專利名稱：分離升麻消旋體a的方法
分離升麻消旋體A的方法
背景技術(shù)：
升麻屬(Cimicifuga)的許多種已在中國、韓國和日本醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中被用作炎性病癥的治療劑。類似地，含有黑升麻(black cohosh)——植物學(xué)上稱為總狀升麻(Cimicifuga
racemosa L. Nutt)(又稱為類葉升麻屬(Actaea racemosa)-的組合物在美國和歐洲被
廣泛地用作草藥膳食補充品。歷史上，印第安婦女將黑升麻用于治療不適(malaise)、瘧疾、風(fēng)濕病、腎功能異常、咽喉痛、月經(jīng)不調(diào)和與分娩相關(guān)的疾病(Blementhal et al.，2000)。在一些亞洲國家，該草藥和包括興安升麻(Cimicifuga dahurica(Turcz.)Maxim.)、升麻(Cimicifuga foetida L.)和大三葉升麻(Cimicifuga heracleifolia Kom.)的升麻屬的其他種被用于治療炎癥、發(fā)熱、頭痛、疼痛、咽喉痛和受寒(Foster，1999 ；Kusano,2001 ；Kimet al.，2004)。然而，這些草藥的內(nèi)在作用機理仍有待充分地闡述。黑升麻的生物學(xué)活性在過去已進行過研究。在體內(nèi)，已證實黑升麻提取物以劑量依賴的方式抑制斯普拉-道來(Sprague-Dawley)大鼠體內(nèi)的抗-IgE-誘導(dǎo)的被動皮膚過敏反應(yīng)(Kim et al.，2004)。在體外，所述草藥提取物在HMC-I人白血病肥大細胞中通過炎癥因子(例如PMA和A2387)抑制細胞因子(包括IL_4、IL-5和TNF- a )的轉(zhuǎn)錄(Kim etal.，2004)。其他研究也證實了黑升麻提取物對組胺、緩激肽和C0X-2介導(dǎo)的炎癥作用的抑制效果(Kim and Kim, 2000) 然而，存在于所述提取物中的活性組分是未知的。升麻消旋體A (Cimiracemate A)為異阿魏酸和3_ (30,40-二輕基苯基)_2_酮-丙醇之間所形成的酯(Chen et al.，2005)。升麻消旋體A為具有1，7_ 二芳基骨架的天然存在的化合物。其他具有這種1，7_ 二芳基骨架的化合物具有顯著的生物活性
(Roughley&Whiting, 1973)。例如，已有報道稱,姜黃素-一種從姜黃(Curcuma longa)
中分離的天然色素-能抑制多種類型惡性細胞的生長(Chen et al. , 1999 ；Aggarwal et
al. ,2004)并且尤其是在HIV感染的情況下(Vlietinck et al. , 1998)。從益智(AlpinaoxyphylIa)的種子中提取的益智酮B (Itokawa et al. , 1982)具有抗血膽固醇過多和動脈粥樣硬化的活性(Ohishi et al. ,2001) o已發(fā)現(xiàn)升麻消旋體A在人巨噬細胞中抑制LPS誘導(dǎo)的TNF- a并抑制LPS誘導(dǎo)的MAP激酶活性以及特定轉(zhuǎn)錄因子的活化。此外，升麻消旋體A可具有另外的健康益處，其包括活性氧簇清除劑(Burdette et al.，2002)。綜合考慮，具有1，7_ 二芳基骨架的化合物(如升麻消旋體A)可具有多種能夠通過多細胞依賴性機制而起作用的生物活性。在美國和歐洲，總狀升麻的消耗量一直在顯著增加。其產(chǎn)品以消費者目前可得的異丙醇和乙醇提取物的一系列制劑和劑量的形式制備。該草藥的使用是基于提取物而非單獨的生物活性組分。雖然已從總狀升麻中分離了一些化合物(包括三萜苷和酚類)，但其生物活性以及在所述提取物中的一致存在性仍待確定(Kennelly et al.，2002)。
另一個經(jīng)分離的總狀升麻組分為23-表-26-脫氧升麻烴(deoxyactein)。該23-表-26-脫氧升麻烴組分目前用作化學(xué)標記物以使市售的總狀升麻產(chǎn)品標準化。其使用原理為其在提取物中豐富(P印ping，1999)。因此，所述用于總狀升麻提取物標準化的化學(xué)標記物并非必須是該草藥生物活性的代表。
升麻屬的許多不同種通常均用于治療炎癥；然而，如圖10所示，其化學(xué)成分在相同分析條件下相當不同。雖然已開發(fā)不同的方法以通過使用指紋法區(qū)分升麻屬種(He etal. ,2006 ；Li et al.，2002)，但該草藥化學(xué)組分的復(fù)雜性和多變性限制了上述方法在種鑒別中的應(yīng)用因此，非常需要提取并分離升麻消旋體A以隨后用作治療劑。此外，還需要可用于鑒別升麻屬成員(例如總狀升麻、興安升麻、升麻和大三葉升麻)的生物活性標記物。理想的是該生物活性標記物還可用于使升麻屬種的提取物標準化以用作治療炎癥相關(guān)疾病的抗炎劑，并可用于基于每種樣品的化學(xué)特征而區(qū)分種。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了用于從升麻屬中分離和提取升麻消旋體A的材料和方法。根據(jù)本發(fā)明，所述經(jīng)分離的升麻消旋體A可用作治療性組合物和/或膳食補充品。此外，所述經(jīng)分離的升麻消旋體A還可用作多個升麻屬種的生物活性化學(xué)標記物和標準。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于純化升麻消旋體A的方法，其包括以下步驟a)提供足夠量的升麻屬種的原料；b)研磨所述原料；c)將所述經(jīng)研磨的原料與水性溶劑混合；且d)分離升麻消旋體A。有利地，本發(fā)明提供了更高且更一致的從升麻屬種中分離的升麻消旋體A的收率。本發(fā)明的新分離步驟也更快更方便。本發(fā)明提供了經(jīng)分離的升麻消旋體A以用于治療，例如不適、瘧疾、風(fēng)濕病、腎功能異常、咽喉痛、月經(jīng)不調(diào)、與分娩相關(guān)的疾病、發(fā)熱、頭痛和受寒以及與這些病狀相關(guān)的癥狀和/或綜合征。此外，本發(fā)明提供了可用作抗炎劑的經(jīng)分離的升麻消旋體A。在另一個實施方案中，本發(fā)明使得可區(qū)分升麻屬的多個種。根據(jù)本發(fā)明，所述多個升麻屬種的提取物產(chǎn)生了升麻消旋體A生物活性的特有化學(xué)特性。一方面，根據(jù)本發(fā)明，升麻消旋體A可用作化學(xué)標記物以使市售的總狀升麻產(chǎn)品標準化。升麻消旋體A作為化學(xué)標記物以使總狀升麻產(chǎn)品標準化的用途可能是基于例如升麻消旋體A作為抗炎劑的生物活性。有利地，通過使用本發(fā)明的經(jīng)改進的提取步驟，可區(qū)分升麻屬的不同種并且可通過使用升麻消旋體A作為化學(xué)標記物而使提取物標準化，以用于這些草藥或相關(guān)產(chǎn)品作為備選治療法或膳食補充品的潛在生物活性用途。


圖I為升麻消旋體A的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖 2 示出了以(1)100 O、(2)80 20、(3)60 40、(4)40 60、(5)20 80 和
(6)0 100的比率使用Milli-Q-乙醇提取的總狀升麻根的色譜圖。*表示在不同的提取條件下在所述總狀升麻樣品中存在升麻消旋體A。該色譜圖是通過以下方式獲得將所述樣品注入反相高效液相色譜中(Lichrospher 100RP C18EC 5 U , 250X4. 6mm ID)并以ImlmiiT1的流速使用15% CH3CN至100% CH3CN梯度洗脫，且檢測波長為210nm。
圖3示出了通過在⑴室溫、(2)50°C和(3) 100°C下使用mi I Ii-Q提取總狀升麻根而得到的提取物的色譜圖。*表示在不同的提取條件下在所述總狀升麻樣品中存在升麻消旋體A。該色譜圖是通過以下方式獲得將所述樣品注入反相高效液相色譜中(Lichrospher 100RP C18EC 5 U ,250X4. 6mm ID)并以 Iml mirT1 的流速使用 15% CH3CN至100% CH3CN梯度洗脫，且檢測波長為210nm。圖4示出了通過超聲處理(1)0分鐘、(2)5分鐘、(3) 10分鐘、(4)20分鐘和(5)30分鐘而使用milli-Q提取的總狀升麻根的色譜圖。*表示在不同的提取條件下在所述總狀升麻樣品中存在升麻消旋體A。該色譜圖是通過以下方式獲得將所述樣品注入反相高效液相色譜中(Lichrospher 100RP C18EC 5 U , 250 X 4. 6mm ID)并以 Iml mirT1 的流速使用15% CH3CN至100% CH3CN梯度洗脫，且檢測波長為210nm。圖5 示出了以(1)1 5(w/v)、(2)l 10 (w/v), (3) I 15(w/v)和(4)1 20 (w/v)的比率使用milli-Q提取的總狀升麻根的色譜圖。*表示在不同的提取條件下在所述總狀升麻樣品中存在升麻消旋體A。該色譜圖是通過以下方式獲得將所述樣品注入反相高效液相色譜中(Lichrospher 100RP C18EC 5 U , 250 X 4. 6mm ID)并以 Iml mirT1 的流速使用15% CH3CN至100% CH3CN梯度洗脫，且檢測波長為210nm。圖6示出了提取溶劑對升麻消旋體A的提取率的影響(n = 3)。實驗條件所述草藥(2. Og)是通過在室溫下超聲處理30分鐘而進行提取，且該提取重復(fù)進行三次。條上方的不同字母表示Tukey檢驗的顯著性差異(p < 0. 05,單因素AN0VA)。圖7示出了溫度對升麻消旋體A的提取率的影響(n = 3)。實驗條件草藥量2. Og ；提取時間30分鐘；提取溶劑Milli-Q水(10ml)。該提取重復(fù)進行三次。條上方的不同字母表示Tukey檢驗的顯著性差異(p < 0. 05,單因素AN0VA)。圖8示出了提取時間對升麻消旋體A的提取率的影響(n = 3)。實驗條件所述草藥(2. Og)是在室溫下用Milli-Q水進行提取。條上方的不同字母表示Tukey檢驗的顯著性差異(P < 0. 05，單因素AN0VA)。圖9示出了溶劑體積對升麻消旋體A的提取率的影響(n = 3)。實驗條件所述草藥(2. Og)是在室溫下用Milli-Q水提取30分鐘。該提取重復(fù)進行三次。條上方的不同字母表示Tukey檢驗的顯著性差異(p < 0. 05,單因素AN0VA)。圖10A-C示出了興安升麻、升麻和大三葉升麻的色譜指紋圖譜。*表示在所述樣品中存在升麻消旋體A。所述色譜圖是通過將所述樣品注入反相高效液相色譜中(Lichrospher 100RP C18EC 5 U ,250X4. 6mm ID)并以 Iml mirT1 的流速使用 15% CH3CN至100% CH3CN梯度洗脫，且檢測波長為210nm。
具體實施例方式本發(fā)明提供了用于從升麻屬的多個種分離和提取升麻消旋體A的材料和方法。根據(jù)本發(fā)明，所述經(jīng)分離的升麻消旋體A可用作治療性組合物或膳食補充品。此外，所述經(jīng)分離的升麻消旋體A還可用作升麻屬的多個種的生物活性化學(xué)標記物和標準品。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了一種純化升麻消旋體A的方法，其包括以下步驟a)提供足夠量的升麻屬種的原料；b)將所述原料研磨成粉末；c)將所述粉末與水性溶劑混合；且d)分離升麻消旋體A。 在具體的實施方案中，所述升麻屬種選自總狀升麻、升麻和/或大三葉升麻。在一個優(yōu)選實施方案中，所述升麻屬種為總狀升麻。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的提取步驟使用水一任選地和乙醇一作為所述溶劑。所述溶劑優(yōu)選包含低于20%的乙醇，更優(yōu)選可存在低于15%、甚至低于10%或甚至低于5%的乙醇。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明使用的總狀升麻與水的比率為I : 5至I : 20，優(yōu)選為約I : 15。此外，優(yōu)選地，所述提取步驟是在室溫下進行。該溫度可為，例如，20°C至28°C或22°C至26°C。在一個具體的實施方案中，所述提取步驟是在約25°C下進行。有利地，本發(fā)明提供了更高且更一致的從升麻屬種中分離的升麻消旋體A的收率。本發(fā)明還提供了一種更快更方便的升麻消旋體A的分離方法。本發(fā)明提供經(jīng)分離的升麻消旋體A以用于治療，例如不適、瘧疾、風(fēng)濕病、腎功能異常、咽喉痛、月經(jīng)不調(diào)、與分娩相關(guān)的疾病、發(fā)熱、頭痛和受寒。此外，本發(fā)明提供了可用作抗炎劑的經(jīng)分離的升麻消旋體A。本發(fā)明還提供了經(jīng)分離的升麻消旋體A，其可用于在人巨噬細胞中抑制LPS誘導(dǎo)的TNF- a、抑制LPS誘導(dǎo)的MAP激酶活性或用作活性氧簇清除劑。本文所使用的術(shù)語“受試者”描述一種可對其提供使用本發(fā)明組合物的治療的生物體，包括哺乳動物例如靈長動物?？墒芤嬗谒_的治療方法的哺乳動物種包括但不限于，猿、黑猩猩、猩猩、人、猴；以及家養(yǎng)動物，例如狗、貓、馬、牛、豬、綿羊、山羊、雞、小鼠、大鼠、豚鼠和倉鼠。在另一個實施方案中，本發(fā)明使得可區(qū)分升麻屬的多個種。根據(jù)本發(fā)明，所述多個升麻屬種的提取物依據(jù)HPLC產(chǎn)生了升麻消旋體A生物活性的特有化學(xué)特性?！矫?，本發(fā)明的經(jīng)分離的升麻消旋體A可用作化學(xué)標記物以使市售可得的總狀升麻產(chǎn)品標準化。所述經(jīng)分離的升麻消旋體A作為化學(xué)標記物以使市售可得的總狀升麻產(chǎn)品標準化的用途可基于例如升麻消旋體A作為抗炎劑的生物活性。升麻消旋體A已在黑升麻的經(jīng)干燥的根莖和根中得到了鑒別。該化合物在原代人巨噬細胞中抑制LPS誘導(dǎo)的效應(yīng)，其包括特異的激酶磷酸化、轉(zhuǎn)錄因子的活化和TNF-a的產(chǎn)生(2009年I月12日提交的第61/143，925號美國專利；其全部內(nèi)容以引用的方式納入本說明書)。樣品提取是用于從草藥原料中提取最大量所需化學(xué)組分的至關(guān)重要的第一步。在過去幾年內(nèi)，已將包括頂空分析、超臨界和次臨界-流體提取、微波輔助提取和加壓液體提取的一些現(xiàn)代技術(shù)用于藥用植物分析中的定量制備(Huie，2002)。雖然這些方法通過降低有機溶劑消耗、省去樣品提純和濃縮步驟以及改進所述草藥的提取效率而比常規(guī)方法具有顯著優(yōu)勢，但其具有嚴重的局限性。例如，頂空分析以及超臨界和次臨界-流體提取僅針對草藥的揮發(fā)油，而加壓液體提取是在高溫下進行，所述高溫可能導(dǎo)致熱降解。因此，希望開發(fā)一種經(jīng)改進的提取方案以增加所述草藥中特定化合物的產(chǎn)生。有利地，本發(fā)明的方法提供了高的且一致的從黑升麻中提取的升麻消旋體A的收率。本發(fā)明方法的另一個優(yōu)點是其在藥用的樣品制備中迅速且方便。根據(jù)本發(fā)明，已通過改變包括溫度、提取溶劑、提取時間和溶劑體積的提取參數(shù)而改進了升麻消旋體A的提取條件。還已經(jīng)鑒別了提高從所述提取物中得到的升麻消旋體A的百分比的HPLC條件。此外，通過使用如本文中所述的提取步驟和HPLC條件，可建立用于表征具有特定生物活性的草藥產(chǎn)物的標準。 此外，根據(jù)本發(fā)明，升麻消旋體A可用于鑒別升麻屬的成員，例如總狀升麻、興安升麻、升麻和大三葉升麻。升麻消旋體A還可用于使升麻屬種的提取物標準化，以用作治療炎癥相關(guān)疾病的抗炎劑。根據(jù)本發(fā)明，升麻消旋體A還可用于基于每種樣品的化學(xué)特性而區(qū)分品種，例如基于所述樣品中升麻消旋體A與其他化合物的比率。溶劑選擇將極性且無毒的溶劑(包括水和乙醇，及其混合物)用于從總狀升麻中提取升麻消旋體A。該溶劑體系適于提取不同極性的活性成分，同時也是人體可食用的。在所使用的溶劑中，水和20%或更少的乙醇得到最大量的升麻消旋體A。提取溫度根據(jù)本發(fā)明，提取溫度的選擇對于從總狀升麻中提取更大量的升麻消旋體A也是至關(guān)重要的。據(jù)報道，溫度的增加可通過破壞溶質(zhì)-基質(zhì)的相互作用鍵而顯著地增加擴散率并增加溶質(zhì)的揮發(fā)性(Loncin&Mersonl979)。然而,根據(jù)本發(fā)明，已測定升麻消旋體A的提取率在溫度超過室溫后隨著溫度的增加而降低。這表明升麻消旋體A從草藥中的遷移可能是在室溫(例如25°C)下發(fā)生，隨后可能由于在更高溫度下的分解而出現(xiàn)損失。因此，根據(jù)本發(fā)明，室溫為從總狀升麻中提取升麻消旋體A的優(yōu)選提取溫度。超聲處理超聲處理是可在某些情況下改進從草藥的干燥材料中提取化合物的效率并縮短其提取時間的另一種方法。增強作用的內(nèi)在機理是質(zhì)量轉(zhuǎn)移的增強和溶劑更易于接觸到所述草藥的干燥材料(Vinatoru,2001 ;Shotipruk et al. ,2001)。在分析條件下,超聲處理是對常規(guī)提取技術(shù)并且在某些情況下甚至是對超臨界流體和微波輔助提取而言迅速、廉價且有效的替換方法(Luque-Garcia et al. , 2003)。然而,根據(jù)本發(fā)明，當與使用浸潰條件的情況對比時，發(fā)現(xiàn)超聲處理并未提到升麻消旋體A的提取率(圖4和8)。結(jié)果顯示升麻消旋體A可容易地從所述草藥原料中浸出并進入水中且不需要任何能量。因此，從總狀升麻中提取升麻消旋體A時可采用冷浸潰法。實驗材料和方法儀器使用Agilent 1200系列高效液相色譜-光二極管陣列(HPLC-DAD) (Palo Alto,CA，USA)系統(tǒng)。其配有G1367c自動進樣器、真空脫氣器、二元泵、DAD檢測器和LC工作站。超聲浴(J. P. Selecta，西班牙)用于從所述草藥中提取所述化合物。溶劑去離子水從Milli-Q水系統(tǒng)(Millipore，Bedford，MA，USA)中得到以用于提取樣品以及制備流動相。分析級乙醇(EtOH,Merck,德國)用于標準品和/或樣品溶液的制備。HPLC級乙腈(ACN，Tedia, USA)用于流動相的制備。植物原料總狀升麻原料在2008 年 5 月購自 Monterey Bay Spice Company (Santa Cruz,USA)。將所述材料用研磨機(IKA，德國)研磨成粉末狀。然后將所述粉末保存在干燥器中并用于所有實驗中。優(yōu)選的提取條件的鑒別 水醇溶劑比的影響將總狀升麻(2g)用IOml 的 0%、20%、40%、60%、80%和 100% (v/v)乙醇的水溶液進行提取。提取是通過在室溫下超聲處理30分鐘而完成。每種溶劑設(shè)三個平行實驗。重復(fù)所述提取過程并將所述實驗進行三次。將所述提取物在4000rpm下離心5分鐘并隨后通過濾紙(No 1，Advantec，日本)過濾。將得到的濾液蒸發(fā)并冷凍干燥以得到所述提取物
的干重。提取溫度的影響使用三個提取溫度(室溫、50°C和100°C )研究升麻消旋體A的提取率。將經(jīng)干燥的總狀升麻粉末(2. Og)在各提取溫度下用IOml的Milli-Q水超聲處理30分鐘。每種溫度設(shè)三個平行實驗，且所述提取過程重復(fù)進行三次。將所述提取物在4000rpm下離心5分鐘并隨后通過上文所述的濾紙過濾。然后將得到的濾液冷凍干燥以得到所述提取物的干重。超聲時間的影響將總狀升麻(2. Og)在室溫下用IOml的Milli-Q水進行提取。提取是通過浸潰和/或超聲處理5、10、20和30分鐘而完成。每種提取時間設(shè)三個平行實驗，且所述提取過程重復(fù)進行三次。將所述提取物在4000rpm下離心5分鐘并隨后通過上文所述的濾紙過濾。將得到的濾液蒸發(fā)并冷凍干燥以得到所述提取物的干重。溶劑與草藥比的影響將總狀升麻(2. Og)在室溫下連續(xù)超聲處理30分鐘進行提取，總狀升麻與mi I Ii-Q水的比率為I : 5、1 IOU 15和I : 20(w/v)。每種提取體積設(shè)三個平行實驗，且所述提取過程重復(fù)進行三次。將所述提取物在4000rpm下離心5分鐘并隨后通過上文所述的濾紙過濾。將得到的濾液蒸發(fā)并冷凍干燥以得到所述提取物的干重。定量分析在通過使用反相Lichrospher IOOC18 (250 X 4. 6mm i.d.,5lim)柱的HPLC(Alltech, USA)進行測定前，將所述干燥提取物溶解于甲醇(MeOH)中(25mg/ml)。通過使用ACN(15分鐘內(nèi)25-90% )和Milli-Q水(15分鐘內(nèi)75-10% )的線性梯度洗脫而進行分離。流速為I. Oml/分鐘。檢測波長和柱溫分別設(shè)定為210nm和23°C。注射體積為5iU。對運行條件進行優(yōu)化以得到升麻消旋體A與其他洗脫峰的最佳分離。興安升麻、升麻和大三葉升麻的提取總狀升麻的三個相似物興安升麻、升麻和大三葉升麻是由PurapharmInternational (H. K.) Ltd提供。將每種草藥(2. Og)在室溫和超聲處理下(30分鐘)用40ml的Milli-Q水進行提取。所述提取過程重復(fù)進行三次且每種草藥設(shè)三個平行實驗。將所述水性提取物冷凍干燥并隨后溶解于MeOH中以獲得25mg/ml的最終濃度。所述草藥的指紋圖譜以及升麻消旋體A的百分比收率是使用如上所述的HPLC-PDA進行測定。統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS統(tǒng)計學(xué)軟件包對數(shù)據(jù)進行分析。使用Shapiro-Wilk檢驗對所述提取條件間升麻消旋體A提取率的差異進行了正態(tài)性檢查，并使用Cochran’ s C檢驗進行了方差齊性檢查。然后使用單因素ANOVA和Tukey檢驗對其進行比較。在所有情況下，顯著性的閾值為5%。以下為示例說明實施本發(fā)明的步驟的實施例。提供這些實施例僅用于示例說明的目的，而不應(yīng)解釋為限制性的。實施例I-升麻消旋體A的分離和提取的優(yōu)化HPLC條件的優(yōu)化使用根據(jù)活性追蹤分離和鑒別法，將具有抗炎活性的升麻消旋體A(圖I)從總狀升麻的水性提取物中分離出。為了對各提取物中的升麻消旋體A定量，得到了范圍為0. 15625 M I. 25 u g/u I 的校準曲線(y = 9197. 4x_12. 457，R2 = 0. 9993)。提取條件的優(yōu)化水醇溶制比的影響總狀升麻中升麻消旋體A的百分比收率與提取溶劑中乙醇含量的關(guān)系示于圖2和6中。如圖2所示，升麻消旋體A的峰(標記為* )在乙醇為0% (即100%水)時最高，其隨著乙醇含量的增加而明顯降低。當所述乙醇含量從0增加至100%時，升麻消旋體A的提取率從I. 36降低至0. 19% (圖6)。該結(jié)果表明乙醇含量影響了從總狀升麻中提取升麻消旋體A，提取效率隨所述提取溶劑中乙醇含量的增加而降低。因此，使用水作為進一步研究的提取溶劑。提取溫度的影響為了研究溫度如何影響升麻消旋體A的提取率，將總狀升麻在三種不同熱條件下進行提取室溫、50和100°C。在圖3中，示出了由經(jīng)優(yōu)化的HPLC條件所得到的提取物的色譜圖。升麻消旋體A的峰(標記為* )在室溫時最高，且在溫度從室溫至50°C并隨后至100°C時明顯降低(圖3)。此外，室溫、50和100°C時升麻消旋體A的提取率分別為I. 24、
0.51和0. 11% (圖7)。該結(jié)果表明溫度顯著影響升麻消旋體A的提取率(Tukey檢測，p<0.05)且升麻消旋體A的提取效率隨溫度的升高而明顯降低。因此，選擇室溫用于進一步的研究。超聲時間的影響通過不同超聲時間從總狀升麻中提取的升麻消旋體A的百分比收率示于圖4和8中。在圖4中，升麻消旋體A的峰在所有提取物中均具有相似的強度。超聲時間為0、5、10、20和30分鐘時，所測定的升麻消旋體A的百分比收率分別為I. 20、0. 96、I. 39、I. 56和
1.34% (圖8)。該結(jié)果表明超聲處理不會明顯提高升麻消旋體A的提取率(Tukey檢驗，p> 0. 05)。溶劑與草藥比率的影響 溶劑體積對總狀升麻中升麻消旋體A的提取效率的影響是通過以I : 5、1 : 10、I 15和I : 20(w/v)的比率使用milli-Q提取所述草藥而測定。該結(jié)果顯示由I : 15和I : 20 (w/v)得到的升麻消 旋體A的峰強度高于剩余兩個比率(圖5)。在圖9中，升麻消旋體A的百分比收率在總狀升麻與水的比率為I : 5、1 IOU 15和I : 20 (w/v)時分別測定為0. 98,0. 93、I. 68和I. 52%。該結(jié)果表明總狀升麻與水的比率應(yīng)高于I : 15 (w/v)以得到更高的升麻消旋體A的提取率。實施例2-用于確定升麻屬種的種類和生物活性的升麻消旋體A分離和指紋圖譜興安升麻、升麻和大三葉升麻中的升麻消旋體A的測定興安升麻、升麻和大三葉升麻的參考指紋圖譜是通過以下方式測定的在相同的且經(jīng)優(yōu)化的提取條件下提取所述草藥，并隨后進行與黑升麻相同的HPLC設(shè)置。該結(jié)果顯不,如圖10所不,興安升麻不包含升麻消旋體A,而升麻和大三葉升麻包含不同水平的升麻消旋體A。一般而言，通過使用相同的且經(jīng)優(yōu)化的提取和HPLC條件，很容易鑒別總狀升麻及其相似物——即升麻和大三葉升麻——的草藥原料中的所述化合物。實施例3-升麻消旋體A的治療用途本發(fā)明的化合物可用于治療與感染相關(guān)的炎癥，其包括但不限于由病毒、細菌、真菌、酵母和其他微生物引起的感染。另外，本發(fā)明的化合物可用于治療由多種促炎因子介導(dǎo)的炎癥，所述促炎因子包括但不限于腫瘤壞死因子、干擾素、白細胞介素、白細胞三烯和環(huán)
境毒素。本發(fā)明的化合物和藥物組合物可用于治療或改善任意疾病、病癥或障礙中的炎性癥狀，在所述疾病、病癥或障礙中免疫和/或炎癥抑制是有利的。其中本發(fā)明的化合物和組合物可用于抑制不想要的免疫反應(yīng)和炎癥的炎性疾病、病癥或障礙包括但不限于，關(guān)節(jié)炎(包括但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)，以及其中免疫和/或炎癥抑制是有利的其他關(guān)節(jié)或肌骨骼系統(tǒng)的疾病、病癥或障礙。此外，所述化合物和組合物還可用于治療或改善與以下疾病相關(guān)的炎癥動脈粥樣硬化；動脈硬化；動脈粥樣硬化性心臟病；再灌注損傷；心臟停搏；心肌梗塞；血管炎性障礙，包括腦血管疾病(中風(fēng))；呼吸窘迫綜合征；和其他心肺疾病、病癥或障礙，其中免疫和/或炎癥抑制(例如移植物抗宿主疾病和過敏病癥)是有利的。此外，所述化合物和組合物還可用于治療或改善與以下疾病相關(guān)的炎癥消化性潰瘍；潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、腸易激綜合征、其他炎性腸病和其他胃腸道疾病、病癥或障礙，其中免疫炎癥抑制是有利的；肝臟纖維化；肝硬化和其他肝臟疾病、病癥或障礙，其中免疫和/或炎癥抑制是有利的；甲狀腺炎和其他腺體疾病、病癥或障礙，其中免疫和/或炎癥抑制是有利的；腎小球性腎炎以及其他腎臟和泌尿系疾病、病癥或障礙，其中免疫和/或炎癥抑制是有利的。此外，所述化合物和組合物還可用于治療或改善與以下疾病相關(guān)的炎癥創(chuàng)傷后炎癥；感染性休克；傳染病，其中免疫和/或炎癥抑制是有利的；手術(shù)的炎性并發(fā)癥和副作用，其中免疫和/或炎癥抑制是有利的；骨髓移植和其他移植并發(fā)癥和/或副作用，其中免疫和/或炎癥抑制是有利的；基因治療的炎癥和/或免疫并發(fā)癥和副作用，例如由于病毒載體感染而導(dǎo)致；以及與獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)相關(guān)的炎癥。此外，所述化合物和組合物還可用于抑制與炎癥無關(guān)的免疫應(yīng)答的與巨噬細胞或T細胞相關(guān)的方面。所述化合物和組合物能抑制巨噬細胞或T細胞活性，其包括但不限于巨噬細胞的抗原呈遞活性、巨噬細胞的細胞因子生成、T細胞的細胞因子生成、T細胞的粘著活性、T細胞的增殖等。因此，所述肽、肽衍生物和組合物可用于抑制體液和/或細胞的免
疫應(yīng)答 。所述化合物和組合物還可用于通過降低單核細胞和淋巴細胞的量而治療或改善單核細胞和白細胞增殖性疾病，例如白血病。本發(fā)明的化合物和藥物組合物還可用于在天然細胞或人造細胞、組織和器官(例如角膜、骨髓、器官、晶狀體、起搏器、天然和人造皮膚組織等)的移植情況下預(yù)防和/或治療移植物排斥。所述化合物和組合物還可用于治療或改善與以下疾病相關(guān)的炎癥超敏反應(yīng)；過敏反應(yīng)；哮喘；系統(tǒng)性紅斑狼瘡；膠原??；和其他自身免疫性疾病、病癥或障礙，其中免疫和/或炎癥抑制是有利的。所述化合物和組合物還可用于治療或改善與以下疾病相關(guān)的炎癥耳炎和其他耳鼻喉疾病、病癥或障礙，其中免疫和/或炎癥抑制是有利的；皮膚炎和其他皮膚疾病、病癥或障礙，其中免疫和/或炎癥抑制是有利的；牙周病和其他牙科疾病、病癥或障礙，其中免疫和/或炎癥抑制是有利的。此外，所述化合物和組合物還可用于治療或改善與以下疾病相關(guān)的炎癥后葡萄膜炎；中間葡萄膜炎；前葡萄膜炎；結(jié)膜炎；脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎；葡萄膜視網(wǎng)膜炎；視神經(jīng)炎；眼內(nèi)炎癥，例如視網(wǎng)膜炎和囊樣黃斑水腫；交感性眼炎；鞏膜炎；視網(wǎng)膜色素變性；退行性眼底疾病的免疫和炎性成分；眼外傷的炎性成分、由感染引起的眼部炎癥；增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變；急性缺血性視神經(jīng)病；過度瘢痕化，例如在青光眼濾過手術(shù)后；對眼部植入物的免疫和/或炎癥反應(yīng)；以及其他免疫和炎癥相關(guān)的眼科疾病、病癥或障礙，其中免疫和/或炎癥抑制是有利的。此外，所述化合物和組合物還可用于治療或改善與以下疾病相關(guān)的炎癥自身免疫性疾病和病狀或障礙，其中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)和任意其他器官中免疫和/或炎癥抑制均是有利的；帕金森氏?。慌两鹕喜≈委煹牟l(fā)癥和/或副作用；AIDS_相關(guān)的癡呆復(fù)合征(HIV-相關(guān)的腦病)；德維克氏??；西登哈姆氏舞蹈??；阿耳茨海默氏病和其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退變性疾病、病癥或障礙，其中免疫和/或炎癥抑制是有利的；中風(fēng)的炎性成分；脊髓灰質(zhì)炎后綜合征；精神障礙的免疫和炎性成分；脊髓炎；腦炎；亞急性硬化性全腦炎；腦脊髓炎；急性神經(jīng)??；亞急性神經(jīng)??；慢性神經(jīng)??；格_巴二氏綜合征；西登哈姆氏舞蹈病；重癥肌無力；腦假瘤；唐氏綜合征；亨廷頓氏舞蹈?。患∥s性側(cè)索硬化；中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)壓迫或CNS創(chuàng)傷或腦血管意外(中風(fēng))或CNS的感染或CNS的缺氧-局部缺血的炎性成分；肌萎縮和營養(yǎng)不良的炎性成分；與中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的免疫和炎癥相關(guān)的疾病、病癥或障礙，其中免疫和/或炎癥抑制是有利的。在又一個實施方案中，本發(fā)明的化合物和組合物可用于在已失去其免疫赦免的免疫赦免部位(例如腦、眼和睪丸)處恢復(fù)免疫赦免。實施例4-制劑在一個實施方案中，本發(fā)明提供了經(jīng)分離的化合物。如本文所使用的，“經(jīng)分離的”指的是已從化合物天然可存在于其中的任意環(huán)境中分離出的化合物。例如，經(jīng)分離的升麻消旋體A不會指存在于總狀升麻中的升麻消旋體A化合物。在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物至少有75%純度、優(yōu)選至少90%純度、更優(yōu)選大于95%純度并且最優(yōu)選大于99%純度(基本上純凈的)。本發(fā)明還提供了治療性或藥物組合物，其包含本發(fā)明的化合物，所述化合物的形式為可與可藥用載體結(jié)合。在本文的上下文中，該化合物可為例如經(jīng)分離的或基本上純凈的。術(shù)語“載體”指的是與所述化合物一起給藥的稀釋劑、佐劑、賦形劑或運載劑(vehicle)。這類藥物載體可為無菌液體,例如水和油,包括石油(例如礦物油)、植物油(例如花生油、大豆油和芝麻油)、動物油或合成油。鹽水溶液以及葡萄糖和甘油水溶液也可用作液體載體，特別是用于注射用溶液。特別優(yōu)選的用于治療或改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的藥物載體是可穿透血/腦屏障的載體。本文所使用的載體不包括以其天然形式存在的天然植物材料。合適的藥用賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻、面粉、白堊、硅 膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、經(jīng)干燥的脫脂乳、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。所述治療性組合物——如果需要的話——還可包含極少量的潤濕劑、乳化劑或PH緩沖劑。這些組合物可采取溶液劑、懸浮劑、乳劑、片劑、膠囊劑、粉劑、緩釋制劑等形式。所述組合物可用常規(guī)粘合劑和載體(例如甘油三酯)進行配制。合適的藥用載體的實例記載于E. W. Martin 的 “Remington, s Pharmaceutical Sciences”。該組合物包含治療有效量的治療性組合物與合適量的載體，以便為患者提供合適的給藥形式。所述劑型應(yīng)適合于所述給藥的方式。在一個實施方案中，根據(jù)常規(guī)方法將所述組合物配制為適合于對人類進行局部注射給藥的藥物組合物。通常，用于局部注射給藥的組合物是無菌等滲水性緩沖液中的溶液。需要時，所述組合物還可包含增溶劑和局部麻醉劑(例如利多卡因)以減弱注射部位的疼痛。一般而言，所述成分單獨提供或混合在一起以單位劑型提供，例如密封容器(例如標明活性劑的量的安瓿或藥袋)中的干燥凍干粉末或不含水的濃縮物。當所述組合物通過注射給藥時，可提供注射用無菌水或鹽水的安瓿以便所述組分可在給藥前進行混合。本發(fā)明的治療性或藥物組合物可配制成中性或鹽形式?？伤幱名}包括與游離氨基基團形成的那些鹽，例如衍生自鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些；以及與游離羧基基團形成的那些鹽，例如衍生自氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等的那些鹽。本發(fā)明還提供了對所述化合物的修飾以使其一旦給予受試者則更加穩(wěn)定，即一旦給藥則其與未修飾的化合物相比具有更長的有效時間。所述修飾是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，例如聚乙二醇衍生化(PEG化)、微囊化等。在一些具體的實例中，本發(fā)明的活性化合物可通過使用交聯(lián)劑(linker)而偶聯(lián)至大分子量或小分子量的PEG。現(xiàn)在已知的這類結(jié)構(gòu)的實例包括PEG-伊立替康(irinotecan)和PEG-多西他賽(docetaxel)?？捎行е委熅唧w疾病、病癥或障礙的本發(fā)明治療性或藥物組合物的用量取決于所述疾病、病癥或障礙的性質(zhì)并可由標準臨床技術(shù)確定。一般而言，所述劑量在約0. OOlmg/kg至約2mg/kg范圍內(nèi)。此外，可任選地采用體外測定法來幫助鑒別最佳劑量范圍。在所述制劑中使用的精確劑量還取決于給藥途徑和所述疾病、病癥或障礙的嚴重程度，并應(yīng)根據(jù)醫(yī)師的判斷和各患者的情況而決定。有效劑量可由來源自體外或動物模型測試體系的劑量-應(yīng)答曲線而推斷得出。例如，為了基于由大鼠研究所生成的數(shù)據(jù)而得到用于人的有效mg/kg劑量，將大鼠的有效mg/kg劑量除以六。本發(fā)明還提供了包含裝有一種或多種本發(fā)明的藥物組合物的成分(例如化合物、載體)的一個或多個容器的藥包或藥盒。本發(fā)明的化合物還可按照中醫(yī)實踐進行配制?？捎行е委熅唧w疾病、病癥或障礙的制劑的組成和劑量取決于根據(jù)標準臨床技術(shù)確定的所述疾病、病癥或障礙的性質(zhì)。處方用量的中藥可容易地制成任意形式的藥，適于對人類或動物給藥。合適的形式包括，例如酊劑、煎劑和干浸膏。這些可口服、通過靜脈注射或粘膜施用。所述活性組分還可制成膠囊劑、粉劑、片劑(pallet)、錠劑、栓劑、口服溶液劑、巴氏滅菌的胃腸懸浮液注射劑、包含靜脈給藥制品的少量或大量注射劑、凍結(jié)粉狀(frozen power)注射劑、巴氏滅菌的粉狀注射劑等。所有上述方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，且記載于書中并由中藥醫(yī)師普遍使用。酊劑是通過將草藥懸浮于醇(例如酒或飲料酒)的溶液中而制備。懸浮一段時間后，所述液體(醇溶液)可例如一天給藥兩或三次，每次一茶匙。煎劑是草藥制品的常規(guī)形式。其通常是在粘土罐中制備，但也可在玻璃、釉質(zhì)或不銹鋼容器中制備?？蓪⑺鲋苿┰谒薪菀欢螘r間并隨后使其沸騰并慢沸直至水量減少例如一半。提取物是草藥的基本組分的濃縮制品。通常，所述基本組分是通過將所述草藥懸浮于所選擇的合適溶劑中而從所述草藥中提取得到，所述溶劑通常為水、乙醇/水混合物、甲醇、丁醇、異丁醇、丙酮、己烷、石油醚或其他有機溶劑。所述提取方法還可進一步借助浸潰法、滲濾法、再滲濾法、逆流提取法、渦輪提取法(turbo extraction)或二氧化碳超臨界(溫度/壓力)提取法。過濾去除草藥碎屑后，所述提取液可被進一步蒸發(fā)并從而濃縮以得到軟提取物(濕浸膏(extractum spissum))和/或最終通過噴霧干燥、真空箱干燥、流化床干燥或冷凍干燥得到的干燥提取物、干浸膏。所述軟提取物或經(jīng)干燥的提取物可被進一步溶解于合適液體中至給藥所需濃度或者被加工成例如丸劑、膠囊劑、注射劑等形式。本文中涉及或引用的所有專利、專利申請、臨時申請和公開文本通過引用方式全部——包括所有附圖和表格——納入本申請，至與本說明書的明確教導(dǎo)不相抵觸的程度。應(yīng)理解，本文所述的實施例和實施方案只是為了示例說明的目的，多種改進或變化對本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的并包括在本申請的主旨和范圍內(nèi)。參考文獻1. 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權(quán)利要求
1.一種從升麻屬種中分離升麻消旋體A的方法，其包括以下步驟a)提供足夠量的升麻屬種的原料；b)在約20°C至約28°C的溫度下將所述升麻屬種的原料與水性的極性溶劑混合以得到包含升麻消旋體A的溶劑提取物；和c)從所述溶劑提取物中分離升麻消旋體A。
2.權(quán)利要求I的方法，其中升麻消旋體A是使用高效液相色譜法(HPLC)而從所述溶劑提取物中分離。
3.權(quán)利要求2的方法，其中升麻消旋體A是使用HPLC在約210nm的UV吸光度處從所述溶劑提取物中洗脫。
4.權(quán)利要求3的方法，其中升麻消旋體A是使用HPLC在約23°C下從所述溶劑提取物中洗脫。
5.權(quán)利要求I的方法，其中將所述升麻屬種的原料研磨成粉末。
6.權(quán)利要求I的方法，其中所述升麻屬種選自總狀升麻(Cimicifugaracemosa)、升麻 (Cimicifuga foetida)和大三葉升麻(Cimicifuga heracleifolia)。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述升麻屬種為總狀升麻。
8.權(quán)利要求I的方法，其中所述水性的極性溶劑為乙醇濃度小于20%的水-乙醇。
9.權(quán)利要求8的方法，其中將所述升麻屬種與水-乙醇以約I: 15至約I : 20(w/v) 的比例混合。
10.權(quán)利要求I的方法，其中所述水性的極性溶劑為水。
11.權(quán)利要求10的方法，其中將所述升麻屬種與水以約I: 15至約I : 20(w/v)的比例混合。
12.權(quán)利要求11的方法，其中將總狀升麻與水以約I: 15(w/v)的比例混合。
13.權(quán)利要求I的方法，所述方法由以下步驟組成a)提供足夠量的升麻屬種的原料；b)在約20°C至約28°C的溫度下將所述升麻屬種的原料與水性的極性溶劑混合以得到包含升麻消旋體A的溶劑提取物；和c)從所述溶劑提取物中分離升麻消旋體A。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述水性的極性溶劑為水。
15.權(quán)利要求14的方法，其中將所述升麻屬種與水以約I: 15至約I : 20(w/v)的比例混合。
16.一種用于將包含升麻屬種的治療性組合物標準化的方法，其中所述方法使用升麻消旋體A的濃度和/或生物活性作為標準。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于從升麻屬種中分離升麻消旋體A的方法，其包括步驟a)提供足夠量的獲自所述升麻屬種的原料，b)在約20℃至約28℃的溫度下將獲自所述升麻屬種的原料與水性的極性溶劑混合以得到包含升麻消旋體A的溶劑提取物；和c)從所述溶劑提取物中分離升麻消旋體A。
文檔編號A61K31/05GK102625791SQ201080037200
公開日2012年8月1日 申請日期2010年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月21日
發(fā)明者A·S·劉, L·H·C·楊 申請人:培力(香港)健康產(chǎn)品有限公司, 港大科橋有限公司