 (使M蛋白基因259位的AAG為TAG)和Δ觀9 (使M蛋白基因89位的ATG為TAG，并且使259位的 AAG 為 TAG)的 2 種 M 蛋白缺損 hPIV2(分別為 rhPIV2(A119) ^P rhPIV2 ( Δ 289))反義 rhPIV2基因組的質(zhì)粒載體的情況(將它們總稱為rhPIV2(M終止))。在構(gòu)建使M蛋白缺損的hPIV2(M終止)中，能夠使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的基因手法(例如PCR法)。實施例2 :rhPIV2 (Μ終止)的制備方法接著，說明從含有在Τ7啟動子的下游插入有反義rhPIV2基因組cDNA的質(zhì)?；厥詹《绢w粒的方法。在圖2中表示該方法的概要。將如圖1所示操作而構(gòu)建得到的反義 rhPIV2 基因組(rhPIV2、rhPIV2(A^9)、rhPIV2(A119))轉(zhuǎn)染到表達(dá) T7 RNA聚合酶的細(xì)胞 (例如，BSR-T7/5)中。此時，一同轉(zhuǎn)染作為表達(dá)hPIV2聚合酶單元(即，NP蛋白、P蛋白、L蛋白)載體的hPIV2-NP、hPIV2-P、hPIV2-L的3種表達(dá)載體。另外，在DNA的轉(zhuǎn)移中，能夠使用使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法(在本實施方式中使用Lipofectamine)。每48小時進(jìn)行與Vero細(xì)胞的共培養(yǎng)5 7次，以90%以上的效率確認(rèn)細(xì)胞病變效應(yīng)(Cyto pathic effect :CPE)。此時，hPIV2中，在上清中可以確認(rèn)大量的重組病毒顆粒，但在rhPIV2(A^9)和rhPIV2 ( Δ 119)中幾乎不能確認(rèn)重組病毒顆粒。這表示如果缺損M蛋白質(zhì)，則不能進(jìn)行hPIV2的出芽。因此，取代Vero細(xì)胞，使用表達(dá)hPIV2_M的Cos細(xì)胞(轉(zhuǎn)染了作為表達(dá)M蛋白的載體的hPIV2-M的Cos細(xì)胞)共培養(yǎng)。其結(jié)果，對rhPIV2(A^9)和rhPIV2 ( Δ 119)也在上清中可以確認(rèn)大量的重組病毒顆粒。上述說明了使用Τ7啟動子的rhPIV2的制備方法，但根據(jù)本發(fā)明，也能夠使用利用任意的載體制備的rhPIV2。實施例3 完全缺損M基因或F基因的反義基因組(AM/rhPIV2、AF/rhPIV2)的構(gòu)建如圖3所示，在pUC118載體的ka I-Kpn I限制酶酶切位點導(dǎo)入含有hPIV2的基因組基因的質(zhì)粒中編碼M基因、F基因和一部分HN基因的ka I-Kpn I限制酶酶切位點之間的大致5. 5kb的基因。關(guān)于M基因缺損基因組的構(gòu)建，通過PCR制作包括M基因的Rl區(qū)域和R2區(qū)域的M 基因編碼區(qū)域完全缺失的AM/rhPIV〗。合成結(jié)合有缺失M基因的M基因上游區(qū)域序列和下游區(qū)域的引物，實施多重PCR，構(gòu)建M基因編碼區(qū)域完全缺失的AM/rhPIV2。引物序列中，作為含有限制酶酶切位點的序列，為5' -tgaaggagat cattgagctc ttaaagggac ttg-3'(序歹丨J序號5)，作為M基因上游區(qū)域序歹丨J，為5 ‘ -tggaacgttt agttttttta ttaaatttat catgtccagc ct_3 ‘(序列序號6)，作為M基因下游區(qū)域序列，為5 ‘ -ttaataaaaa aactaaacgt tccacaataa atcaacgttc ag-3 ‘ (序列序號 7)和 5 ‘ -ggattcttaa agcttggatg gaga-3'(序列序號8)。另外，調(diào)整堿基數(shù)，使得全部堿基數(shù)為6的倍數(shù)。關(guān)于F基因缺損基因組的構(gòu)建，制作完全缺失了含有F基因的Rl區(qū)域和R2區(qū)域的 F基因編碼區(qū)域1884bp的AF/rhPIV2。關(guān)于F基因缺損基因組，在F結(jié)構(gòu)基因的直上區(qū)域中存在Bcll限制酶酶切序列和在HN基因中存在Kpnl限制酶酶切序列，使用該限制酶酶切序列，進(jìn)行基因的完全缺損。使用的引物，使用5' -actgatcaat ctaacaaaaa aactaaacgt tctaagcacg aacccttaag gtgtcgtaac gtctcgt-3 ‘ (序列序號 9)和 5 ‘ -acttgatagg acggtaccca ttgagcctca atg-3'(序列序號 10)進(jìn)行構(gòu)建。實施例4 短暫性病毒的回收對短暫性表達(dá)、回收導(dǎo)入結(jié)核疫苗的α抗原用基因并使M基因或F基因完全缺損的AM/rhPIV2或Δ F/rhPIV2病毒的系統(tǒng)，通過與rhPIV2 (M終止)病毒回收方法同樣的方法或其它的方法實現(xiàn)病毒回收。實施例5 :M蛋白質(zhì)表達(dá)細(xì)胞或F蛋白質(zhì)表達(dá)細(xì)胞的構(gòu)建由于使hPIV2的M蛋白質(zhì)和F蛋白質(zhì)單獨(dú)且持續(xù)地在細(xì)胞中表達(dá)時，認(rèn)為該蛋白質(zhì)具有細(xì)胞毒性，因此，在(1)持續(xù)表達(dá)該蛋白質(zhì)的系統(tǒng)以外，構(gòu)建( 誘導(dǎo)性表達(dá)該蛋白質(zhì)的系統(tǒng)。(1)蛋白質(zhì)持續(xù)系統(tǒng)的構(gòu)建
使用在保持新霉素抗性基因或嘌呤霉素抗性基因病保持雞β -actin啟動子序列和兔β-globin polyA序列(CAG romoter)的載體中導(dǎo)入了 M或F基因序列的載體進(jìn)行實施。(2)蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建由誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)得到的M蛋白質(zhì)表達(dá)細(xì)胞或F蛋白質(zhì)表達(dá)細(xì)胞的構(gòu)建通過利用誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)用Cre重組酶除去在2個IoxP序列中存在的填充序列，使用誘導(dǎo)的系統(tǒng)(pCALN載體)實施表達(dá)。該載體能夠在Swa I限制酶酶切位點插入外來基因。Swa I限制酶酶切位點是末端平滑，在該平滑末端部位為M基因時，在M基因的上下區(qū)域中通過PCR導(dǎo)入產(chǎn)生平滑末端酶切的Riie I限制酶酶切位點，構(gòu)建該M基因的誘導(dǎo)表達(dá)載體。關(guān)于F基因誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，在F基因的上下領(lǐng)域中通過PCR導(dǎo)入產(chǎn)生Swa I平滑末端酶切的限制酶酶切位點，構(gòu)建該F基因的誘導(dǎo)表達(dá)載體。在該F基因回收用中使用的 PCR用弓丨物序列，使用 5' -aaatttaaat atattcagcc atgcatcacc tg_3'(序列序號 11)禾口 5' -aaatttaaat cttgtgatag atttcttaag atatcc-3 ‘ (序列序號 12)。實施例6 表達(dá)細(xì)胞的構(gòu)建使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)等，向Vero細(xì)胞轉(zhuǎn)染上述載體，添加新霉素培養(yǎng)(lmg/ml)。利用新霉素的抗藥性進(jìn)行篩選?；厥漳軌蛘T導(dǎo)表達(dá)M基因的Vero細(xì)胞。 使該細(xì)胞感染表達(dá)Cre蛋白質(zhì)的腺病毒，使M蛋白質(zhì)表達(dá)。使該細(xì)胞感染由上述實施例回收的M基因缺失病毒，實現(xiàn)非增殖型病毒的回收。其結(jié)果，能夠?qū)崿F(xiàn)缺失M基因的非增殖型病毒的回收。以和M蛋白質(zhì)表達(dá)細(xì)胞同樣的方法或其它的方法進(jìn)行F蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)細(xì)胞和F 蛋白質(zhì)持續(xù)表達(dá)細(xì)胞的構(gòu)建。其結(jié)果，能夠獲得F蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)細(xì)胞和F蛋白質(zhì)持續(xù)表達(dá)細(xì)胞。使用這些細(xì)胞，能夠?qū)崿F(xiàn)缺損F基因的非增殖型病毒的回收(圖6)。實施例7 含有編碼α抗原的基因的rhPIV2的構(gòu)建在含有序列序號1所示的第390 第1244的堿基序列的堪薩斯分枝桿菌的α 抗原基因(αΚ)的5'添加TPA的信號序列，再在3'中添加hPIV2的R1、插入序列和 R2，在rhPIV2的Not I部位插入，由此構(gòu)建重組入有α抗原基因的rhPIV2 (以下稱為 “rhPIV2-Ag85B”或“rhPIV2/Ag85B”)(參照圖；3)。Not I部位是緊隨rhPIV2基因組的前導(dǎo)序列重組入的部位，被設(shè)置在反義rhPIV2基因組的5'末端附近。另外，作為對照，在Not I部位中，構(gòu)建重組入有GFP (水母由來的熒光蛋白質(zhì))基因的rhPIV2(以下稱為“rhPIV2-GFP” 或“rhPIV2/GFP”)。通過實施例2的方法，大量制備rhPIV2-Ag85B和rhPIV2_GFP。接著，對于含有序列序號3所示的第121 第975的堿基序列的牛分枝桿菌BCG的 α抗原基因(aK)BCG_Ag85B的基因，在具有序列序號3所示的第121 第975的堿基序列的DNA中添加起始密碼子(ATG)，在rhPIV2的Not I部位插入，構(gòu)建重組入有BCG_Ag85B 的 rhPIV2 (以下稱為 “ Δ M/rhPIV2_Ag85B (BCG) ” 或“或 Δ F/rhPIV2_Ag85B (BCG) ”)(參照圖3)。Not I部位是緊隨rhPIV2基因組的前導(dǎo)序列重組入的部位，被設(shè)置在反義rhPIV2 基因組的5'末端附近。即，對于BCG的Ag85B，在序列序號4的氨基酸序列中切除信號序列部分(1 40)，在第41 第325的氨基酸(FSR……)中重組入第121 第975的堿基(ttctccc……)。實施例8 倉鼠中的GFP的表達(dá)確認(rèn)對倉鼠經(jīng)鼻投與(例5\105個病毒)1~迚1￥2-6 ，如圖5所示，在氣管(trachea) 和肺(lung)的上皮細(xì)胞中確認(rèn)到GFP的熒光。由此可知，rhPIV2通過經(jīng)鼻給藥，在氣管和肺中極高地促進(jìn)外來基因的表達(dá)(圖4)。實施例9 關(guān)于使用小鼠的結(jié)核預(yù)防的效果確認(rèn)將30只BALB/C小鼠分為A C 3組(10只/組)，隊各組分別施加下述處理。A組(對照組)將rhPIV2-GFP以2周間隔經(jīng)鼻給藥4次。作為rhPIV2_GFP的經(jīng)鼻給藥量，1次分量為ι χ IO7個病毒/20 μ L。B組(試驗組1)將表達(dá)型Ag85B_DNA經(jīng)過2周腹腔內(nèi)給藥2次，將 rhPIV2-Ag85B (Μ終止)以2周間隔經(jīng)鼻給藥2次。作為表達(dá)型Ag85B_DNA的給藥量，為每 1只50yg。另外，作為rhPIV2-Ag85B(M終止)的經(jīng)鼻給藥量，1次分量為1 X IO7個病毒 /20 μ L。C組(試驗組2)將rhPIV2_Ag85B (Μ終止)以2周間隔經(jīng)鼻給藥4次。作為 rhPIV2-Ag85B (Μ終止)的經(jīng)鼻給藥量，1次分量為1 X IO7個病毒/20 μ L。對各組在最終免疫1周后，使之經(jīng)鼻感染強(qiáng)毒性的結(jié)核菌(Mycobacterium tuberculosis Kurono菌株)。在實驗開始后的第49日，摘出肺和脾臟，確認(rèn)了結(jié)核結(jié)節(jié)、 病變切片的顯微鏡像和結(jié)核菌數(shù)。在圖8 圖10中表示結(jié)果。經(jīng)鼻噴霧型疫苗的最大特征在于，與通過注射等進(jìn)行疫苗接種相比，接種容易且安全性高。使用了 rhPIV2的結(jié)核疫苗能夠以現(xiàn)有的噴喉類容器進(jìn)行接種，能夠進(jìn)行迅速且安全的接種。特別是，考慮到醫(yī)生不足和由注射產(chǎn)生感染等，也可以認(rèn)為對發(fā)展中國家等的疫苗接種帶來巨大的效果，世界性影響強(qiáng)。結(jié)核菌是在巨噬細(xì)胞等噬菌細(xì)胞中增殖的細(xì)胞內(nèi)寄生性細(xì)菌。在結(jié)核菌的感染預(yù)防中，誘導(dǎo)活化的巨噬細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的細(xì)胞性免疫(Thl)而不是抗體為主體的液體性免疫成為中心。Ag85B是不受基因背景影響地顯示誘導(dǎo)Thl類免疫反應(yīng)的抗酸桿菌生物活性的單一蛋白，促進(jìn)誘導(dǎo)在結(jié)核預(yù)防中重要的活化巨噬細(xì)胞的Y干擾素 (INF- y )的產(chǎn)生和T細(xì)胞向CTL的分化。因此，為了作為結(jié)核疫苗利用，制備將外來基因Ag85B作為分泌型導(dǎo)入的載體 (rhPIV2-Ag85B)，確認(rèn)了 Ag85B的表達(dá)。其結(jié)果，如圖5所示，確認(rèn)了 Ag85B作為蛋白質(zhì)表達(dá)。使F表達(dá)細(xì)胞感染GFP-PIV2 ( Δ F)，如圖6所示，確認(rèn)到GFP熒光，由此可知，可以進(jìn)行病毒的表達(dá)和回收。另外，關(guān)于導(dǎo)入了 BCG-Ag85B的AF/rhPIV2-Ag85B(BCG)載體，可知BCG-Ag85B也作為蛋白質(zhì)表達(dá)(圖7)。另外，可知在利用！·證1￥2(] 終止)、1~迚1￥2(八？)、1~迚1￥2(八]\0經(jīng)鼻投與了 Ag85B 或 BCG_Ag85B 的小鼠中，月市中的強(qiáng)毒結(jié)核菌(Mycobacterium tuberculosis Kurono M 株)引起的肺結(jié)核特有的病變(結(jié)核結(jié)節(jié))顯著地減少。其中，在圖8 圖10中表示 rhPIV2-Ag85B的結(jié)果。在圖8(A)中，確認(rèn)了大量結(jié)核結(jié)節(jié)，另一方面，在圖8 (B)和圖8(C) 中，以該順序結(jié)核結(jié)節(jié)數(shù)比對照組顯著地減少。在圖9中表示結(jié)核結(jié)節(jié)的顯微鏡照片圖。在對照組(B)中，可知肺泡損壞情況，另一方面，在試驗組2(A)中，確認(rèn)與通常狀態(tài)幾乎同等的情況。另外，關(guān)于rhPIV2 ( Δ F)、rhPIV2 ( Δ Μ)，也可以確認(rèn)關(guān)于Ag85B和BCG_Ag85B與上述同等的效果。在圖10中表示在肺和脾臟中的結(jié)核菌數(shù)。在對照組中，分別計數(shù)得到在肺中105_°5 的菌數(shù)、在脾臟中104_°8的菌數(shù)。另一方面，在試驗組1中，分別地計數(shù)得到在肺中104 2°的菌數(shù)、在脾臟中IO3 45的菌數(shù)，在試驗組2中，分別地計數(shù)得到在肺中IO31tl的菌數(shù)、在脾臟中103_”的菌數(shù)。一般而言，在肺結(jié)核的計數(shù)試驗中，在以往的疫苗試驗中，除了 BCGjfW 確認(rèn)顯著差別，在試驗組和對照組之間菌數(shù)相差10倍也是少有的。但是，在本試驗中，使用 rhPIV2-Ag85B的試驗組的結(jié)核菌數(shù)少至對照組結(jié)核菌數(shù)的1/10 1/100左右，因此，可知本實施方式的疫苗是預(yù)防效果非常高的疫苗。<關(guān)于本實施方式的結(jié)核疫苗的考察>hPIV2原型載體特異地感染氣管粘膜，具有(_)極性的非節(jié)段型單鏈RNA作為基因組，該RNA基因組中，6個堿基卷繞1個核衣殼蛋白，構(gòu)成螺旋狀的核苷蛋白(RNP)。通過具有非節(jié)段型RNA作為基因組，不引起如具有節(jié)段型RNA基因組的流感病毒一樣的節(jié)段之間的突變(不連續(xù)突變)。另外，如果基因組不是6的倍數(shù)，轉(zhuǎn)錄、復(fù)制的效果顯著減少， 因此，也難以認(rèn)為是由于同源性重組等產(chǎn)生的基因突變。在之前所示的臨床試驗階段的 MVA85A (安卡拉痘苗病毒)與AeraS402(35型腺病毒)中，母體是DNA病毒，不能避免偶然的同源重組等的危險性，但本實施方式的hPIV2載體的母體是RNA病毒，由于在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)進(jìn)行所有的生活循環(huán)，因此，與上述2種DNA載體不同，基因組不重組入核內(nèi)染色體中。通過終止密碼子或基因的缺損而除去M基因、F基因或HN基因表達(dá)的載體，也沒有2次感染性顆粒產(chǎn)生的危險性，是能夠經(jīng)鼻地向氣管粘膜特異地導(dǎo)入基因的RNP機(jī)器。 該載體原來的病原性低于上述DNA載體，也沒有人(成人)中的病原性報告，極其安全。另外，該載體涉及成為最大限度地利用來自hPIV2基因組的轉(zhuǎn)錄特征、使得基因組的外來基因表達(dá)量為最大，可以認(rèn)為M基因、F基因或HN基因抑制了來自基因組的轉(zhuǎn)錄，因此，使M基因、F基因或HN基因的產(chǎn)物缺失的該載體的蛋白表達(dá)量極高。在倉鼠中經(jīng)鼻投與了插入有 GFP (綠色熒光蛋白)的rhPIV2 (Μ終止)-GFP時，確認(rèn)了 GFP的強(qiáng)表達(dá)(圖4)。在預(yù)防結(jié)核中，比全身免疫更重要的是在作為病態(tài)出現(xiàn)部位的肺的局部免疫(細(xì)胞免疫)的誘導(dǎo)。在本實施方式中，使用插入了細(xì)胞免疫誘導(dǎo)蛋白(Ag85B或BCG-Ag85B)的非增殖型rhPIV2-Ag85B載體或rhPIV2_BCG_Ag85B作為疫苗。該載體由于安全且能夠?qū)崿F(xiàn)向肺的細(xì)胞免疫誘導(dǎo)蛋白的強(qiáng)表達(dá)，因此，可以認(rèn)為作為成人結(jié)核疫苗載體是非常有效的。該疫苗載體通過接種只進(jìn)行一次感染，作為不產(chǎn)生2次感染性顆粒的安全的弱毒性半活經(jīng)鼻噴霧疫苗用被開發(fā)。作為外來抗原表達(dá)的非定型抗酸桿菌(堪薩斯分枝桿菌和牛分枝桿菌BCG)來源的α抗原(Ag85B)具有細(xì)胞免疫誘導(dǎo)能力。通過在病態(tài)出現(xiàn)部位肺中使Ag85B高表達(dá)，可以認(rèn)為誘導(dǎo)對結(jié)核菌的高細(xì)胞性免疫(Thl)。在實際中，如果使倉鼠鼻腔感染rhPIV2-GFP載體，則在氣管上皮細(xì)胞以及指導(dǎo)肺末端支氣管中可見作為標(biāo)靶基因的GFP的強(qiáng)表達(dá)(圖4)。在使用小鼠的感染防御試驗(結(jié)核預(yù)防試驗)中，可以確認(rèn)rhPIV2_Ag85B強(qiáng)大的結(jié)核預(yù)防效果(圖8 圖10)。在該試驗方案中，除了 rhPIV2-Ag85B的單獨(dú)給藥(試驗組2) 以外，研究了表達(dá)型Ag85B-DNA和rhPIV2-Ag85B的并用給藥(試驗組1)的效果。在試驗組2中，可以確認(rèn)非常高預(yù)防效果，另一方面，在試驗組1中只能確認(rèn)有限的效果。根據(jù)現(xiàn)有的報告顯示，對表達(dá)型Ag85B-DNA也可以確認(rèn)預(yù)防效果，但在本次試驗結(jié)果中，可以認(rèn)為表達(dá)型Ag85B-DNA的預(yù)防效果是有限的，可以認(rèn)為試驗組1的預(yù)防效果多依賴于rhPIV2_Ag85B。另外，對導(dǎo)入BCG-Ag85B取代Ag85B的hgPIV2_BCG_Ag85B也可以得到與 rhPIV2-Ag85B同樣的預(yù)防效果。另外，如果對Ag85A、Ag85C也進(jìn)行上述同樣的試驗，發(fā)揮與Ag85B同樣的結(jié)核預(yù)防效果的可能性非常高。這樣，根據(jù)本實施方式，可知通過投與在副粘病毒(特別是rhPIM)中重組入有編碼α抗原等的基因的表達(dá)載體，能夠發(fā)揮顯著的結(jié)核預(yù)防效果。
權(quán)利要求
1.一種經(jīng)鼻噴霧型結(jié)核疫苗，其特征在于在使M基因、F基因或HN基因缺損的副粘病毒基因中重組入有抗酸桿菌來源的α抗原、其類似物、編碼具有與它們同樣的功能的它們的突變體的基因。
2.如權(quán)利要求1所述的經(jīng)鼻噴霧型結(jié)核疫苗，其特征在于所述《抗原是來自堪薩斯分枝桿菌或牛分枝桿菌BCG的α抗原。
3.如權(quán)利要求1或2所述的經(jīng)鼻噴霧型結(jié)核疫苗，其特征在于所述α抗原的類似物是抗原85復(fù)合體結(jié)構(gòu)蛋白85Α或抗原85復(fù)合體結(jié)構(gòu)蛋白85C。
4.一種結(jié)核的預(yù)防方法，其特征在于在使M基因、F基因或HN基因缺損的副粘病毒基因中重組入有抗酸桿菌來源的α抗原、其類似物、編碼具有與它們同樣的功能的它們的突變體的基因，對人進(jìn)行噴霧且經(jīng)鼻給藥。
5.如權(quán)利要求4所述的結(jié)核的預(yù)防方法，其特征在于所述《抗原是來自堪薩斯分枝桿菌或牛分枝桿菌BCG的α抗原。
6.如權(quán)利要求4或5所述的結(jié)核的預(yù)防方法，其特征在于所述α抗原的類似物是抗原85復(fù)合體結(jié)構(gòu)蛋白85Α或抗原85復(fù)合體結(jié)構(gòu)蛋白85C。
全文摘要
本發(fā)明提供對人結(jié)核、特別是對成人結(jié)核具有高預(yù)防效果的經(jīng)鼻噴霧型疫苗。通過在副粘病毒基因(特別是rh-PIV2)中重組入有抗酸桿菌來源的α抗原(例如來自堪薩斯分枝桿菌或牛分枝桿菌BCG的α抗原)、其類似物、編碼具有與它們同樣的功能的它們的突變體的基因的經(jīng)鼻噴霧型疫苗實現(xiàn)。
文檔編號A61P31/06GK102573897SQ201080037188
公開日2012年7月11日 申請日期2010年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月2日
發(fā)明者保富康宏, 河野光雄, 福村正之, 野阪哲哉 申請人:國立大學(xué)法人三重大學(xué), 獨(dú)立行政法人醫(yī)藥基盤研究所, 生物科摩株式會社