專利名稱：用于植入經加工的脂肪組織和經加工的脂肪組織產品的組合物和方法
用于植入經加工的脂肪組織和經加工的脂肪組織產品的組
合物和方法相關申請的交叉引用本申請要求2009年8月11日遞交的臨時專利申請序列第61/232，915號的優(yōu)先權。本申請涉及2008年2月11日遞交的美國臨時專利申請序列號61/065，322和2009年2月11日遞交并于2009年8月20日公布為W02009/102452的PCT申請PCT/US2009/00887。這些申請通過弓I用其全部內容將全部并入本文。背景再生醫(yī)學領域旨在提供用于創(chuàng)傷、疾病或先天性畸形的后續(xù)重建的組織替代物。雖然經常采用生物材料和細胞來再生新組織，這些方法往往是昂貴的且新組織的形成需要大量的時間。對于多種應用包括創(chuàng)傷重建、乳房重建和美容(鼻唇溝、皺紋等)來講，軟組織形式的修復是關鍵的。當今通常有兩種方法1.)注射/移植生物組織(脂肪)或2.)注射或植入合成的或天然來源的材料。在這兩種情況下，移植的組織或生物材料將最終被降解且需要更換。在某些情況下，使用患者組織重建可提供組織的永久修復。然而，這些方法也有其局限性。乳房切除手術之后的乳房重建可包括使用被移至重建部位的來自腹部或背部的肌肉和脂肪組織的組織瓣。這些瓣的尺寸必然受限于女性體內存在的可使用的組織的量，且來自腹部或背部的肌肉的移植可延長恢復時間并導致供體部位發(fā)病。脂肪移植的持久性變化很大，報道具有30-90%之間的任何值。持久性也經常取決于外科醫(yī)生和技術。這些持久性損失需要多種方法以維持期望的修正。與自體脂肪移植有關的供體部位發(fā)病也是一個重要的問題。另外，植入的脂肪組織經常導致手術后鈣化。對于具有乳腺癌病史經歷乳房切除之后的乳房重建的女性來講這一現象是特別重要的，因為鈣化可干擾乳房造影讀數并導致多次的、不必要的乳房活檢和憂慮。最后，對于經歷癌癥化療和放射的許多患者，相關的惡病質使他們沒有其需要的用于自體脂肪移植的脂肪體積。發(fā)明概述本發(fā)明提供了經加工的脂肪組織組合物及其制備和使用方法。本發(fā)明提供了包括具有脫細胞的活細胞固定地粘附的脂肪組織細胞外基質(decellularized adipose tissue extracellular matrix to which viable cellssecurely attach)的經加工的脂肪組織的組合物。本發(fā)明的經加工的脂肪組織可包括一種或多種材料，至少一種(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12)材料選自由麻醉劑、鎮(zhèn)痛劑、抗生素、抗微生物劑、生長因子、冷凍保護劑、抗氧化劑、自由基清除劑、胱天蛋白酶抑制劑、維生素、脂肪抽吸物(lipoaspirate)和細胞組成的組。在某些實施方式中，脫細胞的脂肪組織包括交聯劑。交聯劑包括但不限于碳二亞胺(EDC)、1，6-己二異氰酸酯(hexamethylene diisocyanate,HM C)、戊二醛、原花色素、核糖、蘇糖和賴氨酰氧化酶、碳二亞胺、聚環(huán)氧醚、二乙烯砜(DVQ、京尼平、聚醛和疊氮磷酸二苯酯(DPPA)、京尼平、環(huán)氧化合物、二醛淀粉、戊二醛、甲醛、辛二亞氨酸二甲酯(dimethylsuberimidate)、碳二亞胺、琥珀酰亞胺、二異氰酸酯和酰疊氮；或其任何組合。在某些實施方式中，經加工的脂肪組織還包括生物聚合物支架。在某些實施方式中，經加工的脂肪組織和生物聚合物支架還包括生物聚合物交聯劑。在某些實施方式中，經加工的脂肪組織包括聚合引發(fā)劑。生物聚合物支架包括但不限于透明質酸、PEG-DA、硫酸軟骨素、部分或完全水解的聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙基噁唑啉)、聚(環(huán)氧乙烷)_共-聚(環(huán)氧丙烷)嵌段共聚物(泊洛沙姆和美羅沙泊)、泊洛沙胺、羧甲基纖維素和羥烷基化纖維素例如羥乙基纖維素和甲基羥丙基纖維素、多肽、多糖或碳水化合物、Ficoll 聚蔗糖、葡聚糖、硫酸乙酰肝素、肝素、藻酸鹽、明膠、膠原、白蛋白、卵白蛋白和其共聚物或混合物。聚合引發(fā)劑包括但不限于曙紅Y、l-乙烯基-2-吡咯烷酮NVP和三乙醇胺；和Irgacure D2959。在某些實施方式中，經加工的脂肪組織基本上不含基膜。在某些實施方式中，經加工的脂肪組織包括(即，不是基本上不含)基膜。當植入受治療者時，本發(fā)明的經加工的脂肪組織優(yōu)選基本上無免疫原性。本發(fā)明的經加工的脂肪組織優(yōu)選地包含0.2yg/mg或更少(S卩，不可檢測到的DNA 水平至 0. 2 μ g/mg DNA)、0. 1 μ g/mg 或更少、0. 05 μ g/mg 或更少、0. 025 μ g/mg 或更少、0. 1 μ g/mg或更少、或0. 005 μ g/mg或更少的DNA。本發(fā)明的經加工的脂肪組織優(yōu)選地包含10%或更少(即不可檢測到的脂質水平至10%脂質)、5%或更少、2%或更少、或更少、0. 5%或更少、0. 25%或更少、0. 或更少、0. 05%或更少、0. 01%或更少、0. 001%或更少的脂質(w/w)。本發(fā)明的經加工的脂肪組織優(yōu)選地具有104-105I^S、lX104-3X105PaS、2xl04-2xl05Pas,3xl04-lxl05PasUxl04-8xl05Pas 或 IxlO4JxlO5Pas 或那些范圍的任何組合的復數粘度(η)。本發(fā)明的經加工的脂肪組織優(yōu)選地具有103_105Pa、&103-1Χ105Ρει、1χ104-1χ105Ρ&、8χ103-6χ104Ι^、2χ104-5χ104Ι^ 或 1χ104-9χ104Ι^ 或那些范圍的任何組合的復數模量(G*)。本發(fā)明的經加工的脂肪組織優(yōu)選地具有103_105Pa、hl03-lxl05Pa、1χ104-1χ105Ρ&、8χ103-6χ104Ι^、2χ104-5χ104Ι^ 或 1χ104-9χ104Ι^ 或那些范圍的任何組合的彈性模量(G，)。本發(fā)明的經加工的脂肪組織優(yōu)選地具有IO3-IO5Pa jX103-lX105Pa、1χ104-1χ105Ρ&、8χ103-6χ104Ι^、2χ104-5χ104Ι^ 或 1χ104-9χ104Ι^ 或那些范圍的任何組合的粘性模量(G”)。本發(fā)明的經加工的脂肪組織優(yōu)選地具有0. 1-0.2,0. 1-0.5,0. 1-1.0,0. 1-0.3,0. 1-0. 4,0. 1-0. 75,0. 05-0. 5或0. 05-2. 0或那些范圍的任何組合的介質損耗角正切(tan,δ)。本發(fā)明的經加工的脂肪組織優(yōu)選地包含存在于組合物中的50%或更多、60%或更多、70%或更多、80%或更多、或90%或更多(或被那些值包括的任何范圍)的選自由I型膠原、II型膠原、III型膠原、IV型膠原、V型膠原、XII型膠原組成的組的膠原。本發(fā)明的經加工的脂肪組織優(yōu)選地包含存在于組合物中的50%或更多、60%或更多、70%或更多、80%或更多、或90%或更多(或被那些值包括的任何范圍)的選自由透明質酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質素、硫酸肝素組成的組的糖胺聚糖(GAG)。本發(fā)明的經加工的脂肪組織優(yōu)選地是不溶于水的。優(yōu)選可使用本申請?zhí)峁┑娜魏我环N方法制備本發(fā)明的經加工的脂肪組織。在某些實施方式中，脂肪組織是人脂肪組織。在某些實施方式中，脂肪組織是豬脂肪組織。在某些實施方式中，脂肪組織來自活供體。在某些實施方式中，脂肪組織來自尸體供體。本發(fā)明提供了用于制備經加工的脂肪組織(PAT)特別是經加工的人脂肪組織(PhAT)的方法，依序包括提供包括固態(tài)脂肪組織的哺乳動物組織；將組織中的脂肪與非脂肪物質分離；和將脂肪脫細胞或從脂肪中提取脂質或兩者。將脂肪脫細胞或從脂肪中提取脂質的方法包括將組織均質或切碎并用促進去除脂質和細胞的緩沖液處理脂肪以制備經加工的脂肪組織。這些緩沖液包括磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。促進脫細胞的試劑可包括弱酸中的一種或多種，例如弱有機酸、非離子去污劑和膽汁酸。在用不在生理PH或約生理pH的緩沖液或試劑處理脂肪后，緩沖液將脂肪的PH調整至生理pH。本發(fā)明提供了將脂肪脫細胞或從脂肪中提取脂質的方法，包括將脂肪與超臨界(X)2接觸。本發(fā)明的方法還包括用核酸酶處理材料以去除核酸。脂肪組織的來源是哺乳動物脂肪組織。哺乳動物脂肪組織可從任何哺乳動物獲得，最方便地從較大的哺乳動物獲得以提供足夠的起始材料。在優(yōu)選的實施方式中，脂肪組織是來自活體或尸體供體的人脂肪組織或豬脂肪組織。在某些實施方式中，經加工的脂肪組織進一步形成為顆粒。在某些實施方式中，脫細胞的/提取脂質的脂肪組織進一步接觸交聯劑以交聯例如存在于經加工的脂肪組織中的蛋白質例如膠原。用于這些方法的交聯劑包括但不限于碳二亞胺(EDC)、1，6-己二異氰酸酯(HM C)、戊二醛、原花色素、核糖、蘇糖和賴氨酰氧化酶、聚環(huán)氧醚、二乙烯砜(DVS)、京尼平、聚醛和疊氮磷酸二苯酯(DPPA)、京尼平、環(huán)氧化合物、二醛淀粉、戊二醛、甲醛、辛二亞氨酸二甲酯、碳二亞胺、琥珀酰亞胺、二異氰酸酯和酰疊氮；或其任何組合。交聯劑與脫細胞的/提取脂質的脂肪組織的具體比例將取決于例如所使用的特定交聯劑和經加工的脂肪組織的最終用途?；诳墒褂脴藴噬镂锢韺W或生化測定方法測定的經加工的脂肪組織的期望物理性質測定待使用的交聯劑的量。在某些實施方式中，脫細胞的/提取脂質的脂肪組織與生物聚合物支架進一步組合。在某些實施方式中，脫細胞的/提取脂質的脂肪組織和生物聚合物支架與生物聚合物交聯劑進一步組合，其混合物可進一步接觸聚合劑，且任選地進一步接觸聚合引發(fā)劑。與脫細胞的/被提取脂質的脂肪組織一起使用的生物相容性聚合物包括但不限于透明質酸、PEG-DA、硫酸軟骨素、部分或完全水解的聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙基噁唑啉)、聚(環(huán)氧乙烷)_共-聚(環(huán)氧丙烷)嵌段共聚物(泊洛沙姆和美羅沙泊)、泊洛沙胺、羧甲基纖維素和羥烷基化纖維素例如羥乙基纖維素和甲基羥丙基纖維素、多肽、多糖或碳水化合物、Ficoll 聚蔗糖、葡聚糖、硫酸乙酰肝素、肝素、藻酸鹽、明膠、膠原、白蛋白、卵白蛋白和其共聚物或混合物。與脫細胞的/被提取脂質的脂肪組織一起使用的聚合引發(fā)劑包括但不限于，其中所述聚合引發(fā)劑包括選自由曙紅Y、l-乙烯基-2-吡咯烷酮NVP和三乙醇胺和IrgacureD2959組成的組的試劑。在某些實施方式中，聚合引發(fā)劑包括光。用于制備本文提供的經加工的脂肪組織的方法可包括將脂肪與核酸酶(非特異性或位點特異性DNA酶和/或RNA酶)接觸。在某些實施方式中，脂肪組織在脫細胞和/或提取脂質后與核酸酶接觸。在某些實施方式中，用于制備經加工的脂肪組織的方法可包括在方法的一個或多個步驟中將脂肪與蛋白酶抑制劑接觸。在優(yōu)選的實施方式中，蛋白酶抑制劑是生物相容性的，或在加工期間蛋白酶抑制劑被完全去除或失活以使最終的經加工的脂肪組織是生物相容性的。該方法任選地包括例如通過輻射或與合適的氣體接觸對經加工的脂肪組織滅菌。在某些實施方式中，經加工的脂肪組織與包括但不限于麻醉劑、抗生素、生長因子、冷凍保護劑、抗氧化劑、自由基清除劑、胱天蛋白酶抑制劑、維生素、脂肪抽吸物和細胞的其他試劑組合。在某些實施方式中，在儲存經加工的脂肪組織前加入另外的試劑。在某些實施方式中，在儲存后更接近終端用戶使用經加工的脂肪組織的時刻加入另外的試劑。在某些實施方式中，經加工的脂肪組織基本上不含基膜。盡管脂肪組織包括脈管結構，因此包括基膜，本發(fā)明的某些加工方法用于去除脈管結構，并因此去除基膜。在某些實施方式中，經加工的脂肪組織未以基膜的方式界定空間或劃分空間，例如提供不滲透細胞的屏障。在本發(fā)明的某些實施方式中，經加工的脂肪組織包括基膜。在本發(fā)明的某些實施方式中，經加工的脂肪組織包括來自原始組織的脈管結構或脈管結構的殘留部分。本發(fā)明提供通過本發(fā)明的任何方法制備的組合物。本發(fā)明提供的組合物可配制成藥物組合物，例如可注射的或以其他方式可植入的藥物組合物。本發(fā)明還提供了用于制備本發(fā)明的任何一種組合物的試劑盒。本發(fā)明也提供了包括將本發(fā)明的任何一種組合物用作受治療者體內的生物填充劑的試劑盒。試劑盒可包括試劑盒的使用說明。本發(fā)明提供的組合物還可包括在脫細胞的/提取脂質的脂肪組織中的一種或多種物質，這些材料包括但不限于麻醉劑、鎮(zhèn)痛劑、抗生素、抗微生物劑、生長因子、冷凍保護劑、抗氧化劑、自由基清除劑、胱天蛋白酶抑制劑、維生素、脂肪抽吸物和細胞。本發(fā)明的某些組合物還包括交聯劑，例如以提供蛋白質分子例如脫細胞的/提取脂質的脂肪組織的膠原分子之間的交聯。這些交聯劑包括但不限于碳二亞胺(EDC)、1，6-己二異氰酸酯(HM C)、戊二醛、原花色素、核糖、蘇糖和賴氨酰氧化酶、碳二亞胺、聚環(huán)氧醚、二乙烯砜(DVS)、京尼平、聚醛和疊氮磷酸二苯酯(DPPA)、京尼平、環(huán)氧化合物、二醛淀粉、戊二醛、甲醛、辛二亞氨酸二甲酯、碳二亞胺、琥珀酰亞胺、二異氰酸酯和酰疊氮；或其任何組合。本發(fā)明的某些組合物還包括生物聚合物支架，任選地還具有一種或多種生物聚合物交聯劑、聚合劑和聚合弓I發(fā)劑。生物聚合物支架的實例包括但不限于透明質酸、PEG-DA、硫酸軟骨素、部分或完全水解的聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙基噁唑啉)、聚(環(huán)氧乙烷)_共-聚(環(huán)氧丙烷)嵌段共聚物(泊洛沙姆和美羅沙泊)、泊洛沙胺、羧甲基纖維素和羥烷基化纖維素例如羥乙基纖維素和甲基羥丙基纖維素、多肽、多糖或碳水化合物、Ficoll 聚蔗糖、葡聚糖、硫酸乙酰肝素、肝素、藻酸鹽、明膠、膠原、白蛋白、卵白蛋白和其共聚物或混合物。聚合引發(fā)劑的實例包括但不限于曙紅Y、l-乙烯基-2-吡咯烷酮NVP和三乙醇胺；和IrgacureD2959。在某些實施方式中，經加工的脂肪組織未界定或劃分空間。本發(fā)明提供的組合物具有使其用作有用的生物填充劑的一種或多種特性。例如，經加工的脂肪組織是活細胞可固定地粘附于其上并可增殖的脫細胞的脂質。在優(yōu)選的實施方式中，當植入到受治療者時，組合物基本上無免疫原性。在某些實施方式中，組合物基本上不含DNA，以使經加工的脂肪組織具有0. 2 μ g/mg或更少、0. 2 μ g/mg或更少、0. 1 μ g/mg或更少、0. 05 μ g/mg或更少、0. 025 μ g/mg或更少、0. 1 μ g/mg或更少、或0. 005 μ g/mg或更少的DNA。在某些實施方式中，組合物基本上不含脂質，以使經加工的脂肪組織具有10%或更少、5%或更少、2%或更少、或更少、0. 5%或更少、0. 25%或更少、0. 或更少、0. 05%或更少、0. 01%或更少、0. 001%或更少的脂質(w/w)?？赏ㄟ^任何已知方法測定本發(fā)明的組合物的生物物理學性質。在某些實施方式中，經加工的脂肪組織具有 IO4-IO5I^as、Ix 104-3xIO5Pas、2xl04-2xIO5I^asJxIO4-IxIO5Pas、lxl04-8xl05Pas或IxIO4-^clO5Pas或那些范圍的任何組合的復數粘度(η)。在某些實施方式中，經加工的脂肪組織具有 103-105Pa、^cl03-lxl05Pa、lxl04-lxl05Pa、8xl03-6xl04Pa、MlO4-^dO4I3a或IxIO4-^dO4Pa或那些范圍的任何組合的復數模量(G*)。在某些實施方式中，經加工的脂肪組織具有 103-105Pa、^cl03-lxl05Pa、lxl04-lxl05Pa、8xl03-6xl04Pa、2乂104-切1041^或IxlO4-QxIO4I^或那些范圍的任何組合的彈性模量(G，)。在某些實施方式中，經加工的脂肪組織具有 103-105Pa、^cl03-lxl05Pa、lxl04-lxl05Pa、8xl03-6xl04Pa、&104-切104!^或IxlO4-^dO4I3a或那些范圍的任何組合的粘性模量(G”)。在某些實施方式中，經加工的脂肪組織具有 0. 1-0. 2,0. 1-0. 5,0. 1-1. 0,0. 1-0. 3,0. 1-0. 4,0. 1-0. 75、0. 05-0. 5或0. 05-2. O或那些范圍的任何組合的介質損耗角正切(δ )。本發(fā)明提供的經加工的脂肪組織優(yōu)選地包括存在于組合物中的50%或更多、60%或更多、70 %或更多、80 %或更多、或90 %或更多的選自脂肪中存在的類型的膠原。膠原的類型包括I型膠原、II型膠原、III型膠原、IV型膠原、V型膠原、XII型膠原。本發(fā)明提供的經加工的脂肪組織優(yōu)選地包括存在于組合物中的60%或更多、70%或更多、80%或更多、或90%或更多的選自脂肪中存在的類型的糖胺聚糖(GAG)。GAG的類型包括透明質酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質素、硫酸肝素。如果本發(fā)明包括將經加工的脂肪組織植入受治療者的方法，本發(fā)明提供了使用組合物的方法。這些方法包括鑒定需要植入經加工的脂肪組織的受治療者；鑒定需要植入經加工的脂肪組織的受治療者的部位；和在所鑒定的部位將經加工的脂肪組織植入受治療者。可使用本文提供的任何組合物或通過本文提供的方法制備的任何組合物實施植入方法。植入方法可還包括監(jiān)控受治療者的植入材料的持久性和/或細胞向植入物的浸潤和/或受治療者對植入材料的耐受的方法?？墒褂萌魏我阎姆椒ɡ绫疚奶峁┑姆椒ㄟM行監(jiān)控。本發(fā)明提供可用于制備經加工的脂肪組織(PAT)，特別是經加工的人脂肪組織(PhAT)的方法，依序包括獲得包含固體脂肪的哺乳動物組織，例如皮下脂肪組織，將組織中的脂肪與非脂肪物質分離；例如通過刮擦，和用一種或多種促進去除脂質和細胞的緩沖液順序地處理脂肪以制備經加工的脂肪組織；或通過用超臨界二氧化碳(CO2)處理(例如，見通過引用并入本文的美國專利4，466，923)。哺乳動物脂肪組織可從任何哺乳動物獲得，最方便地從較大的哺乳動物獲得以提供足量的起始材料。在處理分離的脂肪組織期間使用的緩沖液包括生理pH和離子強度的緩沖液例如磷酸緩沖鹽溶液(PBQ或生理鹽水。緩沖液可還包括化合物例如弱酸、弱有機酸、非離子去污劑或膽汁酸、或其組合以促進固態(tài)脂肪的脫細胞或脂質提取。本發(fā)明提供了如下方法其中分離的脂肪還可與一種或多種核酸酶例如DNA酶和RNA酶接觸以促進可能存在于材料中的核酸的降解。接觸核酸酶可在任何步驟進行，但優(yōu)選在脫細胞步驟之后進行，因為脫細胞加工可裂開細胞，釋放核酸使其更易于降解。本發(fā)明提供的經加工的脂肪組織也可包括生物聚合物和生物聚合物交聯劑以產生生物聚合物分子之內和分子之間，以及在生物聚合物和脂肪組織來源的材料之間的分子交聯以形成生物聚合物支架。這些生物聚合物可包括但不限于透明質酸、硫酸軟骨素、膠原、彈性蛋白、層粘連蛋白。本發(fā)明提供了用于將本發(fā)明的經加工的脂肪組織形成為顆粒的方法例如以有利于施用。本發(fā)明提供了用于任選地將經加工的脂肪組織和一種或多種交聯劑和/或生物聚合物支架組合的方法。該生物聚合物支架可以是預先交聯的(例如，交聯的透明質酸)或包括官能團以允許生物聚合物在不存在任何其他試劑(例如官能化的硫酸軟骨素)時形成交聯結構?？商娲?，生物聚合物支架可要求使用交聯劑和聚合引發(fā)劑。聚合引發(fā)劑可包括化學引發(fā)劑或光。本發(fā)明提供了聚合生物聚合物支架的方法。本發(fā)明還提供了通過本發(fā)明的任何方法制備的組合物，包括任何加工中間產物。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的任何組合物包括任何加工中間產物作為生物材料以用于例如組織重建或修復的用途。本發(fā)明提供在合適于施用的載體中的本發(fā)明的組合物(例如鹽、緩沖液、具有或不具有抗生素、麻醉劑、生長因子或其他細胞外基質組分或提供更易于注射的粘度的物質)。定義如本文所用的，“無細胞的”應理解為不包含細胞(存活的或不可存活的、整體或片段)或包含足夠少的細胞或細胞材料以使得存在的細胞不足以在植入材料的受治療者中引發(fā)免疫反應的材料。例如，通過機械或化學方法或其組合可從源組織中去除細胞?！盁o細胞脂肪生物相容性生物材料(acellular adipose biocompatiblebiomaterial)”，也表述為“經加工的脂肪組織(processed adipose tissue) ” 或“PAT”，應理解為來源于從供體例如從活供體(例如自體提供(autologous donation)、整容手術程序例如吸脂術或腹壁成形術的副產物)或組織庫(例如活供體、尸體供體)獲得的脂肪組織的組合物?？蓮钠は轮尽扰K脂肪、白脂肪、褐色脂肪、包括脂肪組織的混合細胞群(例如，脂肪抽吸物)或其任何組合獲得該組合物。在第一步中，通過例如從真皮或周圍器官中刮下脂肪、分離脂肪抽吸物等，將組織樣品中的脂肪與非脂肪物質分離，以制備分離的脂肪。用化學和/或機械方法處理分離的脂肪以去除脂肪細胞和脂質組分。在植入受治療者前，優(yōu)選處理材料以殺死未被加工去除的任何殘存的細胞。優(yōu)選用一種或多種核酸酶例如DNA酶和/或RNA酶處理材料以破壞可能存在于材料中的任何潛在免疫原性的核酸。由于材料是無細胞的，所以其無免疫原性。因此，該組合物可被非自體地植入。此外，該材料可用作“即用的”產品以用于重建和整容手術程序中。在植入受治療者之前，該組合物可與其他材料組合，包括其他生物材料或生物聚合物，和細胞或細胞材料，例如包括但不限于成體干細胞、間質干細胞、脂肪來源的間質干細胞、胚胎干細胞、誘導的多能干細胞、成纖維細胞、脂肪細胞的自體或供體細胞。本文可互換地使用的術語“活性劑”和“生物活性劑”是指引發(fā)期望的藥理、生理作用的化學或生物化合物，其中該作用可以是預防性的或治療性的。該術語還包括本文特別提及的那些活性劑的藥學上可接受的、藥理學上有活性的衍生物，包括但不限于鹽、酯、酰胺、前藥、活性代謝產物、類似物等等。當使用術語“活性劑”、“藥物活性劑”和“藥物”時，則應理解，申請人期望包括活性劑本身以及藥學上可接受的、藥理學上有活性的鹽、酯、酰胺、 前藥、代謝產物、類似物等。如本文所用的，“麻醉劑”應理解為提供減少感覺或敏感性的試劑。就本發(fā)明來講，麻醉劑通常是局部作用麻醉劑，提供接觸該試劑的組織的感覺或敏感性的減弱。局部麻醉劑包括但不限于苯唑卡因、氯普魯卡因、可卡因、環(huán)美卡因、二甲卡因/拉羅卡因、丙氧卡因、普魯卡因/奴佛卡因、丙美卡因、四卡因/ 丁卡因、阿替卡因、布比卡因、卡替卡因、辛可卡因/ 二丁卡因、依替卡因、左布比卡因、利多卡因/利諾卡因、甲哌卡因、哌羅卡因、丙胺卡因、羅哌卡因、三甲卡因、石房蛤毒素和河豚毒素。如本文所用的，“抗生素”應理解為破壞或殺死病原體和/或傳染原包括但不限于細菌和病毒的試劑?？股匕ǖ幌抻诎邢蚣毦毎?青霉素類、頭孢菌素類)或細胞膜(多粘菌素類)或干擾必需的細菌酶(喹諾酮類、磺胺藥物)的通常性質是殺菌性的那些抗生素。靶向蛋白合成的那些抗生素例如氨基糖苷類、大環(huán)內酯類和四環(huán)素類通常是抑菌性的。如本文所用的，“抗氧化劑”應理解為減少或防止形成超氧化物和/或氧化物自由基，或減少或防止由超氧化物和/或氧化物自由基引起的損傷的試劑?？寡趸瘎┌ㄗ杂苫宄齽ＴS多維生素包括維生素C和維生素E是抗氧化劑。其他抗氧化劑包括但不限于抗壞血酸(維生素C)、谷胱甘肽、褪黑激素和生育酚和生育三烯酚(例如維生素E)。用于本發(fā)明的抗氧化劑優(yōu)選是生物相容性的。如本文所用的，“自體”移植、提供等應理解為其中用于植入受治療者的脂肪組織的來源是源于同一個受治療者的程序。自體移植或提供可包括在從受治療者獲取組織和向受治療者再植入該組織之間加工該組織。如本文所用的，“基膜”應理解為襯于器官的內腔和表面的上皮之下或襯于血管的內表面上的內皮之下的纖維薄層。基膜的主要功能是將上皮錨定在其疏松結締組織下方。 這是借助于通過細胞黏附分子(CAM)的細胞-基質粘附實現?；さ鞍子杀砥ぜ毎騼绕ぜ毎置冢渫ǔ＝缍w內的邊界(通常“內對外(vs out)”)以在體內界定內腔，例如腸或膀胱具有表皮基膜，其界定內部空間或將內部空間與外部分開；或對于界定血管內腔的內皮細胞來講，其界定內部對外部(inside vs outside)。脂肪不界定空間或不用來分隔體腔或器官的內部對外部。脂肪ECM僅在其具有血管的程度具有基膜，血管具有基膜(且脂肪具有大量微血管)。脂肪本身不包括基膜。不像真皮，天然形成的脂肪不包括大量的BM， 真皮也是如此。天然形成的脂肪組織主要包括脂質。在制備本文所述的經加工的脂肪組織材料后，該材料基本上不含基膜，例如界定基膜的80%或更多的、90%或更多的、95%或更多的、97%或更多的、98%或更多的、99%或更多的材料從經加工的脂肪組織中去除。另外， 如本文所用的，通常認為基膜能夠封閉或劃分空間。基膜的組成是明確限定的。因此，本領域技術人員將能夠確定來源于基膜的材料。 基膜是兩個基片的融合體。它由約30-70納米厚度的稱作致密板的電子致密膜和平均30納米直徑且平均0. 1-2微米厚度的網狀膠原(III型)原纖維(其前體是成纖維細胞)的下層網絡(underlying network)組成。與在間質基質中發(fā)現的原纖維膠原相比，這種III型膠原具有網狀類型。除了膠原以外，這種支持性基質還包含固有大分子組分。致密板(其由IV型膠原纖維組成；基底膜蛋白聚糖(硫酸乙酰肝素蛋白聚糖))覆蓋這些纖維且其富含硫酸乙酰肝素)和透明板(由層粘連蛋白、整聯蛋白、巢蛋白和營養(yǎng)不良蛋白聚糖組成) 共同組成基底層。通過固著性原纖維(VII型膠原纖維)和微纖維(肌原纖蛋白)粘附在基底層的網狀板統(tǒng)稱為基膜。術語“膽汁酸”理解為主要發(fā)現于哺乳動物的膽汁中的類固醇酸。膽汁酸可起去污劑和表面活性劑作用。膽汁酸包括但不限于牛膽酸、甘氨膽酸、膽酸、鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸和石膽酸。當與聚合物關聯使用時，術語“生物相容性”是領域公認的。例如，生物相容性聚合物包括在所用濃度和量下其自身既不會對宿主產生毒性(例如，動物或人)，也不會以產生毒性濃度的單體或低聚體亞單元或其他副產物的速率在宿主中降解(如果聚合物降解的話)的聚合物。在本發(fā)明的某些實施方式中，生物降解通常包括將聚合物在生物體內降解成例如可能是已知實際上無毒的其單體亞單元。然而，由這種降解產生的中間體低聚體產物可能具有不同的毒理學性質，或者生物降解可能包括氧化或產生除聚合物的單體亞單元以外的分子的其他生化反應。因此，在某些實施方式中，可在一種或多種毒性分析之后測定期望用于體內用途，例如植入或注射到患者的可生物降解聚合物的毒理學。并不必須任何目標組合物具有100%的純度才被認為是生物相容性的；事實上，只需要目標組合物具有上述提到的生物相容性。因此，目標組合物可包括含有99%、98%、97%、96%、95%、90%、 85%,80%,75%,70%,60%,50%或更少的生物相容性的聚合物，例如包括本文所述的聚合物和其他材料和賦形劑，且仍是生物相容性的聚合物。為確定聚合物或其他材料是否是生物相容性的，可能需要進行毒性分析。這些測定是本領域熟知的。可用活的癌細胞例如GT3TKB腫瘤細胞以以下方式進行這種測定的一個實例將樣品在37°C下的IM NaOH中降解直到觀察到完全降解。然后用IM HCl中和該溶液。將約200 μ L的不同濃度的降解樣品產物置于96-孔組織培養(yǎng)板中并以IO4/孔的密度接種人胃癌細胞(GT3TKB)。將降解樣品產物與GT3TKB細胞孵育48小時?？蓪y試結果以相對增長％對組織培養(yǎng)孔中降解樣品的濃度繪圖。另外，也可通過熟知的體內試驗(例如大鼠皮下植入)評價本發(fā)明的聚合物、聚合物基質和制品以確定其不會在皮下植入部位導致顯著水平的刺激作用和炎癥。生物相容性材料也可包括適合植入受治療者的天然來源的產品，例如本文提供的無細胞脂肪生物材料。如本文所用的，“生物相容性生物材料”是適合用于哺乳動物，優(yōu)選用于人類受治療者的可用于組織重建例如面部重建、乳房重建、注射喉成形術(inection laryngoplasty)；治療性HIV蛋白酶介導的脂肪萎縮；整容手術例如乳房、臀部、小腿、胸肌、嘴唇和面頰填充術(cheek augmentation)，去除皺紋和填充缺陷包括傷疤、創(chuàng)傷性損傷、先天性缺陷、手術疤痕、燒傷和源自腫瘤切除的缺陷的材料。如本文所使用的，“胱天蛋白酶抑制劑”是防止蛋白酶胱天蛋白酶，也稱作半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶發(fā)揮作用的一類蛋白酶抑制劑，其參與凋亡、壞死和炎癥。胱天蛋白酶抑制劑包括但不限于胱天蛋白酶抑制劑I、II、III，胱天蛋白酶1抑制劑I、II、III，胱天蛋白酶2抑制劑，胱天蛋白酶3抑制劑等。如本文所使用的“接觸”應理解為使兩種或更多種組分以足夠的時間和在溫度、壓力、PH、離子強度等的合適條件下充分靠近(例如，生物相容性聚合物、交聯劑、表面活性劑和脂肪細胞；皮下脂肪組織和過乙酸)以允許兩種或更多種組分的相互作用，例如，形成包含脂肪細胞的膠凝生物聚合物基質；對脂肪組織脫細胞。就本發(fā)明來講，接觸可發(fā)生在反應容器例如試管中或待用本發(fā)明的組合物填充的受治療者的體腔中。本文所使用的“交聯的”是指包含由共價鍵、離子鍵、氫鍵或其任何組合的形成而引起的分子間交聯和任選的分子內交聯的組合物?！翱山宦摰摹笔侵改軌蜻M行反應以形成交聯的組合物的組分或化合物。如本文所用的，“交聯劑(cross-linker)”或“交聯劑(cross-linking agent)” 和類似表述應理解為包括至少兩個反應基以允許在具有相容性反應基的兩個其他分子之間形成共價連接即交聯的化合物。交聯劑包括對蛋白質或其他分子上的特定官能團(伯胺、巰基等)具有反應性的末端?？赡苁堑鞍踪|和肽中的反應靶標的多種化學基團是易于得到的，使其容易地偶聯和使用交聯法研究。在某些實施方式中，使用交聯劑以形成兩種天然形成的生物聚合物，例如存在于本發(fā)明的經加工的脂肪組織中的那些生物聚合物之間的交聯。這些交聯劑包括但不限于碳二亞胺(EDC)、1，6-己二異氰酸酯(HM C)、戊二醛、原花色素、核糖、蘇糖和賴氨酰氧化酶、碳二亞胺(例如，N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亞胺(EDC) )、N-羥基琥珀酰亞胺(MB)、聚環(huán)氧醚、二乙烯砜(DVS)、京尼平、聚醛和疊氮磷酸二苯酯(DPPA)、京尼平、環(huán)氧化合物、二醛淀粉、戊二醛、甲醛、辛二亞氨酸二甲酯、碳二亞胺、琥珀酰亞胺、二異氰酸酯、1，6_己二異氰酸酯(HM C)和酰疊氮；或其任何組合(例如， 2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多的交聯劑)?！吧锞酆衔锝宦搫焙皖愃票硎鰬斫鉃橛糜诶缛斯ど锞酆衔锘蚧瘜W修飾的天然形成的生物聚合物，即不是脂肪組織中存在的生物聚合物的生物聚合物的交聯劑。這樣的生物聚合物包括但不限于本文討論的透明質酸、水凝膠和其他可交聯的親水性、帶電荷的物質或以其他方式可共價交聯的物質。本文討論了用于脂肪組織中不存在的生物聚合物的合適交聯劑的選擇。本發(fā)明的聚合劑可包括單體、大分子單體、低聚體、聚合物或其混合物。聚合物組合物可單獨包括可共價交聯的聚合物、或可離子交聯的聚合物、或可通過氧化還原化學交聯的聚合物、或可通過氫鍵交聯的聚合物或其任何組合。聚合劑應當基本上是親水性和生物相容性的。如本文所使用的，“檢測(detecting)”、“檢測(detection) ”和類似表述應理解為進行樣品中的特定分析物鑒定的測定或方法。樣品中檢測到的分析物的量可以為0或低于該測定或方法的檢測水平。術語“凝膠(gel) ”是指介于液體和固體之間的物質狀態(tài)，且通常定義為溶脹在液體介質中的交聯聚合物網絡。通常，凝膠是包含固體和液體兩者的兩相膠體分散系，其中的固體的量大于表示為“溶膠(sol)”的兩相膠體分散系中的量。因此，“凝膠”具有液體的某些性質(即，形狀是有彈性的且是可變形的)和固體的某些性質(即，形狀是足夠不連續(xù)的以在二維表面上維持三維形狀)?！澳z凝時間(Gelation time) ”本文也稱作“膠凝時間 (Gel time)”是指在適度應力下使組合物變得不能流動而花費的時間。這通常顯示為達到其中彈性模量G'等于或大于粘性模量G"，即當損耗角正切(δ)變?yōu)?時(如可使用常規(guī)流變學技術測定)的物理狀態(tài)。如本文所使用的，“生長因子”應理解為能夠刺激細胞生長、增殖和細胞分化的天然形成的物質。通常其為蛋白質或類固醇激素。生長因子對于調控多種細胞過程包括細胞生長、分化、遷移和血管生成是重要的。生長因子通常作為細胞之間的信號傳導分子發(fā)揮作用。實例是與其靶細胞表面上的特異性受體結合的細胞因子和激素。生長因子包括但不限于骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、表皮生長因子(EGF)、促紅細胞生成素(EPO)、成纖維細胞生長因子(FGF)、粒細胞集落刺激因子爾-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、 生長分化因子9 (GDF9)、肝細胞生長因子(HGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、肌肉生長抑制素(myostatin，⑶F_8)、神經生長因子(NGF)和其他神經營養(yǎng)因子、血小板衍生生長因子 (PDGF)、促血小板生成素(TPO)、轉化生長因子α (TGF-α )、轉化生長因子β (TGF-β)和血管內皮生長因子(VEGF)?！巴该髻|酸”(HA)(也稱作“透明質烷”或“透明質酸酯”)是在整個結締組織、 表皮組織和神經組織廣泛分布的非硫酸化糖胺聚糖。它是細胞外基質的主要組分之一， 主要有助于細胞增殖和遷移，且也可參與某些惡性腫瘤的形成。HA的重復二糖單元是 (_4GlcUAi3 l-3GlcNAci3 1-)η。透明質酸的長度可以是25，000個二糖重復單元。體內HA 的聚合物的尺寸范圍可是5至20，000kDa。用于本發(fā)明的透明質酸可具有約5、10、25、50、 100、500、1000、2000、5000、7500、10，000、15，000 或 20，OOOkDa 或所提供的任何兩個分子量之間的任何范圍的分子量。待用HA的具體尺寸是終端用戶的選擇問題。例如，應充分理解， 較高分子量的HA具有針對許多應用的更好的粘度。然而，較低分子量的HA是血管生成性的，與較高分子量的HA相比，較低分子量的HA還產生更強的炎性反應。本領域技術人員應充分理解這些考慮因素。如本文所使用的，“水凝膠”應理解為能夠包含大體積分數的水的親水性交聯聚合物。更優(yōu)選地，根據本發(fā)明的水凝膠可包含大于約70-90體積％的水。當原位形成親水性聚合物時，本質上其可從其環(huán)境中或從用來制做水凝膠的溶液中獲得水。如本文所使用的，特別地用于“分離的脂肪”中的“分離的”應理解為將非脂肪組織或細胞與脂肪細胞外基質、組織或細胞分離以允許制備一種或多種本發(fā)明的生物材料。 “分離的脂肪”可包括例如來自組織樣品(諸如例如皮下脂肪)的固態(tài)的分離的脂肪，或例如來自脂肪抽吸物的液態(tài)的分離的脂肪。分離并不要求材料完全不含非脂肪物質。分離的脂肪應理解為包含至少70^^80^^85%,90^^95%或98%的脂肪細胞、組織、細胞外基質等。例如，可通過刮擦從組織樣品包括皮下脂肪中分離脂肪?？梢允褂帽绢I域已知的方法通過密度從脂肪抽吸物中分離脂肪。如本文所使用的，“試劑盒”應理解為包含用于本發(fā)明的方法中的一種或多種組分，其處于合適的包裝中或帶有使用說明。如本文所使用的，“脂肪抽吸物(lipoaspirate) ”是整容手術程序例如吸脂術的本來可丟棄的副產物(otherwise disposable byproduct)0如本文所使用的，“哺乳動物”應理解為哺乳動物類的任何動物。哺乳動物應理解為包括但不限于人類和非人類的靈長類、豬、狗、貓、牛、小鼠、大鼠、馬和兔子。如本文所使用的，“處理(manipulating) ”應理解為手動地(例如，像揉面包一樣) 或機械地(例如，使用混合器、均質器或攪切器(blender))以運作、按壓或分割大量的非液體材料例如脂肪以使所述材料與另一種材料例如緩沖液、干燥材料、溶劑、超臨界流體、酶等充分接觸。例如可進行處理以促進脫細胞化和/或從脂肪中去除脂質。如本文所使用的，“粉碎(mincing) ”應理解為例如通過任選地重復地研磨或切割材料或通過模具擠出材料來加工材料例如脂肪以提供細碎分割的材料。優(yōu)選材料足夠細小以允許試劑例如酸、去污劑、緩沖液、交聯劑與脂質接觸以滲透材料。應理解從組織中分離脂質的過程必然導致提供更小的組織片。如本文所用的“非離子去污劑”應理解為包括例如乙氧基化脂肪醇醚和十二烷基醚、乙氧基化烷基酚(ethoxylated alkyl phenols)、辛基苯氧基聚乙氧基乙醇化合物 (octylphenoxy polyethoxy ethanol compounds)、修飾的乙氧基化禾口 /或丙氧基化直鏈醇(modified oxyethylated straight-chain alcohols,oxypropylated straight-chain alcohols)、聚乙二醇單油酸酯化合物、聚山梨醇酯化合物和酚醛脂肪醇醚。更特別優(yōu)選的是Triton X-100、Triton X-114、來自BASF的Pluronics (例如以下作為表面活性劑列舉的那些)、來自ICI Americas Inc. ,Wilmington,Del.的為聚乙氧基化(20)失水山梨糖醇月桂酸酯的Tween 20、Tween 80，來自 BASF Wyandotte Corp. Parsippany, N. J.的為乙氧基化烷基酚(壬基)的Iconol NP-40 ；辛基-葡糖苷和辛基-葡糖硫苷。如本文所用的，“核酸酶”應理解為消化一種或多種核酸例如DNA和RNA的酶。核酸酶包括但不限于寡核苷酸酶、脫氧核糖核酸酶I、II、IV，限制性內切酶、UVrABC核酸內切酶、RNA酶III、RNA酶H、P、A、Tl，和微球菌核酸酶。用于本發(fā)明的經加工的脂肪組織中的核酸酶優(yōu)選是生物相容性和/或在向受治療者遞送經加工的脂肪組織之前變得失活或可被失活。本文中“獲得”應理解為制造、購買或以其他方式構成擁有。術語“藥學上可接受的載體或佐劑”是指可與本發(fā)明的化合物一起對患者施用的載體或佐劑，且該載體或佐劑不會破壞其藥物活性且當以足以遞送治療量的化合物劑量施用時是無毒性的。用于本發(fā)明的藥學上可接受的載體可以是無菌可注射制劑形式例如無菌可注射水懸浮液或油性懸浮液。可以使用合適的分散劑或濕潤劑(例如，諸如，Tween 80)和懸浮劑根據本領域已知的技術制備這種懸浮液。無菌可注射制劑也可以是在無毒性腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或懸浮液，例如l，3-丁二醇溶液?？刹捎玫目山邮苊浇槲锖腿軇┌ǜ事洞肌⑺?、林格氏液和等滲氯化鈉溶液。另外，通常使用無菌的不揮發(fā)性油作為溶劑或懸浮介質。為了這一目的，可使用任何非刺激性的不揮發(fā)性油，包括合成的甘油單酯或甘油二酯。脂肪酸例如油酸和其甘油酯衍生物可用于制備可注射劑，天然的藥學上可接受的油，例如橄欖油或蓖麻油，尤其是以其聚乙氧基化形式也是如此。這些油溶液或懸浮液還可包含長鏈醇稀釋劑或分散劑或羧甲基纖維素，或通常用于配制藥學上可接受的劑型例如乳劑和/或懸浮液的相似分散劑。其他通常使用的表面活性劑例如吐溫(Tween)或斯盤(Span)和/或通常用于制造藥學上可接受的固體、液體或其他劑型的其他相似乳化劑或生物利用度增強劑也可用于配制目的。如本文所使用的，“多個”應理解為意指多于一個。例如，多個指至少2、3、4、5、10、 25、50、100 或更多?！熬垡叶肌?PEG)(也稱作聚(環(huán)氧乙烷)(PEO)或聚氧乙烯(POE))具有式 H0-(CH2-CH2-0-)n-H且通常是線型(即，未支化)分子。用于本發(fā)明的組合物和方法中的聚乙二醇具有約1000MW至10，000MW的分子量。如本文所用的可聚合混合物是在有或沒有聚合引發(fā)劑存在下形成共價交聯網絡、 形成離子交聯網絡，或形成共價和離子交聯網絡的混合物的任何合適的可聚合聚合物、單體或單體和聚合物的混合物。根據本發(fā)明的可聚合混合物必須能夠形成對包封的細胞、或組織或待植入所述材料的受治療者無毒性的聚合網絡?？晒饩酆系木酆衔锸鞘褂糜赏獠縼碓刺峁┑妮椛湫纬晒矁r交聯網絡、或共價和離子可交聯的或親水的聚合物的混合物的任何合適的聚合物，當所述共價和離子可交聯的或親水的聚合物的混合物暴露于來自外部來源的輻射時，形成具有細胞懸浮于其中的半互穿網絡。根據本發(fā)明的可光聚合的混合物必須能夠形成對包封的細胞無毒性的聚合網絡。聚合引發(fā)劑是引發(fā)聚合物的交聯以形成水凝膠網絡的任何物質，且包括氧化還原齊U、二價陽離子例如鈣離子，和當暴露于可見光和/或UV輻射時形成活性物質的物質。光引發(fā)劑是特殊類型的聚合引發(fā)劑，當暴露于UV光和/或可見光時其產生活性物質且可用來引發(fā)可光聚合的混合物的聚合(即，交聯)。當以引發(fā)可聚合混合物的交聯需要的量使用時，根據本發(fā)明的聚合引發(fā)劑和光引發(fā)劑必須是對包封的細胞無毒性的。包封活細胞的水凝膠是具有高水分含量的親水性聚合物網絡。根據本發(fā)明的這些水凝膠可具有例如大于約70-90%的水分含量。根據本發(fā)明的這些水凝膠是對包封的細胞無毒性的且通過該聚合物網絡允許養(yǎng)分向細胞運動并允許廢物離開細胞?！熬酆弦l(fā)劑(polymerizing initiator) ”是指通過產生自由基引發(fā)單體或大分子的聚合的任何物質或刺激物。示例性的聚合引發(fā)劑包括電磁輻射、加熱和化合物?！按龠M脫細胞和脂質提取”的過程應理解為對樣品例如組織樣品的化學或物理處理(treatment)和/或操作(manipulation)以從材料中去除細胞和脂質。該過程可包括在一種或多種緩沖液存在下對樣品進行連續(xù)輪次的洗滌(washing)和操作。“提供”是指通過例如購買、制備或以其他方式構成擁有來獲得。“牢固粘附的活細胞”應理解為例如使用漂洗(rinse)細胞以更換生長培養(yǎng)基的常規(guī)方法而仍然粘附在經加工的脂肪組織上的有生命的、粘附細胞。例如，使用例如以下實施例中提供的那些方法對粘附在基質上的細胞拍照，通過常規(guī)漂洗方法牢固粘附的活細胞仍然保持粘附在經加工的脂肪組織上。通過進行常規(guī)細胞染色方法(例如，免疫熒光、臺盼藍等)并在細胞培養(yǎng)物中使用的漂洗和/或洗滌步驟、免疫熒光染色或本文提供的其他細胞染色和處理方法后，測定到50 %或更多、60 %或更多、70 %或更多、80 %或更多、90 %或更多、或95%或更多的最初粘附在經加工的脂肪組織上的活細胞仍保持粘附，可以確定活細胞牢固地粘附著，或確定材料是否允許細胞的牢固粘附。如本文所使用的，“溶液(solution) ”是指溶液(solution)、懸浮液(suspension) 或膠體(colloid)。
本文使用術語“空間”以描述注射或植入本發(fā)明的組合物凝固的位置，且被寬泛地定義，且可包括模具內形成的腔、因在組織中手術形成的腔或可手術接近的組織中天然存在的腔、皺紋或待用本發(fā)明的組合物和方法修復的其他組織畸變。如本文所使用的，“受治療者”應理解為動物，優(yōu)選哺乳動物例如小鼠、大鼠、狗、 貓、猴、牛、豬或人類或非人類靈長類。人類受治療者也可稱作患者。如本文所使用的，“實質性免疫反應(substantial immune response) ”應理解為在植入經加工的脂肪組織之后需要醫(yī)療專業(yè)人員介入(例如，需要去除經加工的脂肪組織、施用免疫抑制藥物)的受治療者的免疫反應；或致使植入的經加工的脂肪組織的壽命明顯縮短，例如將植入的經加工的脂肪組織的持續(xù)時間減少50%或更多、至少60%或更多、至少70%或更多、至少80%或更多、或至少90%或更多，且其中植入的經加工的脂肪組織被包括但不限于巨噬細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞的至少一種類型的炎性細胞浸潤的受治療者的免疫反應。實質性免疫反應不包括隨時間減弱的植入部位的暫時且短暫的 (例如，一周或更短、6天或更短、5天或更短、4天或更短、3天或更短、2天或更短、或1天或更短、)常規(guī)發(fā)紅、刺激和腫脹，且不可以是對植入組織本身的反應，而是對由于與植入有關的皮膚或組織的破壞或拉伸弓I起的皮膚或其他鄰接的組織的破壞的反應。如本文使用的“表面活性劑”是幫助在所述的生物材料、水凝膠或其他生物材料溶液中乳化脂肪組織的組合物，該組合物包含具有大于或等于18的HLB (親水性-親脂性平衡)值的直鏈聚醚表面活性劑或任何組合，被證實是臨床使用安全的。直鏈聚醚表面活性劑可從商業(yè)來源獲得，包括但不限于BASF Wyandotte Corp (Wyandotte,Mich)的Pluronic 。已知表面活性劑的HLB值是決定聚醚表面活性劑的乳化特性的主要因素。通常，具有較低HLB值的表面活性劑是更親脂性的，而具有較高HLB 值的表面活性劑是更親水性的。BASF Wyandotte Corp提供了多種泊洛沙胺和泊洛沙姆的 HLB 值。具有大于或等于18的HLB值的合適的直鏈聚醚表面活性劑包括但不限于例如具有31的HLB和4700的平均分子量(AMW)的Pluronic F38 (BASF)、具有29的HLB和8400 的 AMW 的 Pluronic F68 (BASF)、具有洸的 HLB 和 7700 的 AMW 的 Pluronic 68LF (BASF)、 具有 25 的 HLB 和 6600 的 AMW 的 Pluronic F77 (BASF)、具有 24 的 HLB 和 7700 的 AMW 的 Pluronic F87 (BASF)、具有沘的 HLB 和 11400 的 AMW 的 Pluronic F88 (BASF)、具有沘的 HLB 和 13000 的 AMW 的 Pluronic F98 (BASF)、具有 27 的 HLB 和 14600 的 AMW 的 Pluronic F108 (BASF)、具有 22 的 HLB 禾口 12600 的 AMW 的 Pluronic F127 (BASF)、具有 19 的 HLB 禾口 1900 的 AMW 的 Pluronic L35 (BASF)、具有 27 的 HLB 和 12200 的 AMW 的 iTetronic 707 (BASF)、 具有31的HLB和25000的AMW的iTetronic 908 (BASF)。優(yōu)選的具有大于或等于18的HLB 值的直鏈聚(環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷)(ΡΕ0-ΡΡ0-ΡΕ0)嵌段共聚物，Pluronic表面活性劑是 Pluronic F38 、Pluronic F68 、Pluronic 68LF 、Pluronic F77 、Pluronic F87 、 Pluronic F88 、Pluronic F98 、Pluronic F1(l8 和 PluronicF127 。更優(yōu)選的 Pluronic 表面活性劑是 Pluronic F127 。為獲得脂肪組織所需的HLB，聚醚表面活性劑或與水性組合物組合的聚醚表面活性劑的重量百分比是從約2. 0至約10. 0。更優(yōu)選地，總的組合量的范圍是4. 0至8. 0重量百分比。
如本文所使用的“弱酸”在本文中應理解為在溶液中不完全解離的酸，例如過乙酸 (PAA)、乙酸、硼酸和磷酸。本文提供的范圍應理解為范圍內的所有值的簡寫。例如，范圍1-50應理解為包括由 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49 和 50 組成的組的
任何數字、數字的組合或子范圍?！爸辽佟蹦硞€值應理解為該值或更大。例如，“至少10”應理解為“10或更大”；至少20”應理解為“20或更大”。如本文所使用的，“少于”特定值應理解為是指該值或更少。 例如，“少于10”應理解為是指“10或更少”。除非特別指明或從上下文看是明顯的，否則如本文使用的術語“或”應理解為是包括在內的(inclusive)。除非特別指明或從上下文看是明顯的，否則如本文使用的術語“一個(a) ”、“一個 (an)，，和“該(the)，，應理解為單數或復數。除非特別指明或從上下文看是明顯的，否則如本文使用的術語“約”應理解為在本領域的正常公差范圍內，例如在平均數的2個標準差范圍內。約可理解為在所述值的10%、 9%,8%,7%,6%,5%,4%,3%,2%U%>0. 5%,0. 1%,0. 05%或 0. 01% 內。用于本文變量的任何定義的化學基團列舉的敘述包括將該變量定義為列出基團的任何單一基團或組合。對本文的變量或方面的實施方式的敘述包括為任何單一實施方式或與任何其他實施方式或其部分的組合的實施方式。本文提供的任何組合物或方法可以與本文提供的任何其他組合物和方法中的一種或多種組合。附圖簡述圖IA-C示出了用于植入的脂肪抽吸物脂肪組織。A)表示脂質和水性PEG混合物。 最左邊的試管不含表面活性劑。相分離是明顯的。向右移動，已加入漸增濃度的表面活性劑顯示乳化效果提高；B)示出了溶于不同比例的脂肪抽吸物和HA(10%-50%)的10% w/ ν PEG ；和C)示出了皮下注射脂肪抽吸物和PEG和HA之后的無胸腺小鼠。圖2A-D示出了 A)在無胸腺裸小鼠的背部的軟組織植入物的整體圖像；B)具有軟組織植入物的Sprague-Dawley大鼠的T2MRI，允許測量體積；和C-D)繪制C)市售植入物和 D)帶有或沒有透明質酸的細胞脂肪組織的高度和體積對時間作圖，且已發(fā)現與植入的脂肪組織和市售注射用皮膚填充劑的已知臨床持久性相關。圖3A-C =A)示出了加工前(pre-processed)的帶有下方皮下脂肪組織的腹壁成形術供體皮膚的樣品。B)用不同濃度(0. 1%-5%)的過乙酸(PAA)持續(xù)3或6小時的脂肪組織的整體圖像(上)和H&E染色的圖像(下)。C)示出了加工前的脂肪組織的H&E染色，具有深紫色(蘇木精)染色的細胞核和反映填充脂質的空泡(vacuole)的空白空間結構。與加工前的脂肪組織(A)的整體圖像相比，隨PAA的濃度增加發(fā)現特征黃色減弱(B)。 如(C)中所示，C)示出了深紫色蘇木精染色的細胞核和加工前的組織中的空泡空白空間不再存在于經加工的組織(B)中，證實了在加工方法期間發(fā)生了脫細胞化和ECM的壓縮。圖4.量化與未經加工的脂肪組織(對照)相比的依照多種加工方法的樣品組織中的剩余DNA含量的DNA測定。
圖5A-E為確認多種加工方法能夠去除免疫原性和炎性細胞成分包括DNA和脂質， 但仍保存ECM組分，量化了 A)剩余蛋白質含量，B)膠原含量和D)GAG含量，并與對照比較。 C) I型膠原免疫染色(褐色染色)和E)將番紅-0(紅色染料)在組織學樣品上進行，證實了用來量化膠原和GAG的存在的生化測定。圖6.脂肪組織暴露于多種加工方法之后對復數粘度的生物力學效應。復數粘度隨使用的PAA的濃度增加而減少。圖7A-D表示A-B)植入后40天無胸腺小鼠中植入的經加工的脂肪組織的整體圖像；C)第45天大鼠體內的植入的經加工的脂肪組織；和D)第45天大鼠體內的經加工的脂肪組織植入后的4xH&E染色。圖8A-C示出了通過在大鼠動物模型中持續(xù)21天測量的PAT皮下植入物的A)體積比和B)高度來測量體內持久性。C)第7天和第21天的植入材料的H&E染色，表現出由深色染色的白細胞、中性粒細胞或巨噬細胞證實的細胞流入和最小炎癥。盡管體積測量表明持久性隨時間減少，組織學分析表明植入位點緊縮，可能表示組織整合。圖9A-F示出了使用精細粉碎的脂肪組織的脂肪組織加工的步驟。A)示出了從腹壁成形術過程得到的脂肪組織樣品的實例。B)示出了用3%PAA和TX-100處理之后的經加工的脂肪組織基質。C)示出了 H&E染色的完整脂肪組織的組織學圖像，和D)示出了 H&E 染色的脫細胞脂肪組織的組織學圖像，顯示沒有細胞組分殘留。結果來自用從0. 1% -5% 的不同過乙酸濃度處理3小時的組織的E)DNA定量和F)膠原測定。

圖10示出了指定的放大倍數下的沒有細胞的經加工的脂肪ECM的掃描電子顯微鏡圖像(上)和用細胞接種10天的處理的脂肪ECM的掃描電子顯微鏡圖像(下)。圖11示出了當將未交聯的對照組織和交聯的ECM與膠原酶孵育時，通過M小時內降解的總膠原的百分比測定的未交聯和交聯的PhAT對酶降解的耐受性。A)示出了用 5-100mM EDC交聯的PhAT(脂肪ECM)。B)示出了用Tween 20中的和5% HM C交聯的PhAT。C)示出了用2-丙醇(100% )中的和5% HM C交聯的PhAT。圖12示出了兩周體內大鼠皮下植入研究的結果。對于A)未交聯的對照，B)5mM EDC交聯的，和C) Tween-20中的1 % HM C交聯的ECM，通過皮下注射植入2周之后脂肪ECM 的整體圖像(上)和組織學圖像(下)。如13A-H示出了兩周之后在植入物界面(A-F)處和植入物中心處(G-I)的皮下植入物的組織學。由星號表示在界面處拍攝的植入的細胞外基質的圖像，(A、D、G)對照，(B、 E、H) 5mM EDC交聯的和(C、F、I) Tween 20中的1 % HM C交聯的組織。詳述和優(yōu)選實施方式本發(fā)明提供了生物相容性生物材料，制備所述生物材料的方法，和植入本發(fā)明的生物材料的方法。在重建手術領域，迫切需要合適的軟組織替代物。脂肪組織仍然是修復由創(chuàng)傷和手術切除腫瘤引起的軟組織缺陷，或先天性畸形缺陷的所選的組織。然而，目前的自體脂肪移植技術具有許多缺點。脂肪移植的持久性相差很大，在文獻中報道了 30-90%之間的任何處的持久性。持久性經常取決于外科醫(yī)生、技術和患者。持久性的這些損失需要多種程序來維持期望的修正。與自體脂肪移植有關的供體部位發(fā)病也是一個嚴重的問題。另外，植入的脂肪組織經常導致手術后鈣化。對于具有乳腺癌病史經歷乳房切除之后的乳房重建的女性來講這是特別重要的，因為鈣化可干擾乳房造影讀數并導致多次的不必要的乳房活檢和憂慮。最后，對于患脂肪代謝障礙的許多HIV患者或經歷癌癥化療和放射的患者來講，有關的惡病質使他們不具有其將需要的用于自體脂肪移植的脂肪體積。由于這些原因，保留脂肪組織的機械和生物特性的可預測的、“即用的”材料將是軟組織缺陷重建和軟組織增容的理想材料。再生醫(yī)學的一個目標是提供組織替代物。雖然經常使用生物材料和細胞再生新組織，這些方法往往是昂貴的且形成新組織消耗大量的時間。最近，已經由經加工的皮膚、骨骼、膀胱、血管、腸膜和羊膜制造出組織替代物，且用于臨床上的多種應用。已采用多種加工方法對組織脫細胞化，剩下細胞外基質(ECM)，細胞外基質由理想地適合于支持和維持組成特定組織的細胞的結構蛋白和功能蛋白的獨特的組織特異性的聚集組成。(Reing，2009. Tissue Engineering(組織工禾呈)15 :605)之前的研究已表明在皮下脂肪組織中特別發(fā)現的ECM組分，糖蛋白、生長因子和糖胺聚糖(GAG)具有誘導脂肪生成的潛力。為了利用皮下脂肪組織的固有生物活性以制造有利于脂肪組織重構的基質，我們已經研究了許多加工脂肪組織的方法。脂肪組織處理的方法學取決于分別導致炎性反應和局部毒性反應的細胞和脂質的去除。最終的經加工的人脂肪組織(PhAT)是無細胞的并包括極少脂質殘留物至沒有脂質殘留物，還保持了脂肪組織的固有結構和生物活性。這種PhAT提供了待用于軟組織重建和增充的原位組織形成的體積和支架。本發(fā)明提供的第一類生物相容性生物材料，基于細胞的生物相容性材料，包括在表面活性劑存在下與支架連接的(in conjunction with a scaffold)，優(yōu)選生物相容性聚合物可交聯的支架連接的生物材料(水，經常以水凝膠形式)和脂(脂肪)溶性分子的組合。這種生物材料是基于脂肪細胞的生物材料，且移植物優(yōu)選來自自體供體?？赏ㄟ^表面活性劑的選擇和濃度來改變混合的程度。必要時可以加工脂肪，且生物材料的選擇可包括許多標準生物材料組分。在支架存在下將水和脂肪組合在一起的重要性在于以下1)支架為脂肪中的細胞提供了三維框架/支架以更好地形成組織(即，較大的體積)。2)某些生物材料(即，透明質酸)可誘導血管形成，這幫助形成脂肪并提供較大的體積。由于優(yōu)選通過注射進行植入本發(fā)明的生物材料這一方案，可采用多次注射以建立較大的組織結構。通過使用表面活性劑系統(tǒng)，該第一類生物相容性生物材料允許透明質酸以及其他材料包括水凝膠與自體脂肪組合。這種系統(tǒng)允許親水性生物材料和脂質乳化到其他不混溶的材料中。結果是與之前的填充劑材料相比具有更大體積和增長壽命的可注射生物材料， 因此與單獨脂肪或填充劑移植相比，改善了臨床結果，同時保持了臨床使用的容易性和期望的質地。本發(fā)明提供了第二類生物相容性生物材料，其為無細胞脂肪生物相容性生物材料也表述為經加工的脂肪組織(PAT)。這種無細胞生物材料來自于供體脂肪組織，但是，由于從組織中去除了細胞材料，其是無免疫原性的且可用于非自體捐贈。通過提供“即用的”生物相容性生物材料(填充劑)，這提供了使用生物材料的更大的方便性和標準化。例如通過脫細胞化，優(yōu)選對脂肪組織化學脫細胞，生產無細胞材料。由于材料的硬度，在每一個洗滌步驟在樣品上進行機械或手工操作以確保經加工的組織樣品與洗液的合適混合?？赏ㄟ^進行勻漿和在無菌鹽或緩沖液中連續(xù)洗滌來中和，優(yōu)選緊接著連續(xù)在溶液中洗滌進一步從細胞中提取脂質，例如有機過氧化物例如過乙酸(約0. 1% -10% v/v，優(yōu)選約0. 5%至約3% v/v，優(yōu)選約ν/ν)或膽汁酸例如脫氧膽汁酸(約0. -10% w/v, 優(yōu)選約0. 5%至約2. 5% w/v，優(yōu)選約w/v)可實現無細胞脂肪生物相容性生物材料的制備。任選地在酸洗后，在非離子去污劑(例如本文提供的那些去污劑，包括于緩沖液例如磷酸緩沖鹽溶液(PBS)或水中的Triton-X 100或吐溫20 (約0. -10% v/v，優(yōu)選約0. 5% 至約2. 5% v/v，優(yōu)選約v/v))中連續(xù)洗滌。任選地，可在膽汁酸、弱酸和/或非離子去污劑洗滌之后緊接著在有機溶劑例如二氯甲烷/甲醇O 1)中洗滌以去除材料中的殘留脂質并產生均一的白色生物支架。然而另一選擇是使材料通過超臨界流體例如液體二氧化碳，隨后蒸發(fā)二氧化碳并從材料中分離脂質，從而避免使用毒性有機化合物。然后通過任何合適的方法包括但不限于Y射線輻射和/或用環(huán)氧乙烷處理對材料滅菌?？捎萌魏畏栏瘎┗虮Ｗo劑補充這一步驟以減輕對材料的損害。然后，經加工的脂肪組織形成為期望尺寸的顆粒，優(yōu)選允許注射，且任選地在向受治療者注射前，與合適的生物材料例如可聚合生物聚合物支架在具有或沒有一種或多種交聯劑下混合。為了儲存和在使用前再水合，在形成顆粒之前或之后，可以凍干材料。必要時，在注射后使注射的材料經受交聯活化劑(例如， 合適波長的光)處理。本領域技術人員應充分地理解這些考慮因素。之前的研究已表明在皮下脂肪組織中發(fā)現的細胞外基質(ECM)成分、糖蛋白、 和糖胺聚糖(GAG)具有誘導脂肪生成的潛力⑴riel等人，2008，The Role of Adipose Derived Protein Hydrogels in Adipogenesis(脂肪來源的蛋白質水凝膠在脂肪生成中的作用KBiomaterials. 29 :3712_3719，通過引用并入本文)。利用皮下脂肪組織的固有生物活性，本發(fā)明通過加工脂肪組織產生有利于脂肪組織重建的基質，提供了組織來源的材料。 脂肪組織處理的方法學取決于分別導致炎性反應和局部毒性反應的細胞和脂質的去除。最終的經加工的脂肪組織(PAT)是無細胞的并包括極少脂質殘留物至沒有脂質殘留物，還保持了脂肪組織的固有結構和生物活性。類似于通常用于皮膚替代物和疝氣修復的即用的無細胞皮膚填充劑Alloderm ，這種PAT提供了用于軟組織重建和增充中的原位組織形成的體積和支架。如本文指出的，可加工皮下脂肪組織以去除細胞和脂質，同時保留細胞外基質的固有結構。經加工的組織的組織學特征是不含在未經加工的脂肪組織中觀察到的有核細胞和脂質空泡(例如，圖3和9)。最佳加工方法去除了組織的所有免疫原性組分，例如細胞和細胞碎片包括脂質， 同時保持了 ECM的功能和結構特性。為了鑒定最佳保存ECM的加工方法，除了由多種加工方法產生的PhAT的流變特征之外，我們還測定了蛋白質、膠原和糖胺聚糖(GAG)含量。 在用PAA和DNA酶1處理的樣品中，蛋白質含量仍是最大的，其中脂肪組織被暴露于1%， 800 μ g/mg的過乙酸6小時。在所有情況下，蛋白質含量大于對照，100μ g/mg。這可通過加工期間發(fā)生的組織緊縮解釋。與未經加工的脂肪相比，其中脂質對樣品的總重量貢獻最大， 加工后，現在等重的樣品包括緊縮的ECM，有效地濃縮所得材料中的基質組分和蛋白質。暴露于過乙酸(30-45 μ g/mg) 6小時的PhAT的膠原含量和暴露于3%過乙酸(30-45 μ g/ mg) 3或6小時的PhAT的膠原含量明顯高于對照O μ g/mg, ρ < . 05，圖5A_C)。暴露于1 % 3小時基本不會去除脂質解釋了未見這種濃縮效應且膠原含量與對照相似的原因。雖然是脂質減少的材料，暴露于5%過乙酸3或6小時致使膠原含量與對照的膠原含量相似，表明在這種情況下，發(fā)生了膠原降解。I型膠原免疫染色證實了膠原測定的結果。在用3%過乙酸產生的PhAT中GAG含量也是最高的，并隨著過乙酸濃度的增加或減少而減少(圖5C)。 用番紅-0進行組織學分析也證實了這一點(圖5D)。僅在認為是體內試驗的潛在候選PhAT上進行了用PAA和DNA酶1制備的PhAT的進一步特征研究。因此，在剩下的研究中僅包含了具有最小脂質含量，3%和5%，的PhAT。 作為測定哪種加工方法對基質完整性有最小影響的另一種方法，在加工之前和之后獲得了剪應變曲線。流變測試表明暴露時間和酸濃度都影響復數模量(圖6)。用3%過乙酸加工 3小時的PhAT最接近加工前的脂肪組織。當在酸中孵育6小時，這種PhAT變得難以與5% χ 3小時的PhAT區(qū)分。當暴露于5%過乙酸6小時后產生PhAT時，發(fā)生復數模量的最大減少。在接種人間質干細胞的3%和5% PhAT的細胞成活力(cell viability)研究中也反映了在不同PhAT的機械特性中所見的趨勢。這表明在脫細胞期間發(fā)生的結構變化伴有生物學變化，影響細胞粘附和成活力。伴隨細胞接種，在第1天和第7天進行了存活/死亡測定。在每種情況下，在經加工的脂肪組織上培養(yǎng)M小時之后存在活細胞。更大的細胞成活力發(fā)現于3% PAA(3和6小時)而5% PAAx3小時的成活力減小，且5% PAAx6小時的成活力幾乎最小。到第7天，僅在用3%PAA加工的PAT中活細胞數量超過死細胞(紅色核染色)。為發(fā)揮軟組織替代材料的功能，必須驗證生物相容性和持久性。為評價對PhAT的體內反應和PhAT的穩(wěn)定性，在大鼠中皮下植入了 3%和5% PhAT并隨時間監(jiān)控。第1周和第3周的組織學特征表現出最小量的炎性反應(通過中性粒細胞、單核細胞和多核巨細胞的存在測量)且沒有纖維包封或組織壞死的跡象。圖8C中示出了植入材料的代表性組織學圖像。有細胞流入組織的跡象，考慮到其成纖維細胞形態(tài)，最有可能由成纖維細胞組成。 很少鑒別到完整內腔的血管(full lumen vessel) 0卡尺測量表明在第1周絕對高度和體積比初步減少，其在3周后顯示出趨于平穩(wěn) (圖8A-B)。收獲期組織的組織學外觀表現出遠大于其在植入前的外觀的組織密度，表明盡管某些初步降解可能造成了植入物的體積隨時間減少，大鼠肌肉皮膚下的組織壓縮也可能有助于初步體積減少。使用用PAA/TX-100/DNA酶I制備的PhAT的觀察值與未用DNA酶I制備的那些 PhAT的相似。進一步地，PhAT的交聯提供了仍具備生物相容性的更大蛋白酶抗性的材料。去除足量的細胞脂質碎片是加工脂肪組織中的重要挑戰(zhàn)，細胞脂質碎片具有誘發(fā)炎癥和毒性的潛力。在我們的研究中，至少3% w/v濃度的過乙酸(PAA)致使脂質大量減少。所得的PhAT的特征表明對基質成分，包括蛋白質、膠原和糖胺聚糖(GAG)的濃縮效應。 正是這些ECM組分的保留維持了這種材料的指導能力(instructional capacity)。當接種 MSC時，用3% PAA制備的PhAT還能夠支持細胞粘附，表明加工方法不明顯改變其結構和生物學特性。我們認為這種材料具有臨床移植的重要潛質并因此研究了其體內生物相容性。由于觀察到最小炎性反應，因此沒有排斥或有毒性的跡象且沒有組織壞死的跡象。但是，在植入材料的中心觀察到細胞，表明組織整合到大鼠皮下空間內的可能性，該處的可用脂肪墊最小。
體積持久性是臨床使用這種材料的另一問題?？ǔ邷y量研究表明體積的初步下降，但是，當收獲材料時，得到整體上和組織學上都更加致密的材料。不受機制約束，我們認為除了某種降解之外，材料的壓縮也可以解釋持久性圖。作為生物材料，我們期望當摻入和重塑PhAT時發(fā)生某種降解，但是，成為完全摻入的組織將具有長期的持久性。脫細胞組織已對重建手術做出了重要貢獻。臨床使用方面，已表明無細胞真皮和骨促進組織整合和修復。盡管其他人例如Flyrm等人已對多種組織例如胎盤脫細胞化，目的是制備脂肪生成支架，這種技術還沒有直接應用于脂肪組織。隨著我們對細胞外基質在組織生成中的作用的了解增加，顯然基質組分不僅僅在組織中起結構性作用，而且活躍地參與細胞增殖、遷移和分化及最終的組織形成的指導方面。最近已闡明了很多關于多種ECM 降解組分在影響細胞遷移和增殖方面的作用。就ECM起這種指導作用來看，我們留意了原始組織，即脂肪組織本身，認為其唯一適合提供脂肪生成的指導。在這個研究中，我們證明了脂肪組織可被成功地脫細胞化并且用作軟組織重建的潛在材料。去除足量的細胞脂質碎片是加工脂肪組織中的重要挑戰(zhàn)，細胞脂質碎片具有誘發(fā)炎癥和毒性的潛力。在我們的研究中，至少3% w/v濃度的過乙酸(PAA)致使脂質大量減少。機械加工的后續(xù)優(yōu)化已證明可在更低的PAA濃度下進行提取更多的脂質。所得的PhAT 的特征表明對基質組分，包括蛋白質、膠原和GAG的濃縮效應。正是這些ECM組分的保留維持了這種材料的指導能力。當用MSC接種時，用3% PAA制備的PhAT具有與未加工的脂肪組織相同數量級的流變特征且也能夠支持細胞粘附，表明加工方法不明顯改變其結構和生物學特性。我們認為這種材料具有臨床移植的重要潛質并因此研究了其體內生物相容性。由于觀察到最小炎性反應，沒有排斥或有毒性的跡象，且沒有組織壞死的跡象。這些研究使用小的植入物尺寸，200μ 1。但是，在植入材料的中心觀察到成纖維細胞樣細胞，表明組織整合到大鼠皮下空間內的可能性，該處的可用脂肪墊最小。其他人已表明當靠近脂肪組織植入Matrigel 時，其具有體內生成脂肪的潛力7。關于在大鼠的附睪脂肪墊附近植入的進一步研究將探索例如，如人們將在乳房中所期望的，當與脂肪環(huán)境接觸時PhAT的生成脂肪的潛力。另外，當暴露于基質膠時，宿主細胞經刺激變成脂肪細胞。研究已確定基膜組分，尤其是IV型膠原和層粘連蛋白引起生成脂肪的潛力。因為脂肪組織是高度血管化的組織，發(fā)現于脂肪組織中的許多微血管的基膜蛋白質可能將授予它這種生成脂肪的潛力。本發(fā)明提供了可注射生物材料的用途，包括本發(fā)明的生物相容性生物材料特別適合的隆胸。本發(fā)明的生物材料的使用提供了有關現有填充劑問題的解決辦法并允許例如在乳房重建中去除疤痕、縮短手術和麻醉時間、消除對合成乳房植入物的異物反應，以及提供更自然的感覺。緊迫尋求延長移植的自體脂肪持久性的方法。已在許多組織類型中使用生物材料用于這一目的。將生物材料應用于脂質組織的主要限制是當混合親水性生物材料和脂質時的相分離。通過使用表面活性劑，本文提供的組合物和方法克服了這些缺點，從而有助于將多種生物材料應用于脂質組織?？商娲?，本發(fā)明的組合物提供了脂肪細胞支架而無需將脂肪細胞摻入生物材料中。目前市售填充劑的使用受到體積和壽命的限制。盡管自體脂肪提供了較大的體積，其低移植成活率限制了其使用，這部分地是由細胞壞死。通過開發(fā)用于將基于生物材料的支架例如透明質酸或水凝膠與脂肪組合的組合物和方法，同時解決了這兩個問題。脂肪和生物材料例如生物相容性聚合物的組合提供了直接更大體積(immediately greater volume)的生物材料。第二，本發(fā)明的組合物利用了透明質酸和其他生物材料作為支架以及作為增加體積的生物材料的雙重性質，因此提供了允許細胞附著、血管內生(vascular ingrowth)和與生長因子相互作用的網絡，這解決了被認為是導致不理想的脂肪移植物存活的細胞死亡問題。例如，本發(fā)明的PAT可與新鮮的自體脂肪抽吸物或含有其他細胞的混合物、與天然生物材料例如透明質酸、硫酸軟骨素、膠原、彈性蛋白或層粘連蛋白，或其他生物材料例如生物相容性聚合物和粘合劑組合以用于多種應用中的任何一種。本發(fā)明提供了表面活性劑系統(tǒng)以允許不同親水性支架組合，包括市售透明質酸和水凝膠與待用于脂肪移植的疏水脂肪組織的結合。目前，脂肪抽吸物不經加工地在期望的位置注射。通過使用本文提供的表面活性劑系統(tǒng)，在再注射脂肪抽吸物之前，用脂肪組織適當地乳化親水性生物材料現在是可能的。通過給成熟脂肪細胞和前脂肪細胞提供待粘附的支架，這具有增加自體脂肪移植物物成活率的期望作用。另外，使用生物材料支架作為遞送劑能夠摻入多種促生長因子，以刺激脂肪生成，從而提高移植物成活率，這是本脂肪移植技術的另一新穎性。本發(fā)明的修改包括使用本文提供的特別是與細胞生物材料一起使用的多種表面活性劑。進一步的修改包括使用多種生物材料，包括作為市售填充劑的聚二丙烯酸乙二醇酉旨(PEG-A)、透明質酸(HA)，包括但不限于 Restylane、Juvaderm、Captique, iTeoxyl。本發(fā)明還提供了將間質干細胞(MSC)、胚胎干細胞(ES)、脂肪組織源性干細胞 (ASC)、成纖維細胞以及其他細胞類型摻入到生物材料包封的脂肪抽吸物中。進一步的改變包括修改支架以包括肽、激素、生長因子、維生素、受體、藥物和其他調節(jié)因子。臨床應用包括面部重建、乳房重建、注射喉成形術、治療性HIV蛋白酶介導的脂肪萎縮、整容手術例如乳房、臀部、小腿、胸肌、嘴唇和面頰填充術，去除皺紋和填充缺陷包括傷疤、創(chuàng)傷性損傷、先天性缺陷、手術疤痕、燒傷和源自腫瘤切除的缺陷?？山宦撚H水性聚合物合適的親水性聚合物包括合成聚合物例如聚(乙二醇)、聚(環(huán)氧乙烷)、部分或完全水解的聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙基噁唑啉)、聚(環(huán)氧乙烷)_共-聚 (環(huán)氧丙烷)嵌段共聚物(泊洛沙姆和美羅沙泊)、泊洛沙胺、羧甲基纖維素和羥烷基化纖維素例如羥乙基纖維素和甲基羥丙基纖維素，和天然聚合物例如多肽、多糖或碳水化合物 (諸如Ficoll )，聚蔗糖、透明質酸、葡聚糖、硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素、肝素或藻酸鹽，和蛋白質例如明膠、膠原、白蛋白或卵白蛋白或其共聚物或，混合物。如本文使用的，“纖維素” 包括纖維素和上述類型的衍生物；“葡聚糖”包括葡聚糖和其類似衍生物?？捎脕硇纬伤z的材料的實例包括修飾的藻酸鹽。藻酸鹽是從海草分離到的碳水化合物聚合物，例如WO 94/25080(其公開內容通過引用并入本文)中所述的，通過暴露于二價陽離子例如鈣，藻酸鹽可交聯形成水凝膠。在二價陽離子存在下、在水中、在室溫下， 藻酸鹽被離子交聯以形成水凝膠基質。可合成修飾的藻酸鹽衍生物，其具有提高的形成水凝膠的能力。使用藻酸鹽作為起始材料是有利的，因為藻酸鹽可從多于一種來源獲得，并且具有良好的純度和特征。如本文使用的，術語“修飾的藻酸鹽”是指具有改性水凝膠特性的化學修飾的藻酸鹽?？蓪μ烊恍纬傻脑逅猁}進行化學修飾以產生更快降解的藻酸鹽聚合物衍生物。例如，可以化學裂解藻酸鹽以產生更小嵌段的可膠凝低聚糖嵌段并且可形成帶有另一個預選部分例如乳酸或己內酮的線型共聚物。所得的聚合物包括允許離子催化膠凝的藻酸鹽嵌段和根據合成設計產生更快降解的低聚酯嵌段?？商娲?，可使用藻酸鹽共聚物，其中甘露糖醛酸與古洛糖醛酸的比例不會產生由疏水的、水不穩(wěn)定鏈衍生而來的薄膜凝膠，例如己內酮的低聚體。疏水作用誘導膠凝，直到其在體內降解。另外，使用與可用于上述交聯藻酸鹽的那些方法類似的方法，可交聯通過暴露于單價陽離子而膠凝的多糖(包括細菌多糖例如胞外多糖膠，和植物多糖例如角叉藻聚糖) 以形成水凝膠。在單價陽離子存在下膠凝的多糖一經暴露于例如包含生理水平的鈉的溶液則形成水凝膠。也可以用非離子例如甘露醇調節(jié)水凝膠前體溶液的滲透壓，并然后注射以形成凝膠。為非常粘稠的液體或是觸變性的，并隨時間推移通過結構的緩慢發(fā)展而形成凝膠的多糖也是有用的。例如，可使用透明質酸，其形成具有稠度類似于發(fā)膠一樣的可注射凝膠。修飾的透明質酸衍生物是特別有用的。如本文使用的，術語“透明質酸”是指天然的和化學修飾的透明質酸。可用預選的化學修飾設計和合成修飾的透明質酸以調節(jié)交聯和生物降解的速率和程度。例如，可設計和合成用相對疏水基團例如丙酸或苯甲酸酯化以使聚合物更加疏水且更易形成凝膠的透明質酸，或用胺接枝以促進靜電自裝配的修飾的透明質酸。因此可合成可注射的修飾的透明質酸，以致其在壓力下流動，當不處于壓力下時卻維持凝膠樣結構?？蓮腉enzyme，Cambridge, Mass.和Fidia，意大利獲得透明質酸和透明質酸衍生物。其他聚合物水凝膠前體包括聚環(huán)氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物例如Pluronics 或Tetronics ，其通過氫鍵和/或通過溫度變化交聯，如在Meinleitner等人，Obstetrics & Gynecology (產科學和婦科學)，第 77 卷，48-52 頁(1991)和 Steinleitner 等人， Fertility and Sterility (生育和不育)，第57卷，305-308頁(1992)中所述的。可使用的其他材料包括蛋白質例如血纖蛋白、膠原和明膠。也可使用聚合物混合物。例如，可使用聚環(huán)氧乙烷和聚丙烯酸的混合物，其一經混合通過氫鍵膠凝。在一個實施方式中，可組合 5% w/w聚丙烯酸溶液和5% w/w聚環(huán)氧乙烷(聚乙二醇、聚氧乙烯)100，000的混合物以隨時間過程例如快至幾秒鐘內形成凝膠。帶電的可交聯聚合物溶液帶有帶電側基的水溶性聚合物可通過將該聚合物與含有相反電荷離子，陽離子 (如果聚合物具有酸性側基)或陰離子(如果聚合物具有堿性側基)的水溶液反應而交聯。 用于交聯帶有酸性側基的聚合物以形成水凝膠的陽離子的實例是單價陽離子例如鈉，二價陽離子例如鈣和多價陽離子例如銅、鈣、鋁、鎂、鍶、鋇和錫，和二 _、三-或四-官能化有機陽離子例如烷基銨鹽。向聚合物加入這些陽離子鹽的水溶液以形成柔軟的、高度水脹的水凝膠和膜。陽離子濃度越高，或化合價越高，聚合物的交聯度越大。另外，可酶交聯聚合物，例如用凝血酶酶交聯血纖蛋白。合適的可離子交聯基團包括酚基、胺基、亞胺基、酰胺基、羧酸基、磺酸基和磷酸基。帶負電的基團例如羧酸根離子、磺酸根離子或磷酸根離子可與陽離子例如鈣離子交聯。 藻酸鹽和鈣離子的交聯是這種離子型交聯的實例。帶正電的基團例如銨離子可與帶負電的離子例如羧酸根離子、磺酸根離子或磷酸根離子交聯。優(yōu)選地，帶負電的離子包含多于一個羧酸基、磺酸基或磷酸基。用于交聯聚合物以形成水凝膠的優(yōu)選陰離子是單價、二價或三價陰離子例如低分子量二羧酸例如對苯二甲酸、硫酸根離子和碳酸根離子。如關于陽離子所述的，向聚合物加入這些陰離子鹽的水溶液以形成柔軟的、高度水脹的水凝膠和膜。多種聚陽離子可用于絡合并由此將聚合物水凝膠穩(wěn)定成為半滲透表面膜?？墒褂玫牟牧系膶嵗ň哂?，000至100，000之間的優(yōu)選分子量的具有堿性反應基例如胺基或亞胺基的聚合物，例如聚乙烯亞胺和聚賴氨酸。這些市場上有售。一種聚陽離子是聚(L-賴氨酸)；合成的多胺的實例是聚乙烯亞胺、聚(乙烯胺)和聚(烯丙胺)。也有天然的聚陽離子例如多糖、殼聚糖?？捎脕硗ㄟ^與聚合物水凝膠上的堿性表面基團反應而形成半滲透膜的聚陰離子包括丙烯酸、甲基丙烯酸和丙烯酸的其他衍生物的聚合物和共聚物、帶有SO3H側基的聚合物例如磺化聚苯乙烯，和帶有羧酸基的聚苯乙烯?？尚揎椷@些聚合物以包含活性物質的可聚合基團和/或可離子交聯基團。修飾親水性聚合物以包括這些基團的方法是本領域技術人員熟知的。聚合物可以是內在可降解的，但優(yōu)選生物可降解性低(以可預測溶解性)但分子量足夠低以允許排泄。人類(或期望使用的其他物種)允許排泄的最大分子量將隨聚合物類型而變化，但將通常是約20，000道爾頓或更低。由于內在可生物降解性，水溶性天然聚合物和合成等價物或衍生物，包括多肽、多核苷酸和可降解多糖可用于一般用途但不是太優(yōu)選的。聚合物可以是具有至少600，優(yōu)選2000或更大且更優(yōu)選至少3000的分子量的單嵌段?？商娲兀酆衔锟砂?可以是通過其他基團連接的兩個或更多個水溶性嵌段。這些連接基團可包括可生物降解的連接、可聚合的連接或兩者。例如，不飽和二羧酸，例如馬來酸、富馬酸或烏頭酸可被含有羥基的親水性聚合物例如聚乙二醇酯化或被含有胺基的親水性聚合物例如泊洛沙胺酰胺化?？晒矁r交聯的聚合物溶液可共價交聯的水凝膠前體也是有用的。例如，水溶性聚胺例如殼聚糖可與水溶性二異硫氰酸酯例如聚二異硫氰酸乙二醇酯交聯。異硫氰酸酯將與胺反應形成化學交聯凝膠。也可利用與胺例如與聚乙二醇二醛(polyethylene glycol dialdehyde)的醛反應。也可使用羥基化水溶性聚合物。可替代地，可使用包括取代基的聚合物，該取代基接觸自由基引發(fā)劑后通過自由基反應交聯。例如，可使用包括可被光化學交聯的乙烯不飽和基團的聚合物，如WO 93/17669中公開的，其公開內容通過引用并入本文。在這一實施方式中，提供了包括至少一個水溶性區(qū)域、可生物降解區(qū)域和至少兩個可聚合自由基區(qū)域的水溶性大分子單體。通過將可聚合區(qū)域暴露于例如通過光敏化學品和/或光產生的自由基聚合大分子單體。這些大分子單體的實例是PEG-低聚丙烯酸乳酰酯(PEG-oligolactyl-acrylates)，其中使用自由基引發(fā)系統(tǒng)例如曙紅染料或通過簡單地暴露于紫外或可見光聚合丙烯酸基。另外，可使用包括可被光化學交聯的肉桂酰基的水溶性聚合物，如在Matsuda等人，ASAIO Trans.，第38 卷，154-157頁(1992)中所公開。
術語“活性物質可聚合基團(active species polymerizable group)”定義為具有暴露于活性物質后形成引起聚合物互連的額外的共價鍵的能力的反應性官能團。活性物質包括自由基、陽離子和陰離子。合適的自由基可聚合基團包括乙烯不飽和基團(即，乙烯基，例如乙烯醚)、烯丙基、不飽和單羧酸、不飽和二羧酸和不飽和三羧酸。不飽和單羧酸包括丙烯酸、甲基丙烯酸和巴豆酸。不飽和二羧酸包括馬來酸、富馬酸、衣康酸、中康酸或檸康酸。在一個實施方式中，活性物質可聚合基團優(yōu)選位于親水性聚合物的一個或多個末端。在另一個實施方式中，活性物質可聚合基團位于帶有形成單個嵌段的一種或多種親水性聚合物的嵌段共聚物內。優(yōu)選的可聚合基團是丙烯酸酯、二丙烯酸酯、低聚丙烯酸酯、二甲基丙烯酸酯、低聚甲基丙烯酸酯和其他生物學上可接受的可光聚合基團。丙烯酸酯是最優(yōu)選的活性物質可聚合基團。通常，聚合物在水溶液例如水、緩沖鹽溶液或醇水溶液中至少部分可溶。合成上述其他化合物的方法是本領域技術人員已知的。例如，參見Concise Encyclopedia of Polymer Science and Polymeric Amines and Ammonium Salts (聚合物禾斗學禾口聚合胺禾口按鹽的簡明百科全書)，Ε. Goethals 編輯(Pergamen Press,Elmsford,N. Y 1980)。許多聚合物例如聚(丙烯酸)市場上有售?？墒褂帽绢I域可用的和例如在1992年3月第4版“Advanced Organic Chemistry (高等有機化學)"Wiley-Interscience Publication，紐約中所述的化學反應修飾天然形成的和合成的聚合物。這些方法可用來引入例如本文所述的丙烯酸酯基。優(yōu)選地，包括活性物質或可交聯基團的親水性聚合物包括至少平均1. 02個可聚合或可交聯基團，且更優(yōu)選地，每一種平均包括兩個或更多個可聚合或可交聯基團。由于每個可聚合基團將聚合成鏈，使用每個聚合物僅略大于1個反應基(即，平均約1. 02個可聚合基團)可產生交聯的水凝膠。但是，優(yōu)選更高百分比，并且可在其中大多數或所有分子具有兩個或更多個反應性雙鍵的聚合物混合物中獲得極好的凝膠。親水性聚合物的實例-泊洛沙胺具有4個臂且因此可被容易地修飾以包括4個可聚合基團。植入方法在優(yōu)選的實施方式中，制備本發(fā)明的組合物，并并將其直接注射到期望植入該材料的部位。如果需使用交聯劑，優(yōu)選地在聚合物交聯形成水凝膠之前注射該材料。在優(yōu)選的方法中，交聯足夠快地發(fā)生以致于基本上沒有生物材料遷移遠離注射部位。在特別的實施方式中，通過在多部位或以定期時間間隔、幾分鐘、小時、天、周或更長的間隔多次注射遞送生物材料可能是有利的?？赡苄枰ㄆ谧⑸湟源偈蛊つw伸展以容納生物材料(例如，在乳房切除后的乳房重建期間)。確定待注射本發(fā)明的生物材料的一個或多個部位，以及當生物材料包含細胞時， 確定必需的細胞數量。技術人員可使用外部模具以對注射溶液定形。另外，通過控制聚合速率，像人們模制粘土那樣模制生物材料注射植入物是可能的。可替代地，可將混合物注射到模具中，使生物材料變硬，然后植入該材料。通過注射器和針頭或任何合理設計的注射裝置或微創(chuàng)性植入裝置將組合物直接注射到需要填充劑的特定區(qū)域，即軟組織殘缺，例如手術后見到的或帶有由先天或后天疾病引發(fā)或創(chuàng)傷、燒傷等繼發(fā)的肌肉萎縮區(qū)域的畸形。這種實例將是將組合物注射到乳房切除后的乳房區(qū)域或神經損傷繼發(fā)的肌肉萎縮的患者的上部軀干(upper torso)內。
也可通過直接觸摸(direct palpation)經皮膚注射懸浮液，例如通過將針置于輸精管內并用注射的填充物質阻塞該輸精管，因此使患者不育。也可通過帶有熒光、超聲、計算機斷層攝影、磁共振成像或其他類型的放射學引導的導管或針注射懸浮液。這將允許通過血管途徑或皮膚途徑將這種物質放置或注射到將需要填充劑的體內的特定器官或其他組織區(qū)域。進一步地，可通過腹腔鏡或胸腔鏡將這種物質注射到腹膜內或腹膜外或胸腔的器官中。任選地，水凝膠溶液中可包含多種添加劑例如100U/ml青霉素和100 μ g/ml鏈霉素以抑制微生物(micrcAacterial)污染。但是，這些并不是可包含在水凝膠溶液中的僅有生物活性添加劑。例如，生物活性添加劑可單獨地或組合地包括生長因子、細胞分化因子、其他細胞介質(cellular mediator)、營養(yǎng)成分、抗生素、抗炎藥和其他藥物。盡管不是限制性的，取決于細胞類型，如果有的話，待封裝在某些合適的細胞生長因子的水凝膠或相鄰水凝膠層中的該某些合適的細胞生長因子包括肝素結合生長因子(HBGF)、轉化生長因子 (TGFa或TGFi3)、a成纖維細胞生長因子(FGF)、表皮生長因子(EGF)、血管內皮生長因子 (VEGF)、各種血管生成因子、生長因子、神經生長因子(NGF)和肌肉形態(tài)生長因子。另外，水凝膠溶液任選地包括充分混合以制備終濃度0. 05% w/v的合適的無毒性聚合引發(fā)劑。當選擇PEGDA或PEODA作為聚合物時，優(yōu)選加入聚合引發(fā)劑，并選擇光引發(fā)劑 IgracureTS^959(由 Ciba Specialty Chemicals Corp.市售，Tarrytown，紐約)為聚合引發(fā)劑，盡管可使用其他合適的光引發(fā)劑。雖然可光聚合PEGDA和PEODA屬于制備根據本發(fā)明的水凝膠的優(yōu)選聚合物，可使用其他合適的親水性聚合物。合適的親水性聚合物包括合成聚合物例如部分或完全水解的聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙基噁唑啉)、聚(環(huán)氧乙烷)_共-聚(環(huán)氧丙烷) 嵌段共聚物(泊洛沙姆和美羅沙泊)、泊洛沙胺、羧甲基纖維素和羥烷基化纖維素例如羥乙基纖維素和甲基羥丙基纖維素，和天然聚合物例如多肽、多糖或碳水化合物例如Ficoll 、 聚蔗糖、透明質酸、葡聚糖、硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素、肝素或藻酸鹽，和蛋白質例如明膠、 膠原、白蛋白或卵白蛋白或其共聚物或混合物。如本文使用的，“纖維素”包括纖維素和上述類型的衍生物；“葡聚糖”包括葡聚糖和其類似衍生物。可光聚合混合物的這一列舉意在是說明性而不是詳盡無遺的。例如，適合應用于本發(fā)明的其他可光聚合混合物描述于美國專利第6，224，893 Bl號，其通過引用并入本文。雖然優(yōu)選的光引發(fā)劑是IgraCUre 2959，可替代使用多種其他光引發(fā)劑。例如，由 Polysciences市售的HI3K是另一種合適的光引發(fā)劑。此外，已知當暴露于外部輻射時，多種染料和胺催化劑形成活性物質。特別地，染料對光的吸收使染料呈現三重態(tài)，這種三重態(tài)隨后與胺反應以形成引發(fā)光聚合的活性物質。通常，通過用波長約200-700nm之間，最優(yōu)選在長波長紫外線范圍或可見光范圍，320nm或更高，且最優(yōu)選在約365和514nm之間的光輻射可引發(fā)聚合。可使用多種染料用于光聚合，且這些染料包括赤蘚紅、酸性紅(phloxime)、玫瑰紅、thonine、樟腦醌、乙基曙紅、曙紅、亞甲基藍、核黃素、2，2-二甲基-2-苯基苯乙酮、2-甲氧基-2-苯基苯乙酮、2，2_ 二甲氧基-2-苯基苯乙酮、其他苯乙酮衍生物和樟腦醌。合適的助催化劑包括胺例如N-甲基二乙醇胺、N，N-二甲基芐胺、三乙醇胺、三乙胺、二芐胺、N-芐基乙醇胺、N-異丙基芐胺。三乙醇胺是這些染料中的一個的優(yōu)選助催化劑。這些聚合物溶液的光聚合基于以下知識聚合物和光引發(fā)劑的組合(以對細胞無毒性的濃度，以重量計少于0. 1 %，更優(yōu)選以重量百分比計在0. 05到0. 01 %之間的引發(fā)劑)暴露于相當于1到 3mffatts/cm2之間的光后將交聯。雖然由于使用通過手術鏡(surgical scope)提供的外輻射控制聚合是方便的，光聚合物是制備水凝膠優(yōu)選的，但使用其他聚合物材料和聚合引發(fā)劑可實施本發(fā)明?？捎脕硇纬伤z的其他材料的實例包括(a)修飾的藻酸鹽，(b)多糖(例如胞外多糖膠和角叉藻聚糖)，其通過暴露于單價陽離子而膠凝，(c)多糖(例如透明質酸)，其為非常粘稠的液體或是觸變性的且通過結構的緩慢進展隨時間推移形成凝膠，和(d)聚合物水凝膠前體(例如，聚環(huán)氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物和蛋白質)。美國專利第6，224，893B1號提供了多種聚合物的詳細說明和適合制備根據本發(fā)明的水凝膠的這些聚合物的化學性質，且該專利的全部內容通過引用并入本文。用于本發(fā)明的聚合劑可包括單體、大分子單體、低聚體、聚合物和其混合物。聚合物組合物可只由可共價交聯的聚合物，或可共價交聯和可離子交聯的聚合物或親水性聚合物的混合物組成。無細胞牛物組織的交聯劑先前報道了無細胞生物組織可提供宿主細胞遷移的天然微環(huán)境，并可用作組織再生的支架。為減少抗原性，必須在植入前用交聯劑固定生物組織。在Liang，H.-C.等人， 2004的研究中，使用細胞提取方法從牛心包中去除細胞成分。然后用多種已知濃度的交聯劑京尼平固定無細胞組織以獲得不同交聯度。體外降解研究表明，用京尼平固定之后，隨著其交聯度的增加，對無細胞組織的酶降解的抗性明顯增加。在體內皮下研究中，發(fā)現細胞 (炎性細胞、成纖維細胞、內皮細胞和紅細胞)能夠浸潤到無細胞組織。通常，細胞浸潤到無細胞組織的深度隨其交聯度增加而減少。炎性細胞的浸潤伴隨著無細胞組織的降解。由于早期降解，在剛制得的(沒有交聯)和30% -交聯度的無細胞組織中沒有觀察到組織再生。這是因為這兩種樣品提供的支架在浸潤的細胞開始分泌其自身細胞外基質前已被完全降解。相反，通過組織學測定、免疫組織染色、透射電子顯微鏡和變性溫度測量，在60% -和 95%-交聯度的無細胞組織中觀察到組織再生(成纖維細胞、新-膠原纖維和新-毛細血管)。95%-交聯度的無細胞組織的酶降解抗性比其60%-交聯度的對應物更大。結果， 貫穿整個研究過程(手術后1年)組織再生局限于95%-交聯度的無細胞組織的外層，而在60%-交聯度的無細胞組織的全部樣品內觀察到組織再生。Liang，H.-C.等人推論出交聯度決定了無細胞組織的降解速率和其組織再生方式。這些數據表明經加工的脂肪組織的交聯量可控制降解速率和細胞浸潤量。無細胞組織的交聯方法是本領域已知的。例如，無細胞組織可以在37°C下，在用磷酸緩沖鹽溶液(PBS，0· lm, pH7. 4, Sigma Chemical Co.)緩沖的多種已知濃度的京尼平 (Challenge Bioproducts，臺中市，臺灣)水溶液中固定3天。通過茚三酮測試(Stryer， Biochemistry (生物化學)，第3版，紐約，Freeman, 1988，50-55，通過引用并入本文)或使用市售試劑盒例如由AnaSpec提供的那些試劑盒測定交聯度。交聯量定義為固定后無細胞組織中與交聯劑例如京尼平反應的游離氨基的百分比。可在例如Perkin-Elmer差示掃描量熱儀(Model DSC 7，Norwalk, CT，美國)中測量各個研究組的變性溫度(對應于膠原的變性)。這種技術已廣泛用于研究膠原生物材料的熱轉化。可使用加熱速率5°C/min。通常，掃描的溫度在(Td225°C ) < T < (Td+10°C )的大致范圍內；其中Td是相關變性溫度。 對于揮發(fā)性化合物，推薦使用密封鋁盤。取決于使用的一種或多種具體交聯劑和由經加工的脂肪組織的最終用途決定的期望交聯水平，可改變交聯劑的具體量、交聯時間和交聯溫度。在某些實施方式中，經加工的脂肪組織具有40% -交聯度至95% -交聯度。在某些實施方式中，經加工的脂肪組織具有50 % -交聯度至90 % -交聯度。在某些實施方式中，經加工的脂肪組織具有60 % -交聯度至90% -交聯度。在某些實施方式中，經加工的脂肪組織具有60% -交聯度至80% -交聯度。在某些實施方式中，經加工的脂肪組織具有50 % -交聯度至75 % -交聯度。用于生物組織來源的材料例如本發(fā)明的經加工的脂肪組織的交聯劑包括但不限于碳二亞胺(EDC)、 1,6-己二異氰酸酯(HMDC)、戊二醛、原花色素、核糖、蘇糖和賴氨酰氧化酶、碳二亞胺、聚環(huán)氧醚、二乙烯砜(DVS)、京尼平、聚醛和疊氮磷酸二苯酯(DPPA)、京尼平、環(huán)氧化合物、二醛淀粉、戊二醛、甲醛、辛二亞氨酸二甲酯、碳二亞胺、琥珀酰亞胺、二異氰酸酯和酰疊氮。經加工的脂肪組織的超臨界流體萃取方法其中在萃取期間CO2處于壓縮狀態(tài)的方法是已知的，其中CO2為液態(tài)的其他方法也是已知的(Hubert等人，1980 ；Wilson, 1984)。這種技術提供了與通過常規(guī)萃取方法使用有機溶劑獲得的那些萃取產量相當的萃取產量。另外，與有機溶劑不同，二氧化碳無毒性、不易燃、無腐蝕性、廉價且容易以高純度大量獲得。在制備本文的經加工的脂肪組織中，可使用超臨界流體技術萃取脂肪組織。超臨界流體(SCF)通常表述為高密度氣體。技術上，如在純物質的相圖中定義的，SCF是以高于其臨界溫度和臨界壓力存在的氣體。當氣體被壓縮至高于其臨界溫度時，密度急劇增加。因此，在一組給定條件下，SCF可具有液體的密度同時保持氣體的擴散性。SCF的溶劑性質已被認可100多年，但商業(yè)應用發(fā)展緩慢。因為其無毒性、防爆、廉價、易于獲得且容易從提取的產品中去除，SC-CO2是理想溶劑。例如美國專利第4，466，923號中提供了使用SC CO2萃取脂質的方法，該專利通過弓I用并入本文。流變學測量本文提供的經加工的脂肪組織材料的流變學定義是粘彈性材料。當施加應力時 (變形)，粘彈性材料具有粘性(液體樣)和彈性(固體樣)特征。粘性材料如蜂蜜，當變形時會移動或流動，且當去除變形應力時不能恢復到原始狀態(tài)。彈性材料如橡膠，當變形時會移動但一旦去除變形應力會恢復到原始狀態(tài)。對于本文提供的經加工的脂肪組織，低應力或高應力環(huán)境是重要的，因為在使用期間其經受高應力和低應力。在材料流出狹窄的針孔時施加高應力，而材料靜止于真皮中的應用部位時，植入物經歷非常低的應力。流變學上， 可通過在單一運行程序中使用流變儀估計彈性模量(G')和粘性模量或損耗模量(G") 描述經加工的脂肪組織的粘彈性特征。根據這兩個值可描述任何粘彈性材料包括經加工的脂肪組織的特征?？蓪’和G”組合成介質損耗角正切定義的總值(aggregate value)，其中介質損耗角正切=G' /G"。較低的介質損耗角正切對應較硬的、更加固體樣或彈性樣的凝膠。通過調節(jié)遞送的經加工的脂肪組織材料的濃度、交聯劑的濃度、生物聚合物的存在或不存在和其他因素，可調整經加工的脂肪組織的具體G’、G”和介質損耗角正切。使用許多本領域已知方法的任何一種，可進行流變學測量。例如，使用在錐面和平面幾何安裝的Hiermo Haake RS300流變儀(Newington，NH)進行小變形動態(tài)振動流變測量。在25°C下，可使用35讓/1°鈦錐形傳感器進行測量?？稍谝欢l率范圍上例如， 0.6 至198rad/S的頻率范圍進行振動測量。彈性百分比計算為彈性百分比=(IOOxG' )/ (G' +G")?？蓮娜魏嗡x頻率下例如頻率為0.628rad/S下的動態(tài)模量數據獲得介質損耗角正切，介質損耗角正切=G〃 /G'。實施例和附圖對實驗進行討論，并提供來自基于脂肪組織的可植入材料的結果。 圖1-2中示出使用脂肪抽吸物起始材料進行的結果。圖3-13中示出使用固態(tài)的皮下脂肪組織作為起始材料進行的結果。圖3-8示出了用通過PAA和DNA酶I處理但未用TX-100 處理的粉碎精細度較小(less finely minced)的起始材料進行實驗的結果。圖9_13示出了用通常以PAA、TX-100和DNA酶I處理的粉碎精細度較大(more finely minced)的起始材料進行實驗的結果。以下在討論附圖的實施例中和在以上提供的附例中更詳細地討論用來制備經加工的人脂肪組織(PhAT)的具體試劑。實施例1-制備細胞生物相容性生物材料使用標準微創(chuàng)手術技術獲得脂肪抽吸物。去除腫脹液，并將脂肪抽吸物放置在冰上，直到下一步驟。將脂肪抽吸物與用于制備生物相容性生物材料的多種表面活性劑和支架組合。1.通過加入5% Pluronic表面活性劑，透明質酸用含細胞的脂肪抽吸物以1 1 的比例乳化。2.將10%重量/體積的PEG-DA溶解于50 50比例的PBS 脂肪抽吸物中。圖1表示存在或不存在表面活性劑時脂肪抽吸物和水性PEG混合物的乳化。圖IA 中，最左邊的試管不含表面活性劑?；旌衔锏乃畬雍椭瑢又g的相分離是明顯的。向右移動，加入濃度漸增的表面活性劑，并觀察到乳化改善。所用的HA是市售的交聯HA，其無需交聯劑并可手工模塑(molded)。制備并加入光引發(fā)劑以聚合PEG-DA混合物。通過將曙紅Y二鈉鹽(Sigma-Aldrich 目錄號45235，其在450-550nm波長范圍內吸收最強)溶解在PBS (GIBC0目錄號 14190342)中制備引發(fā)劑溶液(1.375mg/ml 曙紅 Y)。將 IOOmg (10 % w/v) PEODA (3. 4KD 漏SunBio目錄號P2AC-3)溶解于50 μ 1引發(fā)劑溶液、30 μ 1 PBS和20 μ L N-乙烯基吡咯烷酮(Sigma-Aldrich目錄號95060)中。通過將這種PEODA溶液與30 μ 1三乙醇胺 (Sigma-Aldrich#90278)和Iml脂肪抽吸物混合制備終溶液。圖IB示出了在表面活性劑和HA(10% -50% )存在下溶解在不同比例的脂肪抽吸物中的10%W/v PEG。脂肪抽吸物/PEG/HA可形成為期望植入形狀的植入物。可替代地，如圖IC中所示，可注射脂肪抽吸物材料，并將其原位交聯。注射前，渦漩混合物直到混合物呈現出具有均一脂肪分布。在水凝膠的情況下，皮下注射PEG-DA/脂肪抽吸物混合物，并應用光源(例如，發(fā)光二極管)以提供強脈沖光(IPL)。經皮光聚合法是本領域熟知的(例如，參見 Elisseeff 等人，Transdermal photopolymerization for minimally invasive implantation(用于微創(chuàng)植入的經皮光聚合)Proc. Natl. Acad. Sci, USA. 96 :3104-3107,通過引用并入本文)。圖IC示出了皮下注射脂肪抽吸物和PEG和HA之后的無胸腺小鼠?？扇菀椎匕l(fā)現交聯脂肪抽吸物腫塊增大。為促進并預測本發(fā)明的生物相容性生物材料的臨床功效，已開發(fā)臨床前期動物模型，并證實其能夠預測軟組織替代物的壽命或持久性和耐受性。在無胸腺小鼠和Sprague-Dawley大鼠兩者中，多種軟組織材料包括人脂肪組織和市售透明質酸皮膚填充劑的皮下注射物的持久性與這些材料的已知臨床持久性相關。使用MRI體積測量驗證本發(fā)明的基于細胞的生物材料的持久性。但是，還可使用卡尺進行測定注射的材料的高度和寬度的評估。在小鼠模型中測試有或沒有HA，和只有HA的注射的脂肪抽吸物材料的持久性。使用市售生物填充劑用不同的測量(高度對體積)進行類似的實驗。圖2A示出了注射多種生物填充劑的無胸腺裸鼠。用星號指示注射部位。圖2B示出了提供體積測量的類似地用軟組織植入物注射的Sprague-Dawley大鼠的T2MRI圖像。將有或沒有透明質酸情況下，市售植入物的高度和體積(圖2C中)和細胞脂肪組織的高度和體積(圖2D中)對時間作圖。 表明了脂肪抽吸物材料的良好持久性。進一步地，已發(fā)現該材料的持久性與植入的脂肪組織和注射的市售皮膚填充劑的已知臨床持久性相關。例如，在第35天，仍存在超過50%體積的具有HA的脂肪。發(fā)現單獨的透明質酸或單獨的脂肪消散更快。實施例2-制備無細胞生物材料/經加工的人脂肪組織(PhAT)組織獲取和加工。經捐獻者的適當同意，從新鮮的手術和尸體來源獲取組織。圖 3A和9A中示出了皮下脂肪的代表性樣品。圖3C和9C中提供了顯示出細胞核、脂質空泡和細胞外基質的代表性組織切片。通過刮擦從樣品分離皮下脂肪。在攪切器中對刮下的脂肪組織勻漿。然后將勻漿物放置在過濾器上并在去離子水下洗滌5分鐘以洗去脂質和細胞碎片。重復這一步驟三次。將等重的勻漿并洗滌的組織置于37°C搖床上的0.或5%過乙酸中，持續(xù)3 或6小時。當脂肪細胞死亡時，油從細胞中釋放出來。為完全滲入脂肪組織并去除油，用研缽和研棒手動處理材料，或在PBS洗滌之間在攪切器中或用壓榨機(press)勻漿。當完全除去脂質時，經加工的脂肪材料從黃色變成白色(圖:3B)?？商娲?，通過迫使材料反復穿過模具而將刮下的脂肪組織精細粉碎，同時用水漂洗以去除脂質。將粉碎的材料轉移到試管中，用0. 1% -5%的弱酸溶液例如于無菌蒸餾水中的過乙酸(PAA)在37°C振蕩溶解3-6小時以促進化學脫細胞作用。用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌PAA處理的材料以去除碎片并將pH恢復到生理pH。在某些實驗中，在37°C下用2mM在無菌水中的EDTA中的1 %Triton X-100過夜處理PAA處理的材料以進一步去除脂質。在PBS中反復漂洗材料以去除去污劑。在某些實驗中，在0. 1 % DNA酶I或600單位/ml DNA酶于IOmMMgCl2中的溶液中在37°C下用核酸酶進一步過夜處理PAA處理的材料或PAA/Triton X_100處理的材料(圖 9B)。在儲存前，用PBS反復漂洗加工的材料。將加工的材料儲存在_20°C帶有抗生素的 PBS中，例如青霉素/鏈霉素或10%抗生素-抗霉菌藥溶液(A5955Sigma-Aldrich，圣路易斯，M0)。任選地，在室溫儲存前，將材料迅速冷凍并凍干，持續(xù)2-3。將經加工的脂肪材料制成有或沒有生物支架和交聯劑的注射用顆粒。使用本文提供的方法表征經加工的脂肪材料。確定了也用Triton X-100處理的更細小粉碎的組織導致更好地去除脂質和核酸。然而，通過任一方法加工的脂肪產生與市售組織填充劑相比具有體內良好持久性的經加工的材料，產生最小免疫反應并在體外和體內支持細胞生長。實施例3-無細胞生物相容性生物材料的分析
使用多種測定測試無細胞生物相容性材料生物材料(經加工的人脂肪組織或 PhAT)以證實材料是無細胞的、無脂質的，包括完整的細胞外基質(ECM)和適當的動態(tài)剛度 (dynamic stiffness)。提供了所使用的示例性測定。測定材料是否具有期望特征的其他方法是本領域已知的。不含細胞。在由至少一種前述實施例的方法制備的PAT石蠟包埋切片上進行蘇木精和曙紅(H&E)染色以確定細胞核(細胞)的存在(比較圖7C和9C與圖7B和9D)。在根據本發(fā)明的方法用PAA和DNA酶(圖7B)或用PAA、TX_100和DNA酶(圖9D)加工后，沒有觀察到細胞性材料或細胞核。另外，可進行MHC I類免疫染色以評估抗原的存在。DNA含量為證實脫細胞度，進行了 DNA測定。對于DNA熒光測定，用0_100 μ g/ml DNA制備小牛胸腺DNA標準品。將樣品(100 μ 1)或標準品與溶解在IXTNE緩沖液(IOmM Tris,ImM EDTA，0.2M NaCl, pH. 7. 4)中的 33258Hoechst 溶液(0. 1 μ g/ml, Molecular probes, Eugene, OR)混合。用熒光計(Hoefer DyNA Quant 200 熒光計)使用 A365nm 激發(fā)和A458nm發(fā)射測定DNA含量，并根據小牛胸腺DNA標準曲線計算DNA含量。脫細胞脂肪組織組合物的生化分析表明橫觀三個不同的供體，幾乎沒有供體差異性。如所示，PAA和核酸酶(圖4)加工和PAA、TX-100和核酸酶(圖9E)處理去除了存在于樣品中的大量核酸。由于與起始材料相比加工的材料的體積明顯減少，在圖9中沒有與原始材料做對比。在圖9中，與來自較高酸濃度的樣品相比，用0. 過乙酸處理的樣品具有最高的DNA含量，盡管酸濃度從1 %到5 %變化，但來自較高酸濃度的樣品卻提供了相似結果(圖9E)。這些結果表明本發(fā)明的PhAT從組織中去除了大量核酸，其中在也用TX-100 處理的更細碎粉碎的樣品中，PAA的具體濃度對去除核酸具有較小影響。不含脂質。進行快速乳化測定以排除加工的組織中殘余脂質的存在。檢測樣品中低水平脂質的不同量，通常PAA濃度越低，導致殘留在組織中的殘余脂質越多。加工后，發(fā)生皮下脂肪組織的整體和組織學外觀的明顯變化(圖幻。加工前的脂肪組織呈橙色，反映其高濃度脂質含量(圖3A)。機械破碎和過乙酸(PAA)暴露后，如PhAT顏色漸白所證實， 脂質去除與過乙酸濃度有關。H&E染色的組織學也表明加工前脂肪的脂質充滿空泡的細胞結構減少(圖3C)。脂肪組織的加工導致與膠原纖維結構一致的具有纖維樣外觀的壓縮的 ECM。還用組織學方法觀察脂質的存在。用組織學方法觀察到無脂質(圖5E)。組織學將支架在10%福爾馬林中固定過夜。使用一系列乙醇(EtOH)溶液對樣品脫水，隨后在石蠟中包埋過夜。將切片切至5 μ m厚度，安放在顯微鏡載玻片上并允許在40°C板上干燥一小時至過夜。再水合后，使用蘇木精和曙紅(H&E)和番紅-0/固綠對切片染色。根據生產商說明使用Histostain-SP試劑盒(Zymed Laboratories Inc. , San Francisco, CA)進行免疫組織化學。使用抗膠原I兔多克隆抗體(Research Diagnostics Inc.)作為一抗。蛋白質含量根據生產商說明使用二辛可寧酸(BCA)蛋白測定試劑盒 (Sigma-Aldrich,B 9643, St. Louis,MO)進行不同加工方法制備的PhAT樣品中蛋白含量的對比。簡單地，將20份BCA工作試劑與1份受試樣品混合并在37°C孵育30分鐘。在λ = 562處讀取受試樣品的吸光度，并將其與包含已知量的白蛋白的標準品對比。圖5Α中示出了用PAA和TX-100處理后的樣品中的蛋白含量。膠原含量簡單地，如以前所述(Creemers，L. B.等人，Microassay for the assessment of low levels of hydroxyproline (評估低水平羥脯氨酸的微測定)。 Biotechniques. 22 :656-658,1997 ；ffoessner, J. F. , Jr. m The determination of hydroxyproline in tissue and protein samples containing small proportions of this imino acid (測定包含小比例羥脯氨酸的組織和蛋白質樣品中的該氨基酸)Arch Biochem Biophys. 93 =440-4477,1961，兩者都通過應用并入本文)使用0. 1作為羥脯氨酸與總膠原的比例，通過測量用6N鹽酸110°C過夜水解并與對二甲基氨基苯甲醛和氯胺-T反應之后的木瓜蛋白酶消化液(100 μ 1)的羥脯氨酸濃度測定總膠原含量。使用L-4-羥脯氨酸(Fluka，美國)制作羥脯氨酸標準曲線。圖5B和9F中示出了結果。再次地，PAA的具體濃度對殘留在用TX-100進一步處理的更細碎粉碎的材料中的膠原量具有較小影響。然而， 隨著在較高過乙酸濃度下膠原含量開始減少，5%過乙酸最明顯(圖9F)。在高酸濃度下，細胞外基質開始失去其結構完整性并變得更難操作。根據最佳地滿足兩個目標完全去除細胞材料同時保留細胞外基質結構的能力確定最佳加工條件，最后使用3%過乙酸用于隨后實驗。ECM保留。用組織學方法評價細胞外基質保留以量化地(使用膠原和蛋白聚糖生化測定)并機械地評估結構(H&E和Masson's毛狀體染色)(圖3B、5C和E、9D和10)。觀察到完整的ECM。蛋白聚糖濃度。通過以前描述的二甲基亞甲基藍(DMMB)分光光度測定法對木瓜蛋白酶消化液進行蛋白聚糖/糖胺聚糖濃度測定。硫酸軟骨素C(鯊魚軟骨提取物，Sigma) 用作標準品(圖5D)。流變學評估使用錐板配置(cone-plate configuration)在RFS-3流變儀 (Rheometric Scientific he.)上進行流變學測試。使用25讓錐體和0. 0584mm間隙。 lrad/s頻率下的先導動態(tài)剪應變-掃描測試表明0. 1 %剪應變位于線性應力-應變范圍內。對所有隨后樣品進行動態(tài)剪應變-掃描測試以確定線性應力-應變范圍相似。在頻率范圍從0. 1至lOOrad/s、剪切振幅0. 1下測試動態(tài)剪切頻率-掃描。測定頻率為10的復數模量為約IxlO3-IxIO5泊。使用ELFTM 3200測量設備測量樣品的動態(tài)剛度和壓縮模量。使用SPSS(10. 0版； SPSS，芝加哥，伊利諾斯)軟件包進行統(tǒng)計學分析。圖6中示出了結果。表明復數粘度隨 PAA濃度增加而減少。所有生化結果以平均值和標準差(n = 3-4)呈現。使用SPSS(10. 0版；SPSS，芝加哥，伊利諾斯)軟件包進行統(tǒng)計學分析。通過ANOVA 和事后檢驗(post-hoc test)測定統(tǒng)計學顯著性，并設定P < 0.05。實施例4-體外脂肪生成支持評價經加工的脂肪組織體外支持細胞生長和脂肪生成的能力。測試本發(fā)明的方法制備的PhAT支持體外脂肪生成的能力。簡單地，對經加工的材料的樣品接種密度為每平方厘米切103或IOxlO3個細胞的間質干細胞(MSC)。在M、48、72或96小時加入脂肪生成誘導培養(yǎng)基并在第5、第10和第 15天通過DNA、油紅0染色和尼羅紅染色測定分化百分比。當接種72-96小時后用誘導培養(yǎng)基處理時，發(fā)現細胞分化最好，并在第5天觀察到脂肪形成的分化。為進一步分析脂肪生成，如所述地從接種在PAT上的細胞中提取RNA，進行包括 PPAR-Y和脂蛋白脂酶(LPL)的脂肪標記的RT-PCR，并與單層擴增的細胞和天然脂肪組織中的那些細胞對比(Hillel，A.等人 Embryonic Germ Cells are capable of Adipogenic Differentiation in Vitro and in Vivo (胚胎生殖細胞能夠在體外和體內誘導脂肪形成的分化)。Tissue Engineering A 部分· 14 :1-8,2008)。實施例5-帶有細胞的PhAT的掃描電子顯微術在室溫下，通過在含有2. 5%蔗糖的0. IM 二甲胂酸鈉緩沖溶液中的3. 0%福爾馬林/1.5%戊二醛中固定1小時制備SEM樣品。然后在用梯度乙醇溶液脫水前，在室溫下用四氧化鋨避光后固定樣品30分鐘。進行CO2臨界點干燥，然后用鉬濺射涂布 (sputter-coating)，并在 FEI Quanta 200SEM(Hillsboro, OR)上獲取圖像。脫細胞脂肪基質的SEM圖像示出了帶有不同厚度的束的ECM的纖維膠原結構(圖 10A、B)。ECM本質上也是多孔的，有助于細胞遷移和營養(yǎng)成分擴散。脂肪來源干細胞的體外實驗揭示了在脫細胞組織的ECM上的大量的細胞粘附和散布(圖10C、D)。培養(yǎng)第7天， 對于每個細胞，可看到多細胞-ECM接觸。實施例6-PhAT的交聯和體外降解抗性使用于pH5. 5的50mM 2_ (N-嗎啉代)乙磺酸(MES)緩沖液中的N- (3- 二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)交聯使用PAA/DNA酶I/TX-100 處理制備的PhAT。將樣品與在5、10、50和IOOmM EDC濃度下EDC NHS摩爾比2 1的交聯溶液一起孵育4小時。通過用0. IM Na2HPO4漂洗2小時除去殘余交聯劑然后與蒸餾水進行4次額外的30分鐘孵育。將EDC交聯與一種不同的化學交聯劑1，6_己二異氰酸酯(HMDC)對比。由于其在水溶液中的不穩(wěn)定性，我們的方法所依據的以前的研究已使用仲醇作為溶劑或使用表面活性劑保存HMDC的反應性。對于仲醇懸浮液，于2-丙醇中制備了和5% HMDC溶液。在交聯溶液中孵育4小時之前，在2-丙醇中對樣品脫水，更換2次2-丙醇，每次隔30分鐘 (2changes at 30minutes each)。用100% 2_丙醇漂洗樣品兩次，每次30分鐘，然后使用梯度2-丙醇溶液再水合并用蒸餾水再漂洗4次每次30分鐘。另外，將樣品與于pH 7. 4的磷酸緩沖液(0. 054M Na2HPO3,0. 013麗aH2P04)中的包含吐溫20的表面活性劑溶液中的和5% HMDC交聯。在室溫下進行交聯4小時，然后用蒸餾水徹底漂洗，與4M NaCl孵育30分鐘兩次，并用蒸餾水再漂洗4次每次30分鐘以去除表面活性劑和殘余交聯劑。通過比較其對酶降解的敏感性來表征不同的交聯條件。將交聯的樣品和未交聯的對照凍干兩天以減少基于水分含量的差異性。然后在37°C孵箱中將樣品與于0.05M Tris-HCl (ρΗ7· 5)中的200U/ml膠原酶I孵育4，6。在時間點1、3、8、16和24小時，將樣品離心下來并收集上清液并儲存在-20°C直到實驗完成。加入新制的膠原酶并將樣品放回孵箱直到下一個設定時間點。第M小時收集上清液后，在60°C水浴中用125ug/ml木瓜蛋白酶(papainase)溶液消化任何剩余的細胞外基質16小時。最后，用以上提及的膠原測定分析所有上清液和木瓜蛋白酶消化的樣品以測定溶解的膠原量，進而獲得在不同時間點降解的總膠原的百分比。對每個交聯條件使用三個樣品。
當與膠原酶孵育時，與未交聯的對照相比，EDC-交聯的樣品顯示出更大的對酶降解的抗性(圖11A)。降解抗性隨化學交聯劑的濃度升高而增加。取決于所用的溶劑，HM C 交聯導致不同的降解特性。當懸浮于吐溫20溶液中時，發(fā)生極少降解，同時沒有在
或5% HM C濃度之間觀察到差別(圖11B)。當HM C懸浮于2-丙醇中時，在1 % HM C中的交聯樣品比在5% HM C中的交聯樣品更易于被膠原酶降解(圖11C)。實施例7-體外細胞成活力支持進行存活/死亡測定(Live/Dead assay, Molecular Probes)以證明發(fā)現由本文提供的任何方法制備的PhAT支持細胞成活力。 用8mm鉆取活組織檢查，支架由用多種PAA濃度和用DNA酶處理的每一種PhAT制備，凍干以有助于細胞接種，并用濃度為50，000個細胞/30111 DMEM的人間質干細胞(MSC) 重建。在37°C下，在5% (X)2下在脂肪生成培養(yǎng)基(補充有FBS和0. 5mM的地塞米松(Sigma ； St. Louis, MO)、lmg/mL 胰島素(Sigma ;St. Louis，M0)和 0. 5mM 的 1-甲基 _3_ 異丁基甲基-夾氧雜蒽(IBMX ； (Sigma ；St. Louis,MO))的DMEM)中培養(yǎng)支架。在培養(yǎng)M小時和1周后，切下多種PhAT支架的切片，并在存活/死亡溶液中孵育30分鐘(存活/死亡溶液；鈣黃綠素AM EthD-同源二聚體1 DMEM(0.5 4 2000))。孵育30分鐘后，洗滌切片， 并按照生產商(Molecular Probes)描述地在熒光顯微鏡下觀察細胞成活。細胞接種后，在第1天和第7天進行存活/死亡測定。在每種情況下，在培養(yǎng)M小時后，經加工的脂肪組織上存在活細胞。更大的細胞成活力發(fā)現于3% PAA(3和6小時)PhAT，同時在5% PAAx3 小時中成活力減少，且對于5% PAAx6小時成活率幾乎最小。到第7天，僅在用3% PAA處理的PAT中活細胞數量超過死細胞(紅色核染色)。使用相似的方法，還測試了交聯的PhAT制品的支持細胞成活力的能力。如果殘余交聯劑殘留在組織中，化學交聯劑可以是有細胞毒性的，且若不完全去除，所使用的溶劑也可以對細胞存活有害。通過迫使脂肪組織穿過模具制備PhAT，并如上述用3% PAA、TX-100 和DNA酶I順序加工。然后使用5-100mM EDC、1 %Tween 20存在下的1-5% HMDC、于 2-丙醇(100%)中的1-5% HMDC如下所述地交聯樣品。在48-孔板中以每個支架40，000 個細胞接種細胞，并在ASC維持培養(yǎng)基(DMEM-F12、10% FBSU00U/ml青霉素，10ug/ml鏈霉素)中培養(yǎng)5天。使用存活/死亡成活力/細胞毒性試劑盒(LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, Invitrogen, Carlsbad, CA)評估細胞成活力。在 37°C禾口 5% CO2 下在 DMEM-F12 中含有4uM鈣黃綠素AM和4uM乙啡啶同源二聚體_1的存活/死亡培養(yǎng)基中孵育細胞-ECM支架 30分鐘。完成孵育后，從孔中取出存活/死亡培養(yǎng)基并用PBS漂洗支架。分別以485士 IOnm 和530士 12. 5nm濾光鏡使用熒光顯微鏡觀察存活和死亡細胞，以評價細胞毒性。與未交聯的對照相比，在第1天和第5天，即使在最高交聯劑濃度的條件下細胞是可成活的且增殖，同時在每種條件中培養(yǎng)5天后活細胞遠大于死細胞。最不利于細胞生長的條件顯示出是于2-丙醇中的HMDC且因此在隨后的體內研究中被排除在外。實施例8-經加工的脂肪組織的體內評價將通過用PAA和DNA酶I處理制備的1毫升PhAT皮下植入到Sprague-Dawley大鼠的背部，并將500ul皮下植入到無胸腺裸小鼠。圖7A和B中示出了植入PhAT后40天的代表性小鼠的照片。通過觸診隨時間監(jiān)控植入物，并使用卡尺進行測量且發(fā)現在從植入時間起第45天時維持。PhAT在整個實驗過程中是可觸及的，且移去PhAT上面的皮膚后是可見的(圖7C)。在第45天，處死動物并收集材料以用于組織學。組織學表明了與周圍組織整合、血管生成和最小炎性的跡象(圖7D)。實施例9-體內持久性和生物相容性研究體內測試大鼠中皮下植入的優(yōu)選基質的持久性和生物相容性。經約翰霍普金斯動物護理和使用委員會(Johns Hopkins Animal Care and Use Committee)的在先批準進行所有方案。將PhAT皮下植入到八周齡的雌性Sprague-Dawley大鼠(n = 4)的背部。為測量持久性，使用數字卡尺(digital caliper)測量每個植入部位的長度、寬度和深度并記錄三次且取平均值。假設植入物是類橢圓形，使用方程(4/ ( π ) (1/2高度)(1/2寬度)用每個尺寸的平均值計算體積。在剛注射后、第1周和第3周進行這些測量。然后將體積對時間繪圖，并在圖8Α和B中示出了結果。在第1周和第3周安樂死后，取出植入物，并在 10%福爾馬林中過夜固定，并用Η&Ε染色。使用對PhAT植入的炎性反應、細胞流入和PhAT 的血管化的組織學評估評價生物相容性。有細胞流入組織的跡象，考慮到其成纖維細胞形態(tài)，最有可能由成纖維細胞組成。 很少鑒別到完整內腔的血管。卡尺測量表明在第1周絕對高度和體積比初步減少，其在3周后趨于平穩(wěn)(圖 8Α-Β)。收獲時組織的組織學外觀表現出遠大于其在植入前的外觀的組織密度，表明盡管某些初步降解可能造成了植入物的體積隨時間減少，大鼠肌肉皮膚下的組織壓縮也可能有助于初步體積減少。還使用交聯的PhAT進行了生物相容性研究。在植入兩周后，脂肪ECM植入物是不透明的且可在表面觀察到血管化(圖12)。炎性細胞主要存在于植入物周圍。盡管沒有大量的炎性反應，5mM EDC交聯的ECM形成的纖維囊最為明顯。細胞向植入物遷移反映了纖維囊的存在，與對照相比較少的細胞向交聯的支架的中心遷移(圖13)。從該數據可推出 ECM可以被交聯并體內植入而不引起嚴重的免疫反應，從而提供了調節(jié)生物材料的降解特征和機械特性的機制。在第二個研究中，經約翰霍普金斯動物護理和使用委員會的在先批準通過大鼠體內注射研究評價使用交聯的PhAT。用以下條件的400uL脫細胞脂肪細胞外基質皮下注射 12周齡的Sprague-Dawley大鼠(η = 2)未交聯的(對照)、5mM EDC-交聯的或于吐溫20 中的HMDC-交聯，每種條件在背部進行兩個注射。3周后取出植入物并用10%福爾馬林固定以用于組織學分析。在石蠟包埋之前，通過一系列的梯度乙醇溶液對樣本脫水并在二甲苯中提純(cleared)。將植入物切成5um厚的切片，再水合并隨后用蘇木精和曙紅以及Masson三色染色以評價植入物的生物相容性。監(jiān)測植入物的持久性表明在植入第一周后維持穩(wěn)定的植入物體積。在植入物的中心可觀察到與宿主組織的良好整合和細胞浸潤， 表明隨著細胞的大量遷移和隨后的ECM重構，組織再生可維持體積穩(wěn)定的植入物。實施例10-在0. 63rad/sec下評價經加工的脂肪組織的動態(tài)流變學特性使用已知方法例如上述的那些方法(還參見例如Falcone和Berg，2009. Temporary polysaccharide dermal fillers :A model for persistence based on physical properties (短暫多糖皮膚填充劑基于物理性質的持久性模型)。Dermatol. Surg. 35:1-6，通過引用并入本文)分析經加工的脂肪組織的流變學特性。下表提供了結果表1. 0. 63rad/s下PhAT的動態(tài)流變學特性
權利要求
1.一種組合物，所述組合物包括含有脫細胞的活細胞固定地粘附的脂肪組織細胞外基質的經加工的脂肪組織。
2.根據權利要求1所述的組合物，其中所述組合物還包括來自由麻醉劑、鎮(zhèn)痛劑、抗生素、抗微生物劑、生長因子、冷凍保護劑、抗氧化劑、自由基清除劑、胱天蛋白酶抑制劑、維生素、脂肪抽吸物和細胞組成的組的至少一種物質。
3.根據權利要求1或2所述的組合物，還包括交聯劑。
4.根據權利要求3所述的組合物，其中所述交聯劑選自由碳二亞胺(EDC)、1，6-己二異氰酸酯(HMDC)、戊二醛、原花色素、核糖、蘇糖和賴氨酰氧化酶、碳二亞胺、聚環(huán)氧醚、二乙烯砜(DVS)、京尼平、聚醛和疊氮磷酸二苯酯(DPPA)、京尼平、環(huán)氧化合物、二醛淀粉、戊二醛、甲醛、辛二亞氨酸二甲酯、碳二亞胺、琥珀酰亞胺、二異氰酸酯和酰疊氮；或其任何組合組成的組。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的組合物，還包括生物聚合物支架。
6.根據權利要求5所述的組合物，其中所述經加工的脂肪組織和所述生物聚合物支架還包括生物聚合物交聯劑。
7.根據權利要求1至6中任一項所述的組合物，其中所述脂肪組織選自由人脂肪組織和豬脂肪組織組成的組。
8.根據權利要求6或7所述的組合物，還包括交聯劑。
9.根據權利要求8所述的組合物，其中所述混合物還包括聚合劑。
10.根據權利要求9所述的組合物，其中所述混合物還包括聚合引發(fā)劑。
11.根據權利要求6至10中任一項所述的組合物，其中所述生物聚合物支架包括選自由透明質酸、PEG-DA、硫酸軟骨素、部分或完全水解的聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙基噁唑啉)、聚(環(huán)氧乙烷)_共-聚(環(huán)氧丙烷)嵌段共聚物(泊洛沙姆和美羅沙泊)、泊洛沙胺、羧甲基纖維素和羥烷基化纖維素例如羥乙基纖維素和甲基羥丙基纖維素、多肽、多糖或碳水化合物、Ficoll 聚蔗糖、葡聚糖、硫酸乙酰肝素、肝素、藻酸鹽、明膠、膠原、白蛋白、卵白蛋白和其共聚物或混合物組成的組的聚合物。
12.根據權利要求10或11中任一項所述的組合物，其中所述聚合引發(fā)劑包括選自由曙紅Y、l-乙烯基-2-吡咯烷酮NVP和三乙醇胺；和Irgacure D2959組成的組的試劑。
13.根據權利要求1至12中任一項所述的組合物，其中所述經加工的脂肪組織基本上不含基膜或其中所述經加工的脂肪組織包括基膜。
14.根據權利要求1至13中任一項所述的組合物，其中當植入受治療者體內時，所述組合物基本上是無免疫原性的。
15.根據權利要求1至14中任一項所述的組合物，其中所述組合物包括0.2μ g/mg或更少、0. 2 μ g/mg或更少、0. 1 μ g/mg或更少、0. 05 μ g/mg或更少、0. 025 μ g/mg或更少、0. 1 μ g/mg或更少、或0. 005 μ g/mg或更少的DNA。
16.根據權利要求1至15中任一項所述的組合物，其中所述組合物包括10%或更少、5%或更少、2%或更少、或更少、0. 5%或更少、0. 25%或更少、0. 或更少、0. 05%或更少、0. 01%或更少、0. 001%或更少的脂質(w/w)。
17.根據權利要求1至16中任一項所述的組合物，其中所述組合物包括104-105Pas、lxl04-3xl05Pas、2xl04-2xl05Pas、3xl04-lxl05Pas、lxl04-8xl05Pas 或 lxl04_9xl05Pas 或那些范圍的任何組合的復數粘度(η)。
18.根據權利要求1至17中任一項所述的組合物，其中所述組合物包括103-105Pa、5xl03-lxl05Pa、IxlO4-IxlO5Pa,8xl03-6xl04Pa,2xl04-5xl04Pa 或 lxl04_9xl04Pa 或那些范圍的任何組合的復數模量(G*)。
19.根據權利要求1至18中任一項所述的組合物，其中所述組合物包括103-105Pa、5xl03-lxl05Pa、IxlO4-IxlO5Pa,8xl03-6xl04Pa,2xl04-5xl04Pa 或 lxl04_9xl04Pa 或那些范圍的任何組合的彈性模量(G’ )。
20.根據權利要求1至19中任一項所述的組合物，其中所述組合物包括103-105Pa、5xl03-lxl05Pa、IxlO4-IxlO5Pa,8xl03-6xl04Pa,2xl04-5xl04Pa 或 lxl04_9xl04Pa 或那些范圍的任何組合的粘性模量(G”)。
21.根據權利要求1至20中任一項所述的組合物，其中所述組合物包括0.1-0. 2、0. 1-0. 5,0. 1-1. 0,0. 1-0. 3,0. 1-0. 4,0. 1-0. 75,0. 05-0. 5 或 0. 05-2. 0 或那些范圍的任何組合的介質損耗角正切(S)。
22.根據權利要求1至21中任一項所述的組合物，其中存在于所述組合物中的50%或更多、60%或更多、70%或更多、80%或更多、或90%或更多的膠原選自由I型膠原、II型膠原、III型膠原、IV型膠原、V型膠原、XII型膠原組成的組。
23.根據權利要求1至22中任一項所述的組合物，其中存在于所述組合物中的50%或更多、60%或更多、70%或更多、80%或更多、或90%或更多的糖胺聚糖(GAG)選自由透明質酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質素、硫酸肝素組成的組。
24.根據權利要求1所述的組合物，其中所述組合物不溶于水。
25.根據權利要求1所述的組合物，其中所述組合物使用權利要求118中的任何步驟制備。
26.一種用于制備經加工的脂肪組織(PAT)的方法，所述方法依序包括(a)提供包含固態(tài)脂肪的哺乳動物組織；(b)將所述組織中的所述脂肪與非脂肪物質分開；和(c)將所述脂肪脫細胞或從所述脂肪中提取脂質。
27.根據權利要求25所述的方法，其中將所述脂肪脫細胞或從所述脂肪中提取脂質包括用促進去除脂質和細胞的緩沖液處理所述脂肪以制備經加工的脂肪組織。
28.根據權利要求沈所述的方法，其中所述緩沖液包括磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。
29.根據權利要求沈或27所述的方法，其中促進脫細胞的試劑包括選自由弱酸、弱有機酸、非離子去污劑和膽汁酸組成的組的試劑。
30.根據權利要求沈或四所述的方法，其中將所述脂肪脫細胞或從所述脂肪中提取脂質包括使所述脂肪與弱酸和非離子去污劑接觸。
31.根據權利要求沈、四或30中任一項所述的方法，其中將所述脂肪脫細胞或從所述脂肪中提取脂質包括使所述脂肪與選自由過乙酸(PAA)、乙酸、硼酸、磷酸和膽汁酸組成的組的酸接觸。
32.根據權利要求沈、四或30中任一項所述的方法，其中將所述脂肪脫細胞或從所述脂肪中提取脂質包括使所述脂肪與選自由乙氧基化脂肪醇醚、十二烷基醚、乙氧基化烷基酚、辛基苯氧基聚乙氧基乙醇化合物、修飾的乙氧基化直鏈醇、丙氧基化直鏈醇、聚乙二醇單油酸酯化合物、聚山梨醇酯化合物和苯酚脂肪醇醚組成的組的非離子去污劑接觸。
33.根據權利要求32所述的方法，其中所述非離子去污劑選自由Triton X-100、Triton X_114、Pluronics 、Tween 20、Tween 80、聚乙氧基化 QO)失水山梨糖醇單月桂酸酯、Iconol ,Nonidet P 40 (NP-40)、辛基葡糖苷和辛基葡糖硫苷組成的組。
34.根據權利要求27至33中任一項所述的方法，還包括將來自權利要求1的步驟(b)或(c)的脂肪與緩沖液接觸以將脂肪的pH調整至生理pH。
35.根據權利要求沈所述的方法，其中將所述脂肪脫細胞或從所述脂肪中提取脂質包括使所述脂肪與超臨界(X)2接觸。
36.根據權利要求沈至35中任一項所述的方法，還包括使所述經加工的脂肪組織形成顆粒。
37.根據權利要求沈至36中任一項所述的方法，還包括使脫細胞的脂肪與交聯劑接觸。
38.根據權利要求37所述的方法，其中所述交聯劑選自由碳二亞胺(EDC)、1，6-己二異氰酸酯(HMDC)、戊二醛、原花色素、核糖、蘇糖和賴氨酰氧化酶、聚環(huán)氧醚、二乙烯砜(DVS)、京尼平、聚醛和疊氮磷酸二苯酯(DPPA)、京尼平、環(huán)氧化合物、二醛淀粉、戊二醛、甲醛、辛二亞氨酸二甲酯、碳二亞胺、琥珀酰亞胺、二異氰酸酯和酰疊氮；或其任何組合組成的組。
39.根據權利要求沈至38中任一項所述的方法，還包括將所述經加工的脂肪組織與生物聚合物支架組合。
40.根據權利要求39所述的方法，還包括將所述經加工的脂肪組織和生物聚合物支架與生物聚合物交聯劑組合。
41.根據權利要求沈至40中任一項所述的方法，其中所述脂肪組織選自由人脂肪組織和豬脂肪組織組成的組。
42.根據權利要求39所述的方法，其中步驟(c)的混合物還包括交聯劑。
43.根據權利要求42所述的方法，其中所述混合物還包括聚合劑。
44.根據權利要求41至43所述的方法，還包括使所述混合物與聚合引發(fā)劑接觸。
45.根據權利要求41至44中任一項所述的方法，其中所述生物相容性聚合物包括選自由透明質酸、PEG-DA、硫酸軟骨素、部分或完全水解的聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙基噁唑啉)、聚(環(huán)氧乙烷)_共-聚(環(huán)氧丙烷)嵌段共聚物(泊洛沙姆和美羅沙泊)、泊洛沙胺、羧甲基纖維素和羥烷基化纖維素例如羥乙基纖維素和甲基羥丙基纖維素、多肽、多糖或碳水化合物、Ficoll 聚蔗糖、葡聚糖、硫酸乙酰肝素、肝素、藻酸鹽、明膠、膠原、白蛋白、卵白蛋白和其共聚物或混合物組成的組的聚合物。
46.根據權利要求45或46中任一項所述的方法，其中所述聚合引發(fā)劑包括選自由曙紅Y、l-乙烯基-2-吡咯烷酮NVP和三乙醇胺；和Irgacure D2959組成的組的試劑。
47.根據權利要求45至47中任一項所述的方法，其中述聚合引發(fā)劑包括光。
48.根據權利要求沈至50中任一項所述的方法，還包括使所述脂肪與核酸酶接觸。
49.根據權利要求48所述的方法，其中在步驟(c)之后使所述脂肪與所述核酸酶接觸。
50.根據權利要求沈至49中任一項所述的方法，還包括將所述脂肪與蛋白酶抑制劑接觸。
51.根據權利要求沈至50中任一項所述的方法，還包括將所述脂肪與選自由麻醉劑、抗生素、生長因子、冷凍保護劑、抗氧化劑、自由基清除劑、胱天蛋白酶抑制劑、維生素、脂肪抽吸物和細胞組成的組的至少一種物質接觸。
52.根據權利要求51所述的方法，其中在步驟(c)之后使所述脂肪與所述至少一種物質接觸。
53.根據權利要求沈至52中任一項所述的方法，其中步驟(c)的脂肪組織基本上不含基膜。
54.根據權利要求沈至53中任一項所述的方法，其中所述固態(tài)脂肪組織由活供體或尸體供體提供。
55.一種通過權利要求沈至M中任一項所述的方法制備的組合物。
56.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含在藥物載體中的權利要求1至25或55所述的組合物。
57.根據權利要求56所述的組合物的用途，包括將所述組合物注射到受治療者體內。
58.一種用于制備根據權利要求1至25或55至56所述的組合物中的任一種的試劑品.ο
59.一種用于施用根據權利要求1至25或55至56中任一項所述的組合物的任一種的試齊U盒。
60.根據權利要求58或59所述的試劑盒，還包括所述試劑盒的使用說明。
61.一種將經加工的脂肪組織植入受治療者的方法，所述方法包括(a)鑒定需要植入經加工的脂肪組織的受治療者；(b)鑒定需要植入經加工的脂肪組織的受治療者的部位；和(c)在所鑒定的部位將所述經加工的脂肪組織植入到所述受治療者。
62.根據權利要求60所述的方法，其中所述經加工的組織通過權利要求1至對中任一項所述的方法的任一種制備，或所述經加工的組織是權利要求1至25中任一項所述的組合物。
63.根據權利要求61或62所述的方法，其中所述方法還包括監(jiān)控所述受治療者的所述經加工的脂肪組織的持久性、細胞浸潤或免疫反應中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明提供了經加工的脂肪組織的組合物和用于制備經加工的脂肪組織的方法。本發(fā)明還提供了使用經加工的脂肪組織的方法。
文檔編號A61L27/40GK102575229SQ201080045640
公開日2012年7月11日 申請日期2010年8月11日 優(yōu)先權日2009年8月11日
發(fā)明者伊文·吳, 扎伊納·納哈斯, 詹尼弗·H·葉利謝耶夫 申請人:約翰霍普金斯大學