專利名稱：用于基于亞單位的痘病毒疫苗的包含痘病毒衍生肽和針對抗原呈遞細(xì)胞的抗體的免疫偶聯(lián)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療和/或預(yù)防痘病毒感染(包括但不限于天花)的基于亞單位的疫苗的設(shè)計、產(chǎn)生和應(yīng)用。在優(yōu)選實施方案中，疫苗包含來自一種或多種病毒蛋白的亞單位抗原肽的免疫偶聯(lián)物。在更優(yōu)選實施方案中，病毒蛋白是免疫調(diào)節(jié)因子，如病毒IL-18結(jié)合蛋白(VIL18BP)，但是可使用替代病毒蛋白，如病毒包膜蛋白。在其它替代實施方案中，基于亞單位的疫苗可能包含來自一種以上病毒蛋白(如免疫調(diào)節(jié)因子和包膜蛋白)的抗原肽的組合。病毒抗原肽連接到抗體或其抗原結(jié)合片段，從而將所述亞單位靶向輸送到抗原產(chǎn)生細(xì)胞(APC)。在最優(yōu)選的實施方案中，基于亞單位的疫苗并有針對HLA-DR抗原的抗體或抗體片段，如L243抗體；但是本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到其它APC靶向抗體是已知的，并且可以使用。免疫偶聯(lián)物的使用提供大幅增加的免疫原性和對病毒抗原的改進(jìn)的免疫系統(tǒng)反應(yīng)，同時避免接觸活病毒疫苗的免疫力低下的個體感染的可能性。優(yōu)選地，基于亞單位的疫苗在體內(nèi)有效地誘導(dǎo)對天花和/或其它痘病毒的免疫性，并且防止受其感染。相關(guān)技術(shù)具有交叉反應(yīng)抗原的一組復(fù)合病毒即正痘病毒包括牛痘病毒(VV)、猴痘病毒和引起天花(痘瘡，VAR)的病毒。天花已不再是一種自然發(fā)生的傳染病，它已被持續(xù)到1978年為止的一個大規(guī)模的免疫規(guī)劃所消滅，從那時起世界人口的例行性疫苗接種停止(Minor，2002, British Med J 62 213-224) 0當(dāng)時，剩余的病毒原液存放于美國和前蘇聯(lián)。最近出現(xiàn)的生物恐怖主義的威脅、最近爆發(fā)的猴痘(⑶C MMWR2003)，和尤其在全世界據(jù)估計只有不到一半的人口進(jìn)行接種的情況下天花病的致命性質(zhì)，重新激起了對于研制針對VAR或此病毒家族的其它危險成員的疫苗保護(hù)的關(guān)注。采用活性VV的天花疫苗目前代表針對天花進(jìn)行免疫的最有效的手段(Rosenthal等，2001，Emerg. Infect. Dis. 7 =920-926) 0這種疫苗產(chǎn)生短暫的病毒血癥，它在大多數(shù)個體中得以消退，并留下長久的免疫力。然而，這種疫苗也由于包括全身性病毒血癥和死亡的嚴(yán)重不良反應(yīng)而引起安全問題(He等，2007，JID 196 =1026-1032 ；Rosenthal等，2001)。因此，如果客觀形勢要求進(jìn)行人口免疫，就必須開發(fā)替代接種策略。替代疫苗的幾種方法已經(jīng)嘗試過，或正在開發(fā)中。具有缺失或突變基因的減毒痘病毒形式，如 Akhara 改良牛痘(MVA) (Grandpre 等，Vaccine 27 1549-56，2009)，可賦予針對痘病毒的強(qiáng)毒株的部分免疫力。用滅活病毒進(jìn)行的免疫已得到研究，但它并沒有賦予與活病毒相同程度的保護(hù)；無論使用哪一種滅活方法，都需要多IO3-IO4個單位的滅活病毒來保護(hù)小鼠免受激發(fā)影響(Turner等1970，J Hyg. Camb68 197-210)。這一事實意味著，用活性病毒進(jìn)行免疫所獲得的保護(hù)包括非活性病毒不能夠產(chǎn)生或在非活性病毒中不存在的因子。痘病毒產(chǎn)生一系列分泌性宿主免疫反應(yīng)修飾因子，其會中和掉宿主細(xì)胞因子和先天防御機(jī)制。通過削弱宿主的第一道防線，病毒可能能夠建立感染(如在粘膜中)，并在宿主細(xì)胞內(nèi)開始第一階段的感染性復(fù)制。存在對于針對痘病毒(如天花)的疫苗的需要，所述疫苗比滅活病毒更有效，但可避免活病毒疫苗所出現(xiàn)的安全性問題。發(fā)明概述本發(fā)明公開了針對痘病毒(如天花)的亞單位疫苗的改進(jìn)的組合物和其使用方法。在優(yōu)選實施方案中，該疫苗包含一個或多個亞單位抗原肽與結(jié)合抗原呈遞細(xì)胞(APC)，如樹突狀細(xì)胞(DC)的抗體或抗體片段偶聯(lián)以形成免疫偶聯(lián)物。向受試者施用疫苗可誘導(dǎo)對痘病毒的免疫力，并且有效地預(yù)防或治療痘病毒感染。任選地，該疫苗可能并有一種或多種佐劑，如氫氧化鋁、CpG DNA、磷酸鈣或基于細(xì)菌的佐劑(例如，德氏保加利亞乳桿菌(L. delbroeckii/bulgaricus))。VV和VAR都產(chǎn)生的一種宿主免疫調(diào)節(jié)因子是病毒白細(xì)胞介素18結(jié)合蛋白(vIL18BP,牛痘病毒C12L基因)。和其它病毒宿主防御調(diào)節(jié)因子一樣，該基因在感染的早期階段表達(dá)，它通過中和掉關(guān)鍵促炎性細(xì)胞因子IL-18來削弱宿主免疫力，所述促炎性細(xì)胞因子刺激NK、⑶8和Thl⑶4細(xì)胞產(chǎn)生干擾素-Y (IFN)，它進(jìn)而活化抗原呈遞細(xì)胞(APC)和其它細(xì)胞，并且引導(dǎo)對Thl類型的免疫反應(yīng)(Born等，2000，J. Immunol. 164 =3246-3254 ；Scott,1991,J Immunol147 :3149-3155 ；Pien等，2002，· Immunol. 169 :5827-5837 ；Xiang和Moss, 1999，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 :11537-11542)。在優(yōu)選實施方案中，選擇亞單位抗原肽以模擬VIL18BP的表位。其它示例性宿主免疫調(diào)節(jié)因子及其Iocusjag標(biāo)識符在表1中提供。在其它優(yōu)選實施方案中，亞單位抗原肽源于病毒免疫調(diào)節(jié)蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到各種病毒免疫調(diào)節(jié)蛋白是已知的并且可以使用。非限制性實例包括干擾素-Y (IFN-y)受體同源物(B8R基因)、補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白同源物(B5R基因)和絲氨酸蛋白酶抑制劑(B13R、B14R、B22R基因)。多種痘病毒免疫調(diào)節(jié)蛋白已得以報道，但其對病毒免疫原性的影響一直沒有得到很好地表征。(參見例如Jackson等J Virol79 =6554-59, 2005 ；B12R基因(絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶)；B15R基因(IL-1和IL-6受體)；B16R基因(IL-1受體)、B18R基因(IFN- α受體)、B19R基因(IL-1和IL-6受體、IFN抑制因子)。表1.痘病毒免疫調(diào)節(jié)蛋白
VACWR001VACWRO11VACWRO12
TNF-α受體樣細(xì)胞凋亡鋅(Zn)指樣
VACWRO13 (VAC WR C12L) IL-18 結(jié)合蛋白
VACWR025VACWR028VACWR033VACWR034VACWR059VACWRl 72VACWRl 90VACWR208
阻斷C3b/C4b補(bǔ)體活化細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子絲氨酸蛋白酵抑制因子干擾素抗性
dsRNA結(jié)合因子；干擾素結(jié)合因子Toll樣受體調(diào)節(jié)因子IFN-γ受體樣
鋅指樣
VACV WR 215
TNF-aRVACWR217TNF-α 受體樣
VACV COP B19R (VACWR200) I 型 IFN 結(jié)合因子
VACV COPA39RVACV COPA40RVACV COPA41L_6] VACV A4L
VACV A27L (VACWR150)VACV D8L (VACWR113)VACV B5R (VACWR187)
腦信號蛋白樣(semaphoring-like)
II型膜蛋白
分泌性糖蛋白
免疫顯性抗原
表面結(jié)合疏酸肝素
表面結(jié)合疏酸軟骨素
為跨高爾基體(trans-Golgi)中的IMV膜包覆所必需在替代實施方案中，亞單位抗原肽可能源于病毒包膜蛋白或其它病毒蛋白。非限制性實例包括D8L、A27L、L1R和A33R基因的蛋白產(chǎn)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到所述各種痘病毒基因和蛋白質(zhì)的DNA和氨基酸序列是本領(lǐng)域熟知的并且可公開獲得(關(guān)于牛痘病毒W(wǎng)R的完整基因組序列以及所編碼的蛋白質(zhì)序列，參見例如GenBank登錄號AYM3312)。免疫偶聯(lián)物的抗體組分將復(fù)合物引導(dǎo)至APC，其中抗原肽組分經(jīng)加工以引起對痘病毒和/或表達(dá)靶抗原的受感染細(xì)胞的免疫反應(yīng)。各種APC靶向抗體是本領(lǐng)域已知的，如結(jié)合選自由以下組成的組的抗原的抗體HLA-DR、CD74、CD209 (DC-SIGN)、CD;34、CD74、CD205、TLR2 (toll 樣受體 2)、TLR4、TLR7、TLR、BDCA-2、BDCA-3 和 BDCA-4。在更優(yōu)選實施方案中，抗體結(jié)合選自HLA-DR和CD74的抗原。在最優(yōu)選實施方案中，抗體結(jié)合HLA-DR。在一些優(yōu)選實施方案中，痘病毒疫苗包含人源化、人或嵌合抗-HLA-DR抗體，如L243抗體。L243抗體已被描述(例如美國專利第7，612，180號，其實施例部分以引用方式并入本文)并且特征在于具有重鏈互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)序列⑶R1(NYGMN，SEQ ID NO:1), CDR2 (WINTYTREPTYADDFKG ，SEQ ID NO :2)，和 CDR3 (DITAWPTGFDY，SEQ ID NO 3)和輕鏈 CDR 序列 CDRl (RASENIYSNLA, SEQ ID NO 4)，CDR2 (AASNLAD, SEQ ID NO 5),和CDR3 (OHFWTTPWA，SEQ ID NO :6)。然而，可使用本領(lǐng)域中已知的其它抗-HLA-DR抗體(參見例如美國專利第6，416，958,6, 894，149,7, 262，278號，其實施例部分分別以引用方式并入本文)。在其它優(yōu)選實施方案中，痘病毒疫苗包含人源化、人或嵌合抗-CD74抗體，如LLl抗體。LLl抗體已被描述(例如美國專利第7，312，318號，其實施例部分以引用方式并入本文)并且特征在于具有輕鏈⑶R序列⑶R1(RSSQSLVHRNGNTYLH，SEQ ID NO:7)，CDR2 (TVSNRFS, SEQ ID NO :8)，禾口 CDR3 (SQSSHVPPT, SEQ ID NO :9)禾口重鏈 CDR 序列 CDRl(NYGVN, SEQ ID NO 10), CDR2(WINPNTGEPTFDDDFKG ，SEQ ID NO: 11)，禾口⑶R3 (SRGKNEAWFAY，SEQ ID NO: 12)。或者，可利用其它抗⑶74抗體或針對其它APC或DC相關(guān)抗原的抗體(參見例如 LifeSpan Biosciences Inc.，Seattle, WA ；BioLegend, SanDiego, CA ；Abeam, Cambridge, ΜΑ)。在各種實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段可能是嵌合、人源化或人抗體或其抗原結(jié)合片段。使用嵌合抗體優(yōu)于親本鼠源抗體，因為它們具備人抗體恒定區(qū)序列，因此不會引起和鼠源抗體一樣強(qiáng)的人抗小鼠抗體(HAMA)反應(yīng)。為了進(jìn)一步降低誘發(fā)HAMA反應(yīng)的可能性，使用人源化抗體是更優(yōu)選的。正如下面所討論，通過將鼠源框架和恒定區(qū)序列用相應(yīng)人抗體框架和恒定區(qū)序列替換來使鼠源抗體人源化的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，并已應(yīng)用于眾多的鼠源抗癌抗體?？贵w人源化還可能涉及將一個或多個人框架氨基酸殘基用來自親本鼠源框架區(qū)序列的相應(yīng)殘基取代。也如下面所討論，產(chǎn)生人抗體的技術(shù)也是熟知的，而且此類抗體可并入主題痘病毒疫苗構(gòu)建體中。其它實施方案涉及編碼融合蛋白(如抗體-亞單位抗原肽融合蛋白)的DNA序列，含有所述DNA序列的載體和宿主細(xì)胞，以及制造用于產(chǎn)生痘病毒疫苗的融合蛋白的方法。在一些實施方案中，使用DNL (對接-和-鎖定)技術(shù)制造亞單位疫苗的情況下，融合蛋白可包含DDD (二聚化和對接域)部分或AD (錨定域)部分。在替代實施方案中，可通過例如抗體或抗體片段與抗原肽的化學(xué)交聯(lián)來形成免疫偶聯(lián)物。發(fā)明詳述定義本文使用的術(shù)語“一”和“所述(該)”可能是指單數(shù)或復(fù)數(shù)，除非上下文另外明確指出僅表示單數(shù)。本文使用的術(shù)語“約”是指數(shù)值加上或減去百分之十(10% )。例如，“約100”是指90和110之間的任何數(shù)字?？贵w是指全長(即自然發(fā)生或通過正常的免疫球蛋白基因片段重組過程形成的)免疫球蛋白分子(如IgG抗體)，或免疫球蛋白分子的免疫活性、抗原結(jié)合部分，如抗體片段?？贵w片段是抗體的一部分，如F (ab丨)2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv等。無論結(jié)構(gòu)為何，抗體片段結(jié)合由完整抗體識別的相同抗原。因此，該術(shù)語與“抗原結(jié)合抗體片段”同義地使用。術(shù)語“抗體片段”還包括由可變區(qū)組成的分離片段，如由重鏈和輕鏈可變區(qū)組成的“Fv”片段以及輕鏈和重鏈可變區(qū)通過連接肽連接的重組單鏈多肽分子(“scFv蛋白”)。本文使用的術(shù)語“抗體片段”不包括無抗原結(jié)合活性的抗體部分，如Fc片段或單個氨基酸殘基。其它抗體片段，例如單域抗體片段是本領(lǐng)域已知的，并且可用于所主張的構(gòu)建體中。(參見例如 Muyldermans 等，TIBS 26 :230-235,2001 ；Yau 等，J Immunol Methods281 161-75,2003 ；Maass 等，J Immunol Methods 324 :13-25,2007)。術(shù)語抗體融合蛋白可指具有相同或不同特異件的一個或多個相同或不同單鏈抗體或抗體片段相連的重組產(chǎn)生的抗原結(jié)合分子。融合蛋白的價態(tài)指示融合蛋白相對于單個抗原或表位所具有的結(jié)合臂或位點的數(shù)量，即一價、二價、三價或多價?？贵w融合蛋白的多價性是指它可以在結(jié)合抗原時利用多重相互作用，從而提高與抗原結(jié)合的親合力(avidity)。特異性指示抗體融合蛋白能夠結(jié)合的抗原或表位的數(shù)量，即單特異性、雙特異性、三特異性、多特異性。使用這些定義，例如IgG的天然抗體是二價的，因為它有兩個結(jié)合臂，但是它是單特異性的，因為它結(jié)合一個表位。單特異性、多價融合蛋白對于表位有一個以上結(jié)合位點，但只結(jié)合一個表位。融合蛋白可能包含單一抗體組分、不同抗體組分的多價或多特異性組合，或同一抗體組分的多個拷貝。此外，融合蛋白可包含抗體或抗體片段和亞單位肽抗原。然而，該術(shù)語不是限制性的，并且多種蛋白或肽效應(yīng)物可并入融合蛋白中。在另一個非限制性實例中，融合蛋白可包含用于產(chǎn)生如下討論的DNL構(gòu)建體的AD或DDD序列。嵌合抗體是含有來源于一個物種的抗體(優(yōu)選嚙齒動物抗體)的可變域(包括互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R))，而抗體分子的恒定域來源于人抗體的恒定域的重組蛋白。對于獸醫(yī)應(yīng)用，嵌合抗體的恒定域可能源于其它物種，如貓或狗。人源化抗體是來自一個物種的抗體(例如嚙齒動物抗體)的CDR從嚙齒動物抗體的重鏈和輕鏈可變鏈轉(zhuǎn)移至人重鏈和輕鏈可變域(例如框架區(qū)序列)的重組蛋白?？贵w分子的恒定域源自人抗體。在某些實施方案中，來自親本(嚙齒動物)抗體的有限數(shù)量的框架區(qū)氨基酸殘基可取代入人抗體框架區(qū)序列。人抗體是例如由經(jīng)“工程化”以響應(yīng)于抗原激發(fā)而產(chǎn)生特異性人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠獲得的抗體。在這種技術(shù)中，人重鏈和輕鏈基因座的元件被引入到源自胚胎干細(xì)胞系的包含內(nèi)源性鼠源重鏈和輕鏈基因座的靶向斷裂的小鼠品系中。轉(zhuǎn)基因小鼠可以合成具有針對特定抗原的特異性的人抗體，并且所述小鼠可以用來產(chǎn)生分泌人抗體的雜交瘤細(xì)胞。從轉(zhuǎn)基因小鼠獲得人抗體的方法由Green等，Nature Genet. 7 :13 (1994)，Lonberg等，Nature368 856 (1994)，和Taylor等，ht. Immun. 6 :579 (1994)描述。完全人抗體也可以通過基因或染色體轉(zhuǎn)染方法，以及噬菌體展示技術(shù)來構(gòu)建，所述方法和技術(shù)都是本領(lǐng)域已知的。關(guān)于從來自未免疫供體的免疫球蛋白可變域基因譜體外產(chǎn)生人抗體和其片段，參見例如McCafferty等，Nature 348:552-553(1990)。在此技術(shù)中，將抗體可變域基因同框克隆至絲狀噬菌體的主要或次要外殼蛋白基因中，并且以功能性抗體片段形式展示于噬菌體顆粒的表面上。由于絲狀顆粒含有噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，所以基于抗體的功能性質(zhì)的選擇也導(dǎo)致編碼展現(xiàn)這些性質(zhì)的抗體的基因的選擇。這樣，噬菌體模擬B細(xì)胞的某些性質(zhì)。噬菌體展示可以多種方式執(zhí)行，關(guān)于評論，參見例如Johnson和Chiswell，Current Opinionin Structural Biology 3:5564-571(1993)。人抗體也可通過在體外活化的B細(xì)胞產(chǎn)生。參見美國專利第5567610號和第52四275號，其實施例部分以引用方式并入本文。附圖簡述

圖1.源自 VIL18BP 序列(SEQ ID NO 23)的肽的結(jié)合和吸收。(A) vIL18BP110 (SEQID NO 16)與 T2 細(xì)胞結(jié)合。所示的肽(TT830，SEQ ID NO 19 ；vA4L229, SEQ ID NO :18 ；vIL18BP008, SEQ IDNO 13 ；vIL18BP105, SEQ ID NO 15 ；vIL18BP110, SEQ ID NO :16 ；vIL18BP117，SEQ ID NO :17)與T2細(xì)胞一起孵育Mh。顯示HLA-A02在T2細(xì)胞中的相對豐度。從左到右的條形圖分別代表從0到40μ g/mL以10-μ g/mL增量遞增的肽的濃度。⑶vIL18BP105(SEQ IDNO :15)展現(xiàn)最高的供體PBMC吸收。在與所示的經(jīng)生物素化肽孵育Mh之后，評價平行雙份樣品。NJ01、NJ04、NJ07和NJ08。在添加抗生物素蛋白-FITC偶聯(lián)物之后，通過流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果。每個肽的熒光值等于同一實驗中的肽處理細(xì)胞的熒光值減去未處理細(xì)胞的熒光值。肽濃度為20微克/毫升。圖2.來自接種供體的PBMC在與病毒肽一起孵育時增殖。將來自接種㈧和未接種(B)人供體的負(fù)載 CFSE 的 PBMC 與 10 μ g/mL指定肽(vA27L003, SEQ ID NO :20 ；vD8L118,SEQ ID NO 22 ；vIL18BP105, SEQ ID NO : 15或?qū)φ?一起孵育5天。收獲細(xì)胞，并利用流式細(xì)胞術(shù)分析(平均值士SD)。條形圖按以下順序顯示未填實條形圖，培養(yǎng)基對照；實心黑色條形圖，2.5mg/mL肽(或SEA)；水平-陰影線淺灰色條形圖，5. Omg/mL肽；垂直-陰影線深灰色條形圖，10.0mg/mL肽。(C)來自獨立實驗的結(jié)果，其中來自指定樣品的細(xì)胞與vD8L118(SEQ ID NO :22) —起孵育以測定細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子和活化標(biāo)志物的表達(dá)。結(jié)果顯示于所嵌入表(C)中(D8L，VD8L118肽，SEQ ID NO :22)。*相比于培養(yǎng)基對照，組平均值P< 0. 05 (t-檢驗)。圖3.應(yīng)答⑶8+IFN-Y +細(xì)胞具有TEM或⑶45RA-終末分化細(xì)胞的表型。針對CD45RA和CCR7表達(dá)，對來自接種供體的CD8+PBMC進(jìn)行了評估。數(shù)目代表細(xì)胞總數(shù)的百分比。對于TEM群體，VD8L118相比于培養(yǎng)基對照的P < 0. 019 (ANOVA)(左下象限)。圖4.⑶8+細(xì)胞的⑶107a表達(dá)。相比于脫粒潛在標(biāo)志物⑶107a，評估⑶8+細(xì)胞群體的IFN-γ、IL-2。數(shù)目和條形圖值代表針對以下細(xì)胞的門中細(xì)胞百分比㈧⑶8+IFN- y +細(xì)胞、⑶⑶8+IFN- γ -細(xì)胞，和(C)⑶8+IL-2+細(xì)胞。*相比于培養(yǎng)基對照，組平均值P < 0. 04 (t-檢驗)。圖5.肽抗體存在于接種供體的血清中。將來自未接種或接種供體的血清1 200稀釋并且在針對以下肽的改良ELISA中與固定于96-孔板上的肽一起孵育(A)肽 vA27L003 (SEQ ID NO :20)、(B)肽 vD8L110(SEQ ID NO :21)，禾口 (C)肽 vIL18BP102(SEQID NO 14)。圓點代表每個供體的A450。*相比于未接種者，P < 0. 03 (ANOVA)。未接種供體:213、704、220 ；接種供體:05、12A、12B、19、26、720、308、416 和 920。肽 vD8L110 和VIL18BP105 是包括 vD8L118 和 vIL18BP105 全序列的 25-聚體。圖 6.相對于 VIL18BP105 的 HLA_DR04tg 脾細(xì)胞增殖。以 vIL18BP105_L243 偶聯(lián)物(偶聯(lián)物)或游離vIL18BP105(游離)接種的HLA-DR04tg小鼠，原初(naiVe)HLA-DR04tg小鼠(HLA-DR04tg原初)和野生型C57BL/6J(WT原初)(n = 3小鼠/組)。用與不同濃度的肽一起孵育的經(jīng)CFSE標(biāo)記的脾細(xì)胞進(jìn)行三次重復(fù)試驗。結(jié)果是3次獨立實驗的代表值(n = 3，平均值士 SD)。圖7.第一次加強(qiáng)免疫之后7和14天，用CIL18BP105 (偶聯(lián)物)和IL18BP105 (游離)免疫的HLA-DR04tg小鼠中的肽特異性血清抗體產(chǎn)生。原初HLA-DR04tg小鼠血清用作對照(原初)。實驗用匯集的血清三次重復(fù)執(zhí)行(n = 3，平均值士SD)。圖8.來自免疫小鼠的血清抗體與完整VIL18BP蛋白的結(jié)合。針對識別完整VIL18BP蛋白的抗體，對用單獨L243抗體、VIL18BP105肽(SEQ ID NO 15)、與L243抗體偶聯(lián)的病毒IL18BP105肽(CIL18BP105)、單獨培養(yǎng)基免疫的小鼠或原初小鼠的血清進(jìn)行測試ο圖9.亞單位疫苗的基于脂質(zhì)體的免疫偶聯(lián)物。㈧脂質(zhì)體展示的肽-L243抗體偶聯(lián)物。(B)脂質(zhì)體展示的沒有抗體的裸肽。痘病毒疫苗
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亞單位抗原肽痘病毒產(chǎn)生一系列分泌性宿主免疫反應(yīng)修飾因子，其會中和掉宿主細(xì)胞因子和先天防御機(jī)制。削弱宿主的第一道防線會使病毒建立感染(如在粘膜中)，并接著開始第一階段的感染性復(fù)制。VV和其它痘病毒產(chǎn)生的一種因子是病毒白細(xì)胞介素18結(jié)合蛋白(VIL18BP，牛痘病毒C12L基因)，其在感染的早期階段表達(dá)(Born等J Immunol 164 3246-54,2000)。它通過中和掉關(guān)鍵促炎性細(xì)胞因子IL-18來起作用，所述促炎性細(xì)胞因子刺激NK、⑶8和Thl⑶4細(xì)胞產(chǎn)生干擾素-Y (IFN- Y )，它引導(dǎo)對Thl類型的獲得性免疫(Livingston 等，J Immunol168 :5499_5506，2002 ;Pien 等，J Immunol 160 :5827-37,2002 ；Scott, JImmunol 147 :3149-55,1991 ；Turner 等，J Hyg Camb 68 197-210，1970 ；Xiang和Moss, PNAS USA 96 :11537-542，1999)。在下面的實施例中所描述的研究解決對VIL18BP的宿主反應(yīng)是否牽涉到對于痘病毒感染的抗性的問題。如果是這樣，替代疫苗策略應(yīng)包括這一因子和/或類似的抗原。最近報道另一種正痘病毒宿主防御調(diào)節(jié)因子即I型IFN-結(jié)合蛋白對于致病力是必不可少的(Xu等，JExp Med 205 =981-92,2008)并且可為包含于亞單位痘病毒疫苗中的候選物。正如下面所討論的，其它已知的病毒蛋白也可作為基于亞單位的痘病毒疫苗的亞單位抗原肽的候選物而包含在內(nèi)。如以下實施例中所描述，通過研究VIL18BP抗原肽是否能夠引起經(jīng)接種人受試者的外周血單核細(xì)胞(PBMC)和血清的回憶反應(yīng)來測試人免疫力的基于亞單位肽的疫苗方法。細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性在對痘病毒的抗性中的重要性仍在研究中，但是免疫性需要抗體反應(yīng)得到了一定公認(rèn)(Chaudhri 等，J Virol 80 :6339-44,2006 ；Combadiere 等，J Exp Med199，1585-89，2004 ;Kim 等，Clin Vaccine Immunol 13:1172-74,2006)。除了 VIL18BP-衍生肽以外，來源于其它VV基因的肽即D8L和A27L也得以測試。D8L蛋白對于病毒吸附和進(jìn)入細(xì)胞是重要的，并且已顯示可在痘病毒感染的小鼠模型中引起強(qiáng)烈的保護(hù)性免疫(Kan-Mitchell 等，J Immunol 172 =5249-61,2010 ；Berhanu 等，J Virol82 :3517- ，2008)。A27L蛋白對于病毒吸附和組裝也是重要的，并且針對它的抗體提供保護(hù)性免疫(Berhanu 等，J Virol 82 =3517-29,2008 ；Chun g 等，J Virol 72:1577-85,1998 ；Scott,J Immunol 147:3149-55,1991)。本發(fā)明的總體目標(biāo)是選擇和開發(fā)供包含于多表位疫苗規(guī)格中的T-細(xì)胞(HLA-結(jié)合)和B-細(xì)胞抗原肽。肽具有相對易于合成、修飾和組合成多抗原復(fù)合物的優(yōu)勢。為了提高其免疫原性，將肽與靶向APC的抗體如針對HLA-DR抗原的抗體連接。靶向APC的抗體作為專門的抗原呈遞細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞(DC)在發(fā)動先天免疫和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮著舉足輕重的作用，并已被用于產(chǎn)生有效的疫苗(Vulink等，Adv Cancer Res. 2008,99 363-407 ；0' Neill 等，Mol Biotechnol. 2007，36 131-41)。在體內(nèi)將抗原靶向輸送到 APC和DC代表一種有前途的接種方法，因為它可以避開費力而昂貴的離體抗原負(fù)載和培養(yǎng)，并且有助于免疫療法的大規(guī)模應(yīng)用CTacken等，Nat Rev Immunol. 2007，7 :790-802)。更重要的是，體內(nèi)APC和/或DC靶向接種可更高效地引發(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng)，并且可更有效地控制動物模型中的腫瘤生長(Kretz-Rommel 等，J Immunother 2007,30 :715-726) 除了 DC以外，B細(xì)胞是另一類型強(qiáng)效的抗原呈遞細(xì)胞，它能夠預(yù)激Thl/Th2細(xì)胞(Morris 等，J Immunol. 1994,152:3777-3785 ；Constant, J Immunol. 1999,162 5695-5703)和經(jīng)由交叉呈遞來活化 CD8T 細(xì)胞(Heit 等，J Immunol. 2004,172 :1501-1507 ；Yan等，Int Immunol. 2005，17 :869-773)。最近據(jù)報道，在體內(nèi)將抗原靶向輸送至B細(xì)胞打破 MUCl 的免疫耐受(Ding 等，Blood 2008，112 :2817-25)。在本發(fā)明的各種實施方案中，可將針對一般由APC并且特別由DC表達(dá)的抗原的抗體并入免疫偶聯(lián)物疫苗中以便將亞單位抗原肽靶向輸送至免疫系統(tǒng)細(xì)胞。兩個示例性APC抗原是HLA-DR和CD74。HLA-DR是主要組織相容性復(fù)合物種類II細(xì)胞表面受體，它在抗原呈遞中起作用以引起T-細(xì)胞免疫反應(yīng)。HLA-DR發(fā)現(xiàn)于多種抗原呈遞細(xì)胞上，如巨噬細(xì)胞、B-細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。如上所述，針對HLA-DR的抗體(包括L243抗體)是本領(lǐng)域已知的。此類抗體可與亞單位抗原肽偶聯(lián)以便遞送至APC。另一種APC表達(dá)的抗原是⑶74，它是適當(dāng)MHC II折疊和將MHC II-⑶74復(fù)合物靶向輸送至內(nèi)涵體所必需的II型膜內(nèi)在蛋白(Stein等，Clin Cancer Res. 2007,13 5556s-5563s ;Matza 等，Trends Immunol. 2003,24(5) :264-8) CD74 表達(dá)不限于 DC，而是發(fā)現(xiàn)于幾乎所有抗原呈遞細(xì)胞中(Freudenthal等，Proc Natl Acad Sci USA. 1990，87 :7698-702 ;Clark 等，J Immunol. 1992,148(11) :3327-35)。CD74 在 APC 中的廣泛表達(dá)可提供超過只是表達(dá)于髓性DC中的一些優(yōu)勢，因為已報道將抗原靶向輸送至其它APC(如B細(xì)胞)可打破免疫耐受(Ding等，Blood 2008，112 =2817-25)，并且靶向輸送至類漿細(xì)胞DC可將抗原交叉呈遞至原初⑶8T細(xì)胞。更重要的是，⑶74也表達(dá)于濾泡DC中(Clark等，J Immunol. 1992,148(11) :3327-35)，所述濾泡DC是對于抗原呈遞至B細(xì)胞起關(guān)鍵作用的DC亞群(Tew等，Immunol Rev. 1997，156 :39-52)。這一表達(dá)譜使CD74成為用于體內(nèi)靶向接種的優(yōu)秀候選物。各種抗CD74抗體是本領(lǐng)域已知的，如LLl抗體(Leung等，MolImmunol. 1995,32 :1416-1427 ；Losman 等，Cancer 1997,80 :2660-2666 ；Stein 等，Blood2004，104 :3705-11)?？贵w和抗體片段在各種實施方案中，抗體或抗體的抗原結(jié)合片段可并入痘病毒疫苗中?？乖Y(jié)合抗體片段是本領(lǐng)域熟知的，如F(ab' )2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv等，并且可使用任何此類已知片段。如本文所使用的抗原結(jié)合抗體片段是指與完整或親本抗體識別的相同抗原結(jié)合的抗體的任何片段。制備幾乎任何目標(biāo)抗體或片段的偶聯(lián)物的技術(shù)是已知的(例如美國專利第7, 527，787號)。制備針對幾乎任何靶抗原(如HLA-DR或CD74)的單克隆抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。參見例如 Kohler 和 Milstein，Nature 256 :495 (1975)，和 Coligan 等(編著)，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，第 1 卷，第 2. 5. 1-2. 6· 7 頁(John ffiley&Sons 1991)。簡單地說，單克隆抗體可通過以下步驟獲得將包含抗原的組合物注入小鼠，取出脾臟以獲得B-淋巴細(xì)胞，將B-淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合以產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞，克隆雜交瘤細(xì)胞，選擇產(chǎn)生所述抗原的抗體的陽性克隆，培養(yǎng)產(chǎn)生所述抗原的抗體的克隆，和從雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)物中分離抗體。單克隆抗體(MAb)可通過多種行之有效的技術(shù)從雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)物中分離和純化。此類分離技術(shù)包括利用蛋白質(zhì)-ASEPHAROSE 的親和色譜、體積排阻色譜和離子交換色譜。參見例如Coligan第2. 7. 1-2. 7. 12頁和第2. 9. 1-2. 9. 3頁。還參見Baines 等 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，第 10 卷，第 79-104 頁中的 “Purification ofImmunoglobulin G(IgG)，，(The Humana Press, Inc. 1992)。在最初培殖針對免疫原的抗體之后，可對抗體測序并且隨后通過重組技術(shù)來制備。鼠源抗體和抗體片段的人源化和嵌合是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。使用來源于人源化、嵌合或人抗體的抗體組分避免了與鼠源恒定區(qū)的免疫原性相關(guān)的潛在問題。嵌合抗體嵌合抗體是人抗體的可變區(qū)被例如小鼠抗體的可變區(qū)(包括小鼠抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR))替換的重組蛋白。嵌合抗體在施用給受試者時呈現(xiàn)降低的免疫原性和增加的穩(wěn)定性?？寺∈笤疵庖咔虻鞍卓勺冇虻囊话慵夹g(shù)公開于例如Orlandi等，Proc. Nat' 1Acad. Sci. USA 86 :3833 (1989)。構(gòu)建嵌合抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。舉例來說，Leung等，Hybridoma 13:469(1994)中通過將編碼鼠源LL2 (—種抗-CD22單克隆抗體)的Vk和Vh域的DNA序列與相應(yīng)人κ和IgG1恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域組合來產(chǎn)生LL2嵌合體。人源化抗體產(chǎn)生人源化MAb的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的(參見例如Jones等，Nature 321 522(1986) , Riechmann 等，Nature 332 323 (1988) , Verhoeyen 等，Science 239 1534 (1988)，Carter 等，Proc. Nat ‘ 1 Acad. Sci. USA 89 :4285 (1992)，Sandhu, Crit. Rev.Biotech. 12 :437 (1992)，和 Singer 等，J. Immun. 150 :2844(1993))。嵌合或鼠源單克隆抗體可通過將來自小鼠免疫球蛋白的重鏈和輕鏈可變鏈的小鼠CDR轉(zhuǎn)移到人抗體的相應(yīng)可變域中來人源化。嵌合單克隆抗體的小鼠框架區(qū)(FR)也替換為人FR序列。因為簡單地將小鼠CDR轉(zhuǎn)移到人FR中常常導(dǎo)致抗體親和力降低或甚至喪失，所以可能需要額外修飾以便恢復(fù)鼠源抗體的原有親和力。這可以通過將FR區(qū)域中的一個或多個人殘基替換為其鼠源對應(yīng)物以獲得具有針對其表位的良好結(jié)合親和力的抗體來實現(xiàn)。參見例如Tempest等，Biotechnology 9:266(1991)和 Verhoeyen 等，Science 239:1534(1988)。一般來說，不同于其鼠源對應(yīng)物并且接近或毗鄰一個或多個⑶R氨基酸殘基的那些人FR氨基酸殘基將是替換的候選物。人源化形式的L243和LLl抗體是已知的(參見例如美國專利第7612180號和第7312318號)。人抗體使用組合方法或用人免疫球蛋白基因座轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因動物來產(chǎn)生完全人抗體的方法是本領(lǐng)域已知的(例如 Mancini 等，2004，New Microbiol. 27 :315-28 ；Conrad 和Scheller,2005, Comb. Chem. High Throughput Screen. 8 :117-26 ；Brekke 禾口 Loset,2003,Curr. Opin.Phamacol. 3 :544-50)。完全人抗體也可以通過基因或染色體轉(zhuǎn)染方法，以及噬菌體展示技術(shù)來構(gòu)建，所述方法和技術(shù)都是本領(lǐng)域已知的。參見例如McCafferty等，Nature 348:552-553(1990)。與嵌合或人源化抗體相比，預(yù)計此類完全人抗體表現(xiàn)出更少的副作用并且在體內(nèi)基本上如內(nèi)源性人抗體一樣發(fā)揮作用。在一些實施方案中，所主張的方法和程序可利用由此類技術(shù)產(chǎn)生的人抗體。在一個替代方案中，噬菌體展示技術(shù)可用于產(chǎn)生人抗體(例如Dantas-Barbosa等，2005，Genet. Mol. Res. 4 :126-40)?？蓮恼Ｈ嘶虮憩F(xiàn)出特定疾病狀態(tài)(如癌癥)的人產(chǎn)生人抗體(Dantas-Barbosa等，200 。從患病個體構(gòu)建人抗體的優(yōu)點是可使循環(huán)抗體譜偏向針對疾病相關(guān)抗原的抗體。
在此方法的一個非限制性實例中，Dantas-Barbosa等^00 從骨肉瘤患者構(gòu)建人Fab抗體片段的噬菌體展示文庫。一般來說，從循環(huán)血液淋巴細(xì)胞中獲得總RNA (同上)。 重組Fab從μ、γ和κ鏈抗體譜克隆并且插入噬菌體展示文庫中(同上)。將RNA轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA并且用于使用針對重鏈和輕鏈免疫球蛋白序列的特異性引物來產(chǎn)生FabcDNA文庫 (Marks 等，1991，J. Mol. Biol. 222 :581-97)。根據(jù) Andris-Widhopf■等執(zhí)行文庫構(gòu)建 Q000， Phage Display Laboratory Manual, Barbas ^ ( ^m^- ), M 1 ，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 第 9. 1 到 9. 22 頁)。最終 Fab 片段用限制性內(nèi)切酶消化并且插入噬菌體基因組中以產(chǎn)生噬菌體展示文庫。如本領(lǐng)域中已知，此類文庫可通過標(biāo)準(zhǔn)噬菌體展示方法進(jìn)行篩選(參見例如Pasqualini和Ruoslahti，1996，Nature 380 :364-366 ；Pasqualini,1999, The Quart. J. Nuc1. Med. 43 :159-162)。噬菌體展示可以多種方式執(zhí)行，關(guān)于其評論，參見例如Johnson和Chiswell， Current Opinion in Structural Biology 3 :5564-571 (1993)。人抗體也可通過在體外活化的B細(xì)胞產(chǎn)生。參見美國專利第5567610號和第5229275號，其全部內(nèi)容以引用方式并入本文。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到這些技術(shù)是示例性的并且可利用制造和篩選人抗體或抗體片段的任何已知方法。在另一替代方案中，經(jīng)基因工程化以產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動物可用于使用標(biāo)準(zhǔn)免疫方案來產(chǎn)生針對基本上任何免疫原靶標(biāo)的抗體。從轉(zhuǎn)基因小鼠獲得人抗體的方法由 Green 等，Nature Genet. 7 :13(1994)，Lonberg 等，Nature 368 :856(1994)，和 Taylor 等， Int. Immun. 6 =579(1994)公開。此種系統(tǒng)的非限制性實例是來自Abgenix(Fremont，CA)的 XenoMouse (例如 Green 等，1999，J. Immunol. Methods231 :11-23)。在XenoMouse 和類似動物中，小鼠抗體基因經(jīng)滅活并且替換為功能性人抗體基因，而小鼠免疫系統(tǒng)的其余部分仍然完好。將XenoMouse 用包含人IgH和Ig κ基因座的部分(包括大部分可變區(qū)序列) 以及附加基因和調(diào)控序列的生殖細(xì)胞系配置YAC(酵母人工染色體)來轉(zhuǎn)化。人可變區(qū)譜可用來產(chǎn)生抗體產(chǎn)生B-細(xì)胞，所述B-細(xì)胞可通過已知技術(shù)加工成雜交瘤細(xì)胞。用靶抗原免疫的XenoMouse 通過正常免疫反應(yīng)產(chǎn)生人抗體，其可通過以上討論的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來收獲和/或產(chǎn)生?？衫枚喾NXenoMouse 品系，其各自能夠產(chǎn)生不同種類的抗體。轉(zhuǎn)基因方式產(chǎn)生的人抗體已被證明具有治療潛力，同時保持正常人抗體的藥代動力學(xué)性質(zhì)(Green 等，1999)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到所主張的組合物和方法不限于使用XenoMouse 系統(tǒng)，而是可利用經(jīng)基因工程化以產(chǎn)生人抗體的任何轉(zhuǎn)基因動物?？贵w片段識別特定表位的抗體片段可以通過已知的技術(shù)產(chǎn)生。抗體片段是抗體的抗原結(jié)合部分，如F(ab' )2、Fab'、F(ab)2、Fab、Fv、sFv等。F(ab，)2片段可通過胃蛋白酶消化抗體分子來產(chǎn)生，而Fab'片段可通過還原F(ab，)2片段的二硫橋鍵來產(chǎn)生。另外，可構(gòu)建Fab' 表達(dá)文庫(Huse等，1989，Science, 246 :1274-1281)以允許快速簡便地鑒定具有所需特異性的單克隆Fab'片段。？(油)2片段可通過木瓜蛋白酶消化抗體來產(chǎn)生，而Fab片段可通過二硫鍵還原來獲得。單鏈Fv分子(scFv)包含VL域和VH域。VL和VH域聯(lián)合形成靶結(jié)合位點。這兩個域進(jìn)一步通過連接肽(L)共價連接。制造scFv分子和設(shè)計合適連接肽的方法描述于美
14國專利第 4，704，692 號、美國專利第 4，946，778 號、R. Raag 和 M. Whitlow, "Single ChainFvs. "FASEB 第 9 卷:73-80 (1995)以及 R. Ε. Bird 和 B. W. Walker,"Single Chain AntibodyVariable Regions, ” TIBTECH，第 9 卷132-137(1991)。產(chǎn)生單域抗體的技術(shù)也是本領(lǐng)域已知的，例如Cossins等Q006，Prot ExpressPurif 51 :253-259)中所公開。單域抗體(VHH)可通過標(biāo)準(zhǔn)免疫技術(shù)例如從駱駝、羊駝或美洲輪獲得。(參見例如 Muyldermans 等，TIBS 洸230_2；35，2001 ;Yau 等，J ImmunolMethods 281 161-75，2003 ；Maass 等，J Immunol Methods 324 :13-25,2007) VHH 可具有強(qiáng)效的抗原結(jié)合能力并且可與常規(guī)VH-VL對難以接近的新的表位相互作用。(Muyldermans等，2001)。羊駝血清IgG含有約50 %的僅駱駝科重鏈IgG抗體(HCAb) (Maass等，2007)。羊駝可用已知抗原如TNF- α免疫，并且可分離結(jié)合靶抗原并中和靶抗原的VHH(Maass等，2007)。擴(kuò)增幾乎所有羊駝VHH編碼序列的PCR引物已得到鑒定并且可用于構(gòu)建羊駝VHH噬菌體展示文庫，其可用于通過本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)生物淘選技術(shù)來分離抗體片段(Maass等，2007)?？贵w片段可通過全長抗體的蛋白水解或通過在大腸桿菌或編碼該片段的DNA的另一宿主中表達(dá)來制備?？贵w片段可用常規(guī)方法對全長抗體進(jìn)行胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化來獲得。這些方法描述于例如Goldenberg的美國專利第4，036，945號和第4，331，647號和其中所含的參考文獻(xiàn)。還參見Nisonoff等，Arch Biochem. Biophys. 89 230 (1960)；Porter，Biochem. J. 73 :119(1959) ,Edelman 等，METHODS IN ENZYM0L0GY 第 1 卷，第 422 頁(Academic Press 1967)，和 Coligan 第 2. 8. 1-2. 8. 10 頁和第 2. 10. -2. 10. 4 頁。已知的抗體雖然針對HLA-DR或CD74的抗體是優(yōu)選的，但是痘病毒疫苗可替代地使用與靶細(xì)胞表面上的另一抗原結(jié)合或與其反應(yīng)的抗體來產(chǎn)生。優(yōu)選的額外MAb可包括可與CD209 (DC-SIGN)、CD34、CD205、TLR2 (toll 樣受體 2)、TLR4、TLR7、TLR9、BDCA-2、BDCA-3 或BDCA-4反應(yīng)的人源化、嵌合或人MAb。此類抗體可從如美國菌種保藏中心的公共來源或商業(yè)抗體供應(yīng)商獲得。例如，針對 CD209 (DC-SIGN)、CD34、BDCA-2、TLR2、TLR4、TLR7 和 TLR9 的抗體可從 Santa CruzBiotechnology 公司(Santa Cruz, CA)購買。針對 CD205 和 BDCA-3 的抗體可從 MiltenyiBiotec公司(Auburn，CA)購買。眾多的其它抗體商業(yè)來源是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這些抗體只是示例性的并且多種其它抗體和其雜交瘤細(xì)胞是本領(lǐng)域已知的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到針對幾乎任何APC-相關(guān)抗原的抗體序列或分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞可通過針對選定的相關(guān)靶抗原的抗體來簡單搜索ATCC、NCBI和/或USPTO數(shù)據(jù)庫而獲得。克隆抗體的抗原結(jié)合域可使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來擴(kuò)增、切除、連接到表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)染至改造的(adapted)宿主細(xì)胞中并用于蛋白質(zhì)產(chǎn)生。免疫偶聯(lián)物在各種實施方案中，痘病毒疫苗可以免疫偶聯(lián)物形式施用。制造具有抗體或融合蛋白的共價或非共價偶聯(lián)物的許多方法是本領(lǐng)域已知的并且可利用任何此類已知方法。例如，抗原肽可經(jīng)由二硫鍵形成而連接于經(jīng)還原抗體組分的鉸鏈區(qū)。另外，此類藥劑可使用異雙功能交聯(lián)劑，如N-琥珀酰3- -吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)來連接。Yu等，Int. J. Cancer 56:244(1994)。此類偶聯(lián)的一般技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。參見例如 Wong，CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING (CRCPressl991) ；MONOCLONAL ANTIBODIES PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch 等(編著)，第 187-230 頁中的 Upeslacis 等，“Modification of Antibodies by ChemicalMethods” (ffiley-Liss, Inc. 1995) ；MONOCLONAL ANTIBODIES PRODUCTION，ENGINEERINGAND CLINICAL APPLICATION, Ritter 等(編著)，第 60-84 頁中的 Price，"Productionand Characterization of Syntheticn Peptide-Derived Antibodies，， (CambridgeUniversity Press 1995)。對接和鎖定(DNL)方法在替代實施方案中，包含免疫偶聯(lián)物的基于亞單位的疫苗可通過其它技術(shù)產(chǎn)生。一種幾乎將任何蛋白或肽與任何其它蛋白或肽偶聯(lián)的技術(shù)稱為對接和鎖定(DNL)技術(shù)。DNL方法利用在cAMP-依賴性蛋白激酶(PKA)的調(diào)控(R)亞單位和A-激酶錨定蛋白(AKAP)的錨定域(AD)之間發(fā)生的特異性蛋白/蛋白相互作用(Baillie等，F(xiàn)EBS Letters. 2005 ；579 :3264o Wong和 Scott, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004 ；5 :959)。PKA在一種由第二信使cAMP與R亞單位的結(jié)合所觸發(fā)的研究最徹底的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮核心作用，它于1968年首次從兔骨骼肌中分離(Walsh等，J. Biol. Chem. 1968 ；243 3763) 0全酶的結(jié)構(gòu)由通過R亞單位來保持非活性形式的兩個催化亞單位所組成(Taylor, J. Biol. Chem. 1989 ；264 :8443)。PKA的同工酶被發(fā)現(xiàn)具有兩種類型的R亞單位(RI 和 RII)，并且每種類型具有 α 和 β 同種型(Scott, Pharmacol. Ther. 1991 ；50 :123)。R亞單位僅以穩(wěn)定二聚體形式得以分離并且二聚化域已被證明由前44個氨基末端殘基組成(Newlon等，Nat. Struct. Biol. 1999 ；6 :222)。cAMP與R亞單位的結(jié)合導(dǎo)致釋放活性催化亞單位以產(chǎn)生廣泛范圍的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，其通過PKA對接于AKAP而發(fā)生區(qū)室化來定向于選定底物(Scott 等，J. Biol. Chem. 1990 ；265 ；21561)。自從第一種AKAP即微管相關(guān)蛋白-2于1984年得到表征(Lohmann等，Proc. Natl.Acad. Sci USA. 1984 ；81 6723)以來，集中于各種亞細(xì)胞位點(包括質(zhì)膜、肌動蛋白細(xì)胞骨架、核、線粒體，和內(nèi)質(zhì)網(wǎng))的50多種AKAP已被鑒定出在從酵母到人范圍內(nèi)的物種中具有不同結(jié)構(gòu)(Wong 和 kott，Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004 ;5 :959)。AKAP 針對 PKA 的 AD 是14-18個殘基的兩親性螺旋(Carr等，J. Biol. Chem. 1991 ；266 :14188)。AD的氨基酸序列在個別AKAP之間具有很大差異，其中針對RII 二聚體的結(jié)合親和力據(jù)報道在2到90nM范圍內(nèi)(Alto 等，Proc. Natl. Acad. ki. USA. 2003 ； 100 :4445)。引起關(guān)注的是，AKAP 只與二聚體R亞單位結(jié)合。對于人RII α，AD與由23個氨基末端殘基形成的疏水表面結(jié)合(Colledge^P Scott, Trends Cell Biol. 1999 ;6 :216)。因此，人 RII α 的二聚化域和 AKAP 結(jié)合域都位于相同 N-末端 44 氨基酸序列內(nèi)(Newlon 等，Nat. Struct. Biol. 1999 ；6 :222 ；Newlon 等，EMBO J. 2001 ；20 :1651)，它在本文中稱為 DDD0人RII α的DDD和AKAP的AD作為連接物模塊我們已開發(fā)一種將人RII α的DDD和AKAP的AD用作優(yōu)秀連接物模塊對以便將以下稱為A和B的任何兩個實體對接成非共價復(fù)合物的平臺技術(shù)，所述非共價復(fù)合物可通過將半胱氨酸殘基引入DDD和AD的戰(zhàn)略位置以促進(jìn)形成二硫鍵而進(jìn)一步鎖定為穩(wěn)定栓系的結(jié)構(gòu)?！皩?和-鎖定”途徑的一般方法如下。實體A通過將DDD序列連接至A的前體，產(chǎn)生以下被稱為a的第一組分來構(gòu)建。因為DDD序列將實現(xiàn)二聚體的自發(fā)形成，所以A將由 組成。實體B通過將AD序列連接至B的前體，產(chǎn)生以下被稱為b的第二組分來構(gòu)建。
中所包含的DDD的二聚基元產(chǎn)生與b中所包含的AD序列結(jié)合的對接位點，由此促進(jìn)％和b 的即刻締合，以便形成由組成的二元、三聚體復(fù)合物。此結(jié)合事件由于將兩個實體經(jīng)由二硫橋鍵來共價固定的后續(xù)反應(yīng)而變得不可逆，因為最初結(jié)合相互作用使置于DDD和AD上的反應(yīng)性硫醇基團(tuán)處于接近位置中以便于位點特異性地連接，所以此后續(xù)反應(yīng)非常高效地基于有效局部濃度的原理而發(fā)生(Chmura等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001 ；98 :8480)。在一些替代實施方案中，痘病毒疫苗免疫偶聯(lián)物基于％13結(jié)構(gòu)的變化形式，其中抗-HLA-DR或抗-⑶74抗體或F (ab ‘ ) 2或F (ab) 2抗體片段的每個重鏈在其C-末端連接至 AD部分的一個拷貝。因為每個抗體或片段有兩個重鏈，所以每個抗體或片段有兩個AD部分。亞單位抗原肽被連接到互補(bǔ)DDD部分。在DDD部分二聚化之后，每個DDD 二聚體與連接至IgG抗體或F(ab' )2或？(油)2片段的其中一個AD部分結(jié)合，產(chǎn)生每個IgG或F(ab' )2 或F(ab)2單位四個抗原肽的化學(xué)計量關(guān)系。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到可利用替代復(fù)合物，如抗原肽與AD序列連接和將抗-HLA-DR或抗-⑶74MAb或片段與DDD部分連接，產(chǎn)生效應(yīng)因子部分的不同化學(xué)計量關(guān)系。例如，通過將DDD序列與IgG抗體或F(ab' )2片段的每個重鏈的C-末端連接，和將AD序列與抗原肽連接，可構(gòu)建包含一個抗原肽和一個抗體或片段的DNL復(fù)合物。通過將DDD和AD遠(yuǎn)離兩個前體的功能性基團(tuán)連接，預(yù)計此類位點特異性連接可保存兩個前體的初始活性。此方法在性質(zhì)上是模塊化的并且潛在地可用于位點特異性地和共價地連接廣泛范圍的物質(zhì)。在優(yōu)選實施方案中，DDD或AD部分與抗體或抗原肽共價連接以形成融合蛋白或肽。制造融合蛋白的多種方法是已知的，包括核酸合成、雜交和/或擴(kuò)增以產(chǎn)生編碼目標(biāo)融合蛋白的合成雙鏈核酸。此類雙鏈核酸可通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)插入表達(dá)載體中以產(chǎn)生融合蛋白(參見例如 Sambrook 等，Molecular CloninR, A laboratory manual，第 2 版， Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor，NY，1989)。在此類優(yōu)選實施方案中，AD 和/或DDD部分可與蛋白質(zhì)或肽的N-末端或C-末端連接。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到 AD或DDD部分的連接位點可變化。例如，雖然可在保持抗原結(jié)合活性的同時將AD或DDD部分連接至抗體或抗體片段的N-或C-末端，但是與C-末端的連接使AD或DDD部分處于遠(yuǎn)離抗原結(jié)合位點的位置并且似乎產(chǎn)生更強(qiáng)的結(jié)合相互作用(例如Chang等，Clin Cancer Res 2007，13 :5586s-91s)。多種效應(yīng)因子部分的位點特異性連接還可使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)來執(zhí)行，如使用二價交聯(lián)試劑和/或其它化學(xué)偶聯(lián)技術(shù)。治療性處理的方法制劑痘病毒疫苗可根據(jù)已知方法配制以制備藥學(xué)適用組合物，其中痘病毒疫苗以混合物形式與藥學(xué)合適賦形劑組合。無菌磷酸鹽緩沖鹽水是藥學(xué)合適賦形劑的一個實例。其它合適賦形劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。參見例如Ansel等，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，第 5 版(Lea&Febiger 1990)，和 Gennaro (編著)， REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第 18 版(Mack Publishing Company 1990)和其修訂版。痘病毒疫苗優(yōu)選皮下或鼻腔施用。更優(yōu)選地，痘病毒疫苗以單個或多個推注劑形式經(jīng)由皮下注射施用。施用制劑可以單位劑型提供，例如提供于安瓿或多劑量容器中，其中添加防腐劑。組合物可采用如油性或水性載體中的混懸液、溶液或乳狀液這樣的形式，并且可含有配方劑，如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。另外，活性成分可呈在使用之前用合適載體(例如無菌無熱原水)復(fù)水的粉末形式?？墒褂闷渌扑幏椒▉砜刂贫徊《疽呙绲淖饔贸掷m(xù)時間。可通過使用絡(luò)合或吸附痘病毒疫苗的聚合物來制備緩釋制劑。例如，生物相容聚合物包括乙烯-醋酸乙烯共聚物基質(zhì)和硬脂酸二聚體與癸二酸的酸酐共聚物基質(zhì)。Sherwood等，Bio/Technology 10:1446 (199 。從此種基質(zhì)中釋放的速率取決于痘病毒疫苗的分子量、基質(zhì)內(nèi)的痘病毒疫苗的量和分散顆粒的大小。Saltzman等，Biophys. J. 55 :163(1989) ； Sherwood等，上述。其它固體劑型描述于Ansel等，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，第5 版(Lea&Febiger 1990)，和 Gennaro (編著)，REMINGTON，S PHARMACEUTICAL SCIENCES,第 18 版(Mack Publishing Company 1990)和其修訂版。一般來說，人施用痘病毒疫苗的劑量取決于如患者年齡、體重、身高、性別、一般醫(yī)學(xué)狀況和既往病史等因素而有所不同。在單次施用中向接受者提供約lmg/kg到25mg/kg范圍內(nèi)的痘病毒疫苗劑量可能是可取的，但是如情況需要也可施用更低或更高劑量。舉例來說，l-20mg/kg劑量對于70kg患者為70-1，400mg,或?qū)τ?. 7-m患者為41_824mg/m2。如需要可重復(fù)給藥以誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。在替代實施方案中，治療肽可通過吸入途徑施用(例如Sievers等，2001，PureAppl. Chem. 73 =1299-1303)。超臨界二氧化碳霧化已用于從包括蛋白質(zhì)和肽的各種藥劑中產(chǎn)生納米或微米尺度的顆粒(同上)。將超臨界二氧化碳與蛋白質(zhì)或肽水溶液混合所形成的微泡可在與形成藥物粉末的替代方法相比較低的溫度(25至65°C)下干燥，從而保留治療肽的結(jié)構(gòu)和活性(同上)。在某些情況下，可將穩(wěn)定劑如海藻糖、蔗糖、其它糖、緩沖劑或表面活性劑添加到溶液中，以進(jìn)一步保存功能活性。產(chǎn)生的顆粒小到足以通過吸入施用。在其它替代方案中，可利用水溶液的鼻腔施用。試劑盒各種實施方案可涉及含有適合于治療或診斷患者的患病組織的組分的試劑盒。示例性試劑盒可含有至少一種或多種如本文所述的痘病毒疫苗免疫偶聯(lián)物。如果包含施用組分的組合物不是經(jīng)配制以便通過鼻腔施用或吸入來遞送，能夠通過皮下注射來遞送試劑盒組分的裝置可被包括在內(nèi)。一種類型的裝置是用于將組合物注入受試者的身體內(nèi)的注射器。在一些實施方案中，治療劑可以含有無菌、液體制劑或凍干制劑的預(yù)充式注射器或自動注射筆形式提供。試劑盒組分可以包裝在一起或分隔至兩個或更多個容器中。在一些實施方案中，容器可為含有適合于復(fù)水的組合物的無菌、凍干制劑的小瓶。試劑盒還可能包含一種或多種適合于復(fù)水和/或稀釋其它試劑的緩沖劑?？墒褂玫钠渌萜靼ǖ幌抻谛〈?、盤、盒、管等。試劑盒組分可以被包裝于容器內(nèi)并保持無菌?？梢园趦?nèi)的另一個組成部分是向使用者提供試劑盒的使用方法的說明書。表達(dá)載體其它實施方案可能涉及包含編碼痘病毒疫苗免疫偶聯(lián)物或其組成蛋白的核酸的DNA序列。融合蛋白可包含與亞單位抗原肽連接的抗-HLA-DR抗體。另外，所編碼融合蛋白可包含與抗體或抗原肽連接的DDD或AD部分。各種實施方案涉及包含編碼DNA序列的表達(dá)載體。載體可含有可與嵌合、人源化或人可變區(qū)序列連接的編碼人免疫球蛋白的輕和重鏈恒定區(qū)和鉸鏈區(qū)的序列。此外，載體可能含有在選定的宿主細(xì)胞中表達(dá)所編碼的蛋白質(zhì)的啟動子、增強(qiáng)子和信號或前導(dǎo)序列。 特別有用的載體是pdHL2或GS。更優(yōu)選地，輕鏈和重鏈恒定區(qū)和鉸鏈區(qū)可來自人EU骨髓瘤免疫球蛋白，其中任選地同種異型(allotype)位置中的至少一個氨基酸更換為不同IgGl 同種異型中的氨基酸，并且其中任選地基于EU編號系統(tǒng)的EU重鏈的氨基酸253可替換為丙氨酸。參見 Edelman 等，Proc. Natl. Acad, ki USA 63:78-85(1969)。在其它實施方案中，IgGl序列可轉(zhuǎn)換為IgG4序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到對表達(dá)構(gòu)建體進(jìn)行基因工程化并將其插入宿主細(xì)胞中以表達(dá)工程化蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域熟知的，并且屬于例行實驗。宿主細(xì)胞及表達(dá)克隆抗體或片段的方法已描述于例如美國專利第7531327、7537930和7608425號，其實施例部分以引用方式并入本文。
實施例下面的實施例用來說明而非限制本發(fā)明的權(quán)利要求。實施例1.針對痘病毒亞單位抗原肽的免疫反應(yīng)材料和方法肽設(shè)計.具有針對HLA I類和/或HLA II類分子的多個潛在結(jié)合位點的9_聚體或15-聚體肽序列通過目測篩查HLA錨定殘基是否處于正確間距，或使用基于萬維網(wǎng)的方法(例如 BIMAS 或 SYFPEITHI [Parker 等，J Immunol 152 163-75，1994 ；Rammensee 等， Immunogenetics 50 :213-19,1999])而從痘病毒開放閱讀框架獲得，其中選擇是基于特異性 HLA-結(jié)合的較高潛力(表 2)。vIL18BP(C12L)、A4L (Boulanger 等，J Virol 72:170-79， 1998)、A27L(Chung 等，J Virol72 1577-85，1998)或 D8L (Hsaio 等，J Virol 73 :8750-61) W抗原的核苷酸和氨基酸序列從NIH GenBank入藏登記號:AY243312來檢索。這些肽通過其基因來源和編號(例如VIL18BP105或VD8L118)來定名。表2.痘病毒VIL18BP-衍生肽、A4L2^和TT830的氨基酸數(shù)目和HLA限制。
權(quán)利要求
1.一種免疫偶聯(lián)物，其包含a)至少一種來自痘病毒蛋白的抗原肽；和b)結(jié)合抗原呈遞細(xì)胞(APC)的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體或片段與所述抗原肽偶聯(lián)；其中將所述免疫偶聯(lián)物施用給受試者誘導(dǎo)針對所述痘病毒的免疫反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫偶聯(lián)物，其中所述痘病毒蛋白是病毒免疫調(diào)節(jié)因子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的免疫偶聯(lián)物，其中所述痘病毒蛋白是病毒IL-18結(jié)合蛋白(VIL18BP)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫偶聯(lián)物，其中所述痘病毒蛋白是包膜蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫偶聯(lián)物，其中所述痘病毒蛋白選自由L1R、A27L和D8L組成的組。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫偶聯(lián)物，其中所述免疫偶聯(lián)物包含至少一種來自病毒免疫調(diào)節(jié)因子的抗原肽和至少一種來自病毒包膜蛋白的抗原肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫偶聯(lián)物，其中所述痘病毒是天花。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫偶聯(lián)物，其中所述抗體或其片段結(jié)合選自由以下組成的組的 APC 抗原HLA-DR、CD74、CD209 (DC-SIGN)、CD34、CD74、CD205、TLR2 (toll 樣受體 2)、TLR4、TLR7、TLR9、BDCA-2、BDCA-3 禾口 BDCA-4。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫偶聯(lián)物，其中所述APC抗原是HLA-DR或CD74。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的免疫偶聯(lián)物，其中所述抗體或其片段是抗-HLA-DR抗體，其包含重鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)序列 CDR1NYGMN(SEQ ID N0:1)、CDR2 WINTYTREPTYADDFKG (SEQID NO 2) ^P CDR3 DITAVVPTGFDY (SEQ ID NO :3)以及輕鏈 CDR 序歹丨J CDRl RASENIYSNLA (SEQID N0:4)、CDR2 AASNLAD (SEQ ID NO :5)和 CDR30HFWTTPWA (SEQ ID NO :6)。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的免疫偶聯(lián)物，其中所述抗體或其片段是抗-CD74抗體，其包含輕鏈 CDR 序列 CDR1RSSQSLVHRNGNTYLH(SEQ ID NO :7)、CDR2 TVSNRFS (SEQ ID NO:8)和 CDR3 SQSSHVPPT (SEQ ID NO 9)以及重鏈 CDR 序列 CDR1NYGVN(SEQ ID N0:10)、CDR2WINPNTGEPTFDDDFKG(SEQ ID NO :11)和 CDR3 SRGKNEAffFAY(SEQ ID NO :12)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫偶聯(lián)物，其中所述抗原肽具有選自由以下組成的組的氨基酸序列SEQ ID NO :13,SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15,SEQ ID NO 16,SEQ ID N0:17、SEQ ID NO :18,SEQID NO 19,SEQ ID NO 20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ IDNO :23、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :30、SEQ IDNO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO 33、SEQ ID NO :34、SEQ IDNO :35、SEQ ID NO :36、SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :38、SEQ IDNO 39 禾口 SEQ ID NO :40。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫偶聯(lián)物，其中所述免疫偶聯(lián)物是包含所述抗原肽和所述抗體或抗體片段的融合蛋白。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫偶聯(lián)物，其中所述抗原肽與所述抗體或抗體片段共價連接。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫偶聯(lián)物，其中所述抗原肽是第一融合蛋白的一部分，所述抗體或其片段是第二融合蛋白的一部分，并且所述第一和第二融合蛋白彼此結(jié)合。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的免疫偶聯(lián)物，其中第一融合蛋白包含來自人蛋白激酶A(PKA)RI α、RII α、RI β或RII β的二聚化和對接域(DDD)部分，并且所述第二融合蛋白包含來自AKAP蛋白的錨定域。
17.一種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫偶聯(lián)物和藥學(xué)上可接受的載體。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物是亞單位疫苗。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的藥物組合物，其中將所述疫苗施用給受試者提供針對痘病毒感染的免疫力。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的藥物組合物，其中將所述疫苗施用給受試者誘導(dǎo)針對天花感染的免疫力。
21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的藥物組合物，其中所述組合物進(jìn)一步包含至少一種佐劑。
22.—種誘導(dǎo)針對痘病毒感染的免疫力的方法，其包括向受試者施用根據(jù)權(quán)利要求18所述的亞單位疫苗。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述痘病毒是天花。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述組合物皮下或鼻腔施用。
25.根據(jù)權(quán)利要求M所述的方法，其中脂質(zhì)體亞單位疫苗經(jīng)鼻腔施用。
26.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述免疫偶聯(lián)物以編碼融合蛋白的表達(dá)載體形式施用，所述融合蛋白包含至少一種來自痘病毒蛋白的抗原肽和結(jié)合APC的抗體或其抗原結(jié)合片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及誘導(dǎo)針對諸如天花的痘病毒感染的免疫力的基于亞單位的疫苗的方法和組合物。優(yōu)選實施方案涉及包含一種或多種與靶向抗原產(chǎn)生細(xì)胞(APC)的抗體或其片段連接的亞單位抗原肽的免疫偶聯(lián)物。更優(yōu)選地，所述抗體與HLA-DR結(jié)合并且所述抗原肽來自免疫調(diào)節(jié)因子，如病毒IL-18結(jié)合蛋白(vIL18BP)。然而，也可使用來自不同病毒蛋白的抗原肽的混合物。所述疫苗能夠誘導(dǎo)針對痘病毒的免疫力，而沒有在免疫功能低下宿主中發(fā)生播散性感染或傳染給易感染的接觸者的風(fēng)險。
文檔編號A61K39/385GK102573902SQ201080047418
公開日2012年7月11日 申請日期2010年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月5日
發(fā)明者A·P·泰勒, B·馬卡比-潘祖, D·M·戈德堡 申請人:分子醫(yī)學(xué)和免疫學(xué)中心