專利名稱：嵌合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及嵌合冠狀病毒S蛋白。特別是，當(dāng)用于產(chǎn)生病毒時(shí)，導(dǎo)致病毒具有擴(kuò)展組織嗜性(extended tissue tropism)的嵌合冠狀病毒S蛋白。本發(fā)明還涉及編碼這種嵌合蛋白的核苷酸序列；包含這種嵌合蛋白的病毒顆粒，和它們?cè)陬A(yù)防和/或治療疾病的疫苗中的用途。
背景技術(shù)：
傳染性支氣管炎病毒(IBV)禽傳染性支氣管炎病毒(IBV)是家禽的具有高度傳染性(infectious)和感染性 (contagious)的病原，其主要在呼吸道中復(fù)制，但也在腸、腎和輸卵管的上皮細(xì)胞中復(fù)制。 IBV是冠狀病毒科(Coronaviridae)的成員，而且遺傳學(xué)上非常相似的冠狀病毒在火雞和雉(pheasant)中引起疾病。IB的臨床癥狀包括打噴嚏、氣管羅音、流鼻涕和氣喘(wheezing)。肉禽的體重增加減緩，而蛋禽則產(chǎn)蛋量下降。呼吸道感染使禽類容易產(chǎn)生二次細(xì)菌感染，其在幼禽 (chick)中可為致命的。病毒還能引起(特別是幼禽中)輸卵管永久性損害，導(dǎo)致產(chǎn)蛋數(shù)量和質(zhì)量下降；以及腎永久性損害，有時(shí)引起可為致命的腎病?；钜呙绾蜏p毒疫苗兩者目前都用于IB疫苗接種。至今為止，最有效的疫苗是通過經(jīng)胚胎蛋盲目重復(fù)傳代以經(jīng)驗(yàn)方法產(chǎn)生的減毒活疫苗。這種方法的問題是，在系列傳代時(shí)，病毒的免疫原性下降。必需實(shí)現(xiàn)可接受的減毒程度使病毒安全和可接受的免疫原性損失使病毒疫苗仍然有效兩者之間的平衡。減毒的 “平衡”是試錯(cuò)法(trial and error approach)，使得減毒過程的結(jié)果不確定。由于通過系列傳代而減毒實(shí)際上是隨機(jī)事件，因?yàn)闇p毒的分子基礎(chǔ)未知，所以獲得的疫苗沒有清楚的遺傳學(xué)定義。每批減毒病毒都不同，很難實(shí)現(xiàn)所得疫苗的一致性和體內(nèi)預(yù)防/治療效果的再現(xiàn)性。另一個(gè)缺點(diǎn)是胚胎蛋很昂貴，而且不能用作持久的病毒來源。病毒在胚胎蛋上的生長是個(gè)棘手的過程，因?yàn)槊恐坏岸急仨殰缇⒄諜z、接種病毒和孵育，然后從每只蛋收獲少量的尿囊液，匯集然后純化。高質(zhì)量蛋的可靠供應(yīng)不足導(dǎo)致可產(chǎn)生的疫苗量受到限制，特別是在緊急情況下。除了這些物流和供應(yīng)問題，胚胎蛋作為疫苗生產(chǎn)的宿主系統(tǒng)還有其它局限。例如， 越來越多的對(duì)于存在外來病毒的關(guān)注，特別是蛋中的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其會(huì)危害減毒活病毒疫苗的產(chǎn)生。因此需要可替換的IBV疫苗及其生產(chǎn)方法，從而不受上述缺陷所累。冠狀病毒冠狀病毒是在細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制且含有27至321Λ的非節(jié)段(unsegmented)、單鏈、正義RNA基因組的包膜病毒。所有冠狀病毒脂質(zhì)包膜都含有至少三個(gè)膜蛋白刺突糖蛋白(S)、膜內(nèi)在蛋白 (M)，和小膜蛋白(E)。冠狀病毒S蛋白是I類糖蛋白，其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中低聚化并通過與膜蛋白之間的非共價(jià)相互作用而裝配入病毒體膜。在并入冠狀病毒顆粒后，S蛋白負(fù)責(zé)與靶細(xì)胞受體的結(jié)合以及病毒與細(xì)胞膜的融合。S糖蛋白由四個(gè)域組成在合成過程中切割的信號(hào)序列；外功能區(qū)，其存在于病毒體顆粒之外；負(fù)責(zé)將S蛋白錨定于病毒體顆粒脂雙層中的跨膜區(qū)；和胞質(zhì)尾區(qū)。IBV S蛋白(1162個(gè)氨基酸)被切割成兩個(gè)亞基，Sl (535個(gè)氨基酸；90kDa)，包含 S-蛋白的N-末端部分，和S2 (627個(gè)氨基酸；84kDa)，包含S蛋白的C-末端部分。S2蛋白亞基與Sl亞基非共價(jià)結(jié)合，并含有跨膜和C-末端胞質(zhì)尾區(qū)域。已經(jīng)廣泛報(bào)道Sl亞基包含S蛋白的受體-結(jié)合活性。例如，已顯示對(duì)于血清組I冠狀病毒，人冠狀病毒HCoV_229E而言，在Sl的N-末端結(jié)構(gòu)域中有截?cái)嗟娜齻€(gè)變體中的兩個(gè)不能結(jié)合受體，表明氨基酸417和547之間的區(qū)對(duì)于受體結(jié)合是重要的(Bonavia 等(2003) J. Virol 77.2530-2538)。鼠肝炎病毒(MHV) S蛋白的769個(gè)殘基Sl亞基的前330個(gè)氨基酸足以結(jié)合MHV 受體(Kubo等(1994) J. Virol. 68 =5403-5410)。相似地，SARS S蛋白的193個(gè)氨基酸片段 (殘基318-510)結(jié)合于受體并阻斷S-蛋白介導(dǎo)的感染(Wong等Q004) J. Biol. Chem. 279 3197-3201)。還據(jù)報(bào)道SARS-CoV S糖蛋白的氨基酸1_510代表含有受體結(jié)合位點(diǎn)(氨基酸 270-510)的域，所述位點(diǎn)類似于其它冠狀病毒S糖蛋白的Sl亞基(Babcock等^)04) J. Virol. 4552-4560)。S蛋白是病毒的細(xì)胞嗜性的決定因素(Casias等Q003) J. Virol. 77 :9084-9089)。 已顯示Sl蛋白的N-末端區(qū)中的氨基酸取代與鼠肝炎病毒(MHV)的病毒變體的擴(kuò)展宿主范圍相關(guān)(Thackray和Holmes Q004) Virology 324 :510-524)。而且，通常認(rèn)為感染的種特異性是由于病毒-受體相互作用的特異性而產(chǎn)生的(Compton等(199 J. Virol. 7420-7428 ； Gagneten 等(1995)J. Virol. 69 :889-895)。因此，至今為止已經(jīng)普遍認(rèn)為細(xì)胞嗜性是冠狀病毒的S蛋白的Sl域的性質(zhì)。發(fā)明簡述本發(fā)明的發(fā)明人令人驚訝地顯示了冠狀病毒的細(xì)胞嗜性由S2蛋白決定，并且用另一種冠狀病毒的全部或部分取代S2蛋白能改變(擴(kuò)展或縮小)病毒的細(xì)胞嗜性，取決于 S2蛋白所來源的病毒的細(xì)胞嗜性。這意味著不能在細(xì)胞系上生長的免疫原病毒疫苗可以通過取代其S2蛋白的全部或部分而誘導(dǎo)生長。因此，在第一方面，本發(fā)明提供嵌合冠狀病毒S蛋白，其基于來自具有限制組織嗜性的冠狀病毒株的S蛋白，但是包含來自具有擴(kuò)展組織嗜性的冠狀病毒株的至少部分S2亞基，使包含所述嵌合S蛋白的病毒具有擴(kuò)展組織嗜性。嵌合S蛋白可以包含來自具有擴(kuò)展組織嗜性的冠狀病毒株的全部或部分S2亞基。例如，嵌合傳染性支氣管炎病毒(IBV)S蛋白可以包含部分S2序列，其在S2蛋白的對(duì)應(yīng)于作為SEQ ID No. 1給出的序列的殘基686和691之間的部分中包含序列XBBXBX， 其中B是堿性殘基而X是任何氨基酸。序列XBBXBX可以，例如，是序列SRRKRS或SRRRRS。嵌合S蛋白可以在S2蛋白的對(duì)應(yīng)于作為SEQ ID No. 1給出的序列的殘基686和694之間的部分中包含序列SRRKRSLIE或 SRRRRSVIE。冠狀病毒可以，例如是傳染性支氣管炎病毒(IBV)；犬冠狀病毒(CCoV)；貓冠狀病毒O^eCoV)；人冠狀病毒229E(HCoV-2^E)；豬流行性腹瀉病毒(PEDV)；傳染性胃腸炎病毒(TGEV)；人冠狀病毒NL63 (NL或New Haven)；牛冠狀病毒(BCoV)；犬呼吸道冠狀病毒(CRCoV)；人冠狀病毒OC43(HCoV-OC4;3)；小鼠肝炎病毒(MHV)；豬血凝性腦脊髓炎病毒 (HEV)；大鼠冠狀病毒(RCV)；火雞冠狀病毒(TCoV) ；HCoV-HKUI ；嚴(yán)重急性呼吸道綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)；或火雞冠狀病毒(藍(lán)冠病病毒(Bluecomb disease virus))。其中所述冠狀病毒是IBV，具有擴(kuò)展組織嗜性的IBV株可以是IBV Beaudette0在第二方面，本發(fā)明提供能編碼根據(jù)本發(fā)明第一方面的嵌合S蛋白的核苷酸序列。本發(fā)明還提供包含根據(jù)本發(fā)明第二方面的核苷酸序列的質(zhì)粒。在第三方面，本發(fā)明提供病毒顆粒，其包含根據(jù)本發(fā)明第一方面的嵌合S蛋白，和 /或根據(jù)本發(fā)明第二方面的核苷酸序列。病毒顆?？梢允侵亟M痘苗病毒(rVV)或冠狀病毒。病毒顆?？蔀槟茉诩?xì)胞系如Vero細(xì)胞上生長的。根據(jù)本發(fā)明第三方面的病毒顆粒對(duì)Vero細(xì)胞的感染可通過可溶性肝素阻斷。在第四方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明第三方面的病毒顆粒的方法，所述方法通過下述步驟產(chǎn)生病毒顆粒(i)將如前面部分所述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞；(ii)用重組病毒感染宿主細(xì)胞，所述重組病毒包含具有限制組織嗜性的冠狀病毒株的基因組，缺少至少部分S2亞基；(iii)允許在質(zhì)粒中的S基因序列和重組病毒基因組中的相應(yīng)序列之間發(fā)生同源重組以產(chǎn)生嵌合S基因；和(iv)選擇包含嵌合S基因的重組病毒。重組病毒可為痘苗病毒。為了產(chǎn)生重組冠狀病毒顆粒，可以使用來自步驟(iv)的病毒DNA采用反向遺傳系統(tǒng)(reverse genetics system)原位產(chǎn)生冠狀病毒RNA0因此上述方法任選地包括步驟(ν)從來自步驟(iv)的重組病毒的DNA回收包含嵌合S基因的重組冠狀病毒。在第五方面，本發(fā)明提供能夠產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明第四方面的病毒顆粒的細(xì)胞。所述細(xì)胞可以，例如，是能使用反向遺傳系統(tǒng)產(chǎn)生重組病毒的細(xì)胞，如原代雞腎細(xì)胞，或者用根據(jù)本發(fā)明第四方面的病毒顆粒感染的細(xì)胞。用根據(jù)本發(fā)明第四方面的病毒顆粒感染的細(xì)胞可以源自細(xì)胞系，如Vero細(xì)胞。在第六方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明第四方面的病毒顆粒的疫苗。本發(fā)明進(jìn)一步的方面提供(i)用于治療和/或預(yù)防受試者中的疾病的方法，其包括對(duì)受試者施用根據(jù)本發(fā)明第六方面的疫苗的步驟；(ii)根據(jù)本發(fā)明第六方面的疫苗，用于治療和/或預(yù)防受試者中的疾??；(iii)根據(jù)本發(fā)明第四方面的病毒顆粒在制造用于治療和/或預(yù)防受試者中的疾病的疫苗中的用途。(iv)用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明第六方面的疫苗的方法，其包括用根據(jù)本發(fā)明第四方面的病毒顆粒感染Vero細(xì)胞的步驟；(ν)用于改變冠狀病毒的細(xì)胞嗜性的方法，其包括用來自不同株的S2蛋白或其相應(yīng)部分取代至少部分S2蛋白的步驟；和(vi)細(xì)胞培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)物包含根據(jù)本發(fā)明第五方面的細(xì)胞或細(xì)胞群體。由于嵌合基因的存在而賦予病毒的擴(kuò)展細(xì)胞嗜性意指用于疫苗產(chǎn)生的病毒儲(chǔ)液可以通過在細(xì)胞系，而不是胚胎蛋或原代細(xì)胞上生長而產(chǎn)生。細(xì)胞系如Vero細(xì)胞的使用具有很多優(yōu)勢(shì)(i)先前已經(jīng)對(duì)于病毒的生長和診斷目的進(jìn)行了確證；(ii)細(xì)胞(并且因此病毒)能夠在懸液而不是平板(flat bed)中生長；和(iii)可能實(shí)現(xiàn)一致的得率(yield)。附圖簡述圖I-IBV S蛋白的示意圖。功能S蛋白被糖基化并作為同源三聚體存在于病毒體膜中。Sl亞基的三聚形式構(gòu)成受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。圖 2-顯示來自 Beaudette(Beau-R)和M41 的 S 蛋白和嵌合 S 蛋白 BeauR_MlB2 (S)、 BeauR-B 1M2 (S)、Beau_S_M41-Hep 和 M41-S-Beau-Hep 的示意圖。所有嵌合 S 蛋白的跨膜 (TM)結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)(胞)尾域均源自Beaudette S蛋白。S2亞基中硫酸乙酰肝素-結(jié)合位點(diǎn)的位置用HSBS表示。圖3-含有嵌合S糖蛋白基因的質(zhì)粒的產(chǎn)生。使用位于復(fù)制酶基因中的引物，跨越S1/S2接合點(diǎn)和基因3，通過PCR從兩個(gè)質(zhì)粒pGPT-M41S和pGPT-IBV4tuI-BamHI擴(kuò)增 Beau-R和M41的Sl和S2亞基。使用重疊PCR合并亞基，形成嵌合S基因，然后用NsiI (位于復(fù)制酶基因中的限制位點(diǎn))和BspEI (位于基因3中的限制位點(diǎn))剪切所述基因。受體質(zhì)粒pGPT-IBV-MuI-BamHI也用NsiI和BspEI剪切，并且通過凝膠提取而去除Beaudette S基因。將嵌合S基因連接入包含大腸桿菌鳥嘌呤黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(gpt)基因的殘余 pGPT-IBV-MuI-BamHI 骨架中。圖 4-pGPT-IBV4tuI-BamHI 和 pGPT_M41S 的圖。使用質(zhì)粒pGPT-IBV-MuI-BamHI 和 pGPT_M41S 通過 PCR 擴(kuò)增 Beau-R 和 M41S1 和 S2亞基。S基因附近的復(fù)制酶基因和基因3源自Beaudette。pGPT_M41S中M41S基因的 C-末端已對(duì)Beau-R S基因C-末端進(jìn)行交換，因?yàn)檫@是與M蛋白相互作用的區(qū)域。M41和 Beau-R S蛋白的C-末端彼此差別非常大，使嵌合S蛋白可與來自Beau-R的其它結(jié)構(gòu)蛋白相互作用，決定保留Beau-R S基因C-末端。從pGPT-IBV4tuI-BamHI去除Beau-R S基因并將嵌合S基因插入到其位置，以生成質(zhì)粒pGPT-SlM41S4eau和pGPT-SlBeauS2M41。圖5-IBV反向遺傳系統(tǒng)。由嵌合S基因和IBV基因組中部分相鄰基因構(gòu)建包含gpt的質(zhì)粒載體。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入用含有IBV基因組(缺少S基因)的rVV感染的Vero細(xì)胞中。在存在和不存在gpt 選擇元件的情況下各進(jìn)行三輪噬斑純化，以選擇含有嵌合S基因的rVV。在BHK-21細(xì)胞中制備大量病毒儲(chǔ)液，從所述細(xì)胞純化病毒并進(jìn)行DNA提取。將VV基因組中的重組IBV cDNA 和表達(dá)IBV N蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入用rFPV-T7感染的CK細(xì)胞中。過濾上清并用于在CK細(xì)胞上的傳代，并回收具有嵌合S基因的rIBV。圖6-用多種IBV感染后48小時(shí)的感染Vero細(xì)胞。圖7-Vero細(xì)胞上的rIBV生長的共焦顯微術(shù)。用rIBV感染Vero細(xì)胞，并在感染后固定M小時(shí)，并用小鼠抗-dsRNA、二抗AlexaFluor 488羊抗-小鼠(綠色，Invitrogen) 免疫標(biāo)記以檢測(cè)IBV感染的細(xì)胞。所有細(xì)胞的細(xì)胞核用DAPI (藍(lán)色)標(biāo)記。圖 8-rIBV 在 Vero 細(xì)胞上的生長動(dòng)力學(xué)。用 Beau-R、M41-CK、BeauR_M41 (S)、 BeauR-MlB2 (S)、BeauR-B 1M2 (S)、Beau-S-M41-Hep 和 M41-S-Beau_H印以 0· 1 的多重性感染(multiplicity of infection)感染Vero細(xì)胞。在感染后1、12、24、48和72小時(shí)收獲上清并在CK細(xì)胞上測(cè)滴度。進(jìn)行三次重復(fù)并取平均值。誤差線表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖9-用漸增量的可溶性肝素預(yù)處理的IBV在Vero細(xì)胞上的噬斑減少試驗(yàn) (plaque reduction assay) 0

圖10-比較可溶性肝素對(duì)IBV感染的Vero細(xì)胞百分比的影響的柱狀圖。在感染Vero細(xì)胞之前，用PBS(-)或可溶性肝素，15mg/ml (+)在室溫將IBV株Beau-R和 BeauR-MlB2(S)溫育30分鐘。感染后將細(xì)胞固定M小時(shí)，然后用小鼠α-dsRNA、二抗羊 α -小鼠IgG (綠色，Invitrogen)進(jìn)行免疫標(biāo)記，并用DAPI將核染成藍(lán)色。通過40倍放大的共焦顯微術(shù)每個(gè)樣品分析十個(gè)視野，并計(jì)算感染細(xì)胞的百分比。圖11-Beaudette (Beau-R)、Μ41、具有將硫酸乙酰肝素結(jié)合位點(diǎn)修飾成相應(yīng) Μ41序列的Beaudette (Beau-S-M41_H印)和具有Beaudette硫酸乙酰肝素結(jié)合位點(diǎn)的 M41(M41-S-Beau-Hep)。圖12-Beaudette和M41的比較。a) S蛋白序列，和b) S2區(qū)。圖13-M41和Beaudette S蛋白之間的氨基酸差異。圖14-M41和Beaudette S2區(qū)之間的氨基酸差異。發(fā)明詳述冠狀病毒冠狀病毒是屬于冠狀病毒科的動(dòng)物病毒屬。冠狀病毒是具有正義單鏈RNA基因組和螺旋對(duì)稱性的包膜病毒。冠狀病毒的基因組大小從約27至32千堿基，是任何已知RNA 病毒中最長的。冠狀病毒主要感染哺乳動(dòng)物和鳥類的上呼吸道和胃腸道。冠狀病毒的四至五種不同的目前已知的株感染人。最廣為人知的人冠狀病毒，可引起SARS的SARS-CoV，具有獨(dú)特的發(fā)病機(jī)理，因?yàn)樗梢砸鹕虾粑篮拖潞粑栏腥?，還能引起腸胃炎。人們相信冠狀病毒引起成年人中所有普通感冒的大部分。冠狀病毒還引起農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物和馴養(yǎng)寵物中的多種疾病，其中有些可為非常嚴(yán)重，且為對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的威脅。農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物的經(jīng)濟(jì)上重要的冠狀病毒包括傳染性支氣管炎病毒(IBV)， 其主要引起鳥類中的呼吸道疾病，并嚴(yán)重影響全世界的家禽業(yè)；豬冠狀病毒(感染性腸胃炎，TGE)和牛冠狀病毒，兩者均導(dǎo)致年幼動(dòng)物中的腹瀉。貓冠狀病毒有兩種形式，貓腸冠狀病毒是臨床影響較小的病原，但是這種病毒的自發(fā)突變能引起貓傳染性腹膜炎(FIP)，一種與高死亡率相關(guān)的疾病。還有兩類犬冠狀病毒(CCoV)，一種引起輕微腸胃疾病，一種已發(fā)現(xiàn)引起呼吸疾病。鼠肝炎病毒(MHV)是引起具有高死亡率的流行性鼠病的冠狀病毒，特別是在實(shí)驗(yàn)室小鼠群體中。
冠狀病毒可分成三組，如下所示第1 組 犬冠狀病毒(CCoV) 貓冠狀病毒(FeCoV)·人冠狀病毒 229E (HCoV-229E) 豬流行性腹瀉病毒(PEDV) 傳染性胃腸炎病毒(TGEV) 人冠狀病毒 NL63 (NL 或 New Haven)第2 組 牛冠狀病毒(BCoV) 犬呼吸道冠狀病毒(CRCoV)-常見于東南亞(SE Asia)和密克羅尼西亞(Micronesia)·人冠狀病毒 0C43 (HCoV-0C43) 小鼠肝炎病毒(MHV) 豬血凝性腦脊髓炎病毒(HEV) 大鼠冠狀病毒(RCV)。大鼠冠狀病毒在東澳大利亞非常普遍，2008年三/四月， 在天然和野生嚙齒動(dòng)物群落中發(fā)現(xiàn)。 火雞冠狀病毒(TCoV)·(尚無通用名)(HCoV-HKUI) 嚴(yán)重急性呼吸道綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)第3組 傳染性支氣管炎病毒(IBV)·火雞冠狀病毒(藍(lán)冠病病毒)本發(fā)明的病毒可以是第1組冠狀病毒如TGEV ；第2組冠狀病毒如MHV ；或者第3組冠狀病毒如IBV。IBV禽類傳染性支氣管炎(IB)是急性并且高傳染性的鳥類呼吸道疾病，其引起嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。疾病的特征為呼吸道癥狀，包括氣喘、咳嗽、打噴嚏、氣管羅音和流鼻涕。在年幼鳥類中，可發(fā)生嚴(yán)重的呼吸困難。在蛋禽中，呼吸困難、腎炎、產(chǎn)蛋量下降，和蛋內(nèi)部品質(zhì)與蛋殼品質(zhì)降低是常見的。在肉禽中，咳嗽和發(fā)出咕嚕聲(rattling)是常見的臨床癥狀，可在舍內(nèi)所有禽只中快速傳播。在未接種疫苗的群體中發(fā)病率為100%。發(fā)病率依賴于年齡、病毒株和二次感染而不同，但是在未接種疫苗的群體中可以達(dá)到60%。鑒定的第一種IBV血清型是Massachusetts (馬薩諸塞型)，但是除了最初鑒定的馬薩諸塞型，幾種血清型包括Arkansas (阿肯色型)和Delaware (特拉華型)，目前正在美國傳播。在禽胚中至少150次傳代后得到IBV株Beaudette。對(duì)于成年鳥類，IBV Beaudette 不再是病原性的，但是能迅速殺死胚胎。圖12和表1顯示了 IBV Beaudette和M41之間的氨基酸差異。
H120是商業(yè)化的活I(lǐng)BV Massachusetts血清型疫苗株，通過在胚胎禽蛋中約120 次傳代而減毒。H52是另一 Massachusetts株，且代表在H120發(fā)展過程中更早且病原性略強(qiáng)的傳代病毒(52代)。通常使用基于H120和H52的疫苗。S-蛋白冠狀病毒S蛋白包含大量重度糖基化的外功能區(qū)，其在生物合成過程中由高爾基體中的弗林樣酶(furin-like enzyme)切割為兩個(gè)亞基(Si和S2)。并非所有冠狀病毒都被切割，即使未切割，S蛋白的基本亞基結(jié)構(gòu)仍是保守的。Sl包含受體結(jié)合域(1^等Q005) Science 309 1864-1868)，而S2包含融合體域。IBV的S蛋白在S1/S2邊界被完全切割， 特別是在禽胚胎系統(tǒng)中。S2結(jié)構(gòu)域含有五個(gè)域或功能區(qū)，如圖1所示兩個(gè)域，HRl和HR2形成螺旋結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生蛋白的桿狀結(jié)構(gòu)(stalk structure)；負(fù)責(zé)將蛋白錨定至病毒體膜的跨膜域；富含半胱氨酸的胞質(zhì)域，負(fù)責(zé)與其它病毒結(jié)構(gòu)蛋白相互作用；和第五個(gè)域，融合肽，負(fù)責(zé)病毒-細(xì)胞融合或細(xì)胞與細(xì)胞融合。M41和Beaudette S蛋白之間的氨基酸差異和S2區(qū)分別如圖13和14所示。組織嗜性冠狀病毒表現(xiàn)出強(qiáng)的物種和組織嗜性。同樣地，IBV的臨床分離株在體內(nèi)和細(xì)胞培養(yǎng)物中顯示不同的嗜性。M41株已經(jīng)適應(yīng)了在原代幼禽腎(CK)細(xì)胞上的生長，并且僅限于感染原代禽細(xì)胞，因此需要在胚胎蛋或CK細(xì)胞上生長。另一方面，已知Beaudette株能夠感染培養(yǎng)物中的多種細(xì)胞，包括Vero和幼倉鼠腎(BHK)細(xì)胞。具有限制組織嗜性的冠狀病毒能感染的細(xì)胞類型比具有擴(kuò)展組織嗜性的冠狀病毒少。具有限制組織嗜性的冠狀病毒可以，例如僅限于感染原代細(xì)胞，而具有擴(kuò)展組織嗜性的冠狀病毒可(除了能夠感染原代細(xì)胞之外)能夠感染一種或多種細(xì)胞系。具有擴(kuò)展組織嗜性的冠狀病毒可以，例如，具有感染Vero細(xì)胞的能力。Vero細(xì)胞譜系1962年分離自從非洲綠猴(Cercopithecus aethiops)提取的腎上皮細(xì)胞。Vero細(xì)胞用于很多實(shí)驗(yàn)和臨床目的，包括用作生長病毒的宿主細(xì)胞。Vero細(xì)胞譜系是連續(xù)的，可通過多次分化循環(huán)復(fù)制并且不會(huì)衰老。Vero細(xì)胞已被許可用于制造疫苗，并且目前用于生產(chǎn)脊髓灰質(zhì)炎和狂犬病疫苗。具有限制組織嗜性的株可為免疫原性的并且能夠誘導(dǎo)體內(nèi)預(yù)防性或治療性免疫應(yīng)答。具有限制組織嗜性的株可為，例如，目前用于疫苗生產(chǎn)的株。對(duì)于IBV，其包括株如 H52、H120、Ma5、4/91、D41、D274*W93。具有限制組織嗜性的株可為或源自“野外”分離株如 BJl、BJ2 或 BJ3 (Li 禾口 Yang QOOl)Avian Pathol 30:535-541)。對(duì)于IBV，具有擴(kuò)展組織嗜性的株可為，例如，IBV Beaudette，使得本發(fā)明的嵌合蛋白包含全部或部分IBV Beaudette S2蛋白。細(xì)胞嗜性可以通過用經(jīng)病毒感染簡單刺激給定的細(xì)胞類型而由實(shí)驗(yàn)建立。然后可以在一定傳代次數(shù)后分析細(xì)胞病理效應(yīng)(cpe)和合胞體形成程度，如實(shí)施例中所述。可以使用顯微術(shù)分析感染細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的變化。
嵌合蛋白本發(fā)明涉及嵌合冠狀病毒刺突蛋白(S蛋白)，其基于來自具有限制組織嗜性的冠狀病毒株的S蛋白，但是其包含來自具有擴(kuò)展組織嗜性的冠狀病毒株的至少部分S2亞基。術(shù)語“基于”表示至少Sl域源自或可源自具有限制組織嗜性的株。嵌合蛋白還可以包含來自具有限制組織嗜性的株的部分S2域。例如，跨膜和/或胞質(zhì)域可為源自或可源自具有限制組織嗜性的株。嵌合蛋白可包含來自具有擴(kuò)展組織嗜性的冠狀病毒株的全部或部分S2亞基。嵌合蛋白可包含位于，例如，IBV Beaudette的S2亞基中的硫酸乙酰肝素結(jié)合位
點(diǎn)ο嵌合傳染性支氣管炎病毒(IBV)S蛋白可，例如，在S2蛋白的對(duì)應(yīng)于如SEQ ID No. 1給出的序列的殘基686和691之間的部分中包含序列XBBXBX(圖12ABEAU-CK序列)， 其中B是堿性堿基，而X是任何氨基酸。例如，蛋白可在S2蛋白的對(duì)應(yīng)于如SEQ ID No. 1給出的序列的殘基686和691之間的部分中包含序列SRRKRS或SRRRRS。例如，蛋白可在S2蛋白的對(duì)應(yīng)于如SEQ ID No. 1給出的序列的殘基686和694之間的部分中包含序列SRRKRSLIE或SRRRRSVIE。嵌合蛋白可包含基本上全部S2序列部分，其是來自具有擴(kuò)展組織嗜性的株的 N-末端至HRl域。嵌合蛋白可包含部分S2序列，其是來自具有擴(kuò)展組織嗜性的株的N-末端至HRl域，以及HRl域。嵌合蛋白可包含部分S2序列，其是來自具有擴(kuò)展組織嗜性的株的N-末端至HRl域，HRl域和HRl與HR2域之間的序列的部分。嵌合蛋白可包含部分S2序列，其是來自具有擴(kuò)展組織嗜性的株的N-末端至HRl域，HRl域，HRl與HR2域之間的序列的部分和HR2域。嵌合蛋白可包含來自具有擴(kuò)展組織嗜性的冠狀病毒株的基本上全部S2亞基。嵌合蛋白可包含表1和圖14中所示的S2區(qū)十九種氨基酸變化中的一種或多種。 具體地，嵌合蛋白可在位置687包含精氨酸殘基，在位置689包含賴氨酸殘基。嵌合蛋白還可在位置692包含亮氨酸殘基。術(shù)語“基本上全部”表示嵌合蛋白包含野生型序列的相應(yīng)部分的至少95%。缺失的氨基酸可以位于序列中任何位置，并且可為成組在一起(從而缺失序列的小部分)或單獨(dú)的。當(dāng)部分嵌合蛋白可源自給定株的S蛋白時(shí)，所述部分可具有與野生型序列的相應(yīng)部分相同的氨基酸序列，或者與野生型序列相比，它可具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、添加或缺失，只要保留序列該部分的初始功能即可。術(shù)語“野生型”用于意指具有與天然蛋白(即病毒蛋白)相同的一級(jí)氨基酸序列的多肽。突變體序列可以天然產(chǎn)生，或者人工生成(例如通過定點(diǎn)突變)。突變體可與野生型序列的相應(yīng)部分具有至少70、80、90或95%的序列同一性。突變體在野生型序列的相應(yīng)部分可具有少于20、10或5個(gè)突變。同一性比較可通過目測(cè)進(jìn)行，或者更通常地，在容易可用的序列比較程序的幫助下進(jìn)行。這些商業(yè)上可得到的計(jì)算機(jī)程序可計(jì)算兩個(gè)或多個(gè)序列之間的％同一性。進(jìn)行這種比對(duì)的合適的計(jì)算機(jī)程序是GCG Wisconsin Bestfit軟件包(Unviersity of Wisconsin, U. S. Α. ；Devereux 等，1984，Nucleic Acids Research 12 :387)。能進(jìn)行序列比較的其它軟件的實(shí)例包括，但不限于，BLAST軟件包(參見Ausubel等，1999ibid_第18章)、 FASTA (Atschul 等，1990，J. Mol. Biol.，403-410)和比較工具的 GENEffORKS 套裝。BLAST 禾口 FASTA可用于離線和在線檢索(參見Ausubel等，1999ibid，7-58至7-60頁)。然而，對(duì)于有些應(yīng)用，優(yōu)選使用GCG Bestfit程序。一個(gè)新工具，稱作BLAST 2 kquences也可用于比較蛋白和核苷酸序列(參見 FEMS Microbiol Lett 1999174(2) :247-50 ；FEMS Microbiol Lett 1999177(1) 187—8 禾口 tatianaOncbi. nlm. nih. gov)。序列可以具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的缺失、插入或取代，產(chǎn)生沉默變化并得到功能上等同的分子。只要能夠保留活性，可基于殘基的極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和/或兩性性質(zhì)的相似性進(jìn)行故意的氨基酸取代。例如，帶負(fù)電荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；帶有具有相似親水性值的不帶電的極性頭基團(tuán)的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸?？梢裕绺鶕?jù)下表，進(jìn)行保守取代。第二列中相同單元格內(nèi)的氨基酸，并且優(yōu)選第三列中相同行的氨基酸，可以互相取代。
權(quán)利要求
1.嵌合冠狀病毒S蛋白，其基于來自具有限制組織嗜性的冠狀病毒株的S蛋白，但是其包含來自具有擴(kuò)展組織嗜性的冠狀病毒株的至少部分S2亞基，使包含所述嵌合S蛋白的病毒具有擴(kuò)展組織嗜性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的嵌合S蛋白，其基本上包含來自具有擴(kuò)展組織嗜性的冠狀病毒株的全部S2亞基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的嵌合傳染性支氣管炎病毒(IBV)S蛋白，其在S2蛋白的對(duì)應(yīng)于作為SEQ ID No. 1給出的序列的殘基686和691之間的部分中包含序列XBBXBX，其中B 是堿性殘基而X是任何氨基酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的嵌合S蛋白，其在S2蛋白的對(duì)應(yīng)于作為SEQID No. 1給出的序列的殘基686和691之間的部分中包含序列SRRKRS或SRRRRS。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的嵌合S蛋白，其在S2蛋白的對(duì)應(yīng)于作為SEQID No. 1給出的序列的殘基686和694之間的部分中包含序列SRRKRSLIE或SRRRRSVIE。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2的嵌合S蛋白，其中所述冠狀病毒選自下組傳染性支氣管炎病毒(IBV)；犬冠狀病毒(CCoV)；貓冠狀病毒O^eCoV)；人冠狀病毒229E (HCoV_2^E)；豬流行性腹瀉病毒(PEDV)；傳染性胃腸炎病毒(TGEV)；人冠狀病毒NL63 (NL或New Haven)； 牛冠狀病毒(BCoV)；犬呼吸道冠狀病毒(CRCoV)；人冠狀病毒0C43(HCoV-0C43)；小鼠肝炎病毒(MHV)；豬血凝性腦脊髓炎病毒(HEV)；大鼠冠狀病毒(RCV)；火雞冠狀病毒(TCoV)； HCoV-HKUI ；嚴(yán)重急性呼吸道綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)；和火雞冠狀病毒(藍(lán)冠病病) ο
7.根據(jù)任何前述權(quán)利要求的嵌合S蛋白，其中所述冠狀病毒是IBV，并且具有擴(kuò)展組織嗜性的 IBV 株是 IBV Beaudette。
8.核苷酸序列，其能夠編碼根據(jù)任何前述權(quán)利要求的嵌合S蛋白。
9.質(zhì)粒，其包含根據(jù)權(quán)利要求8的核苷酸序列。
10.病毒顆粒，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的嵌合S蛋白，和/或根據(jù)權(quán)利要求 8的核苷酸序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的病毒顆粒，其能夠在Vero細(xì)胞上生長。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的病毒顆粒，其對(duì)Vero細(xì)胞的感染可通過可溶性肝素阻斷。
13.制備根據(jù)權(quán)利要求10-12中任一項(xiàng)的病毒顆粒的方法，所述方法包括下述步驟(i)將根據(jù)權(quán)利要求9的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞；( )用重組病毒感染所述宿主細(xì)胞，所述重組病毒包含具有限制組織嗜性的冠狀病毒株的基因組，缺少至少部分S2亞基；(iii)允許在質(zhì)粒中的S基因序列和重組病毒基因組中的相應(yīng)序列之間發(fā)生同源重組，以產(chǎn)生嵌合S基因；和(iv)選擇包含所述嵌合S基因的重組病毒。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述重組病毒是痘苗病毒。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14的方法，所述方法還包括下述步驟(ν)從來自步驟(iv)的重組病毒的DNA回收包含所述嵌合S基因的重組冠狀病毒。
16.細(xì)胞，其能夠產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求10-12中任一項(xiàng)的病毒顆粒。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的Vero細(xì)胞。
18.疫苗，其包含根據(jù)權(quán)利要求10-12中任一項(xiàng)的病毒顆粒。
19.用于治療和/或預(yù)防受試者中的疾病的方法，其包括對(duì)所述受試者施用根據(jù)權(quán)利要求18的疫苗的步驟。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的疫苗，其用于治療和/或預(yù)防受試者中的疾病。
21.根據(jù)權(quán)利要求10-12中任一項(xiàng)的病毒顆粒在制造用于治療和/或預(yù)防受試者中的疾病的疫苗中的用途。
22.根據(jù)權(quán)利要求19、20或21的方法、疫苗或用途，其中所述疾病是傳染性支氣管炎病毒(IBV)或鼠肝炎病毒(MHV)。
23.用于產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求18或20的疫苗的方法，其包括用根據(jù)權(quán)利要求10-12中任一項(xiàng)的病毒顆粒感染Vero細(xì)胞的步驟。
24.改變冠狀病毒細(xì)胞嗜性的方法，其包括用來自不同株的S2蛋白或其相應(yīng)部分取代至少部分S2蛋白的步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供嵌合冠狀病毒S蛋白，所述蛋白基于來自具有限制組織嗜性的冠狀病毒株的S蛋白，但是其包含來自具有擴(kuò)展組織嗜性的冠狀病毒株的至少部分S2亞基，使包含所述嵌合S蛋白的病毒具有擴(kuò)展組織嗜性。本發(fā)明還提供包含這種嵌合S蛋白的病毒。
文檔編號(hào)A61K39/215GK102574897SQ201080039682
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月7日
發(fā)明者E.比克頓, M.阿梅斯托, P.布里頓 申請(qǐng)人:動(dòng)物健康研究院