專利名稱：肝病的治療方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療肝病和包括肝硬化和門靜脈高血壓在內(nèi)的并發(fā)癥的方法。具體地，本發(fā)明涉及治療對(duì)肝產(chǎn)生直接或間接損害的非惡性肝病如病毒性或中毒性肝炎、脂肪肝的方法，以及用于治療肝病的組合物。
背景技術(shù)：
非惡性肝病包括中毒性肝炎如最常見(jiàn)中毒形式的酒精性肝炎，感染引起的肝炎如病毒性肝炎、脂肪肝，以及不太常見(jiàn)的表征為慢性炎癥的免疫性肝病。嘗試改善肝功能的治療總是次于原發(fā)性疾病過(guò)程治療，但有許多嘗試通過(guò)靶向不同病理過(guò)程組成來(lái)改善功能，所述病理過(guò)程包括細(xì)胞膜磷脂氧化以及細(xì)胞膜滲透性變化引起的細(xì)胞腫脹和缺氧。采用的一種關(guān)鍵方法是使用抗氧化劑，由黃酮木脂素如植物提取物水飛薊素和水飛薊賓開始(綜述見(jiàn)Flora等，1998)。然而，這種黃酮木脂素在酒精性肝病中的功效令人失望(Angulo等，2000)，并有可能產(chǎn)生肝毒性作用(Bass ； 1999)。水飛薊素的副作用在患者如病毒性丙肝和非酒精性脂肪肝病患者中最嚴(yán)重，所述病例中累積的黃酮木脂素水平報(bào)道為健康對(duì)象的4或5倍或更多(Schrieber等，Drug Metab. Dispos. 2008年 9月36(9) 1909-16)。水飛薊素的副作用包括胃部不適、惡心、輕微頭痛、腹瀉、嘔吐和關(guān)節(jié)痛。還報(bào)道了水飛薊素降低口服避孕藥的有效性，在少見(jiàn)情況下所述副作用可包括嚴(yán)重的胃痛、出汗和肌無(wú)力。最近，使用了生育酚、雙嘧達(dá)莫(Novikov等，1991 ;Vargas等，2001) 和一系列新型合成和天然產(chǎn)生的抗氧化劑(Vaidya等，1996)。這些包括了鈣阻斷劑異搏定、地爾硫卓和氨氯地平(Mason等，1999)，以及尼群地平(Thurman和同事，1998)。首先，認(rèn)為這些試劑在興奮性組織如心肌和動(dòng)脈中時(shí)直接作用于肝細(xì)胞以阻斷鈣進(jìn)入(Liang和Thurman，1992)，然而，很快認(rèn)識(shí)到肝沒(méi)有電壓門控性鈣通道，所述通道是這些藥物在興奮性組織中的靶標(biāo)。因此，如果這些藥物作用于肝臟，其需要以不同方式起作用。因而，發(fā)現(xiàn)許多鈣阻斷劑也是有力的抗氧化劑(Heo等，1997)。還推測(cè)鈣通道阻斷劑可擴(kuò)張肝動(dòng)脈以增加氧合血到肝的遞送(McLean. 1998)。然而，藥物如異搏定、地爾硫卓(Liang和Thurman，1992 ；Romero和同事，1994)及其它鈣阻斷劑的保護(hù)效果在分離細(xì)胞中出現(xiàn)，并因而獨(dú)立于血流中藥物誘導(dǎo)的改變。尚未確認(rèn)低劑量口服給藥的鈣阻斷劑對(duì)肝動(dòng)脈血流的效果。還顯示地爾硫卓對(duì)肝內(nèi)微血管血流沒(méi)有影響 (Marteau 和同事，1988)。本文包括關(guān)于發(fā)明背景的討論以解釋本發(fā)明內(nèi)容。其不視作在任意權(quán)利要求優(yōu)先權(quán)日期上承認(rèn)任何涉及的材料已發(fā)表、已知或作為部分公知常識(shí)。發(fā)明概述我們發(fā)現(xiàn)將對(duì)線粒體施加鈣阻斷效果和具抗氧化作用的鈣通道阻斷劑(具體是地爾硫卓)與源自天然產(chǎn)物的黃酮木脂素共同給予可顯著改善肝細(xì)胞的功能，所述細(xì)胞經(jīng)處理產(chǎn)生與慢性肝病中所出現(xiàn)類似的變化。據(jù)信鈣通道阻斷劑且具體是地爾硫卓在患病細(xì)胞的效果能使細(xì)胞更適當(dāng)代謝黃酮木脂素，從而減少副作用可能。
因此，我們提供治療肝病患者的方法，包括給予(i)具有抗氧化效果的鈣通道阻斷劑的口服緩釋制劑和(ii)至少一種黃酮木脂素。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，鈣通道阻斷劑是地爾硫卓且給予劑量為10_70mg/天。在另一實(shí)施方式中，提供治療肝病患者的方法，包括給予(i)具有抗氧化效果的鈣通道阻斷劑的口服緩釋制劑和(ii)抗氧化有效量的黃酮木脂素。所述黃酮木脂素一般以每天l_5000mg的量給予。在一個(gè)實(shí)施方式中，也給予硫胺素且所用典型劑量可為每天l_200mg，優(yōu)選為每天 20-200mg硫胺素。所述鈣通道阻斷劑和黃酮木脂素可以在同一單位劑量中或分開給予。地爾硫卓采用緩釋制劑形式，其在一個(gè)實(shí)施方式中還包括黃酮木脂素且在另一實(shí)施方式中不包括黃酮木脂素，所述黃酮木脂素以緩釋或非緩釋制劑形式分開給予。本發(fā)明還提供治療和預(yù)防肝病的藥物組合物，包括(i)具有抗氧化效果的鈣通道阻斷劑和(ii)至少一種黃酮木脂素。所述藥物組合物通常是緩釋組合物，提供各鈣通道阻斷劑和黃酮木脂素的緩釋。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述緩釋組合物可包括l_5000mg的至少一種黃酮木脂素(優(yōu)選5-3000mg如10-2000mg或50_1000mg)和10-70mg如10_50mg含量的地爾硫卓構(gòu)成的單
位劑量。在一個(gè)具體優(yōu)選方面，我們發(fā)現(xiàn)將對(duì)線粒體施加鈣阻斷效果和具抗氧化作用的鈣通道阻斷劑(具體是地爾硫卓)與黃酮木脂素如提取自圣奶薊(水飛薊(Silybum marianum))的黃酮木脂素共同給予在模擬疾病的實(shí)驗(yàn)條件下可顯著改善肝細(xì)胞的功能和存活。黃酮木脂素如水飛薊素在患病細(xì)胞中通常無(wú)效且在患病肝臟中可濃縮至正常健康水平的4或5倍，從而加劇顯著副作用的風(fēng)險(xiǎn)。我們認(rèn)為共給予鈣通道阻斷劑不僅保護(hù)受疾病影響細(xì)胞中的細(xì)胞膜，還促進(jìn)至少部分再生功能并改善黃酮木脂素的代謝。水飛薊素作為親水性抗氧化劑的作用可補(bǔ)充地爾硫卓抗氧化效果以保護(hù)暴露于活性氧(R0Q細(xì)胞的細(xì)胞膜和線粒體膜。這些效果具有互補(bǔ)性，因?yàn)橛H水性水飛薊素主要在形成ROS的胞質(zhì)水相中，而親脂性地爾硫卓在ROS通過(guò)將磷脂氧化成溶血磷脂而產(chǎn)生損害的細(xì)胞膜磷脂內(nèi)積聚。ROS引起的細(xì)胞膜損傷提高了細(xì)胞和線粒體膜對(duì)水和鈣的滲透性， 從而分別產(chǎn)生細(xì)胞腫脹、缺氧和鈣超載。作為鈣阻斷劑的地爾硫卓在鈣超載情況中抑制鈣進(jìn)入線粒體，因?yàn)槠湟种凭€粒體膜中的鈣門控性鈣通道，所述通道在胞內(nèi)鈣濃度上升時(shí)激活。此作用可使受損或疲勞 (tired)細(xì)胞繼續(xù)產(chǎn)生能量(ATP)。此效果在類似疾病情況的條件下對(duì)肝細(xì)胞功能具有積極影響。水飛薊素看來(lái)對(duì)線粒體沒(méi)有直接效果，除了可通過(guò)其抗氧化性質(zhì)有助于保護(hù)膜， 而地爾硫卓對(duì)線粒體的能量保護(hù)效果通過(guò)使細(xì)胞能繼續(xù)代謝水飛薊素而產(chǎn)生額外的有益作用。通過(guò)地爾硫卓的直接線粒體效果保持水飛薊素代謝具有2個(gè)重要的臨床結(jié)果。首先，其有助于減輕若肝細(xì)胞代謝能力降低時(shí)肝病條件下可能發(fā)生的水飛薊素副作用。第二， 疾病情況下肝細(xì)胞持續(xù)代謝水飛薊素有助于維持肝選擇性遞送水飛薊素，因?yàn)槌说蛣┝拷o予和在緩釋制劑中，肝選擇性藥物遞送的一個(gè)關(guān)鍵特征是所述藥物必須具有由肝首過(guò)清除產(chǎn)生的較短半衰期。根據(jù)本發(fā)明，我們提供治療患有肝病對(duì)象的方法，包括給予(i)具有抗氧化效果的鈣通道阻斷劑和(ii)至少一種黃酮木脂素的口服緩釋制劑。本發(fā)明還提供(i)具有抗氧化效果的鈣通道阻斷劑和(ii)同為抗氧化劑的至少一種黃酮木脂素在制備治療肝病的藥物中的應(yīng)用，所述兩種成分在一種或多種緩釋鈣通道阻斷劑的組合物中共同給予。本發(fā)明還提供治療或預(yù)防肝病的藥物組合物，包括(i)具有抗氧化效果的鈣通道阻斷劑和(ii)同為抗氧化劑的至少一種黃酮木脂素。所述藥物組合物通常是緩釋組合物， 其在數(shù)小時(shí)，優(yōu)選8-12或更多小時(shí)內(nèi)釋放活性劑(具有抗氧化效果的親脂性鈣通道阻斷劑與親水性黃酮木脂素抗氧化劑)。需要肝選擇性緩釋制劑，因?yàn)樵S多適用于此治療的藥物有血管活性或具有全身效果，若其優(yōu)選在肝內(nèi)濃縮則可避免這種作用。所述低劑量、緩釋制劑優(yōu)選提供的鈣通道阻斷劑遞送率足以在門靜脈內(nèi)產(chǎn)生臨床有效血液水平且低于在外周循環(huán)產(chǎn)生臨床有效水平所需，從而提供對(duì)肝有選擇性效果的遞送率。除了鈣通道阻斷劑和黃酮木脂素，可分開或同時(shí)給予硫胺素。以維生素B這一名稱為人熟知的硫胺素在線粒體內(nèi)作為線粒體保護(hù)劑起作用，即作為丙酮酸脫氫酶輔因子，其也是親水性抗氧化劑。其用于營(yíng)養(yǎng)不良患者和一些病毒性肝炎患者。將硫胺素添加到具有抗氧化性質(zhì)的鈣拮抗劑中也發(fā)揮了維生素對(duì)線粒體內(nèi)能量產(chǎn)生的促進(jìn)效果和其自身在細(xì)胞內(nèi)的抗氧化效果。發(fā)明詳述肝臟以靜脈血低壓灌注。因此，在任何原因的細(xì)胞腫脹抑制血流時(shí)，其缺氧風(fēng)險(xiǎn)超過(guò)體內(nèi)任何其它器官。肝缺氧是幾乎所有非惡性肝病形式的特征，占50%或更多的病理和功能損傷。在炎癥中，氧自由基通過(guò)炎癥過(guò)程在細(xì)胞外產(chǎn)生。相反，在缺氧中，自由基在細(xì)胞內(nèi)生成(隨著NADPH水平升高)。自由基生成區(qū)域都在水相中。我們發(fā)現(xiàn)通過(guò)使用2種不同類型的抗氧化劑即黃酮木脂素與鈣通道阻斷劑聯(lián)用， 獲得保肝水平，當(dāng)與單一抗氧化劑來(lái)源比較時(shí)其特異性提高。這與某一高水平抗氧化劑提供最優(yōu)保護(hù)的通常觀念相反。不希望受到理論約束，我們認(rèn)為所述組合的效果增強(qiáng)可能是由于來(lái)自天然產(chǎn)物的抗氧化劑具體是黃酮木脂素的胞內(nèi)抗氧化效果結(jié)合了抗擊細(xì)胞內(nèi)低氧自由基的鈣通道阻斷劑的胞內(nèi)抗氧化效果。所述組合提供胞內(nèi)穩(wěn)定水平的磷脂，其與使用單一試劑相比有顯著改善。此外，黃酮木脂素傾向于在患病肝細(xì)胞中積聚，其作為抗氧化劑的效果在鈣通道阻斷劑存在時(shí)得以恢復(fù)。黃酮木脂素在患病細(xì)胞中的代謝也增強(qiáng)，從而降低黃酮木脂素在患有肝病對(duì)象中的副作用風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明使用至少一種選自黃酮木脂素的抗氧化劑。水飛薊賓也稱為水飛薊，是水飛薊素的主要活性組分，水飛薊素是提取自圣奶薊(水飛薊)黃酮木脂素的混合物。本文使用的術(shù)語(yǔ)黃酮木脂素包括水飛薊素和其活性成分水飛薊賓，無(wú)論是純化的化合物形式(認(rèn)為是3，5，7-三羥基-2- (3- (3-羥基-4-甲氧苯基)-2-(羥甲基)-2，3- 二氫苯[b] [1，4] 二惡英-6-基)苯并二氫吡喃-4-酮)或藥學(xué)上可接受鹽如二氫水飛薊賓雙琥珀酸二鈉(商品名Legalon SIL，注射液)，以及包合物如β -環(huán)糊精包合物和水飛薊糖苷，其顯示更好的水溶性和甚至更強(qiáng)的保肝作用。本發(fā)明可使水飛薊素相關(guān)副作用減少或總體消除，以持續(xù)使用組合治療而沒(méi)有延長(zhǎng)的不良效果。所述組合物一般至少每天給予一次，連續(xù)至少10天，優(yōu)選至少20天，更優(yōu)選連續(xù)至少30天。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述組合物包括含有l(wèi)_200mg硫胺素，優(yōu)選20_200mg硫胺素的單位劑型硫胺素。肝病患者可能缺乏硫胺素，其可通過(guò)以每天l_5mg的量給予硫胺素來(lái)治療。相反，使用相對(duì)較高劑量20-200mg遠(yuǎn)超過(guò)治療維生素缺乏癥所需的水平。本發(fā)明組合物的該劑量提供顯著治療效果，認(rèn)為所述效果由相對(duì)較高劑量硫胺素的抗氧化作用產(chǎn)生。優(yōu)選的鈣通道阻斷劑是親脂性的以確保其深入滲透細(xì)胞且進(jìn)入膜內(nèi)，從而其治療效果位于自由基發(fā)揮作用的地方。相反，在胞質(zhì)或細(xì)胞環(huán)境內(nèi)起作用的藥物需要更為親水。 大部分鈣阻斷藥物，包括異搏定、地爾硫卓、氨氯地平和尼群地平都具有抗氧化性質(zhì)作為膜穩(wěn)定效果的組成，但地爾硫卓和異搏定較短的半衰期使得這些試劑更適用于制成肝選擇性膜穩(wěn)定劑。優(yōu)選試劑是作為緩釋制劑給予的地爾硫卓，劑量低于每天70mg如每天10-70mg 或每天20-70mg且優(yōu)選低于每天50mg如每天10_50mg。這些劑量遠(yuǎn)低于治療心絞痛和高血壓所用藥物的劑量。地爾硫卓可采用鹽酸鹽或其它藥學(xué)上可接受鹽的形式。我們發(fā)現(xiàn)地爾硫卓和黃酮木脂素如水飛薊素的組合相較任一單獨(dú)藥物可保護(hù)細(xì)胞抵御氧化壓力。地爾硫卓、黃酮木脂素和組合藥物治療都與2種細(xì)胞類型中ATP水平提高相關(guān)，組合藥物治療顯示高出許多的保護(hù)效果。Bax和Bax mRNA水平通過(guò)藥物治療在統(tǒng)計(jì)上降低，所述組合再次顯示有益效果比任一單獨(dú)治療高許多。地爾硫卓和黃酮木脂素的組合相較任一單獨(dú)藥物提供額外的保肝效果。保護(hù)性質(zhì)延伸到降低促調(diào)亡蛋白Bax的水平。 因此，我們發(fā)現(xiàn)鈣通道阻斷劑和黃酮木脂素的組合不僅相較各自分開使用時(shí)顯著改善肝保護(hù)，而且令人驚訝的是我們發(fā)現(xiàn)所述組合產(chǎn)生有用水平的細(xì)胞再生。因此，治療不僅降低疾病作用，還引起細(xì)胞再生和至少部分減少肝病的嚴(yán)重性。地爾硫卓?jī)?yōu)選以低于治療心血管疾病處方劑量的一半(更優(yōu)選低于三分之一)給予。涉及處方藥物的醫(yī)書中提供了治療心血管疾病的處方劑量。我們具體指澳大利亞版的 MIMS年刊(Australian Edition of MIMS Annual，2001)，其列出了地爾硫卓的平均最優(yōu)劑量為每天180-M0mg。優(yōu)選的鈣通道阻斷劑是膜穩(wěn)定劑(或試劑組合)，其效果跨數(shù)個(gè)膜破壞過(guò)程主要成分。優(yōu)選的鈣通道阻斷劑用作胞內(nèi)和膜內(nèi)抗氧化劑，限制鈣進(jìn)入線粒體，抑制磷脂酶活性，促進(jìn)或維持細(xì)胞的能量產(chǎn)生。此外，這些作用優(yōu)選在缺氧期間隨著細(xì)胞PH降低而持續(xù)運(yùn)作?？傮w上，我們認(rèn)為這些效果用于減少細(xì)胞腫脹和缺氧，從而改善肝功能。我們?cè)谶@些基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)地爾硫卓特別優(yōu)選。所有細(xì)胞中的線粒體具有鈣門控性的鈣通道。所述通道隨著胞內(nèi)鈣水平上升而激活，從而鈣“分流”入線粒體。該通道不同于興奮性組織(肌肉和動(dòng)脈)的電壓門控性通道， 但為幾乎所有鈣阻斷劑(鈣拮抗劑)所抑制。肝病患者常具有較低的正常血壓，需要確保治療不使血壓降低到可能引起疲勞和肝功能損傷的水平。
肝選擇性藥物遞送短效鈣阻斷劑是解決高血壓和疲勞風(fēng)險(xiǎn)的一個(gè)方法，但地爾硫卓作為苯并噻嗪且與異搏定和二氫吡啶相反，在血壓正?；颊咧挟a(chǎn)生很小的降血壓影響并因此較其它鈣拮抗劑更優(yōu)選。亞細(xì)胞研究顯示地爾硫卓的保護(hù)效果看來(lái)在其濃度遠(yuǎn)高于全細(xì)胞研究所用濃度或口服給藥后觀察到的藥物血漿濃度時(shí)出現(xiàn)。然而，所述藥物的親脂性質(zhì)意味著膜吸收藥物，在膜和血漿間獲得100 1或更高的濃度梯度。這也解釋了為什么在藥物用于細(xì)胞培養(yǎng)物后可能需要2小時(shí)或更長(zhǎng)來(lái)顯現(xiàn)線粒體鈣阻斷效果。地爾硫卓是順式-(+)-3-(乙酰氧基)-5-[2_( 二甲氨基)乙基]-2，3_ 二氫-2- (4-甲氧苯基)-1，5-苯并硫氮雜革-4 (5H)-酮，在本文中稱為“地爾硫卓”，其是具有鈣拮抗活性的苯并噻嗪衍生物。因此，地爾硫卓在臨床上用于阻斷鈣離子流入平滑肌和心肌并因而產(chǎn)生潛在的心血管效應(yīng)。顯示地爾硫卓用于緩解慢性心臟病癥狀，具體是心絞痛和心肌缺血及高血壓，而副作用發(fā)生率較低。這些應(yīng)用中，地爾硫卓可采用鹽酸地爾硫卓， 以強(qiáng)度為30、60、90和120mg的片劑形式，和強(qiáng)度為60、90、120、180、240和300mg的膠囊形式。地爾硫卓還采用5mg/ml濃度的注射形式。治療心血管疾病的地爾硫卓療法通常起始于30mg，每天給予4次。所述劑量逐步增加到180-360mg/天，以分劑量每天給予3或4次，間隔1_2天直至獲得最優(yōu)響應(yīng)。地爾硫卓由肝臟廣泛代謝。根據(jù)瑪瑞恩公司(Marion Merrell Dow he.)發(fā)布的專業(yè)應(yīng)用信息，CARDIZEM. RTM.品牌片劑中的地爾硫卓吸收約80%，且受到廣泛的首過(guò)作用，相較靜脈內(nèi)給藥產(chǎn)生約40%的絕對(duì)生物利用度。30-120mg單一口服劑量的CARDIZEM. RTM.地爾硫卓片劑在給藥后2-3小時(shí)產(chǎn)生峰值血漿水平。給藥后30-60分鐘內(nèi)產(chǎn)生可檢測(cè)的血漿水平表明CARDIZEM. RTM.地爾硫卓片劑易吸收。單次或多次給藥后的血漿消除半衰期約為3. 5 小時(shí)。CARDIZEM. RTM.地爾硫卓片劑的治療血液水平看來(lái)為50_200ng/ml。與現(xiàn)有技術(shù)的鈣通道阻斷劑制劑相反，視作阻礙心血管疾病有效治療的藥物如地爾硫卓的首過(guò)清除在治療肝病中成為優(yōu)勢(shì)，因?yàn)槠淇墒顾幬锏呐R床效果限于肝臟。因此，特別優(yōu)選鈣通道阻斷劑以低劑量存在且作為緩釋制劑以提供門靜脈中的臨床有效血液水平和低于在外周循環(huán)產(chǎn)生臨床有效水平所需的劑量。因此，本發(fā)明的方法和組合物提供對(duì)肝具有選擇性效果的遞送率。該肝保護(hù)方法聯(lián)用地爾硫卓和黃酮木脂素及任選的硫胺素，可用于因存在氧化試劑或氧化過(guò)程而出現(xiàn)原發(fā)或繼發(fā)性細(xì)胞膜受損的任何肝疾病狀態(tài)。使用這些膜穩(wěn)定劑的肝選擇性制劑可補(bǔ)充原發(fā)病治療。地爾硫卓的直接線粒體效應(yīng)能在疾病情況下保護(hù)肝功能，還對(duì)水飛薊素的代謝清除有臨床上重要的影響。首先，它有助于減少若肝細(xì)胞代謝能力降低時(shí)肝病條件下可能發(fā)生的水飛薊素副作用。第二，疾病情況下肝細(xì)胞持續(xù)代謝水飛薊素有助于維持肝選擇性遞送水飛薊素，因?yàn)槌说蛣┝拷o予和在緩釋制劑中給予外，肝選擇性遞送的一個(gè)關(guān)鍵特征是所述藥物必須具有由肝首過(guò)清除產(chǎn)生的較短半衰期。適當(dāng)時(shí)這些保肝劑可與主要疾病治療所用的治療劑共開處方或共配制，所述治療劑如治療丙肝的病毒唑或其它口服給藥的抗病毒劑。因此，本發(fā)明還提供治療或預(yù)防肝病的方法，通過(guò)與其它活性劑如用于治療門靜脈高血壓或病毒性肝炎的活性劑一起共給予或共配制本發(fā)明中詳述的保肝治療，該治療包括鈣通道阻斷劑和抗氧化劑如地爾硫卓與至少一種黃酮木脂素的肝選擇性制劑，其中任選包含另一抗氧化劑如硫胺素，其相較鈣通道阻斷劑更親水。所述組合物的2種組分即鈣通道阻斷劑與黃酮木脂素可共配制或以單獨(dú)組合物給予。所述試劑可通過(guò)相同途徑(具體是口服給藥)或不同途徑給予。例如，一種活性劑可經(jīng)靜脈內(nèi)或胃腸外給予而鈣通道阻斷劑經(jīng)口服給予。在本發(fā)明的方法和組合物中，硫胺素在使用時(shí)可采用鹽形式如鹽酸鹽或其它藥學(xué)上可接受的衍生物。中毒性肝炎患者吸收硫胺素的能力受損，盡管血液中較低的硫胺素濃度通常難以測(cè)量。因此，在患病肝臟細(xì)胞中線粒體能量產(chǎn)生嚴(yán)重受阻。在本發(fā)明的一個(gè)具體優(yōu)選實(shí)施方式中，至少一種選自用于治療門靜脈高血壓的試劑或抗病毒劑的藥劑與鈣通道阻斷劑、黃酮木脂素和任選的硫胺素共配制。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供治療或預(yù)防中毒性肝炎(例如酒精性肝炎，還包括脂肪肝)的方法，包括共給予鈣通道阻斷劑和硫胺素的肝選擇性制劑。如果親水性的硫胺素與鈣通道阻斷劑成分共配制，其特別有利。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，我們提供治療中毒性肝炎的組合物，包括鈣通道阻斷劑如地爾硫卓和黃酮木脂素具體是水飛薊素、水飛薊賓和其藥學(xué)上可接受的抗氧化劑衍生物的肝選擇性制劑。優(yōu)選的鈣通道阻斷劑是量為20_70mg/天的地爾硫卓，更優(yōu)選25_50mg/天。黃酮木脂素如水飛薊賓或水飛薊素的日劑量為l-5000mg/天且優(yōu)選10-2000mg/ 天。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，地爾硫卓黃酮木脂素的日劑量比為 50 1-1 120 且更優(yōu)選 2 1-1 120。使用硫胺素時(shí)，優(yōu)選其含量提供每天l_200mg的遞送且更優(yōu)選每天20_200mg。在本說(shuō)明書的描述和權(quán)利要求中，單詞“包括”和該單詞變體如“包含”和“含有” 不用于排除其它添加物、組分、整數(shù)或步驟。使用維生素硫胺素在線粒體中加入補(bǔ)充性線粒體效應(yīng)，在所述線粒體中作為丙酮酸脫氫酶輔因子促進(jìn)能量生成。此療法可用于在肝臟受到任何形式慢性非惡性疾病損傷時(shí)保護(hù)肝臟和維持肝功能，在這些慢性非惡性疾病中細(xì)胞膜受到原發(fā)或繼發(fā)性過(guò)程損傷從而肝細(xì)胞腫脹足以阻礙門靜脈血流并弓I起肝缺氧。本發(fā)明治療可應(yīng)用的疾病包括所有形式的病毒性肝炎(包括乙肝和丙肝)、酒精性肝病、肝硬化、中毒性肝炎、自身免疫性肝炎、脂肪肝、化療或放療期間持續(xù)的肝損傷、肝老化。肝內(nèi)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的進(jìn)行性退化是幾乎所有形式的慢性、非惡性肝病的關(guān)鍵組成。它引起肝功能的總體損傷，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，補(bǔ)充或提高原發(fā)病過(guò)程的效應(yīng)。肝選擇性藥物遞送的構(gòu)想需要半衰期較短的藥物以低劑量和緩釋制劑給予。這與腸包衣很不同且隨著藥物通過(guò)小腸提供了優(yōu)選至少8小時(shí)且至多M小時(shí)的釋放。穿越胃腸壁后，藥物到達(dá)相對(duì)小體積的門靜脈系統(tǒng)且被攜帶到肝臟。在此通過(guò)代謝從循環(huán)中移除顯著部分，剩余部分進(jìn)入體積大許多的全身循環(huán)。如此，獲得穩(wěn)定的濃度梯度，其中肝和門脈循環(huán)中的藥物濃度比全身循環(huán)至多高5倍或更多。所得濃度梯度可在硬化或其它緩流門脈循環(huán)條件下更高，然而，此效果可能為門脈與全身循環(huán)間側(cè)支血管顯著生成所抵消。在許多治療情況下，需要限制藥物遞送到靶器官。當(dāng)藥物具有涉及其它藥理特性的副作用時(shí)，這特別重要。在膜穩(wěn)定劑也是鈣通道阻斷劑(和強(qiáng)效血管擴(kuò)張劑)的情況中，其作為肝選擇性療法可避免或最小化有害血管擴(kuò)張劑和心臟作用，從而增加耐受性和可接受性。肝選擇性遞送還使所需藥物總體日劑量減少到20-25 %的完整全身劑量，所述全身劑量是給予藥物達(dá)到全身效果時(shí)通常需要的劑量。在地爾硫卓的情況中，用于治療心絞痛和高血壓的全身效果所需的劑量通常是 120-360mg/天，每天50mg或更少劑量的地爾硫卓會(huì)在肝中保持治療效果，但在體內(nèi)其它部分則沒(méi)有。具有這些特性且包括配制用于肝選擇性遞送的有或沒(méi)有硫胺素的包含地爾硫卓的膜穩(wěn)定劑可用于在以下情況中保護(hù)肝臟·病毒性肝炎，包括乙肝、丙肝和其它形式·酒精性肝炎·肝硬化·門靜脈高血壓·脂肪肝，包括非酒精性脂肪性肝炎(NASH)·毒素、藥物和異常免疫狀態(tài)引起的其它非惡性肝病形式·化療期間的肝功能障礙·放療后的肝功能障礙·肝老化。在病毒性肝炎的情況中，肝細(xì)胞膜損傷的直接原因是機(jī)體對(duì)病毒存在的免疫應(yīng)答 (Loguercio和狗(1吐化0，2003)。這導(dǎo)致自由基生成，損害細(xì)胞表面和內(nèi)部的細(xì)胞膜(Jain 等，200 。由此盡管有或沒(méi)有添加病毒唑(或相關(guān)分子)時(shí)使用干擾素是必需的抗病毒治療，需要保護(hù)或逆轉(zhuǎn)免疫過(guò)程對(duì)肝細(xì)胞的損傷。因此，具有抗氧化和線粒體效應(yīng)的肝選擇性膜穩(wěn)定劑可補(bǔ)充初級(jí)治療。此外，在無(wú)法負(fù)擔(dān)昂貴的殺病毒療法的人群中，用肝選擇性膜穩(wěn)定劑如地爾硫卓或可最小化或控制癥狀的相關(guān)分子治療成為可負(fù)擔(dān)的替代方案。因此，有或沒(méi)有添加硫胺素的肝選擇性膜穩(wěn)定劑可作為單療法開處方，與干擾素和病毒唑或其它適當(dāng)抗病毒療法共開處方，或與病毒唑或其它口服給藥的抗病毒療法組分共配制從而將2種或所有藥物一起作為肝選擇性制劑給予。硫胺素(維生素Bi)治療用于酒精性肝病，因?yàn)樵摷膊』颊咄ǔＨ狈λ鼍S生素營(yíng)養(yǎng)。硫胺素作為數(shù)個(gè)切割碳-碳鍵的反應(yīng)的輔酶，所述反應(yīng)包括肝線粒體內(nèi)的關(guān)鍵代謝過(guò)程(Wilson，1998)。除了修正營(yíng)養(yǎng)缺乏，硫胺素治療可改善乙肝和丙肝患者中藥物誘導(dǎo)的線粒體損傷(Kontorinis和Dieterich，200 。其它研究顯示硫胺素缺乏在酒精性肝病和丙肝引起的硬化患者中普遍，但在無(wú)硬化的丙肝患者沒(méi)有(Levy和同事，200 。然而，顯示硫胺素改善乙肝患者的肝功能(Wallace和ffeekS，2001)。這些研究提示所述維生素可能對(duì)病毒性肝炎患者的線粒體功能具有保護(hù)效應(yīng)。硫胺素保護(hù)效應(yīng)的另一關(guān)鍵構(gòu)成是其抗氧化特性，這由于其親水性分布而似乎在胞質(zhì)中具有活性。有證據(jù)顯示硫胺素(維生素)治療可作為線粒體保護(hù)劑協(xié)助病毒性肝炎患者 (Wallace AE和W^eeks WB，2001)，具體是在丙肝引起的硬化患者中(Levy等，2002)。肝選擇性膜穩(wěn)定劑和硫胺素的共處方或共配制在這些患者中有效。具體地，我們認(rèn)為硫胺素以及膜穩(wěn)定劑的補(bǔ)充性能量促進(jìn)作用和其抗氧化效果提供了顯著的優(yōu)點(diǎn)。在門靜脈高血壓和硬化患者中，立即治療是修正潛在的原發(fā)肝病，然后降低血管對(duì)門靜脈血流的阻力，或用普萘洛爾或其它非選擇性腎上腺素拮抗劑立即降低門靜脈血流。因此，具有抗氧化劑和線粒體鈣抑制的所述組合物可補(bǔ)充此初步治療。所述組合物可與普萘洛爾共開處方。在其它肝病形式，包括中毒性肝炎、免疫性肝炎和全身性化療進(jìn)程期間肝損傷中， 氧化劑和自由基在細(xì)胞內(nèi)外攻擊肝細(xì)胞膜是所述疾病主要病理機(jī)制。這進(jìn)而引起細(xì)胞腫脹，誘導(dǎo)缺氧和細(xì)胞及線粒體內(nèi)第二階段的自由基生成。放療也產(chǎn)生自由基。盡管在肝必需或有意輻照時(shí)這可能是靶向癌癥器官的關(guān)鍵機(jī)制，通過(guò)門靜脈血用低壓灌注的正常生理功能使得所述器官特別面臨缺氧和功能退化的風(fēng)險(xiǎn)。因此，共同給予鈣通道阻斷劑和黃酮木脂素可補(bǔ)充藥物或毒素撤停、免疫性疾病控制、全身化療期間的治療、或放療后治療。在老化肝中，肝的氧化特性減少，從而肝保護(hù)自身免受飲食中自然發(fā)生的氧化作用的能力減弱。這些變化包括線粒體和胞質(zhì)功能，使得肝面臨更大的細(xì)胞腫脹、中等缺氧和功能受損的風(fēng)險(xiǎn)。因此，共同給予鈣通道阻斷劑和黃酮木脂素用于治療老化肝以協(xié)助維持具有任何程度肝功能損傷的老年患者的肝功能。緩釋制劑有許多技術(shù)可影響活性藥劑從口服給藥制劑中緩釋。這些方法可包括設(shè)計(jì)用于延遲膠囊、片劑或其它載劑崩解的技術(shù)，設(shè)計(jì)用于阻礙膠囊、片劑或其它載劑溶解度的技術(shù)， 活性劑可結(jié)合聚合物或其它大分子從而不發(fā)生吸附直到所述物質(zhì)從該聚合物或其它大分子中釋放的技術(shù)。完成這些不同緩釋方法的手段不同且包括熟知的老方法如蟲膠包被層， 和使用合成及纖維素聚合物或提供具有至少一個(gè)孔的膜包被的更現(xiàn)代化技術(shù)。根據(jù)本發(fā)明的劑型可以是控釋劑型。釋放這些劑型的機(jī)制可通過(guò)擴(kuò)散或侵蝕來(lái)控制。在一些實(shí)施方式中，所述制劑包括聚合物包衣的多顆粒，聚合物包衣的片劑或迷你片劑，或親水性基質(zhì)片劑。設(shè)計(jì)用作保肝劑的膜穩(wěn)定藥物的緩釋制劑可設(shè)計(jì)成在給藥后約6-約M小時(shí)釋放，從而可每天一次給藥并使藥物持續(xù)接觸肝臟。在一些實(shí)施方式中，在延長(zhǎng)時(shí)間段釋放藥物的制劑可具有1個(gè)以上定時(shí)釋放組分以影響時(shí)間覆蓋。本發(fā)明涉及發(fā)現(xiàn)作為緩釋制劑給予的低劑量膜穩(wěn)定劑(包括劑量小于50mg/天的地爾硫卓)的保護(hù)效果是通過(guò)對(duì)肝自身而不是血管系統(tǒng)的直接保護(hù)作用來(lái)介導(dǎo)，所述藥物用作親脂性抗氧化劑以滲透細(xì)胞并保護(hù)細(xì)胞膜和線粒體免受磷脂氧化的損害影響，并用作線粒體鈣拮抗劑。所述緩釋組合物可以是前面報(bào)道用于治療心血管病的任何類型，除了地爾硫卓劑量減少到每天20-70mg。如上所述，該緩釋組合物還優(yōu)選包括含量為每天l_5mg的硫胺素。 所述組合物可設(shè)計(jì)成每天給藥一次、每天給藥二次或更頻繁，具體優(yōu)選每天給藥一次。美國(guó)專利號(hào)4，721，619,4, 891，230,4, 917，899 和 5，219，62 公開了意在需要每 12 小時(shí)給予一次(即每天二次)的地爾硫卓制劑。美國(guó)專利號(hào)4，894，240和5，002, 776公開了意在需要每M小時(shí)給予一次(即每天一次)的地爾硫卓制劑。為獲得這些專利中所公開的溶出概況，公開的制劑需要包被中央芯體的多層膜和活性芯體和/或多層膜中的有機(jī)酸。這些專利中公開的合適有機(jī)酸是己二酸、抗壞血酸、檸檬酸、富馬酸、蘋果酸、琥珀酸和酒石酸。根據(jù)瑪瑞恩公司發(fā)布的專業(yè)應(yīng)用信息，CARDIZEM. RTM.⑶地爾硫卓膠囊是含有 120,180,240或300mg鹽酸地爾硫卓的緩釋型地爾硫卓膠囊，建議劑量為一天1膠囊。類似地，為獲得M小時(shí)地爾硫卓釋放分布，CARDIZEM. RTM.⑶地爾硫卓膠囊中的小丸包括富馬酸、有機(jī)酸和包被中央芯體的多層膜。根據(jù)上述專利，所述小丸在包被過(guò)程期間和之后數(shù)小時(shí)必須干燥。適用于發(fā)明過(guò)程的另一方法描述于美國(guó)專利5 834 024(HeiniCke等)，其使用短滯和長(zhǎng)滯地爾硫卓小丸的組合以提供M小時(shí)的均勻地爾硫卓釋放。在本發(fā)明組合物的一個(gè)實(shí)施方式中，所述緩釋組合物包括含地爾硫卓的芯體和一個(gè)或多個(gè)聚合物包衣。所述芯體可以且優(yōu)選包含硫胺素組分。所述芯體可在例如惰性材料如糖丸芯上形成。藥學(xué)上可接受的粘合劑如羥丙基纖維素可用于所述芯體。一個(gè)或多個(gè)包衣可含有通透地爾硫卓和水的聚合物及相對(duì)較少通透地爾硫卓和水的聚合物。地爾硫卓通透性聚合物示例是合成自丙烯酸和甲基丙烯酸酯的低季銨基團(tuán)含量的陽(yáng)離子聚合物，稱為EUDRAGIT RL(德國(guó)羅姆藥廠(Rohm Pharma GmbH)生產(chǎn))乙基纖維素、醋酸纖維素、丙酸纖維素(較低，中等或較高分子量)、醋酸丙酸纖維素、醋酸丁酸纖維素、醋酸鄰苯二甲酸纖維素、三乙酸纖維素、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、 聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸異丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸異癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸異丙酯)、聚(丙烯酸異丁酯)、聚(丙烯酸十八酯)、聚乙烯、低密度聚乙烯、高密度聚乙烯、 聚丙烯，聚(環(huán)氧乙烷)、聚(對(duì)苯二甲酸乙二酯)、聚(乙烯基異丁基醚)、聚(醋酸乙烯酯)、聚氯乙烯或聚氨酯，或這些中任意2種或更多種的混合物。合適的較少通透水和地爾硫卓的天然產(chǎn)生聚合物或樹脂包括蟲膠、殼聚糖，杜松膠(gumjimiper)或這些中任意2種或更多種的混合物。較少通透地爾硫卓和水的可使用物質(zhì)包括陽(yáng)離子聚合物，稱為EUDRAGIT RS(德國(guó)羅姆藥廠生產(chǎn)；EUDRAGIT RS通透性低于EUDRAGIT RL，因?yàn)镋UDRAGIT RS的銨基團(tuán)較少) 乙基纖維素、醋酸纖維素、丙酸纖維素(較低，中等或較高分子量)、醋酸丙酸纖維素、醋酸丁酸纖維素、醋酸鄰苯二甲酸纖維素、三乙酸纖維素、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸異丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸異癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚 (丙烯酸異丙酯)、聚(丙烯酸異丁酯)、聚(丙烯酸十八酯)、聚乙烯、低密度聚乙烯、高密度聚乙烯、聚丙烯，聚(環(huán)氧乙烷)、聚(對(duì)苯二甲酸乙二酯)、聚(乙烯基異丁基醚)、聚(醋酸乙烯酯)、聚氯乙烯或聚氨酯，或這些中任意2種或更多種的混合物。合適的較少通透水和地爾硫卓的天然產(chǎn)生聚合物或樹脂包括蟲膠、殼聚糖，杜松膠或這些中任意2種或更多種的混合物。除了所述聚合物，包衣層含有潤(rùn)滑劑和濕潤(rùn)劑。優(yōu)選所述潤(rùn)滑劑是滑石且濕潤(rùn)劑是月桂基硫酸鈉。月桂基硫酸鈉的合適替代物可包括試劑如阿拉伯樹膠、苯扎氯銨、聚西托醇 (cetomacrogol)乳化蠟、十八醇十六醇混合物、鯨蠟醇、膽固醇、二乙醇胺、多庫(kù)酯鈉、硬脂酸鈉、乳化蠟、單硬脂酸甘油酯、羥丙基纖維素、羊毛醇、卵磷脂、礦物油、單乙醇胺、泊洛沙姆、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、藻酸丙二醇酯、山梨聚糖酯、硬脂醇和三乙醇胺，或上述任意2種或更多種的混合物。
所述包衣中可含有的合適滑石替代物是硬脂酸鈣、膠態(tài)二氧化硅、丙三醇、硬脂酸鎂、礦物油、聚乙二醇、和硬脂酸鋅、硬脂酸鋁，或上述任意2種或更多種的混合物。增塑劑優(yōu)選包括在所述包衣中以改善聚合物膜的彈性和穩(wěn)定性并防止聚合物滲透性在長(zhǎng)期儲(chǔ)存中變化。這種變化可影響藥物釋放率。合適的常規(guī)增塑劑包括乙?；瘑胃视王?、乙酰檸檬酸三丁酯、乙酰檸檬酸三乙酯、蓖麻油、檸檬酸酯、鄰苯二甲酸二丁酯、癸二酸二丁脂、草酸二乙酯、蘋果酸二乙酯、富馬酸二乙酯、鄰苯二甲酸二乙酯、丁二酸二乙酯、丙二酸二乙酯、酒石酸二乙酯、鄰苯二甲酸二甲酯、丙三醇、甘油、三乙酸甘油酯、三丁酸甘油酯、礦物油和羊毛脂醇、礦脂和羊毛脂醇、鄰苯二甲酸酯、聚乙二醇、丙二醇、菜油、芝麻油、三醋精、檸檬酸三丁酯、檸檬酸三乙酯和乙酰檸檬酸三乙酯，或上述任意2種或更多種的混合物。檸檬酸三乙酯是目前優(yōu)選的增塑劑?；蛘呋虼送?，所述芯體或包衣可包括有機(jī)酸，如己二酸、抗壞血酸、檸檬酸、富馬酸、蘋果酸、琥珀酸、酒石酸和富馬酸?？蒯尩奶娲椒ㄊ鞘褂媚ぐ缓谢钚詣┑男倔w，所述膜中具有至少一個(gè)孔。這種安排由Chen等在US 6，866，866中描述，用以提供每天一次劑量的二甲雙胍緩釋。Chen 等還在美國(guó)專利6，524，620中描述了地爾硫卓的緩釋制劑，其可與低劑量的本發(fā)明組合物一起使用以治療肝病。現(xiàn)在參考以下實(shí)施例描述本發(fā)明。應(yīng)理解本發(fā)明提供所述實(shí)施例的目的只是闡述，它們不限制本發(fā)明范圍。
實(shí)施例盡管水飛薊素組成復(fù)雜，但其他研究者已顯示可將此植物試劑配制在易侵蝕基質(zhì)中，所使用的系統(tǒng)是基于單硬脂酸甘油酯和聚乙二醇6000或泊洛沙姆188 (Cheng等2007)。 由此可使用許多制備緩釋制劑的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將水飛薊素和其它植物抗氧化劑與地爾硫卓共配制。本發(fā)明的權(quán)利要求涉及在緩釋制劑中共配制植物抗氧化劑與低劑量地爾硫卓的構(gòu)想，而不是所用制劑的特定化學(xué)性質(zhì)。對(duì)比實(shí)施例此實(shí)施例比較了地爾硫卓、水飛薊素和硫胺素分開給予時(shí)保護(hù)肝細(xì)胞抵御活性氧的效果。方法分離的大鼠肝線粒體用低濃度Ca2+孵育以部分解偶聯(lián)氧化磷酸化，測(cè)量氧消耗和受體對(duì)照比。用LC質(zhì)譜測(cè)量線粒體外介質(zhì)的地爾硫卓濃度。通過(guò)膠原酶消化分離并在蓋玻片和多孔板中培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞用H2O2孵育(以產(chǎn)生活性氧)，用Cobas Fara全自動(dòng)生化分析儀通過(guò)測(cè)量乳酸脫氫酶釋放來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞活力。結(jié)果在用琥珀酸鹽作為底物的線粒體中，Ca2+(170 μ M)使受體對(duì)照比從3. 3減少到
1.9。D(+)地爾硫卓以210,410和790 μ M濃度預(yù)孵育5分鐘使受體對(duì)照比分別增加到2. 0、
2.3和2. 6。添加線粒體丙酮酸和-酮戊二酸脫氫酶的輔因子-硫胺素，不影響地爾硫卓的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)線粒體外介質(zhì)中的地爾硫卓濃度檢測(cè)顯示有顯著量的地爾硫卓分配到線粒體膜內(nèi)。所測(cè)地爾硫卓濃度在添加205、410和790μΜ地爾硫卓時(shí)分別為142 士 14(5)、275士 10(6)禾Π 553士38(3) μ M。分離的大鼠肝細(xì)胞用0. 5mM H2O2孵育M小時(shí)，誘導(dǎo)87% 的細(xì)胞死亡。肝細(xì)胞用1 μ M地爾硫卓、1 μ M地爾硫卓+50 μ M硫胺素、50 μ M單獨(dú)硫胺素、 50 μ M水飛薊素或100 μ M水飛薊素預(yù)處理2小時(shí)，死亡細(xì)胞比例分別為5、3、87、88和90%。 因此，地爾硫卓而不是低濃度水飛薊素，顯著降低H2A誘導(dǎo)的肝細(xì)胞死亡。結(jié)論推斷低濃度地爾硫卓有效保護(hù)肝細(xì)胞免受活性氧誘導(dǎo)的損傷。這可能部分是由于地爾硫卓作用于調(diào)節(jié)Ca2+移動(dòng)和保護(hù)線粒體合成ATP的能力。在所用條件下，地爾硫卓比低濃度水飛薊素顯著更有效。這些結(jié)果表明地爾硫卓可在保護(hù)肝細(xì)胞免受活性氧和其他試劑誘導(dǎo)的損傷方面發(fā)揮重要作用，但水飛薊素的效果相對(duì)較小。實(shí)施例1此實(shí)施例比較了肝細(xì)胞在氧化應(yīng)激下對(duì)地爾硫卓、水飛薊素和地爾硫卓與水飛薊素的組合的響應(yīng)。材料和方法包括d-順式地爾硫卓、水飛薊素和二氯熒光乙酰乙酸鹽(DCFH2-DA)在內(nèi)的所有化學(xué)物購(gòu)自密蘇里州圣路易斯的西格瑪化學(xué)公司(Sigma Chemical, St. Louis，M0)。達(dá)氏修正依氏培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清、青霉素、鏈霉素購(gòu)自GIBCO/BRL。MTT(細(xì)胞增殖)和ATP 酶試劑盒購(gòu)自西格瑪(密蘇里州圣路易斯)。人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞系Chang和PLC/PRF/5細(xì)胞購(gòu)自馬里蘭州羅克維爾美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC，Rockville, MD) 0細(xì)胞培養(yǎng)和藥物治療Chang和PLC/PRF/5肝細(xì)胞瘤細(xì)胞在補(bǔ)充有DMEM的25cm2培養(yǎng)瓶中于37°C、95% 空氣和5% CO2的濕潤(rùn)大氣下維持至少M(fèi)小時(shí)，所述DMEM含有10% FBS(DF-IO)、青霉素和鏈霉素(50單位/ml)。細(xì)胞接種到培養(yǎng)板(IOOmm2)上并接觸DF-10培養(yǎng)基和藥物處理M 小時(shí)以用于蛋白質(zhì)印跡和RT-PCR研究。對(duì)于DCF和MTT試驗(yàn)，細(xì)胞在黑色96孔板(美國(guó)紐約的康寧公司(Corning))上再次培養(yǎng)，并可在任何藥物處理前貼壁8小時(shí)。板匯合后， 細(xì)胞接觸含藥物的DF-10培養(yǎng)基M小時(shí)。對(duì)照細(xì)胞不用任何藥物孵育。DCF 試驗(yàn)通過(guò)活性氧產(chǎn)物如脂質(zhì)過(guò)氧化物將非熒光2’，7’-二氯二氫熒光素(DCFH)轉(zhuǎn)變成高熒光二氯熒光素(DCF)，形成所述試驗(yàn)的基礎(chǔ)?；钚园麅?nèi)2’，7’-二氫二氯熒光素(DCFH) 形式的DCFH2-DA如TolIefson等^所述制備。簡(jiǎn)言之，通過(guò)在200 μ L甲醇和100 μ L 2Ν NaOH存在下用100 μ L DCFH2-DA儲(chǔ)液室溫避光孵育來(lái)切割DCFH2-DA的二乙酸鹽部分。2小時(shí)后，用Ca/Mg-PBS稀釋所得DCFH溶液以獲得20 μ M的終探測(cè)濃度，臨用前ρΗ調(diào)整至7. 4。H2O2誘導(dǎo)的氧化壓力Chang和PLC細(xì)胞在96孔培養(yǎng)板(Costar#3603，康寧公司)中以每孔25,000個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞密度培養(yǎng)。在DMEM-10 % FBS中過(guò)夜孵育后，培養(yǎng)物用PBS洗2次，然后用IOM H2DCFDA在95%空氣/5% CO2中37°C孵育30分鐘。通過(guò)用溫和PBS清洗培養(yǎng)物2次來(lái)移除胞外H2DCFDA15通過(guò)用400M H2O2在含Ca++和Mg++的PBS中37°C避光孵育細(xì)胞20分鐘，誘導(dǎo)細(xì)胞氧化壓力。負(fù)對(duì)照用相同條件進(jìn)行，但沒(méi)有H202。DCF信號(hào)發(fā)出的細(xì)胞熒光強(qiáng)度立即用BMG(美國(guó)北卡羅來(lái)納州達(dá)勒姆)Fluostar Galaxy熒光分析儀G85nm激發(fā)波長(zhǎng)/520nm 發(fā)射波長(zhǎng))測(cè)量，配有針對(duì)板底部的激發(fā)和發(fā)射探針。從對(duì)照和藥物處理細(xì)胞的3份培養(yǎng)物中計(jì)算平均熒光強(qiáng)度。結(jié)果表示為任意熒光單位(AFU)。細(xì)胞活力/細(xì)胞增殖MTT試驗(yàn)采用MTT試驗(yàn)評(píng)價(jià)細(xì)胞生長(zhǎng)和活力?；罴?xì)胞通過(guò)功能性線粒體使MTT (3-G，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑，一種四唑)還原成紫色甲瓚。試驗(yàn)條件如生產(chǎn)商所概述(密蘇里州圣路易斯的西格瑪)。簡(jiǎn)言之，Chang和PLC細(xì)胞以3xl04個(gè)細(xì)胞/孔的濃度在96孔板中培養(yǎng)。接觸地爾硫卓和/或水飛薊素M小時(shí)和H2A (400 μ Μ, 20分鐘)處理后，各孔添加10 μ 1 MTT溶液(10%的培養(yǎng)物體積)。細(xì)胞用MTT溶液再孵育3. 5小時(shí)， 此時(shí)移除所述培養(yǎng)基并將MTT溶劑加入孔內(nèi)(100 μ 1)。用spectra Max 190(分子儀器公司(Molecular Devices))分析儀定量有色溶液在570nm的吸光度。檢測(cè)細(xì)胞ATP水平采用生物發(fā)光試驗(yàn)檢測(cè)總細(xì)胞ATP水平。過(guò)程細(xì)節(jié)如生產(chǎn)商所概述(密蘇里州圣路易斯的西格瑪)。Bax蛋白質(zhì)印跡蛋白QOyg)與 4X 凝膠上樣緩沖液 GX = 250mmol/L Tris-HCl, pH 6. 8,8% SDS、20%甘油、0. 2%溴酚藍(lán)和5% -巰基乙醇)混合，在還原條件下于15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-聚丙烯酰胺)凝膠上分開，轉(zhuǎn)至Nitroplus-2000膜(微米分離公司(Micron Separations he.)，馬薩諸塞州韋斯特伯魯)。通過(guò)在溶于IX Tris-緩沖鹽水-土溫(TBS-T，每升中2. 42g Tris堿、29. 25g NaCl,0. 5ml 土溫20)的脫脂奶粉中室溫預(yù)孵育膜1小時(shí)來(lái)封閉非特異性抗體結(jié)合。然后用一抗在含5%脫脂奶的IX TBS-T中4°C 過(guò)夜孵育膜。一抗對(duì)于兔抗Bax的效價(jià)為1 1000且對(duì)單克隆小鼠抗β-肌動(dòng)蛋白為 1 3000。然后用辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗(用于Bax的山羊抗兔抗體和用于β-肌動(dòng)蛋白的抗小鼠抗體(1 1000稀釋))孵育膜。所述抗原-抗體復(fù)合物通過(guò)增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光(ECL系統(tǒng)，安瑪西亞公司(Amersham))檢測(cè)。用NIH成像軟件檢測(cè)各靶蛋白帶的光密度 (OD)值。通過(guò)歸一化肌動(dòng)蛋白來(lái)校正蛋白上樣變化。Bax RT-PCR采用TRIzol LS試劑如生產(chǎn)商手冊(cè)所述提取Chang細(xì)胞的總RNA。通過(guò)優(yōu)勢(shì) (Advantage) RT-for-PCR試劑盒合成cDNA的第一條鏈。簡(jiǎn)言之，將1 μ g總RNA溶于焦碳酸二乙酯處理的雙蒸水(ddH20)以獲得12. 5μ1終體積。然后，加入Iyl寡(dT)弓丨物、 4 μ 1 5 X反應(yīng)緩沖液、1 μ 1 10mmol/l dNTP混合物、0. 5 μ 1重組RNA酶抑制劑和1 μ 1莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶，42°C孵育1小時(shí)。逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程結(jié)束時(shí)，反應(yīng)混合物加熱至 94°C持續(xù)5分鐘，加入ddH20至終體積100 μ 1。用優(yōu)勢(shì)(Advantage)PCR試劑盒、聚合酶混合物、GIBC0-BRL(安省伯靈頓)合成的寡芯體苷酸進(jìn)行PCR。用于Bax的基因特異性PCR 引物購(gòu)自西格瑪(密蘇里州圣路易斯)。寡芯體苷酸引物是5’-GTT TCA TCC AGG ATC GAG CAG-3，(有義)，5，-CAT CTT CTT CCA GAT GGT GA-3，(反義)。產(chǎn)物長(zhǎng)度是 487bp。特異性大鼠GAPDH擴(kuò)增引物來(lái)自科隆泰克公司(Clontech，5507-3)，預(yù)期GAPDH大小為986堿基對(duì)。使用艾本德MasterCycler (艾本德公司(Eppendorf)，紐約州韋斯特伯里)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增30輪的94°C變性45秒、53°C (Bax)和60°C (GAPDH)退火45秒、72°C延伸120秒，再在72°C最終延伸7分鐘。用1.2%瓊脂糖凝膠分析PCR產(chǎn)物。通過(guò)在曼尼托巴細(xì)胞生物學(xué)研究所DNA測(cè)序設(shè)備(加拿大溫尼伯)測(cè)序確認(rèn)PCR產(chǎn)物特性。
統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差。η值指各研究重復(fù)進(jìn)行數(shù)量。數(shù)據(jù)用單因素方差分析(one-way ANOVA), SNK 事后檢驗(yàn)(Student-Newman-Keu 1 s post hoc test)采用 ρ
<0. 05作為顯著性水平(統(tǒng)計(jì)顯著性設(shè)為ρ < 0. 05)。根據(jù)附圖討論結(jié)果。在圖中圖l.PLC(圖la)和Chang(圖lb)細(xì)胞在過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的氧化壓力中的DCF熒光。細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng)。將H2DCFDA(IOM)加樣到細(xì)胞上30分鐘。然后細(xì)胞接觸400M H20220分鐘。測(cè)量各孔的細(xì)胞熒光并立即記錄。數(shù)據(jù)表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差；η = 7廣ρ
<0. 01, ***ρ < 0. 001 ；單尾分布。圖2.通過(guò)MTT試驗(yàn)評(píng)價(jià)地爾硫卓和/或水飛薊素后PLC(圖2a)和Chang(圖 2b)細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)。細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng)。數(shù)據(jù)表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差；η = 7廣ρ
<0. 01, ***ρ < 0. 001 ；單尾分布。圖3.通過(guò)生物發(fā)光試驗(yàn)評(píng)價(jià)對(duì)照(無(wú)氧化壓力處理)、PLC細(xì)胞(圖3a)和 Chang(圖3b)細(xì)胞的細(xì)胞ATP水平。數(shù)據(jù)表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差；η = 7。圖4.通過(guò)生物發(fā)光試驗(yàn)評(píng)價(jià)PLC細(xì)胞中的細(xì)胞ATP水平。數(shù)據(jù)表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差；η = 7廣ρ < 0.01, ***ρ < 0. 001 ；單尾分布。圖5.對(duì)照和藥物處理Chang細(xì)胞中的Bax表達(dá)?？瞻装瑹o(wú)血清培養(yǎng)基細(xì)胞而對(duì)照包括H2A處理后的含血清培養(yǎng)基。地爾硫卓、水飛薊素、組合藥物處理在Chang細(xì)胞中的抗調(diào)亡效果。H2O2處理誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Bax活性用作細(xì)胞凋亡標(biāo)記。圖6.通過(guò)相對(duì)肌動(dòng)蛋白歸一化Bax光密度來(lái)計(jì)算Chang細(xì)胞中的相對(duì)Bax表達(dá)。 數(shù)據(jù)表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差；η = 7 ;*ρ < 0. 05，**ρ < 0. 01，***ρ < 0. 001 ；單尾分布。圖7.對(duì)照和藥物處理Chang細(xì)胞中Bax和上樣對(duì)照GAPDH的RT-PCR圖像。胞內(nèi)自由基水平用二氯熒光素(DCF)試驗(yàn)評(píng)價(jià)細(xì)胞自由基水平。

圖1顯示來(lái)自H2O2誘導(dǎo)的氧化壓力的DCF熒光，對(duì)于PLC細(xì)胞(頂部)用地爾硫卓O. 5和10 μ M)、水飛薊素(10和IOOOyg/ L)或地爾硫卓O. 5μΜ或ΙΟμΜ)和水飛薊素(1000 μ g/L)組合處理，或者Chang細(xì)胞 (底部)用地爾硫卓0.5μΜ)和水飛薊素(1000 μ g/L)或地爾硫卓(10 μ M)和水飛薊素 (10 μ g/L)處理。地爾硫卓和水飛薊素都使PLC和Chang細(xì)胞中的自由基水平在統(tǒng)計(jì)上減少(p<0. 05)。地爾硫卓和水飛薊素處理之間的DCF熒光沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。地爾硫卓和水飛薊素的組合還使DCF熒光較圖1所示單用水飛薊素或地爾硫卓減少(P < 0. 001)。細(xì)胞增殖用來(lái)自西格瑪?shù)腗TT試劑盒評(píng)價(jià)細(xì)胞活力和增殖。圖2顯示地爾硫卓和水飛薊素都使細(xì)胞增殖較對(duì)照(無(wú)藥物處理)水平在統(tǒng)計(jì)上增加(P <0.001)。添加水飛薊素 (1000 μ g/L)到2. 5 μ M地爾硫卓進(jìn)一步提高細(xì)胞增殖(P < 0. 001)。將地爾硫卓濃度增至 10 μ M較使用2. 5 μ M不再產(chǎn)生增殖上的任何增加。細(xì)胞ATP水平為了理解地爾硫卓、水飛薊素、地爾硫卓和水飛薊素的組合的保護(hù)性質(zhì)，我們研究了藥物處理后的細(xì)胞ATP水平。圖3顯示對(duì)照組(無(wú)氧化壓力)中藥物處理不顯著影響細(xì)胞ATP水平。然而，如圖4所示，氧化壓力(H2O2處理)后的ATP水平顯著高于對(duì)照(無(wú)藥物處理)。2. 5μ M地爾硫卓和10μ M地爾硫卓間沒(méi)有顯著差異。水飛薊素本身也顯著增加ATP水平(ρ < 0. 01)。將水飛薊素加入地爾硫卓還使ATP水平相較單獨(dú)地爾硫卓(ρ < 0. 001)或單獨(dú)水飛薊素(ρ < 0. 01)提高。當(dāng)?shù)貭柫蜃縿┝吭黾?2. 5 μ M到10 μ Μ)和水飛薊素(1000 μ g/L)，ATP水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)提高。Bax7jC 平為了進(jìn)一步理解地爾硫卓和水飛薊素的保護(hù)性質(zhì)，我們研究了藥物處理是否影響促凋亡蛋白Bax。圖5顯示藥物處理后Chang細(xì)胞中的代表性蛋白質(zhì)印跡，而圖6概括了所有研究的數(shù)據(jù)。地爾硫卓O. 5 μ M和10 μ Μ)使Bax水平顯著低于對(duì)照細(xì)胞(無(wú)藥物處理； ρ <0.001)。2種地爾硫卓濃度間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。水飛薊素存在時(shí)Bax水平減少遠(yuǎn)高于對(duì)照(P < 0. 001)且顯著高于地爾硫卓(10 μ M地爾硫卓時(shí)ρ < 0. 01，2. 5 μ M地爾硫卓時(shí) ρ <0.001)。地爾硫卓和水飛薊素的組合進(jìn)一步減少Bax水平。數(shù)據(jù)顯示地爾硫卓和水飛薊素的組合相較單獨(dú)地爾硫卓或單獨(dú)水飛薊素提供更多肝保護(hù)。Bax mRNA為進(jìn)一步闡明藥物處理的保護(hù)性質(zhì)，我們研究了地爾硫卓和水飛薊素對(duì)Bax mRNA 的影響以理解保護(hù)功能是否與抗調(diào)亡標(biāo)記降解或抑制轉(zhuǎn)錄相關(guān)。圖7顯示RT-PCR Bax mRNA 的代表性掃描。顯然地爾硫卓對(duì)Bax mRNA的抑制顯著高于單獨(dú)使用水飛薊素。小結(jié)細(xì)胞接觸400 μ M H2O2氧化壓力20分鐘后用DCF熒光評(píng)價(jià)胞內(nèi)自由基水平。地爾硫卓在5和10 μ M后顯著降低DCF熒光信號(hào)，而水飛薊素則在1000 μ g/L。地爾硫卓和水飛薊素的組合相較單獨(dú)藥物進(jìn)一步保護(hù)細(xì)胞抵御氧化壓力(P < 0. 001)。用MTT試驗(yàn)評(píng)價(jià)細(xì)胞活力，顯示地爾硫卓和水飛薊素在統(tǒng)計(jì)上提高細(xì)胞生長(zhǎng)(P < 0.01)，組合還提供進(jìn)一步的保護(hù)效果。通過(guò)研究ATP、Bax和Bax mRNA的水平來(lái)評(píng)價(jià)保護(hù)效果的性質(zhì)。地爾硫卓、水飛薊素和組合藥物處理都與2種細(xì)胞類型中的ATP水平提高相關(guān)聯(lián)，組合藥物處理顯示保護(hù)效果大許多(P < 0. 001)。藥物處理使Bax和Bax mRNA水平在統(tǒng)計(jì)上減少，組合再次顯示比任一單獨(dú)處理大許多的有益效果(P < 0. 001)。我們推斷低劑量地爾硫卓和水飛薊素 (1 μ g/ml)提供肝保護(hù)效果抵御氧化壓力引起的自由基損傷。地爾硫卓和水飛薊素的組合相較任一單獨(dú)藥物提供額外的肝保護(hù)作用。保護(hù)性質(zhì)延伸到減少促調(diào)亡蛋白Bax水平。實(shí)施例2 地爾硫卓和水飛薊素的代謝研究此實(shí)施例的過(guò)程用大鼠肝細(xì)胞系H4-IIE細(xì)胞系進(jìn)行。這是一個(gè)已良好建立的肝細(xì)胞模型。所述細(xì)胞系表現(xiàn)出正常分化大鼠肝細(xì)胞的所有主要特征。該細(xì)胞系用于肝功能的醫(yī)學(xué)生化研究已有20年，其特性不遜色于其它正常新鮮分離的大鼠肝細(xì)胞。用采用過(guò)氧化氫的已建立方法誘導(dǎo)氧化損傷。塑料多孔板中培養(yǎng)的肝細(xì)胞用0. 5mM過(guò)氧化氫孵育1 小時(shí)，然后在標(biāo)準(zhǔn)孵育條件下于正常培養(yǎng)基中孵育12小時(shí)。此方案誘導(dǎo)對(duì)靶細(xì)胞的氧化損傷。通過(guò)測(cè)量染料臺(tái)盼藍(lán)的排除和胞質(zhì)酶乳酸脫氫酶的釋放來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞損傷。為評(píng)價(jià)肝細(xì)胞的水飛薊素代謝率，細(xì)胞用5 μ M濃度的水飛薊素在正常細(xì)胞培養(yǎng)孵育條件下孵育4-10小時(shí)。用正常未處理肝細(xì)胞和先前用過(guò)氧化氫處理以誘導(dǎo)氧化損傷的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。測(cè)量通過(guò)肝結(jié)合和氧化藥物代謝酶途徑的水飛薊素代謝，用液相色譜以分開不同代謝物和用質(zhì)譜以鑒定和定量代謝物。為檢驗(yàn)地爾硫卓的效果，在有和沒(méi)有5 μ M地爾硫卓情況下孵育細(xì)胞。用正常未處理肝細(xì)胞和如上所述用過(guò)氧化氫處理的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。各自在有和沒(méi)有地爾硫卓情況下孵育。用所述液相色譜和質(zhì)譜測(cè)量水飛薊素代謝物。通過(guò)測(cè)量培養(yǎng)基中的乳酸脫氫酶活性來(lái)評(píng)價(jià)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷程度。接觸氧自由基的細(xì)胞顯示水飛薊素代謝。添加低劑量地爾硫卓有助于維持受損細(xì)胞代謝水飛薊素和相關(guān)化合物的能力。此效果可聯(lián)用于保護(hù)和提高線粒體功能，能夠保持能量生成。地爾硫卓對(duì)線粒體的此效果可使肝細(xì)胞在接觸氧自由基或輕度受損時(shí)能比其它情況下更有效代謝水飛薊素。此發(fā)現(xiàn)顯著降低來(lái)自水飛薊素和其代謝物增強(qiáng)的副作用風(fēng)險(xiǎn)，并提供甚至在患病肝細(xì)胞中具有恒定低水平活性剤、較短半衰期和良好的首過(guò)清除的治療，所述細(xì)胞中水飛薊素和其代謝物本可能増加并導(dǎo)致副作用。
權(quán)利要求
1.一種治療患有肝病對(duì)象的方法，所述方法包括給予(i)具有抗氧化效果的鈣通道阻斷劑的口服緩釋制劑和(ii)至少一種黃酮木脂素。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述鈣通道阻斷劑和黃酮木脂素在同一緩釋制劑中給予。
3.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述黃酮木脂素在分開的口服劑型中給予。
4.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，除所述鈣通道阻斷劑和黃酮木脂素之外，還共同給予硫胺素。
5.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述至少一種黃酮木脂素選自水飛薊賓、水飛薊素、提取自圣奶薊(水飛薊)的黃酮木脂素、水飛薊賓的藥學(xué)上可接受鹽如二氫水飛薊賓雙琥珀酸二鈉、水飛薊賓和水飛薊賓糖苷的包合物；所述鈣通道阻斷劑是地爾硫卓。
6.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述黃酮木脂素日劑量為 l-5000mg/天且鈣通道阻斷劑日劑量為10-70mg/天的地爾硫卓。
7.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述緩釋制劑所含單位劑量包括含量 20-70mg的鈣通道阻斷劑地爾硫卓和含量10-2000mg的黃酮木脂素。
8.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述地爾硫卓黃酮木脂素的日劑量重量比為2 1-1 120。
9.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述地爾硫卓對(duì)線粒體的能量保持效果使受損肝細(xì)胞能繼續(xù)代謝黃酮木脂素，從而維持水飛薊素的較短半衰期和其肝選擇性遞送。
10.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述至少一種鈣通道阻斷劑是在緩釋制劑中，提供的釋放機(jī)制選自聚合物包衣的多顆粒、聚合物包衣的片劑或迷你片劑、 或親水性基質(zhì)片劑。
11.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述鈣通道阻斷劑和黃酮木脂素在膠囊、片劑或囊片形式的至少一劑中給予。
12.(i)具有抗氧化效果的鈣通道阻斷劑和(ii)同為抗氧化劑的至少一種黃酮木脂素在制備治療肝病的藥物中的應(yīng)用，所述兩種成分在一種或多種緩釋鈣通道阻斷劑的組合物中共同給予。
13.一種治療或預(yù)防肝病的藥物組合物，所述組合物包括(i)具有抗氧化效果的鈣通道阻斷劑的口服緩釋制劑和(ii)至少一種黃酮木脂素。
14.如權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，所述至少一種黃酮木脂素選自水飛薊賓、水飛薊素、提取自圣奶薊(水飛薊)的黃酮木脂素、水飛薊賓的藥學(xué)上可接受鹽如二氫水飛薊賓雙琥珀酸二鈉、水飛薊賓的包合物如β -環(huán)糊精包合物和水飛薊賓糖苷。
15.如權(quán)利要求13或14所述的組合物，其特征在于，所述鈣通道阻斷劑是地爾硫卓。
16.如權(quán)利要求13到15中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述組合物采用單位劑型，所述單位劑型中包括20-70mg的鈣通道阻斷劑。
17.如權(quán)利要求13到16中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述地爾硫卓黃酮木脂素的重量比為50 1-1 120，且更優(yōu)選2 1-1 120。
18.如權(quán)利要求13到17中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述組合物采用單位劑型，所述單位劑型中包括50-3000mg的黃酮木脂素組分。
19.如權(quán)利要求13到17中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述至少一種鈣通道阻斷劑是在緩釋制劑中，提供的釋放機(jī)制選自聚合物包衣的多顆粒、聚合物包衣的片劑或迷你片劑、或親水性基質(zhì)片劑。
20.如權(quán)利要求13到19中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述鈣通道阻斷劑的控釋制劑提供的劑量遞送率足以在門靜脈內(nèi)產(chǎn)生臨床有效血液水平的鈣通道阻斷劑且低于在外周循環(huán)產(chǎn)生臨床有效水平所需，從而提供對(duì)肝有選擇性效果的遞送率。
21.如權(quán)利要求13到20中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述鈣通道阻斷劑與黃酮木脂素一起存在于選自膠囊、片劑或囊片的至少一個(gè)單位劑型中。
全文摘要
一種治療患有肝病對(duì)象的方法，所述方法包括給予(i)具有抗氧化效果的鈣通道阻斷劑的口服緩釋制劑和(ii)至少一種黃酮木脂素。
文檔編號(hào)A61P1/16GK102573864SQ201080046984
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月15日
發(fā)明者H·J·史密斯 申請(qǐng)人:霍華德·J·史密斯及同仁控股有限公司