專利名稱：新型噬菌體和包含所述噬菌體的抗菌組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型噬菌體。
背景技術(shù)：
沙門氏菌(Salmonella)是腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的一個(gè)屬，其特征為革蘭氏陰性、兼性厭氧、無(wú)芽孢形成、桿狀細(xì)菌且大多數(shù)菌株均通過(guò)鞭毛活動(dòng)。沙門氏菌基因組的平均GC含量為50-52%，這與大腸桿菌(Escherichia coli)和志賀氏菌(Shigella)相似。沙門氏菌屬是在家畜和人中引起傳染的病原微生物。血清學(xué)分類指出，作為沙門氏菌的一種，腸道沙門氏菌(Salmonella enterica)具有多個(gè)血清型，包括雞血清型、雞白痢血清型、鼠傷寒血清型、腸炎血清型、傷寒血清型、豬霍亂血清型和德爾卑血清型(Bopp CA, Brenner Fff, Wells JG, Strokebine ΝΑ. Escherichia, Shigella, Salmonella.In Murry PR, Baron EJ, et al. , eds Manual of Clinical Microbiology ( I臨；^itL手冊(cè))· 7th ed. Washington DC American Society forMicrobiology 1999 ；467-74 ；RyanKJ. Ray CG (editors) Q004)。Sherris Medical Microbiology (微生物 M4th ed). McGrawHill. ISBN 0-8385-8529-9.)。其中，雞沙門氏菌(Salmonella Gallinarum)和雞白痢沙門氏菌(Salmonella pullorum)是特異于禽的病原體，傷寒沙門氏菌(Salmonella Typhi)是特異于人的病原體，豬霍亂沙門氏菌(Salmonella Choleraesuis)和德爾卑沙門氏菌(Salmonella derby)是特異于豬的病原體，腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritis)和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella Typhimurium)是人和動(dòng)物二者的病原體，雞沙門氏菌和雞白痢沙門氏菌是特異于禽的病原體。各種血清型在相應(yīng)的物種中引起疾病，對(duì)農(nóng)民或消費(fèi)者產(chǎn)生嚴(yán)重影響。由沙門氏菌引起的家禽疾病為禽傷寒(FT)，其由雞沙門氏菌(下文稱為“SG”)病原體引起。禽傷寒(FT)是家禽(如雞和鴨)的敗血癥，其病程可能為急性或慢性的，并伴有高死亡率。最近報(bào)道禽傷寒常常發(fā)生在歐洲、南美洲、非洲和東南亞，并且其破壞性逐年增加。韓國(guó)自1992年開始有FT爆發(fā)的報(bào)道，F(xiàn)T在褐色蛋雞中引起的經(jīng)濟(jì)損失非常嚴(yán)重(Kwon Yong-Kook. 2000 annual report on avian diseases, information publication byNaional Veterinary Research& Quarantine Service. March,2001 ；Kim Ae-Ran et al.,The prevalence of pullorum disease-fowl typhoid in grandparent stock and parentstock in Korea, 2003, Korean J Vet Res(2006)46(4) :347 353)。雞白痢也是由一種沙門氏菌菌株，雞白痢沙門氏菌(下文稱為“SP”)引起的。雞白痢發(fā)生在任何年齡或季節(jié)，但雛雞特別容易感染此病。上世紀(jì)，雞白痢是在1-2周齡或更年幼雛雞中傳播的嚴(yán)重疾病。從二十世紀(jì)八十年代，其發(fā)病率急劇降低。然而，在二十世紀(jì)九十年代中期其發(fā)病率又開始增加。(Kwon Yong-Kook. 2000 annual report on aviandiseases. Information publication by National Veterinary Research & QuarantineService. March,2001 ；Kim Ae-Ran et al. , The prevalence of pullorum disease -fowltyphoid in grandparent stock and parent stock in Korea,2003, Korean J VetRes (2006)46(4) :347-353)。
在韓國(guó)，禽傷寒和雞白痢的爆發(fā)從二十世紀(jì)九十年代開始增加，給農(nóng)民造成了經(jīng)濟(jì)損失。為此，已經(jīng)從2004年開始在肉用仔雞(broiler)中使用減毒活SG疫苗以預(yù)防禽傷寒(Kim Ae-Ran et al.，Theprevalence of pullorum disease-fowl typhoid ingrandparent stock and parentstock in Korea，2003，Korean J Vet Res (2006)46 (4)347 35 。盡管其功效尚不確定，然而由于存在由雞蛋傳播傳染病的風(fēng)險(xiǎn)，不允許將活疫苗用于蛋雞。遺憾的是，與禽傷寒不同，對(duì)于雞白痢仍沒有在商業(yè)上可行的預(yù)防策略。因此，迫切需要預(yù)防禽傷寒和雞白痢的新方法。同時(shí)，腸炎沙門氏菌(下文稱為“SE”)和鼠傷寒沙門氏菌(下文稱為“ST”)是動(dòng)物源性病原體，與SG或SP不同，它們沒有表現(xiàn)出宿主特異性(Zoobises Report ；UnitedKingdom 2003)。SE和ST是家禽、豬和牛的沙門氏菌病的致因。由沙門氏細(xì)菌引起的沙門氏菌病是家畜消化道的急性或慢性感染，并且主要表現(xiàn)出發(fā)燒、腸炎和敗血癥的癥狀，偶爾會(huì)表現(xiàn)出肺炎、關(guān)節(jié)炎、流產(chǎn)和乳腺炎。沙門氏菌病發(fā)生于世界范圍內(nèi)，并且在夏季最頻繁(T. R. Callaway et al. Gastrointestinal microbial ecology and the safety of thefood supply as related to Salmonella. J Anim Sci 2008. 86 :E163_E172)。在牛中，典型的癥狀包括食欲不振、發(fā)燒、暗褐色腹瀉或糞便中有帶血的粘液。牛犢中的急性感染會(huì)導(dǎo)致快速死亡，并且妊娠期間的感染會(huì)導(dǎo)致由敗血癥引起的胎兒死亡，導(dǎo)致早產(chǎn)(書livestock, co. kr)。在豬中，沙門氏菌病的臨床特征主要為三種癥狀急性敗血癥、急性腸炎以及慢性腸炎。急性敗血癥發(fā)生于2-4月齡的小豬中，并且通常在癥狀出現(xiàn)后2-4天內(nèi)發(fā)生死亡。急性腸炎發(fā)生于育肥期，并伴隨腹瀉、高燒、肺炎和神經(jīng)性癥狀。在某些嚴(yán)重的情況下可能會(huì)發(fā)生皮膚褪色。慢性腸炎伴隨有持續(xù)性的腹瀉(www.livestock.co.kr)。一旦由SE和ST引起的沙門氏菌病在家禽、豬和牛中爆發(fā)，僅利用治療劑是很難治愈的。原因是一旦出現(xiàn)臨床癥狀，沙門氏菌就能對(duì)多種藥物表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抗性，并且能在抗生素?zé)o法透過(guò)的細(xì)胞中存活。時(shí)至今日，仍然沒有可有效治療由SE和ST所引起的沙門氏菌病的方法，包括抗生素(www. lhca. or. kr)。如同在家畜中一樣，SE和ST能通過(guò)家畜及其制品在人中引起感染，導(dǎo)致沙門氏菌食物中毒。攝入被感染的未煮熟的家畜制品(例如肉制品、禽制品、蛋類及副產(chǎn)品)能使人感染。人類的沙門氏菌食物中毒通常涉及迅速發(fā)生頭痛、發(fā)燒、腹痛、腹瀉、反胃和嘔吐。通常在攝取生物后6-72小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)這些癥狀，并可以持續(xù)長(zhǎng)達(dá)4-7天甚至更久(NSW+HEALTH. 2008. 01. 14.)。按照 CDC(The Centers for Disease Control and Prevention, USA)的 艮道，2005至2008年間爆發(fā)的人食物中毒中的16%歸因于沙門氏菌，其中SE和ST各占其20%和18%。關(guān)于1973至1984年間的人沙門氏菌食物中毒，據(jù)報(bào)道，所涉及的食品傳播媒介為雞肉(5%)、牛肉(19%)、豬肉(7%)、乳制品(6%)以及火雞肉(9% )。在1974-1984年間，在屠宰過(guò)程中，對(duì)肉用仔雞進(jìn)行的細(xì)菌污染測(cè)試表明，35%或更多出現(xiàn)沙門氏菌。在1983年，在50. 6 %的雞肉、68. 8 %的火雞肉、60 %的鵝肉、11. 6 %的豬肉以及1. 5 %的牛肉中分離出沙門氏菌。此外，在2007年進(jìn)行的一項(xiàng)調(diào)查報(bào)道，在5. 5%的生禽肉和1. 的生豬肉中發(fā)現(xiàn)沙門氏菌。特別揭示，SE通常來(lái)源于受污染的蛋類或禽肉，而ST來(lái)源于受污染的豬肉、禽肉以及牛肉(www. cdc. gov) (Centers for Disease Control and Prevention (CDC))。例如，由SE引起的食物中毒自從1988在美國(guó)、加拿大和歐洲迅速增加，流行病學(xué)研究表明，這歸因于蛋類或含蛋的食品(Agre-Food Safety Information Service (AGROS). Domestic andforeign food poisoning occurrence and management trend. 2008. 02)。由 FTVO禾口 WHO在2002進(jìn)行的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估指出，通過(guò)蛋類或禽肉在人類傳播沙門氏菌病的發(fā)生率似乎與在家禽中所觀察到的沙門氏菌流行病存在線性關(guān)系。這意味著，當(dāng)家禽中沙門氏菌流行病下降時(shí),人類的沙門氏菌病的發(fā)生率也隨之下降(Salmonella control at the source ；WorldHealth Organization. International Food Safety Authorities Network(INFOSAN)Information Note No. 03/2007)。最近，來(lái)自產(chǎn)品(如花生、菠菜、番茄、阿月渾子、胡椒粉以及最近的曲奇餅)的沙門氏菌的爆發(fā)已激起對(duì)食品安全的擔(dān)憂(Jane Black and Ed0 ‘ Keefe. Overhaul of Food Safety Rules in the Works. Washington Post StaffWriters Wednesday, July 8，2009)。由于這些原因，沙門氏菌感染在德國(guó)必須報(bào)道(6 and 7 of the German law oninfectious disease prevention, Infektionsschutzgesetz)。在 1990 至 2005 年間，官方記載的病歷數(shù)從大約200，000例下降到大約50，000例。據(jù)估計(jì)，在德國(guó)平均每五個(gè)人當(dāng)中就有一個(gè)沙門氏菌攜帶者。在美國(guó)，每年報(bào)道大約有40，000例沙門氏菌感染(en.wikipedia. org/wiki/Salmonella#cite_note_2)。因此，迫切需要控制能在家畜和人中引起沙門氏菌病的SE和ST。USDA與FDA的協(xié)作已開發(fā)出了多種能有效預(yù)防沙門氏菌病的策略，所述沙門氏菌病在美國(guó)引起超過(guò)一百萬(wàn)例食物源性疾病。其中，由FDA發(fā)行的決定性條例是降低蛋類的污染。FDA目前需要蛋類生產(chǎn)商在蛋類生產(chǎn)、儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程中定期測(cè)試致病性沙門氏菌。因此，據(jù)估計(jì)每年將避免由污染的蛋類所導(dǎo)致的79，000例病例和30例死亡(Jane Black and Ed 0' Keefe.Overhaul of Food Safety Rules in the Works. Washington Post Staff WritersWednesday, July 8，2009)。在丹麥，從比較生產(chǎn)部門的沙門氏菌控制成本和沙門氏菌病的總體公共健康成本的成本收益分析得到的保守估計(jì)表明，在2001年，沙門氏菌控制措施為丹麥社會(huì)節(jié)省了 1410 萬(wàn)美元(Salmonella control at the source. World HealthOrganization. International Food Safety Authorities Network(INFOSAN) InformationNote No. 03/2007)。同時(shí)，噬菌體是僅感染并破壞細(xì)菌，并且僅能在宿主細(xì)菌內(nèi)進(jìn)行自我復(fù)制的一種特殊類型的病毒。噬菌體由被蛋白質(zhì)外殼包圍的核酸遺傳物質(zhì)(單鏈或雙鏈DNA或RNA形式)構(gòu)成。噬菌體被分成三種基本的結(jié)構(gòu)類型有尾部的二十面體(二十面)頭部、無(wú)尾部的二十面體頭部和絲狀體。根據(jù)其尾部結(jié)構(gòu)，最豐富的具有有尾部的二十面體頭部的噬菌體形式被進(jìn)一步分成肌尾噬菌體科(Myoviridae)、長(zhǎng)尾噬菌體科(Siphoviridae)和短尾噬菌體科(Podoviridae)，其特征分別在于收縮性尾部、非收縮性的長(zhǎng)尾和非收縮性的短尾?？梢愿鶕?jù)其頭部形狀和成分以及外殼的存在將具有無(wú)尾部的二十面體頭部的噬菌體進(jìn)行分組。根據(jù)其大小、形狀、外殼和細(xì)絲(filament)成分對(duì)以DNA為其遺傳物質(zhì)的絲狀噬菌體進(jìn)行分組(H. W. Ackermann. Frequency of morphological phage descriptions in theyear 2000 ；Arch Virol(2001) 146 :843-857 ；Elizabeth Kutter et al.Bacteriophagesbiology and application ；CRC press)。在感染過(guò)程中，噬菌體附著在細(xì)菌上，并將其遺傳物質(zhì)注入到所述細(xì)胞中。之后，噬菌體進(jìn)入裂解性或溶源性周期這兩個(gè)生命周期之一。裂解性噬菌體接管所述細(xì)胞的運(yùn)轉(zhuǎn)以制備噬菌體組分。然后使細(xì)胞破裂或裂解，以釋放新的噬菌體顆粒。溶源性噬菌體將其核酸并入到宿主細(xì)胞的染色體中，將其作為一個(gè)單元進(jìn)行復(fù)制，而不破壞所述細(xì)胞。在某種情況下，溶源性噬菌體可以被誘導(dǎo)進(jìn)入裂解周期(Elizabeth Kutter et al. Bacteriophagesbiology and application ；CRC Press)。在發(fā)現(xiàn)噬菌體后，人們最初對(duì)于其在傳染病治療中的應(yīng)用給予了極大地信心。然而，在廣譜抗生素得到廣泛使用后，噬菌體因由于特異靶標(biāo)譜而被認(rèn)為是不必要的。但是，抗生素的誤用和濫用使得人們對(duì)抗生素耐性和食品中殘留抗生素的不良影響的擔(dān)憂增力口(Cislo，M et al. Bacteriophage treatmentof suppurative skin infections.Arch Immunol. Ther. Exp. 1987. 2 175-183 ；Kimsung-hun et al.，Bacteriophage ；NewAlternative Antibiotics. Biological research information center，(BRIC))。特別地，已知加入到動(dòng)物飼料以促進(jìn)生長(zhǎng)的抗生素類生長(zhǎng)促進(jìn)劑(AGP)誘導(dǎo)抗生素耐性，因此最近提出禁止使用抗生素類生長(zhǎng)促進(jìn)劑(AGP)的禁令。歐盟從2006年開始禁止使用所有抗生素類促生長(zhǎng)劑(AGP)。韓國(guó)從2009年已經(jīng)禁止使用一些AGP，并且正在考慮將來(lái)限制使用所有的AGP。這些逐漸增加的對(duì)抗生素使用的擔(dān)憂已經(jīng)使人們對(duì)作為抗生素替代物的噬菌體的興趣再次興起。在美國(guó)專利第6485902號(hào)中公開了控制大腸桿菌0157:H的7種噬菌體(2002年申請(qǐng)-噬菌體在控制大腸桿菌0157中的用途(Use of bacteriophages forcontrol of Escherichia coli 0157))。在美國(guó)專利第6，942，858號(hào)中公開了用于控制多種微生物的兩種噬菌體(2005年由Nymox申請(qǐng))。許多公司已經(jīng)積極嘗試?yán)檬删w開發(fā)各種產(chǎn)品。BI food system(歐洲)開發(fā)了用于預(yù)防由單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)引起的食物中毒的食品添力卩劑，命名為L(zhǎng)istex-PlOO，這是得到美國(guó)FDA批準(zhǔn)的首個(gè)噬菌體產(chǎn)品。研發(fā)的產(chǎn)品LMP-102也是基于噬菌體的抗單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的食品添加劑，并被批準(zhǔn)GRAS (公認(rèn)安全)級(jí)。在2007年，OmniLytics生產(chǎn)的基于噬菌體的洗劑被開發(fā)用于預(yù)防屠宰過(guò)程中牛肉的大腸桿菌0157污染，并得到美國(guó)農(nóng)業(yè)部(USDA)的食品安全監(jiān)督服務(wù)局(FSIS)的批準(zhǔn)。在歐洲，產(chǎn)胞梭菌(Clostridium sporogenes)噬菌體 NCIMB 30008 和 Clostridium tyrobutiricum 噬菌體 NCIMB 30008 分別在 2003 年和2005年被注冊(cè)為抗梭菌污染的飼料防腐劑。這些研究表明，目前正在對(duì)將噬菌體作為在家畜產(chǎn)品中抗動(dòng)物源性病原體的抗生素進(jìn)行深入的研究。然而，大多數(shù)噬菌體生物控制研究集中在大腸桿菌、李斯特氏菌和梭菌的控制上。沙門氏菌也是動(dòng)物源性病原體，并且由這種病原體引起的損害無(wú)法被降低。如上文所提到的，由于SE和ST表現(xiàn)出多種藥物抗性，因此已在韓國(guó)根據(jù)傳染病預(yù)防法執(zhí)行法令(行政命令 16961) (Enforcement Decree of the Act on the Prevention ofContagious Disease (Executive Order 16961))、傳染病預(yù)防法執(zhí)行條例(健康福利部規(guī)章 179)(Enforcement ordinance of the Act on the Prevention of ContagiousDisease (Ministry of Health and Welfare' s Order 179))以及國(guó)家健康協(xié)會(huì)機(jī)構(gòu)(行政命令 17164) (Organization of the National Institute of Health (Executive Order17164))進(jìn)行全國(guó)范圍內(nèi)的抗微生物抗性監(jiān)視。因此，存在對(duì)用于控制沙門氏菌的噬菌體開發(fā)的需求。
發(fā)明概述技術(shù)問(wèn)題由本發(fā)明人進(jìn)行的對(duì)從天然來(lái)源分離的噬菌體(其感染家禽的病原體——沙門氏菌)的廣泛且深入的研究旨在克服由廣譜抗生素的誤用和濫用而產(chǎn)生的問(wèn)題，如藥物或多種藥物抗性細(xì)菌的出現(xiàn)、藥物殘留等的研究，導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)下述結(jié)果一些分離的噬菌體除了表現(xiàn)出通過(guò)其形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和遺傳學(xué)特征所鑒定的良好的耐酸性、耐熱性和耐干燥性之外，還對(duì)腸炎沙門氏菌(SE)、鼠傷寒沙門氏菌(ST)、雞沙門氏菌(SG)和雞白痢沙門氏菌(SP)具有殺菌活性而不影響益生菌，因此，所述噬菌體可用作用于預(yù)防和治療由腸炎沙門氏菌或鼠傷寒沙門氏菌介導(dǎo)的疾病(如家畜沙門氏菌病和沙門氏菌食物中毒)以及由雞沙門氏菌或雞白痢沙門氏菌介導(dǎo)的疾病(特別是禽傷寒或雞白痢)的組合物的活性成分，從而導(dǎo)致本發(fā)明。此外，本發(fā)明的噬菌體還可以應(yīng)用于各種控制沙門氏細(xì)菌的產(chǎn)品中，包括用于家畜的家畜飼料添加劑、飲用水、消毒劑以及用于肉制品的清潔劑。技術(shù)方案本發(fā)明的一個(gè)目的是提供對(duì)選自以下的一種或多種沙門氏細(xì)菌具有特異殺菌活性的新型噬菌體腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌和雞白痢沙門氏菌。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于預(yù)防和治療由選自以下的一種或多種沙門氏細(xì)菌引起的傳染病的包含噬菌體作為活性成分的組合物腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌和雞白痢沙門氏菌。本發(fā)明的另一個(gè)目的是為家畜提供家畜飼料添加劑和飲用水。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供包含噬菌體作為活性成分的清潔劑或消毒劑。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供利用包含噬菌體作為活性成分的組合物來(lái)預(yù)防或治療由腸炎沙門氏菌或鼠傷寒沙門氏菌引起的沙門氏菌病或沙門氏菌食物中毒的方法。本發(fā)明還提供了用于預(yù)防或治療由雞沙門氏菌或雞白痢沙門氏菌引起的禽傷寒和雞白痢的方法。有益效果本發(fā)明的新型噬菌體除了具有良好的耐酸性、耐熱性和耐干燥性之外，還對(duì)選自以下的一種或多種沙門氏菌菌株具有特異殺菌活性腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌和雞白痢沙門氏菌。因此，本發(fā)明的新型噬菌體可用于控制腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌和雞白痢沙門氏菌，還可用于預(yù)防或治療由腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌或雞白痢沙門氏菌引起的傳染病，包括沙門氏菌病、沙門氏菌食物中毒、禽傷寒和雞白痢。


圖1為C5CJ7的電子顯微鏡照片，其中OCJ7屬于長(zhǎng)尾噬菌體科的形態(tài)型，特征為等軸衣殼(isometric capsid)和非收縮性長(zhǎng)尾；圖2是展示沙門氏菌菌苔中形成OCJ7噬菌斑的圖片A =SE菌苔；B =ST菌苔；C SG菌苔；D =SP菌苔；E =SA菌苔；F =SB菌苔；G :SC菌苔；H :SD菌苔。在SE、ST、SG和SP菌苔中形成了噬菌斑，但在SA、SB、SC和SD菌苔中沒有形成噬菌斑；圖3為所分離的噬菌體OCJ7的SDS-PAGE結(jié)果，其中顯示了所述噬菌體的蛋白圖譜，包括38kDa、63kDa、52kDa和12kDa的主要蛋白(參見作為標(biāo)志物的藍(lán)色plus 2預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)物(Invitrogen))；圖4為為所分離的噬菌體OCJ7的PFGE結(jié)果，其顯示全基因組大小約為39. 2至44. Ilibp (使用5kbp DNA大小標(biāo)準(zhǔn)物(Bio-rad)作為大小標(biāo)志物)；圖5是利用OCJ7基因組DNA的每個(gè)引物集所進(jìn)行的PCR的結(jié)果A 引物集SEQID NO. 5和6 ;Β:引物集SEQ ID NO. 7和8 ;C 引物集SEQ ID NO. 9和10 ；以及D 引物集SEQ ID NO. 11和12。所有PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度均為500bp-3kbp ；圖6為噬菌體ΦCJ7的耐酸性測(cè)定結(jié)果，顯示噬菌體在pH 2. 1、2. 5、3. O、3. 5、4. O、5. 5、6. 4、6. 9、7. 4、8. 0、9. 0、9. 8和11. O時(shí)存活噬菌體的數(shù)量。與對(duì)照相比，噬菌體。CJ7直到pH 3. O時(shí)都沒有喪失其活性，但在pH 2. 5時(shí)完全喪失其活性；圖7為噬菌體OCJ7的耐熱性測(cè)定結(jié)果，表明在37、45、53、60、70和80°C持續(xù)0、10、30、60、120分鐘時(shí)存活噬菌體的數(shù)量。即便在70°C長(zhǎng)達(dá)2小時(shí)后噬菌體OCJ7依然保持其活性，當(dāng)在80°C暴露10分鐘后其活性略有下降，當(dāng)暴露更長(zhǎng)時(shí)間時(shí)，其活性完全喪失；圖8為在加速干燥器(Lab Plant)的幫助下，噬菌體OCJ7的耐干燥性測(cè)定的結(jié)果，其中，當(dāng)測(cè)量干燥條件下滴度的變化并與干燥前的滴度相比時(shí)，活性100%維持；圖9是用噬菌體OCJ7給藥后1、3、7、10和14天和給藥前，所繪制的大鼠體重與時(shí)間的圖像，表明與對(duì)照相比，沒有發(fā)現(xiàn)體重有顯著的改變(■；雄性對(duì)照、口 ；給予OCJ7的雄性試驗(yàn)組、·；雌性對(duì)照、〇；給予。CJ7的雌性試驗(yàn)組)；以及圖10展示了 Φ 7的消毒效應(yīng)。觀察到在普通水、有機(jī)稀釋液和普通水+20%乳中的所有條件下都是有效的。特別地，在用Φ 7處理后2. 5小時(shí)獲得最高效應(yīng)。商購(gòu)產(chǎn)品Harasol (Yuhan Corporation,Korea)作為陽(yáng)性對(duì)照，在普通水條件下展現(xiàn)了良好的效應(yīng)，但是對(duì)有機(jī)稀釋液沒有效應(yīng)，并且在普通水+20%乳的條件下，效應(yīng)大幅降低(■；對(duì)照普通水、口 ；對(duì)照有機(jī)稀釋液、；對(duì)照普通水+乳20%、· ； c5CJ7普通水、〇；C5CJ7有機(jī)稀釋液、；OCJ7普通水+乳〗()％、▲ ；Harasol普通水、Δ ；Harasol有機(jī)稀釋液、；Harasol普通水+乳20% )。本發(fā)明的最佳實(shí)施方式一方面，本發(fā)明涉及對(duì)腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌或雞白痢沙門氏菌具有特異殺菌活性的新型噬菌體。本發(fā)明的噬菌體屬于長(zhǎng)尾噬菌體科的Bl形態(tài)型，其具有由等軸衣殼和非收縮性長(zhǎng)尾組成的形態(tài)結(jié)構(gòu)，并且特征為全基因組大小為38-451Λρ，主要結(jié)構(gòu)蛋白的大小范圍為37-40kDa、62-65kDa、51-54kDa 和 10_13kDa。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的噬菌體表現(xiàn)出僅特異地感染腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌或雞白痢沙門氏菌的種特異性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的噬菌體的全基因組大小為大約38-451Λρ，且優(yōu)選大約39. 2-44. ΙΙΛρ。此外，所述噬菌體可以含有作為其基因組一部分的選自SEQ ID NO. 1至4的一種或多種核酸分子。優(yōu)選地，所述噬菌體含有作為其基因組一部分的由SEQ ID NO. 1至4組成的核酸分子。當(dāng)在存在選自 SEQ ID N0. 5 禾口 6、SEQ ID N0. 7 禾口 8、SEQ ID N0. 9 禾口 10 以及 SEQID NO. 11和12的引物集集的條件下，利用本發(fā)明噬菌體的基因組作為模板進(jìn)行PCR時(shí)，每種PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度為500bp-31Ap。優(yōu)選地，當(dāng)在分別存在上述引物集的條件下進(jìn)行PCR時(shí)，每種PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度為500bp-31ibp。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“核酸分子”意圖包括DNA(gDNA和cDNA)和RNA分子。當(dāng)與作為核酸的結(jié)構(gòu)單元結(jié)合起來(lái)時(shí)，術(shù)語(yǔ)“核苷酸”包括天然核苷酸及其糖或堿基被修飾的類似物。本發(fā)明噬菌體的結(jié)構(gòu)蛋白的大小范圍為37-40kDa、62-65kDa、51_54kDa和10-13kDa。且優(yōu)選與各自大約38kDa、63kDa、52kDa和12kDa的大小相對(duì)應(yīng)。此外，本發(fā)明的噬菌體具有耐酸、耐熱和耐干燥的生化特性。具體而言，本發(fā)明的噬菌體具有良好的耐酸性和耐熱性，使得其可以在3. 0-11. 0的寬范圍PH和37°C -70°C的熱范圍中存活。就其耐干燥性而言，所述噬菌體即使在120°C /70°C的高溫和干燥條件下仍能保持活性。歸因于其耐酸性、耐熱性和耐干燥性的優(yōu)越性，本發(fā)明的噬菌體可以在寬范圍的溫度和PH下使用，發(fā)現(xiàn)在用于預(yù)防和治療家畜疾病和家畜介導(dǎo)的人類疾病的組合物和產(chǎn)品中的應(yīng)用。將從雞屠宰場(chǎng)的污水樣品分離的，并鑒定為具有對(duì)SG、SP、ST和SE的特異殺菌活性和上述性質(zhì)的本發(fā)明噬菌體，命名為噬菌體OCJ7，并于2009年8月14日保藏在韓國(guó)微生物培養(yǎng)中心(361-221，Honje 1，Seodaemun，Seoul)，保藏號(hào)為 KCCMl 1030Ρ。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，從雞屠宰場(chǎng)收集污水樣品，并用以從其分離能裂解宿主細(xì)胞SE的噬菌體。還發(fā)現(xiàn)它們能裂解SG、SP和ST(圖2和表1)。在電子顯微鏡下的形態(tài)觀察證實(shí)，所述噬菌體(Φ 7)屬于長(zhǎng)尾噬菌體科的Bl形態(tài)型(圖1)。通過(guò)蛋白圖譜分析測(cè)量，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的噬菌體Φ CJ7的結(jié)構(gòu)蛋白為約38kDa、63kDa、52kDa 和 12kDa(圖 3)。此外，基因組分析顯示，OCJ7的全基因組大小約為44. 1-39. Ikbp (圖4)，并且其中并入了 SEQ ID NO. 1至4的核酸分子(實(shí)施例6)。此外，通過(guò)與其它種類的遺傳相似性比較測(cè)量，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的噬菌體與已知噬菌體的遺傳相似性非常低，這表明本發(fā)明的噬菌體是新型噬菌體(表2)。更具體而言，當(dāng)利用為OCJ7設(shè)計(jì)的引物集SEQ ID N0.5和6、SEQID NO. 7和8,SEQ ID NO. 9禾口 10以及SEQ ID NO. 11禾口 12進(jìn)行PCR時(shí)，所得到的PCR產(chǎn)物的大小為500bp-3kbp (圖5)。此外，觀察到由OCJ7感染SE、ST、SG和SP所得到的噬菌斑(一個(gè)噬菌體對(duì)宿主細(xì)胞裂解而在軟瓊脂上產(chǎn)生的清澈區(qū)域)具有相同的大小和濁度(圖2)。檢測(cè)c5CJ7在寬范圍的pH、溫度和干燥下的穩(wěn)定性。觀察到所述噬菌體能在3. 0至11.0的PH范圍(圖6)以及37°C至70°C的溫度范圍下(圖7)存活，并且甚至在高溫干燥后仍能穩(wěn)定存活(120°C /70°C )(圖8)。此外，還發(fā)現(xiàn)野生型菌株SE、ST、SG和SP也落入OCJ7的宿主范圍內(nèi)(表3)。當(dāng)用Φ 7進(jìn)行口服給藥時(shí)，觀察到大鼠在體重(圖9)、死亡率、全身癥狀(表4)和器官異常(表幻上保持不變。此外，清潔測(cè)定表明，當(dāng)用于畜牧場(chǎng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)噬菌體Φ 7可有效控制沙門氏菌(表7)，并且與作為陽(yáng)性對(duì)照的傳統(tǒng)清潔劑相比，在多種條件下對(duì)沙門氏菌菌株具有良好且一致的殺菌活性(表7)。這些數(shù)據(jù)表明，可以將本發(fā)明的噬菌體Φ 7應(yīng)用于各種用于控制沙門氏細(xì)菌的產(chǎn)品中。另一方面，本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療由選自以下的一種或多種沙門氏細(xì)菌引起的傳染病的包含噬菌體作為活性成分的組合物腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌和雞白痢沙門氏菌。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物可以含有抗生素。本發(fā)明的噬菌體對(duì)腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌和雞白痢沙門氏菌具有特異殺菌活性，因此可以用于預(yù)防或治療由這些細(xì)菌引起的疾病的目的。優(yōu)選地，所述傳染病的實(shí)例包括由腸炎沙門氏菌或鼠傷寒沙門氏菌引起的沙門氏菌病和沙門氏菌食物中毒、由雞沙門氏菌引起的禽傷寒以及由雞白痢沙門氏菌引起的雞白痢，但并非受限于此。本文使用的術(shù)語(yǔ)“沙門氏菌病”指沙門氏菌感染后的癥狀，如發(fā)燒、頭痛、腹瀉和嘔吐。也就是說(shuō)，沙門氏菌病是感染了沙門氏菌屬的細(xì)菌，并伴隨兩種代表性的癥狀敗血癥如傷寒發(fā)燒；以及急性腸胃炎，如食物中毒、腸炎和急性bactereria。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“預(yù)防”是指包括通過(guò)給予所述組合物來(lái)抑制或延遲所述疾病的所有行為。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“治療”是指包括通過(guò)給予所述組合物而使所述疾病好轉(zhuǎn)或有所改善的所有行為。本發(fā)明的組合物包含^d02-^cl012pfu/ml 的 OCJ7，優(yōu)選為 lxl06-lxl01Qpfu/ml。本發(fā)明的組合物還可以進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體，并可以與所述載體一起配制進(jìn)食品、藥物和飼料添加劑。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”指不對(duì)生物體造成顯著刺激且不消除所給予的活性組分的生物活性和特性的載體或稀釋劑。為了將所述組合物配制成液體制劑，藥學(xué)上可接受的載體必須適于無(wú)菌和生物相容性。實(shí)例包括鹽水、無(wú)菌水、Ringer’s溶液、緩沖生理鹽水、白蛋白輸注液、葡萄糖溶液、麥芽糖糊精溶液、甘油和乙醇。它們可以單獨(dú)使用或以其任意組合使用。如果需要，可以加入其它常規(guī)添加劑，例如抗氧化劑、緩沖劑和抑菌劑等。當(dāng)還與稀釋劑、分散劑、表面活性劑、粘合劑和/或潤(rùn)滑劑組合時(shí)，還可以將本發(fā)明的組合物制備成注射劑(例如水性溶液、懸浮液和乳液)，或者丸劑、膠囊、粒劑或片劑?？梢酝ㄟ^(guò)包被或噴射將本發(fā)明的預(yù)防性或治療性組合物局部施用于受影響的區(qū)域?？蛇x擇地，可以通過(guò)口服或腸胃外途徑給予本發(fā)明的組合物?？捎玫哪c胃外途徑為靜脈內(nèi)給藥、腹膜內(nèi)給藥、肌內(nèi)給藥、皮下給藥或外用給藥。根據(jù)包括劑型，給藥方式，待治療的患者或動(dòng)物的年齡、體重、性別、狀態(tài)和飲食，給藥時(shí)間，給藥途徑，排泄速率以及應(yīng)答敏感度的多種因素，當(dāng)施用、噴射或給予時(shí)，本發(fā)明組合物的合適劑量可以不同。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，當(dāng)給予患者藥物組合物時(shí)，主治醫(yī)生或獸醫(yī)通過(guò)適當(dāng)?shù)尼t(yī)學(xué)判斷可以確定合適的單日總劑量。本發(fā)明組合物的口服劑型可以采用片劑、錠劑(troches)、糖錠(lozenges)、水懸液或乳懸液、散劑或粒劑、乳劑、硬膠囊或軟膠囊、糖漿或酏劑的形式。諸如片劑和膠囊的口服劑量形式可以包含粘合劑，例如乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、支鏈淀粉、纖維素或明膠；賦形劑，例如磷酸二鈣；崩解劑，例如玉米淀粉或甘薯淀粉；潤(rùn)滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂酰延胡索酸鈉或聚乙二醇蠟。對(duì)于膠囊，還可以進(jìn)一步使用諸如脂質(zhì)的液體載體。對(duì)于非口服給藥，可以將本發(fā)明的組合物配制成用于經(jīng)皮下、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)途徑施用的注射劑，配制成栓劑，或經(jīng)呼吸道施用的噴霧吸入劑，例如氣霧劑?？梢酝ㄟ^(guò)將本發(fā)明的組合物與穩(wěn)定劑或緩沖劑一起溶解或懸浮在水中，并將所述溶液或懸浮液分裝在安瓿或單位小瓶中來(lái)制備注射劑形式。對(duì)于噴劑，例如氣霧劑，可以將用于噴射水分散濃縮物或濕粉末的推進(jìn)劑與添加劑組合使用。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“抗生素”是指可給予動(dòng)物以殺滅細(xì)菌或抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的物質(zhì)或化合物，并且意圖包括防腐劑、殺菌劑和抗菌劑。所述動(dòng)物是包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物。歸因于比傳統(tǒng)抗生素具有更高的沙門氏菌特異性，本發(fā)明的噬菌體可以殺滅特定病原體而不影響益生菌。此外，本發(fā)明的噬菌體不誘導(dǎo)藥物抗性，使其作為具有長(zhǎng)生命周期的新型抗生素來(lái)提供。根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及包含噬菌體作為活性成分的動(dòng)物飼料或飲用水。用于漁業(yè)和家畜產(chǎn)業(yè)的飼料添加劑抗生素意圖預(yù)防感染。然而，當(dāng)前大多數(shù)可用的飼料添加劑抗生素都是有問(wèn)題的，原因在于它們都傾向于誘導(dǎo)抗性菌株的出現(xiàn)，并且由于它們保留在家畜產(chǎn)品中而可以轉(zhuǎn)移至人。攝取這種殘余的抗生素可能使得人類病原體對(duì)抗生素產(chǎn)生抗性，并導(dǎo)致疾病的傳播。此外，常與動(dòng)物飼料組合使用的多種飼料添加劑抗生素可能會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)抗多種藥物的菌株。因此，本發(fā)明的噬菌體可用作飼料添加劑抗生素，其是足夠環(huán)境友好的而成為對(duì)該問(wèn)題的解決方案?？梢酝ㄟ^(guò)向動(dòng)物飼料直接添加噬菌體或以單獨(dú)的飼料添加劑的形式來(lái)制備本發(fā)明的動(dòng)物飼料。在動(dòng)物飼料中，本發(fā)明的噬菌體可以采用液體或干燥形式，優(yōu)選以干粉形式存在。為此，本發(fā)明的噬菌體可以通過(guò)風(fēng)干、自然干燥、噴霧干燥或凍干而進(jìn)行干燥，但這些干燥方法并非限制本發(fā)明?；趧?dòng)物飼料的總重量，可以以粉末的形式添加0. 05-10重量％，優(yōu)選0. 1-2重量％的本發(fā)明噬菌體。除了本發(fā)明的噬菌體之外，所述動(dòng)物飼料還可以包含用于使其長(zhǎng)期保存的其它傳統(tǒng)添加劑?？梢韵虮景l(fā)明的飼料添加劑添加另一種非病原性微生物?？衫玫钠渌⑸锟梢赃x自能夠產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶和轉(zhuǎn)化酶的枯草桿菌(Bacillus subtilis)；能夠在厭氧條件下如牛胃中發(fā)揮生理活性和分解功能的乳酸桿菌(LactcAacillus sp.)菌株；絲狀真菌，包括能增加馴養(yǎng)動(dòng)物的體重、提高乳產(chǎn)量并幫助飼料消化和吸收的米曲霉(Aspergillus oryzae) (J Animal Sci 43 :910-擬6，1976)；以及酵母，包括啤酒酵母(Saccharomyce scerevisiae)(JAnimSci56 :735-739,1983)。本發(fā)明的包含Φ 7的動(dòng)物飼料可以包括基于植物的飼料，例如谷物、堅(jiān)果、食品副產(chǎn)物、海草、纖維、藥物副產(chǎn)物、油、淀粉、粗粉和谷物副產(chǎn)物；基于動(dòng)物的飼料，例如蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、脂肪、單細(xì)胞蛋白質(zhì)、浮游動(dòng)物和食品廢料，但并不限于此。本發(fā)明的包含Φ 7的飼料添加劑可以包含用于防止質(zhì)量退化的添加劑，例如粘合劑、乳化劑、防腐劑；以及用于提高功效的添加劑，例如氨基酸、維生素、酶、益生菌、調(diào)味劑、非蛋白氮、硅酸鹽(酯)、緩沖劑、著色劑、提取物和寡糖，但并不限于此。當(dāng)提供含有本發(fā)明噬菌體的飲用水時(shí)，家畜腸內(nèi)的沙門氏細(xì)菌群可被持續(xù)減少。由此可以產(chǎn)生不含沙門氏菌的家畜。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及包含噬菌體作為活性成分的清潔劑或消毒劑。包含噬菌體作為活性成分的消毒劑對(duì)于食品衛(wèi)生學(xué)，例如針對(duì)食物中毒是非常有用的。具體而言，所述消毒劑不僅可以用作用來(lái)預(yù)防沙門氏菌污染的試劑或食品添加劑，而且還可以用來(lái)產(chǎn)生不含沙門氏菌的家畜。為了除去沙門氏菌，還可以將所述消毒劑噴射到生活污物上以及施用到家畜舍、屠宰場(chǎng)、污染區(qū)域(家畜死掉、制備飼料的地方和制備飼料的設(shè)施)以及家禽活動(dòng)的任何區(qū)域上。此外，包含噬菌體作為活性成分的清潔劑可以用在活家禽的已經(jīng)受沙門氏菌污染的身體部分，如皮膚、羽毛等。另一方面，本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌或雞白痢沙門氏菌介導(dǎo)的傳染病的方法，所述方法包括將噬菌體給予有需要的動(dòng)物，所述噬菌體對(duì)腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌或雞白痢沙門氏菌具有特異殺菌活性。另一方面，本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌或雞白痢沙門氏菌介導(dǎo)的傳染病的方法，所述方法包括將組合物給予有需要的動(dòng)物，所述組合物用于預(yù)防或治療腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌或雞白痢沙門氏菌介導(dǎo)的疾病。可以將本發(fā)明的組合物以藥物制劑的形式給予動(dòng)物或者可以作為與動(dòng)物飼料或飲用水的混合物被動(dòng)物攝取，且優(yōu)選作為與動(dòng)物飼料的混合物來(lái)給予。在本發(fā)明中，所述動(dòng)物包括牛、豬、雞、家禽和人，但并不限于此。只要能到達(dá)靶組織，本發(fā)明組合物的給藥可以采用任何途徑，口服或腸胃外，具體而言，可以經(jīng)由口服、經(jīng)直腸、外用、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、透皮、鼻內(nèi)和吸入途徑來(lái)給予本發(fā)明的組合物。本發(fā)明的治療疾病的方法包括給予治療有效量的本發(fā)明組合物。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，主治醫(yī)生或獸醫(yī)通過(guò)適當(dāng)?shù)尼t(yī)學(xué)判斷可以確定單日總劑量。對(duì)于指定患者來(lái)說(shuō)，治療有效量可能根據(jù)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域熟知的各種因素而變化，包括要獲得的應(yīng)答的種類和程度，患者的年齡、體重、健康狀況、性別和飲食，給藥時(shí)間和途徑，組合物的分泌率，治療時(shí)間周期，根據(jù)是否使用其它試劑的具體組合物等。通過(guò)以下實(shí)施例可以更好地理解本發(fā)明，以下所示的實(shí)施例是用于說(shuō)明，而不應(yīng)當(dāng)被解釋為限制本發(fā)明。發(fā)明的實(shí)施方式 實(shí)施例1 沙門氏菌噬菌體的分離1-1.噬菌體的篩選和單噬菌體的分離將來(lái)自雞屠宰場(chǎng)和附近的污水處理場(chǎng)的50ml的每種樣品轉(zhuǎn)移到離心管中，并以4000rpm離心10分鐘。隨后，利用0. 45 μ m濾器過(guò)濾上清。將18ml樣品濾液與150 μ 1腸炎沙門氏菌(下文稱為“Se”)振蕩培養(yǎng)基(od6tltl = 2)和anl的ioxluria-bertani培養(yǎng)基(下文稱為lb培養(yǎng)基)，蛋白胨10g、酵母提取物5g、nacl 10g，終體積為1l)混合。將混合物在37°c培養(yǎng)18小時(shí)，并將培養(yǎng)液以4000rpm離心10分鐘，之后利用0. 2 μ m濾器過(guò)濾上清。另外，將3ml 0. 7%瓊脂(w/v)和150 μ 1 SE振蕩培養(yǎng)基(od600 = 2)的混合物倒在lb平板上，并允許其凝固。在該平板上涂布10 μ 1培養(yǎng)物濾液，并在37°c培養(yǎng)18小時(shí)(將0.7%的瓊脂用作“上層瓊脂”，并在所述上層瓊脂上進(jìn)行噬菌體裂解物的滴定，稱為軟瓊脂覆層法)。將包含噬菌體裂解物的樣品培養(yǎng)基的稀釋液與150 μ 1 SE振蕩培養(yǎng)基(0D_ =2)混合，隨后進(jìn)行軟瓊脂覆層測(cè)定，從而獲得單個(gè)噬菌斑。由于單個(gè)噬菌斑由相同的噬菌體組成，所以取一個(gè)噬菌斑，并將其溶解于400 μ 1 SM溶液(NaCl，5. 8g ；MgSO4 · 7H20,0. 2g ；IM Tris-Cl (pH7. 5), 50ml ;H20，終體積為1L)中，在室溫下靜置4小時(shí)，以分離單噬菌體。為了擴(kuò)增分離的噬菌體，從所述單噬菌體溶液中取出ΙΟΟμΙ上清，并與12ml0.7%瓊脂和500 μ 1 SE振蕩培養(yǎng)基混合，隨后在LB平板(直徑為150mm)上進(jìn)行軟瓊脂覆層測(cè)定。當(dāng)裂解完成后，向平板中倒入15ml SM溶液，之后將平板在室溫下溫和振蕩4小時(shí)，以從上層瓊脂中洗脫噬菌體?；厥瞻疵摰氖删w的SM溶液，并加入終體積的的氯仿，均勻混合10分鐘。在4000rpm下離心10分鐘后，利用0. 2 μ m濾器過(guò)濾所獲得的上清，并貯存在冰箱中直到使用。1-2.噬菌體的大規(guī)模培養(yǎng)利用SE大量培養(yǎng)所選擇的噬菌體。振蕩培養(yǎng)SEJf 1.5X IOltlCfu(集落形成單位)的等分試樣在4000rpm離心10分鐘，隨后將沉淀重懸在細(xì)1 SM溶液中。在其中接種7. 5X l(fpfu (噬菌斑形成單位)的噬菌體(Μ0Ι (感染倍數(shù))為0. 005)，在37°C靜置20分鐘。將所述溶液接種到搖瓶中的150ml LB培養(yǎng)基中，并于37°C孵育5小時(shí)。加入終體積的1 %的氯仿，并將培養(yǎng)溶液振蕩20分鐘。加入終濃度分別為1 μ g/ml的DNase I和RNaseA0將溶液在37°C靜置30分鐘。加入終濃度分別為IM和10% (w/v)的NaCl和PEG(聚乙二醇)，并在4°C再靜置3小時(shí)。將所述溶液在4°C以12000rpm離心20分鐘，舍棄上清。將沉淀重懸在5ml SM溶液中，在室溫下靜置20分鐘，并與細(xì)1氯仿均勻混合。在4°C以4000rpm離心20分鐘之后，利用0. 2 μ m濾器過(guò)濾上清，并利用甘油密度梯度進(jìn)行超離心(密度40%，5%甘油在4°〇以35，000印111離心1小時(shí))以純化OCJ7。將純化的OCJ7重懸在300 μ 1 SM溶液中，隨后進(jìn)行滴定，將Φ CJ7于2009年8月14日保藏在韓國(guó)微生物培養(yǎng)中心(361-221，Honje 1，Seodaemun, Seoul)，保藏號(hào)為 KCCMl 1030P。實(shí)施例2 檢測(cè)Φ CJ7對(duì)沙門氏菌的感染為了分析所選噬菌體對(duì)SE之外的沙門氏菌種的裂解活性，利用其它沙門氏菌種進(jìn)行了交叉感染的試驗(yàn)。結(jié)果。CJ7沒有感染SC(豬霍亂沙門氏菌)、SD(德爾卑沙門氏菌)、SA(亞利桑那沙門氏菌(Salmonella arizonae))和SB (邦戈?duì)柹抽T氏菌(Salmonellabongori))，但是感染了 SE (腸炎沙門氏菌)、ST (鼠傷寒沙門氏菌)、SG (雞沙門氏菌)和SP(雞白痢沙門氏菌)(參見實(shí)施例11)。所述結(jié)果總結(jié)于下表1中，并在圖2中展示。表1 Φ CJ7對(duì)沙門氏菌的感染
權(quán)利要求
1.分離的噬菌體，其屬于長(zhǎng)尾噬菌體科的Bl形態(tài)型，對(duì)選自以下的一種或多種沙門氏菌(Salmonella)具有特異殺菌活性腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella Typhimurium)、雞沙門氏菌(Salmonella Gallinarum)禾口雞白病沙門氏菌(Salmonella pullorum)，并通過(guò)以下特征之一來(lái)表征1)所述噬菌體全基因組大小為38-451Λ；2)所述噬菌體含有選自SEQID NO. 1至4中至少一個(gè)核酸序列作為其基因組的一部分；以及3)所述噬菌體的結(jié)構(gòu)蛋白大小范圍為37-40kDa、62-65kDa、51-54kDa和10_13kDa。
2.如權(quán)利要求1所述的噬菌體，其具有由等軸衣殼和非收縮性長(zhǎng)尾組成的形態(tài)結(jié)構(gòu)。
3.如權(quán)利要求1所述的噬菌體，其中在選自SEQID NO. 5和6、SEQ ID NO. 7和8、SEQID NO. 9和10以及SEQ ID NO. 11和12的引物集的存在下，利用所述噬菌體的基因組作為模板進(jìn)行PCR，每種PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度為500bp-31ibp。
4.如權(quán)利要求1所述的噬菌體，其表現(xiàn)出以下特性中的至少一種1)對(duì)pH3. 0至pH 11. 0的耐性；2)對(duì)37°C至70°C的熱范圍的耐性；3)對(duì)120°C/70°C條件下干燥的耐性。
5.如權(quán)利要求1所述的噬菌體，其由登錄號(hào)KCCMl1030P來(lái)識(shí)別。
6.用于預(yù)防或治療由選自以下的一種或多種沙門氏菌菌株引起的傳染病的組合物腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella Typhimurium)、雞沙門氏菌(Salmonella Gallinarum)和雞白痢沙門氏菌(Salmonella pullorum)，其包含權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的噬菌體作為活性成分。
7.如權(quán)利要求6所述的組合物，其中，所述傳染病為由腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)或鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella Typhimurium)引起的沙門氏菌病和沙門氏菌食物中毒、由雞沙門氏菌(Salmonella Gallinarum)弓丨起的禽傷寒以及由雞白痢沙門氏菌(Salmonella pullorum)弓丨起的雞白痢。
8.如權(quán)利要求6所述的組合物，其被用作抗生素。
9.動(dòng)物飼料或飲用水，其包含權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的噬菌體作為活性成分。
10.消毒劑或清潔劑，其包含權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的噬菌體作為活性成分。
11.用于預(yù)防或治療由選自以下的一種或多種沙門氏菌菌株引起的傳染病的方法腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella Typhimurium)、雞沙門氏菌(Salmonella Gallinarum)和雞白痢沙門氏菌(Salmonella pullorum)，其包括給予有需要的動(dòng)物權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的噬菌體。
12.用于預(yù)防或治療由選自以下的一種或多種沙門氏菌菌株引起的傳染病的方法腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella Typhimurium)、雞沙門氏菌(Salmonella Gallinarum)和雞白痢沙門氏菌(Salmonella pullorum)，其包括給予有需要的動(dòng)物權(quán)利要求6所述的噬菌體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種對(duì)選自以下的一種或多種沙門氏(Salmonella)細(xì)菌具有特異殺菌活性而不影響益生菌的新型噬菌體腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella Typhimurium)、雞沙門氏菌(Salmonella Gallinarum)和雞白痢沙門氏菌(Salmonella pullorum)。還公開了用于預(yù)防和治療由腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌或雞白痢沙門氏菌所引起的傳染病或用于控制沙門氏菌的組合物、動(dòng)物飼料或飲用水、清潔劑以及消毒劑，所述傳染病包括沙門氏菌病、沙門氏菌食物中毒、禽傷寒以及雞白痢。
文檔編號(hào)A61K38/17GK102596219SQ201080042733
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2010年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月3日
發(fā)明者姜寅惠, 崔秀真, 崔香, 樸敏兌, 申秀安, 趙英郁 申請(qǐng)人:Cj第一制糖株式會(huì)社