專(zhuān)利名稱(chēng)：滅活水蛭提取物不希望的污染的方法
滅活水蛭提取物不希望的污染的方法本發(fā)明涉及利用電磁輻射來(lái)滅活病毒和/或細(xì)菌領(lǐng)域。本發(fā)明提供滅活水蛭提取物(Blutegelextrakt)中病毒和/或細(xì)菌的方法。水蛭(Blutgel )自古便被用于醫(yī)學(xué)治療。早在古希臘和特別在中世紀(jì)時(shí)，水蛭大的血液吸收量就被用于從身體中醫(yī)用取血(放血)。19世紀(jì)初，具有抗凝血作用的水蛭提取物在市場(chǎng)中出現(xiàn)。1955年一種被稱(chēng)為水蛭素(Hirudin)的多肽首次從水蛭中提取出來(lái)。水蛭素結(jié)合在凝血酶的纖維蛋白原結(jié)合位點(diǎn)，并通過(guò)末梢(Auslaufer )來(lái)抑制活性中心,從而阻止凝血酶的作用。下面的出版物給出了水蛭提取物和水蛭素的歷史綜述Nowak, G. & Schror, K.(2007) : Hirudin _ the long and stony way from an anticoagulant peptide in thesaliva of medicinal leech to a recombinant drug and beyond. A historical piece'Thromb. Haemost.第 98 卷，116 - 119 頁(yè)。為獲取有治療作用的水蛭物質(zhì)，將冷凍的水蛭(比如歐洲醫(yī)蛭(Hirudomedicinalis)、側(cè)紋醫(yī)蛭(Hirudo verbana)及其相關(guān)物種)或者其組成部分機(jī)械粉碎并均質(zhì)化。以多級(jí)提取和純化工藝可以獲得活性成分，所述活性成分比如可以用在用于治療靜脈機(jī)能不全和急性痔瘡的軟膏。由于水蛭提取物是來(lái)自于天然原材料源的產(chǎn)品，因此確保避免不希望的污染物如細(xì)菌或者病毒尤為重要。在實(shí)施病毒安全計(jì)劃時(shí)，明確規(guī)定使用互補(bǔ)的，即作用機(jī)理互為補(bǔ)充白勺技術(shù)(見(jiàn)例如 Guideline Q5A, International Conference on Harmonisation ofTechnical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH))(Q5A準(zhǔn)則-人用藥物注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議(ICH)))。借此應(yīng)確保覆蓋廣譜病毒。已確立的用于滅活細(xì)菌以及大包膜病毒的方法為酸處理、用有機(jī)溶劑處理、用洗滌劑處理和巴氏殺菌，這些方法可以單獨(dú)使用或者優(yōu)選組合使用。對(duì)于小的無(wú)包膜的病毒，例如細(xì)小病毒，上述方法卻是無(wú)效的。一種貧化小型無(wú)包膜病毒的方法是納濾法。這里利用尺寸排阻法進(jìn)行分離濾膜可靠地截留尺寸在給定的保留率之內(nèi)的病毒。但是納濾法存在一個(gè)問(wèn)題，即那些小的無(wú)包膜的病毒可能具有和希望的治療物質(zhì)相仿的尺寸。因此，不可能可靠地過(guò)濾掉病原體，而不過(guò)濾掉蛋白質(zhì)。結(jié)果是增加的不可接受的產(chǎn)品損失，而這導(dǎo)致了不再經(jīng)濟(jì)的方法。在一些研究中表明，在鈉濾水蛭提取物時(shí)，單位膜面積所能達(dá)到的流率極低。同時(shí)，在很短的處理時(shí)間后，就出現(xiàn)過(guò)濾器表面的堵塞。這種堵塞是不可逆的。該過(guò)濾器不能通過(guò)常規(guī)的方法(比如反沖洗)再恢復(fù)到有效狀態(tài)。由于納濾效率非常低下，而同時(shí)濾膜單元的成本又高，因此在制藥生產(chǎn)中，對(duì)于經(jīng)濟(jì)應(yīng)用而言不考慮利用納濾工藝貧化水蛭提取物的病毒。另一個(gè)滅活病毒的方法是利用紫外線照射(UV-照射)。這種方法特別的挑戰(zhàn)在于均勻照射有待處理的介質(zhì)。目的是可靠而基本上殺死微生物和/或病毒，同時(shí)基本保留敏感的活性成分。尤其來(lái)自于天然原料源的產(chǎn)品具有復(fù)雜、多樣的組成。一般情況下，產(chǎn)品的不同成分對(duì)紫外線照射顯示出不同的穩(wěn)定性。這使得在滅活病毒和保持產(chǎn)品質(zhì)量之間難于找到折衷。產(chǎn)品保護(hù)的一個(gè)重要準(zhǔn)則是縮短產(chǎn)品在輻照區(qū)的產(chǎn)品時(shí)間。由于所需的平均處理時(shí)間由最快通過(guò)輻照區(qū)的顆粒來(lái)決定，因此為縮短處理時(shí)間，就要求產(chǎn)品流內(nèi)有盡可能一致的停留時(shí)間分布。使用用于對(duì)流體介質(zhì)進(jìn)行紫外線照射的反應(yīng)器時(shí)，將出現(xiàn)這樣的問(wèn)題，隨著距輻射源的距離增加，有待處理的介質(zhì)中的輻射強(qiáng)度呈指數(shù)性下降。因此，距離輻照源比較遠(yuǎn)的微生物和病毒比較慢地或者根本不再被殺死。而隨著介質(zhì)的光吸收量的增加而明顯增強(qiáng)的效果，按照迄今的現(xiàn)有技術(shù)，導(dǎo)致使用非常大的輻照表面，比如例如在薄層反應(yīng)器中所見(jiàn)。而這種現(xiàn)有的薄層反應(yīng)器只能困難地轉(zhuǎn)為工業(yè)規(guī)模，因?yàn)樵跀U(kuò)大規(guī)模時(shí)，只能通過(guò)按生產(chǎn)量成比例擴(kuò)大直徑來(lái)實(shí)現(xiàn)保持恒定 的薄層厚度，在工業(yè)規(guī)模中這導(dǎo)致不再可操作的大型反應(yīng)器。另外一個(gè)不利影響由液體膜的不適宜的停留時(shí)間行為造成，由于大多情況下紫外輻照射入反應(yīng)介質(zhì)的穿透深度很淺，所述液體膜必需非常薄而且因此層流流動(dòng)，在層流流動(dòng)情況下在橫切于主要流向沒(méi)有交換。靠近壁的層，由于線性降低直至到壁為零的流速剖面，其停留時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)長(zhǎng)于距離壁遠(yuǎn)的層。為了在快速流動(dòng)的、距管壁較遠(yuǎn)的流體層也能實(shí)現(xiàn)用于殺滅所需的最小輻射劑量，必須提高膜的平均停留時(shí)間。但是這樣做又導(dǎo)致輻射負(fù)荷提高，從而導(dǎo)致產(chǎn)品更大的損害。在文獻(xiàn)(EP I 339 643A1, EP I 337 280A1)中描述了在螺旋狀流動(dòng)通道中特別有利的停留時(shí)間行為。產(chǎn)品流過(guò)螺旋狀的流體通道。由于這種螺旋式的流動(dòng)導(dǎo)向，在通道中產(chǎn)生被稱(chēng)為“迪恩潤(rùn)(Dean-Wirbeln) ”的二次流(Sekundjirstr5mung),這個(gè)二次流確保了徹底并同時(shí)溫和的徹底混合。通過(guò)這種渦流的高效混合實(shí)現(xiàn)了狹窄的停留時(shí)間分布和輻射劑量分布。這樣就可以有針對(duì)性地引入足以滅活病毒的有效輻射劑量，而無(wú)須對(duì)產(chǎn)品造成強(qiáng)烈的負(fù)荷。這種所謂的劑量方案和模塊的大小無(wú)關(guān)，因此把實(shí)驗(yàn)室的生產(chǎn)規(guī)模擴(kuò)大至生產(chǎn)規(guī)模是可行的。在所謂的螺旋模塊中的紫外線照射原則上如此設(shè)計(jì)，以使得一次性穿流過(guò)螺旋模塊。分別根據(jù)待處理液體的濁度，可以在一定的范圍改變所述螺旋模塊中的流率。這個(gè)范圍由模塊中必需的二次流的形成和壓降得出。若即使是最小的可能流率和因此最長(zhǎng)的停留時(shí)間仍不能足以達(dá)到希望的病毒滅活，原則上可以考慮多個(gè)模塊串聯(lián)運(yùn)行。但是，在此情況下，相應(yīng)的數(shù)量受到跨以串聯(lián)布置的多個(gè)模塊的壓降和模塊的壓力穩(wěn)定性的限制。在水蛭提取物的情況中，液體吸收性如此之高(光密度在254 nm時(shí)大于50CHT1)，以至于紫外線輻射的穿透深度只局限于水蛭提取物的表面和表面以下幾個(gè)微米深。通過(guò)單一的螺旋模塊不能保證有效滅活病毒，同時(shí)保持產(chǎn)品的完整。多個(gè)研究已予證明。多個(gè)模塊串聯(lián)運(yùn)行的潛在可能性出于實(shí)用的理由也被排除。對(duì)于足夠的滅活而言，需要超過(guò)4個(gè)串聯(lián)的模塊。由于隨之而來(lái)的壓降，在設(shè)備的抗壓性有限的情況下這在實(shí)際中無(wú)法實(shí)現(xiàn)。此外，尤其在水蛭提取物中復(fù)雜的活性成分混合的情況下存在在輻照區(qū)內(nèi)形成覆膜的危險(xiǎn)，所述覆膜的形成會(huì)減弱甚至完全阻止射線射入待輻照介質(zhì)。還必須擔(dān)心的是，在水蛭提取物情況下紫外線輻照不是有效的病毒滅活方法。所述問(wèn)題還在于，如果被照射的介質(zhì)具有的光密度很高，則覆膜的形成很難被識(shí)別。在這種情況下，很難利用光敏器件來(lái)測(cè)量輻射強(qiáng)度，以確定覆膜的形成。這存在如下危險(xiǎn)，即被照射的介質(zhì)未獲得足量的照射，因此無(wú)法賦予足夠的產(chǎn)品安全。從現(xiàn)有技術(shù)出發(fā)，本發(fā)明的目的在于提供一種滅活水蛭提取物中病毒和/或細(xì)菌、特別是小型無(wú)包膜病毒的方法。所尋找的方法相對(duì)于那些傳統(tǒng)的方法，如酸處理、溶劑處理、洗滌劑處理、巴氏殺菌和/或納濾，應(yīng)導(dǎo)致更高的產(chǎn)品產(chǎn)率，并同時(shí)還應(yīng)保證經(jīng)濟(jì)運(yùn)行和高的產(chǎn)品質(zhì)量。此外，所尋找的方法還應(yīng)該提供識(shí)別覆膜形成的可能性，以能夠確保足夠的產(chǎn)品安全。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，滅活水蛭提取物中的病毒和細(xì)菌是可以有效并經(jīng)濟(jì)的實(shí)現(xiàn)，SP讓水蛭提取物在攪拌容器和輻照裝置設(shè)備之間循環(huán)輸送，在所述輻照裝置中水蛭提取物被曝露于紫外光福射。因此，本發(fā)明提供滅活流體水蛭提取物中病毒和/或細(xì)菌的方法，其特征在于，所 述提取物在攪拌容器和輻照裝置設(shè)備之間循環(huán)輸送，在所述輻照裝置中所述提取物被曝露于電磁福射。所述流體水蛭提取物優(yōu)選為實(shí)施例I提及的方法獲得的提取物。滅活被理解為這樣的過(guò)程，所述過(guò)程導(dǎo)致病毒和/或細(xì)菌的不希望的性能被減少或者消除。所述滅活通過(guò)引入電磁輻射進(jìn)行。這樣的輻射優(yōu)選用紫外光進(jìn)行，眾所周知，紫外光適合使病毒和/或細(xì)菌如此發(fā)生改變使其不再對(duì)人類(lèi)、動(dòng)物、植物和/或環(huán)境造成傷害。紫外光是波長(zhǎng)范圍在IOOnm至400nm的電磁輻射。對(duì)于滅活病毒而言?xún)?yōu)選使用IOOnm至280nm范圍的所謂UV-C-射線，特別優(yōu)選的范圍是200nm至280nm。根據(jù)本發(fā)明讓水蛭提取物在攪拌容器和輻照裝置之間循環(huán)輸送。所述輻照裝置由一個(gè)或者多個(gè)優(yōu)選并聯(lián)的螺旋模塊組成，所述螺旋模塊在下文進(jìn)一步詳述。出人意料的是，通過(guò)這種循環(huán)操作方式足以滅活水蛭提取物中的細(xì)菌和病毒，而對(duì)水蛭提取物中包含的蛋白質(zhì)沒(méi)有顯著的傷害。出人意料地，通過(guò)使用攪拌反應(yīng)器導(dǎo)致的擴(kuò)大的停留時(shí)間分布(相對(duì)于一次性流過(guò)一個(gè)或者多個(gè)串聯(lián)的螺旋模塊)和由于循環(huán)處理方式延長(zhǎng)的在各個(gè)模塊中的照射時(shí)間對(duì)水蛭提取物中含有的蛋白質(zhì)沒(méi)有造成有害作用。此夕卜，盡管在各個(gè)螺旋膜件中相對(duì)長(zhǎng)的處理時(shí)間，但出人意料的是，沒(méi)有出現(xiàn)明顯的覆膜或者團(tuán)聚的形成。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，在根據(jù)本發(fā)明的方法中，病毒和細(xì)菌甚至在具有大于70的光密度的水蛭提取物中，仍然能通過(guò)紫外線輻照被滅活。優(yōu)選使用的水蛭提取物的光密度的范圍為10-72，特別優(yōu)選30-65的范圍，最特別優(yōu)選40-60的范圍。光密度OD (也被稱(chēng)作吸光度)，是射入介質(zhì)的射線的強(qiáng)度Jci與射出介質(zhì)的射線的強(qiáng)度I比值的以10為底的對(duì)數(shù)
OD = (I0ZI)
光密度和使用的射線的波長(zhǎng)有關(guān)。本文中給出的光密度為波長(zhǎng)254nm處的。根據(jù)本發(fā)明，水蛭提取物循環(huán)輸送。用泵唧送的體積流量與總體積的比例在0. 5至80 1/h的范圍，優(yōu)選在I至60 1/h的范圍，最優(yōu)選3至45 1/h的范圍。在進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的方法時(shí)，將提取物的溫度保持在2°C至25°C的范圍，優(yōu)選4°C至20°C的范圍，特別優(yōu)選8°C至15°C的范圍。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，以循環(huán)操作方式照射批次之前和/或之后，用透明介質(zhì)進(jìn)行一次或者多次循環(huán)，并且對(duì)在輻照區(qū)域內(nèi)射入或者透過(guò)透明介質(zhì)的射線強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)量。
因?yàn)樗翁崛∥锏墓饷芏忍撸筒荒軌蛟谔崛∥锏妮椪掌陂g測(cè)量在輻照區(qū)域內(nèi)進(jìn)入水蛭提取物或者透過(guò)水蛭提取物的射線強(qiáng)度。但是存在這樣的危險(xiǎn)，在輻照的過(guò)程中在輻照模塊的內(nèi)壁上形成覆膜。覆膜形成的結(jié)果是減少射入提取物的輻射強(qiáng)度。因此就無(wú)法保證把病毒和/或細(xì)菌完全滅活。因此，在水蛭提取物輻照之前和/或之后，輸送透明介質(zhì)通過(guò)設(shè)備，并測(cè)量進(jìn)入介質(zhì)或者透過(guò)介質(zhì)的輻射強(qiáng)度。如果在水蛭提取物輻照之前或者之后的輻射強(qiáng)度相同或者幾乎相同，那么就可以排除覆膜的形成，可以進(jìn)行下一批的水蛭提取物的輻照。如果記錄到輻射強(qiáng)度明顯的下降，那么可以考慮到，在輻照模塊的內(nèi)壁上有覆膜的形成，應(yīng)該在下一批次之前進(jìn)行清除。或者也可以考慮調(diào)高輻射的強(qiáng)度和/或增加循環(huán)次數(shù)，來(lái)相應(yīng)地彌補(bǔ)降低的輻射強(qiáng)度。透明介質(zhì)是指對(duì)于所使用的輻射的波長(zhǎng)范圍而言光密度小于10的介質(zhì)(優(yōu)選在254nm 測(cè)量)。透明介質(zhì)優(yōu)選使用水或者含水緩沖溶液。作為緩沖溶液適合的是比如磷酸鹽緩沖的鹽溶液(PBS)，或者其他有機(jī)/無(wú)機(jī)緩沖系統(tǒng)。除了避免覆膜形成之外，還必須要避免由輻射引發(fā)的液體中的產(chǎn)品和次要成分或兩者的團(tuán)聚的形成。在按照本發(fā)明實(shí)施方案中，盡管水蛭提取物以循環(huán)操作方式進(jìn)行處理，但是令人驚奇地未觀察到任何團(tuán)聚形成。根據(jù)本發(fā)明的方法在這樣的裝置中進(jìn)行，所述裝置包括至少一個(gè)攪拌容器、輻照裝置和水蛭提取物的輸送器件。攪拌容器是可以存放水蛭提取物的容器，并且包括用來(lái)徹底混合容器中水蛭提取物的器件。作為徹底混合的器件，通常使用攪拌器諸如葉片攪拌器。所述容器可以由玻璃、不銹鋼或者塑料構(gòu)成。輸送器件的作用是把流體介質(zhì)從攪拌容器中經(jīng)輻照裝置再輸送回?cái)嚢枞萜髦小Ｗ鳛檩斔脱b置適合的是比如泵。用于實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的方法的裝置的特征是，將攪拌容器、輻照裝置以及輸送器件如此相互連接，以便能夠?qū)⑺翁崛∥飶臄嚢枞萜鬏斔徒?jīng)過(guò)輻照裝置并再返回到所述攪拌容器中。所述輻照裝置包括一個(gè)或者多個(gè)優(yōu)選并聯(lián)的螺旋模塊。螺旋模塊是這樣的裝置，這個(gè)裝置提供至少一個(gè)電磁輻射源和繞軸螺旋延伸的通道。這種螺旋模塊的實(shí)例見(jiàn)于出版物WO 2002/038502A1中圖5、6、7、8、9或者10。這種螺旋延伸的通道優(yōu)選如此設(shè)置，使得其繞電磁輻射源延伸。也可以考慮，圍繞通道周?chē)O(shè)置其他的電磁輻射源。如果流體介質(zhì)流過(guò)這種螺旋延伸的通道，則強(qiáng)烈的、在整個(gè)通道長(zhǎng)度上盛行的均勻的橫向混合垂直于產(chǎn)品流動(dòng)主方向作用在介質(zhì)上。盡管按照本發(fā)明的方法盛行著層流特征，但是通過(guò)這種橫向混合導(dǎo)致停留時(shí)間分布變窄。此外，距離輻射源較遠(yuǎn)的流體層(其特別在介質(zhì)吸收強(qiáng)烈的情況下未得到或者很少得到電磁輻射)通過(guò)這種橫向混合被確保與距離輻射源近的被輻射到的層進(jìn)行強(qiáng)烈地交換。這和狹窄的停留時(shí)間分布導(dǎo)致所有流體單元都獲得均勻、一致的輻射時(shí)間長(zhǎng)度和輻射強(qiáng)度，這通過(guò)流動(dòng)速度和輻射源的強(qiáng)度可適配于各種需要。這樣可以確保，有效減少介質(zhì)中的微生物和/或病毒。在太強(qiáng)的輻射會(huì)導(dǎo)致?lián)p傷的介質(zhì)中，將有效地避免這樣的危險(xiǎn)，即通過(guò)不利的寬的停留時(shí)間分布導(dǎo)致過(guò)強(qiáng)的輻射負(fù)荷和由此有時(shí)導(dǎo)致傷害。可以考慮在一個(gè)螺旋模塊中多個(gè)通道相鄰地布置，并且圍繞一個(gè)共同的軸螺旋延伸。通道可以具有方形、圓形、橢圓形或者半圓形的橫斷面輪廓。其他形狀橫斷面輪廓也是可考慮的。優(yōu)選地，所述管道具有至少有一面是展平(abgeflacht)的橫斷面輪廓。電磁射線優(yōu)選從此展平的面進(jìn)入通道中。這些通道的實(shí)例在WO 2002/038502A1中的圖5、6、7、8、9或10中顯示。通道的橫截面剖面優(yōu)選D-型(也就是說(shuō)半圓 形或者半橢圓形)、菱形或者矩形。作為電磁輻射源適宜的是每種發(fā)射出適合滅活病毒和/或細(xì)菌的波長(zhǎng)的輻射源。優(yōu)選使用UV-C-射線源,例如水銀燈,其表現(xiàn)出在254nm波長(zhǎng)處的輻射最大值。也可以考慮使用多個(gè)電磁輻射源。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述螺旋模塊包括空心圓柱，螺旋軟管力鎖合或形狀鎖合(kraft- oder formschliissig)地施加到所述空心圓柱上。在空心圓柱里放進(jìn)不直接和產(chǎn)品接觸的電磁輻射源。這種螺旋模塊例如在申請(qǐng)WO 02/38502AUW0 02/38191A1、WO 07/096057AUEP I 464 342A1 和 DE 10 2009 009 108. 4 中予以描述。例如在WO 07/096057A2中描述了一種螺旋模塊，這種螺旋模塊的特征是，螺旋軟管經(jīng)由內(nèi)支撐管形狀鎖合地施加。因而在所述支撐管和所述螺旋軟管之間形成了通道，這個(gè)通道圍繞著支撐管從螺旋軟管的一端螺旋式延伸到螺旋軟管的另一端。螺旋軟管優(yōu)選如按照申請(qǐng)DE 10 2009 009 108.4.中描述的，力鎖合地施加到空心圓柱上。這樣能有效地避免相鄰?fù)ǖ涝阎g的橫向流動(dòng)。否則，橫向流動(dòng)將導(dǎo)致不希望出現(xiàn)的停留時(shí)間分布的變寬。這種螺旋模塊的優(yōu)選如此構(gòu)造至少被輻射到的部件被設(shè)計(jì)為一次性零件。攪拌容器和具有一個(gè)或者多個(gè)螺旋模塊的輻照裝置之間的體積比為I到1000的范圍，優(yōu)選在5到500的范圍，特別優(yōu)選10至200的范圍。由此能夠遵循操作時(shí)間，該操作時(shí)間能夠很好地嵌入操作過(guò)程中，也即例如一個(gè)班次(Schicht)中。用于實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的方法的裝置優(yōu)選配備一個(gè)或多個(gè)傳感器，例如用來(lái)測(cè)量輻射(如紫外線傳感器)、壓力、容器填充狀態(tài)、溫度以及體積流量。此外，所述裝置優(yōu)選配備監(jiān)測(cè)螺旋模塊正確安裝位置的傳感器，以及檢測(cè)有可能發(fā)生的泄漏的泄漏傳感器。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中也配備安全裝置。這些裝置可以是例如，防止操作人員受到意外輻射(比如具有門(mén)式監(jiān)察器的外殼)的措施、用于泄漏情況的收集槽以及針對(duì)設(shè)備移動(dòng)部件的保護(hù)裝置。整個(gè)裝置優(yōu)選通過(guò)過(guò)程控制系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行控制和調(diào)節(jié)。尤其對(duì)溫度、流率、輻射以及處理時(shí)間進(jìn)行監(jiān)控。這個(gè)裝置的部件優(yōu)選設(shè)計(jì)有CIP (CIP=原位清洗)能力，以確保用于藥物用途的滅菌。下面將基于實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)地說(shuō)明，但是本發(fā)明并不局限于此。圖中顯示
圖I :制備粗制水蛭提取物的方法的示意2 :制備凍干水蛭提取物的方法的示意圖 圖3 :用于進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的方法的裝置的實(shí)施方案的示意圖 圖4 :輻照模塊示意圖 圖5:輻照模塊-頂部示意圖
圖6 :在其中形成迪恩渦的流體流過(guò)的螺旋通道示意圖 圖7 :介質(zhì)中水蛭素和病毒的滅活作為輻射劑量的函數(shù)的圖解。
實(shí)施例I :制備水蛭提取物的方法 第一工藝階段(粗提物的制備)
生產(chǎn)水蛭提取物的第一工藝階段，即粗提物的生產(chǎn)在圖I中示意性示出。把深度冷凍的水蛭解凍，分共70_80kg的兩份在所謂的“切割機(jī)”中粉碎。粉碎后，懸浮液用加溫的純化水進(jìn)行稀釋?zhuān)⑥D(zhuǎn)移至萃取容器中，在所述萃取容器中通過(guò)添加純化水調(diào)節(jié)體積。加入食鹽和丙酮至第一提取階段，同時(shí)繼續(xù)攪拌懸浮液并調(diào)節(jié)溫度。第一提取階段之后，通過(guò)離心操作，將懸浮液分離為含生物質(zhì)相和液相。將液相暫時(shí)存儲(chǔ)。將固相加入調(diào)溫純化的水中并以增加的食鹽和丙酮濃度重新提取(第二提取階段)。然后再次離心并最后升高的食鹽和丙酮濃度的情況下進(jìn)行第三提取階段。接著棄去含生物質(zhì)的固相。在用深度冷卻的丙酮進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀之前，將所述液相純化、過(guò)濾并通過(guò)添加三氯乙酸(TCA)將PH值調(diào)至4-5，優(yōu)選4. 5 ((±0.1)。沉淀蛋白質(zhì)沉淀物，然后與丙酮上清液分離。將沉淀物用丙酮和水的混合液(80%v/v)清洗三次。在清洗過(guò)程中，沉淀物沉淀出來(lái)。隨后在每種情況中分離丙酮上清液。清洗后的沉淀物通過(guò)過(guò)濾收集并用丙酮清洗。接著用氮?dú)鉀_洗把過(guò)剩的丙酮排出，取出濾餅。潮濕的濾餅可任選地深度冷凍暫時(shí)存儲(chǔ)。濾餅在真空干燥箱中干燥，以清除剩余的丙酮。含有水蛭粗制提取物的干燥濾餅在進(jìn)一步加工之前深度冷凍暫時(shí)存儲(chǔ)。第二工藝階段(水蛭提取物的制備(凍干))
圖2示意性示出了制備水蛭提取物的第二工藝階段一制備冷凍干燥的水蛭提取物。將多種含水蛭提取物的干燥的濾餅合并在一起，在純化水中溶解。把生成的蛋白質(zhì)溶液冷凍并暫時(shí)存放于深凍冰箱。然后溶液再次解凍并加入純化水。把稀釋后的蛋白質(zhì)溶液加熱，并在恒定溫度下巴氏消毒規(guī)定的時(shí)間。然后把蛋白質(zhì)溶液冷卻至室溫，并用稀鹽酸或碳酸鈉調(diào)整至7-8的中性pH，優(yōu)選7.5 (±0. I)。經(jīng)過(guò)PH調(diào)整后的溶液進(jìn)行離心處理，且合并上清液并冷卻暫時(shí)存儲(chǔ)。分離的沉淀物通過(guò)加入純化水清洗并重新離心處理。然后將上清液合并、均化并過(guò)濾。如果必要,可以通過(guò)加入純化水來(lái)適當(dāng)調(diào)節(jié)光密度如(254nm)。已證實(shí)至多72的光密度是適宜的。然后用波長(zhǎng)為254nm的紫外線以合適的輻射劑量進(jìn)行輻照。已證實(shí)合適的輻射劑量值為50—1000 J/m2，優(yōu)選100-600 J/m2，特別優(yōu)選250-350J/m2。然后，經(jīng)過(guò)紫外輻照的蛋白質(zhì)溶液經(jīng)過(guò)濾和濃縮(超濾)，以調(diào)整其活度。最后，將調(diào)整后的本體溶液再次過(guò)濾、灌裝于瓶中，然后凍干。將凍干的水蛭提取物暫時(shí)存儲(chǔ)用于進(jìn)一步處理。 實(shí)施例2 用于滅活具有大于50的高光密度的流體介質(zhì)中不希望的污染物的裝置 用于實(shí)施根據(jù)本發(fā)明方法的裝置于圖3中示意性示出。此裝置主要由容器10，比如，帶有攪拌器40的攪拌容器和一個(gè)或者多個(gè)輻射模塊(20，21)構(gòu)成。引導(dǎo)介質(zhì)15經(jīng)過(guò)容器10的軟管連接或者管道連接穿過(guò)輻射模塊20、21，然后重新返回到容器10中。這優(yōu)選用泵30進(jìn)行。輻射模塊可以是串聯(lián)或并聯(lián)的或者結(jié)合串聯(lián)和并聯(lián)。輻射模塊優(yōu)選使用根據(jù)前面所述定義的螺旋模塊，包括圍繞棒狀輻射源的螺旋狀輻射室，所述輻射源尤其發(fā)射254nm的波長(zhǎng)。
所述輻射源優(yōu)選是汞蒸氣燈。輻射室至少在朝向輻射源的一側(cè)用對(duì)波長(zhǎng)254nm的射線呈透過(guò)性的材料制成，優(yōu)選由石英玻璃制成。通過(guò)以螺旋形輸送的流產(chǎn)生二次流，即所謂的迪恩渦200 (見(jiàn)圖6)，這種二次流在層流區(qū)也產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)、有效的液體的橫向混合。以這樣的方式使液體的所有部分在流過(guò)模塊的過(guò)程中在靠近壁的層被輻照。另外，通過(guò)這種導(dǎo)流方式起到收窄停留時(shí)間的作用。螺旋模塊的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案顯不于圖4。在這種優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述螺旋模塊具有特氟隆軟管90的螺旋模塊，所述軟管具有螺旋形的凹槽和由此具有刻出的螺旋。在此特氟隆軟管中力鎖合地引入石英管100。通過(guò)這種結(jié)構(gòu)使得每一個(gè)螺旋95相互分開(kāi)，并形成了螺旋管道系統(tǒng)。在石英管的內(nèi)部100引入紫外燈80。此位置可以使通過(guò)螺旋流動(dòng)的溶液在其流過(guò)反應(yīng)器的整個(gè)路徑中最大程度受輻照。液體進(jìn)料優(yōu)選經(jīng)下部入口進(jìn)行，并可以這樣無(wú)泡導(dǎo)入不同溶液。輻照模塊的上端和下端各有一個(gè)用于液體輸入或輸出的反應(yīng)器頭部(見(jiàn)圖5)。通過(guò)裝入的開(kāi)口 110可以借助于紫外線傳感器來(lái)檢測(cè)值輻射源的性能。圖4中符號(hào)表不
D=螺旋的平均直徑
b=半橢圓形的流動(dòng)管道的寬度 L=特氟隆軟管的長(zhǎng)度 a=螺旋的平均高度 i=兩個(gè)螺旋之間的距離 Rqe =石英管外半徑。實(shí)施例3 用于在實(shí)施例2的裝置中處理得自實(shí)施例I的水蛭提取物的方法 把根據(jù)實(shí)施例I的方法得到的水蛭提取物用根據(jù)實(shí)施例2的具有輻照模塊的裝置輻
照。為此提供230ml體積的提取物，其中加入了少量(>10%)的病毒原液(小鼠細(xì)小病毒)。光密度為53. 3。提取物通過(guò)蠕動(dòng)泵以10L/h的速度被泵過(guò)24 ml的輻照模塊，在那里用254nm的紫外線輻照，再返回到儲(chǔ)存容器中(循環(huán)運(yùn)行)。在0、10、20以及30分鐘后，從儲(chǔ)存容器中取出樣品。其相應(yīng)的輻射劑量分別為0、97、198和303J/m2。采用標(biāo)準(zhǔn)分析對(duì)每個(gè)樣品的病毒活性和水蛭素活性成分的活性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果圖示于圖7中。圖7示出了水蛭素以及加入的病毒的滅活作為輻射劑量的函數(shù)。該結(jié)果表明了明確的病毒的滅活效果，同時(shí)對(duì)活性成分低的損害。然而因?yàn)榛钚猿煞值膿p害是絕對(duì)存在的，因此，為避免不必要的損失，必須在預(yù)先規(guī)定的最小病毒滅活情況下選擇盡可能精確的輻射。附圖
標(biāo)記 10 攪拌容器
15 介質(zhì)(水蛭提取物)20螺旋模塊
21螺旋模塊
30輸送器件(比如，泵)
40攪拌器
50冷卻套管
80輻射源
90特氟隆軟管
95螺旋100石英玻璃管
110用于安裝傳感器的可關(guān)閉的開(kāi)口
120入口 /出口
150入口
160出口
權(quán)利要求
1.用于滅活水蛭提取物中病毒和/或細(xì)菌的方法，其特征在于，所述水蛭提取物在攪拌容器和輻照裝置之間循環(huán)輸送，在所述輻照裝置中用電磁輻射輻照所述介質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其特征在于，所述福照用IOOnm—280nm范圍,優(yōu)選200nm—280nm范圍的紫外光進(jìn)行。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2之一的方法，其特征在于，所述水蛭提取物在波長(zhǎng)254nm具有至多72范圍的光密度，優(yōu)選30-65范圍，特別優(yōu)選40— 60范圍的光密度。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一的方法，其特征在于，用泵唧送的體積流量與總體積的比例為0. 5至80 1/h的范圍，優(yōu)選為I至60 1/h的范圍，特別優(yōu)選為3至45 1/h的范圍。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4之一的方法，其特征在于，將所述水蛭提取物的溫度保持在2-25 0C的范圍，優(yōu)選4-20 °C的范圍，特別優(yōu)選8-15 °C的范圍。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5之一的方法，其特征在于，在水蛭提取物輻照之前和/或之后，將透明介質(zhì)輸送通過(guò)所述裝置，并測(cè)量進(jìn)入所述介質(zhì)中或者透過(guò)所述介質(zhì)的輻照強(qiáng)度。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6之一的方法，其特征在于，所述攪拌容器和所述輻照裝置之間的體積比為I到1000的范圍，優(yōu)選5到500的范圍，特別優(yōu)選10至200的范圍。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7之一的方法，其特征在于，所述輻照裝置通過(guò)一個(gè)或多個(gè)、優(yōu)選并聯(lián)的螺旋模塊構(gòu)成，其中所述螺旋模塊是提供至少一個(gè)電磁輻射源和至少一個(gè)繞軸螺旋延伸的通道的裝置。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其特征在于，將所述螺旋延伸的通道如此布置，使其環(huán)繞電磁輻射源延伸。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9的方法，其特征在于，所述通道具有在至少一面上是展平的橫斷面輪廓，并且電磁輻射優(yōu)選通過(guò)此展平的面進(jìn)入所述通道中。
11.根據(jù)權(quán)利要求8-10之一的方法，其特征在于，所述通道的橫斷面輪廓是D-型、菱形、或長(zhǎng)方形。
12.根據(jù)權(quán)利要求8-11之一的方法，其特征在于，所述螺旋模塊包括空心圓柱，在所述空心圓柱上力鎖合或形狀鎖合地施加螺旋軟管，并且在所述空心圓柱之中引入電磁輻射源。
13.根據(jù)權(quán)利要求8-12之一的方法，其特征在于，如此設(shè)置所述螺旋模塊使得至少被輻射到的部件設(shè)計(jì)為一次性零件。
全文摘要
本發(fā)明提供利用電磁輻射滅活水蛭提取物中病毒和/或細(xì)菌的方法。
文檔編號(hào)A61L2/00GK102648006SQ201080043281
公開(kāi)日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2010年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月13日
發(fā)明者J.彼得斯, J.米歇爾斯, S.施密特 申請(qǐng)人:拜耳制藥股份公司