專利名稱：生物相容性組合物及由其聚合的材料用于抑制血管生成的應(yīng)用的制作方法
生物相容性組合物及由其聚合的材料用于抑制血管生成的
應(yīng)用本發(fā)明涉及一種基于可交聯(lián)的親水性聚合物的生物相容性組合物及由其聚合的材料用于抑制和/或預(yù)防血管生成的應(yīng)用。血管生成是指新的血管結(jié)構(gòu)的形成，所述結(jié)構(gòu)具有內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)壁并具有平滑肌細(xì)胞和周細(xì)胞。血管生成不僅對于生理過程諸如在胚胎發(fā)育和傷ロ愈合中，還對于病理過程諸如在多發(fā)性關(guān)節(jié)炎和腫瘤生長中，起到非常大的作用。在研究和文獻(xiàn)中，曾經(jīng)且目前仍部分使用三個不同的概念用于血管的新形成—— 血管發(fā)生、血管生成和動脈發(fā)生——其中，目前采用血管生成這ー概念作為所有形式新血管形成的總概念，因為這三種所述形式的范圍難以區(qū)分，并且根本原理是一致的。血管生成是ー個復(fù)雜的過程，其中構(gòu)成血管壁所必須的內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞通過不同的血管生成生長因子，例如通過成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)和/或血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)激活。新的毛細(xì)血管通過已存在于相關(guān)組織中的內(nèi)皮細(xì)胞的増殖和遷移產(chǎn)生。血管生成具有重要的生物學(xué)和醫(yī)藥學(xué)意義，在此，血管生成的兩種治療應(yīng)用區(qū)分為促血管生成的治療和抗血管生成或非血管生成的治療。在前一種治療中應(yīng)當(dāng)刺激形成新血管，特別是通過使用和給藥生長因子，像是例如對動脈硬化，特別是冠心病和外周阻塞疾病的治療。而抗血管生成或非血管生成的治療特別在必須阻止或不希望形成新血管的情況下使用，例如在腫瘤治療中，因為實體瘤依賴于向其提供氧和養(yǎng)分的共生毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)。相應(yīng)地，抗血管生成療法嘗試減少/阻隔腫瘤的血管供應(yīng)，由此減少/阻隔對腫瘤的供血。因此，在現(xiàn)有技術(shù)中，為了進(jìn)行腫瘤的抗血管生成治療，使用例如中和VEGF的單克隆抗體。在其他疾病例如克隆氏癥、銀屑病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，不受阻的血管生成也有重要作用，因為通過新形成的血管，用于發(fā)炎的細(xì)胞群的連續(xù)流到達(dá)身體中的感染部位。與血管生成有直接關(guān)系的病癥和疾病的概述可以在例如Polverini的著作《Angiogenesis in health and Disease :Insights into Basic Mechanisms and Therapeutic Opportunities)), Journal of Dental Educationバ2002) Vol. 66，962_975 中的表 1 中找到。此外，對于可植入的醫(yī)療裝置/植入物，例如應(yīng)當(dāng)用以替代受損組織的植入物，或是安置到特定器官中用以支撐其壁的支架/斯滕特移植物，通常對于持久成功使用的前提條件是，要求它們在其植入位置不促進(jìn)形成新的血管，而盡可能的被中性和惰性地填入包圍它們的組織中，在那里，它們還有可能被再吸收。對于醫(yī)學(xué)植入物來說，在這些情況下會產(chǎn)生巨大的危險，即內(nèi)皮細(xì)胞粘連在植入物上并由此啟動新血管形成機(jī)制。由此能夠產(chǎn)生不希望的副作用，例如植入了所述裝置的組織的腫脹和增生，直至導(dǎo)致出現(xiàn)腫瘤生長。為了防止出現(xiàn)這種情況，在現(xiàn)有技術(shù)中，通常對將植入裝置用抗血管生成的(并且還消炎的)活性成分涂覆，例如抗體(如抗VEGF抗體)、視黃酸及其衍生物、蘇拉明、金屬蛋白酶-1-和金屬蛋白酶-2-抑制劑、埃坡霉素、秋水仙堿、長春花堿、紫杉醇等等，其應(yīng)當(dāng)抑制內(nèi)皮細(xì)胞粘連到所述裝置上和可由此引發(fā)的新血管形成。
但是這類涂覆的裝置/植入物存在缺點，一方面，由于附加涂覆步驟而導(dǎo)致生產(chǎn)成本增高，另ー方面，覆層的抗血管生成或無血管生成效果依賴于設(shè)置覆層及活性成分的質(zhì)量/數(shù)量，還依賴于覆層的耐久性。此外，過去的事實證明，涂覆植入物本身不能夠完全阻止內(nèi)皮細(xì)胞的粘連。此外，覆層經(jīng)常導(dǎo)致在接受治療的患者體內(nèi)產(chǎn)生副作用，這些副作用不僅影響每個手術(shù)的成效，還能夠造成整體健康受損。因此，對于能夠克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷的、而且——同時具有出色的生物相容性的——使用起來有效的以及制造成本低廉的醫(yī)學(xué)植入物的供應(yīng)，目前仍存在巨大的需求。在所述技術(shù)背景下，本發(fā)明的目的在干，提供一種用于醫(yī)學(xué)植入物的制品，所述制品不激活或不導(dǎo)致新血管形成，并且抑制內(nèi)皮細(xì)胞的粘連。根據(jù)本發(fā)明，通過應(yīng)用ー種生物相容性的組合物達(dá)到上述目的，所述組合物基于親水性聚合物并能夠聚合為水凝膠形成材料，其中親水性聚合物為可交聯(lián)的血清白蛋白或可交聯(lián)的血清蛋白，用于抑制和/或預(yù)防血管生成或內(nèi)皮細(xì)胞増殖。此外本發(fā)明還涉及所述生物相容性組合物的應(yīng)用，用于對植入物進(jìn)行涂覆和表面改性，所述植入物由另ー種與從上述組合物出發(fā)聚合得到的材料不同的材料構(gòu)成。上述目的進(jìn)ー步通過應(yīng)用一種聚合的、水凝膠形成材料解決，所述材料通過聚合基于血清白蛋白或血清蛋白的組合物得到，用于抑制和/或預(yù)防血管生成或內(nèi)皮細(xì)胞增殖。由此，本發(fā)明的基本目的完全得到解決。通過根據(jù)本發(fā)明組合物的應(yīng)用以及聚合的、水凝膠形成材料，提供ー種新的治療制品，或藥物載體材料，使得例如利用植入物進(jìn)行組織替代成為可能，并且同時抑制內(nèi)皮細(xì)胞在其上粘連和増殖。有利之處在干，由此避免新血管形成以及在其中引入了用于替代患病或缺損組織的所述組合物的組織的腫脹和增生，且同時通過材料的吸收替代缺損或患病組織。根據(jù)本發(fā)明所述的應(yīng)用，還提供植入物用載體材料，通過所述載體材料能夠有針對性地抑制血管生成，并且例如通過預(yù)先引入所述組合物/材料中，可以有針對性地促進(jìn)其它不參與血管生成的細(xì)胞的生長。除此之外，所述新應(yīng)用的有利之處在于，組合物還是首先可原位聚合的，亦即可以將所述組合物注入到應(yīng)當(dāng)進(jìn)行組織替代或組織支撐的位置，并首先在該位置進(jìn)行聚合。由此，為所需的治療處理僅需最少的醫(yī)學(xué)手木。反之，所述組合物也能夠在植入患者體內(nèi)之前進(jìn)行聚合，隨后通過外科手術(shù)植入。發(fā)明者已在其試驗中證實，基于血清白蛋白或血清蛋白的組合物，或更確切地說， 由所述組合物聚合得到的材料，特別適合于作為載體材料，用以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的粘連，從而用于抑制/預(yù)防血管生成。因此，這種基于血清白蛋白/蛋白的組合物/材料作為醫(yī)學(xué)植入物，特別可以用于在新血管形成是不利的和/或是必須絕對避免的情況下，例如在軟骨、 椎間盤、角膜進(jìn)行組織替代吋，抑制血管生成。令人^C喜的是，在本發(fā)明中的基礎(chǔ)實驗證實， 與其它現(xiàn)有技術(shù)中應(yīng)用的和公知的載體或基體相比，只有基于血清白蛋白/血清蛋白的材料抑制了內(nèi)皮細(xì)胞的粘連。與此同吋，在此所述材料本身對內(nèi)皮細(xì)胞是無毒的，并且因此對應(yīng)接受所述材料作為醫(yī)療植入物的患者來說也是無毒的，這再次證明了所述材料對患者持別高的生物兼容性。
除此之外，血清白蛋白能夠結(jié)合大量不同的物質(zhì)，像是例如金屬離子(金屬)、脂肪酸和氨基酸、各種蛋白質(zhì)和藥品，因此其極具生物相容性，而且如此之好而不在體內(nèi)引起反應(yīng)。由此，根據(jù)本發(fā)明所述的應(yīng)用也能夠與其它生物和/或治療活性物質(zhì)組合使用， 所述活性物質(zhì)應(yīng)在患者的目標(biāo)位置通過組合物或者更確切地說通過凝膠發(fā)揮生物和/或治療效果。與此同時，本發(fā)明所述應(yīng)用能夠以如下方式實施，即所述材料是可首先原位聚合的，或在植入前已聚合并且以水凝膠狀態(tài)植入。由此理解的是，當(dāng)植入聚合了的水凝膠時， 優(yōu)選更加堅固的水凝膠稠度，使得對所述水凝膠的實際處理成為可能或變得容易。堅固性的程度，或更確切地說，水凝膠或材料的流體性質(zhì)能夠在此通過其交聯(lián)度得到調(diào)整，交聯(lián)越強(qiáng)，其后水凝膠或材料就越堅固。因此，凝膠的流體性質(zhì)處于液體和固體之間。雖然白蛋白作為生物兼容性物質(zhì)是公知的，并且還作為凝膠或載體材料，作為這些在例如DE 10 2008 008 071. 3中得以敘述，但它在抑制內(nèi)皮細(xì)胞的粘連和増殖及抑制血管生成方面的應(yīng)用尚屬未知。用于根據(jù)本發(fā)明所述應(yīng)用的組合物，或更確切地說基于所述組合物聚合的水凝膠形成材料，可以在其中含有能夠從任何哺乳動物獲得，或能夠相應(yīng)地應(yīng)用于任何哺乳動物的血清白蛋白/血清蛋白，在此優(yōu)選為人類、牛、羊或家兔血清白蛋白，并且根據(jù)本發(fā)明所述的應(yīng)用，對人類優(yōu)先使用基于人類血清白蛋白的材料。根據(jù)本發(fā)明所述的應(yīng)用進(jìn)ー步的優(yōu)點在干，所述水凝膠形成材料的前體是可在室溫操作的。因此，所述材料能夠與各種加入的成分或細(xì)胞分開存放，并當(dāng)需要吋，在即將進(jìn)行本發(fā)明所述應(yīng)用前，再使其與成分，或有時與細(xì)胞，例如應(yīng)當(dāng)支持形成新組織的細(xì)胞，匯合到一起。其中，聚合時間是可調(diào)節(jié)的，可以將時間設(shè)計為幾秒至2分鐘。由此，組分和/ 或細(xì)胞立即固定于材料中，避免不希望的從材料中向外的擴(kuò)散。在此如上文所述，所述應(yīng)用要么通過可原位聚合的水凝膠形成材料實現(xiàn)，要么通過在向患者體內(nèi)引入之前已經(jīng)聚合的水凝膠材料實現(xiàn)。在本說明書中，在根據(jù)本發(fā)明所述的應(yīng)用中使用術(shù)語“組合物”和“材料”，其中， “組合物”偏重于但并不專一地用于尚未聚合的材料，而“材料”或“凝膠”用于已聚合的組合物。不過可以理解，這些術(shù)語不能夠完全地相互分開，因為組合物和材料實際上指的是同 ー對象。此處，“凝膠”指的是組合物的半固體狀態(tài)，它以三維的聚合的網(wǎng)絡(luò)形式存在。根據(jù)本發(fā)明所述的應(yīng)用進(jìn)ー步的優(yōu)點在于，親水性聚合物的原料是可變的，所以一方面可以使用可商購的白蛋白，例如提純或重組制備的人白蛋白，另ー方面也能夠使用異源或自體血清。如上文所述，根據(jù)本發(fā)明所述的應(yīng)用以下述方式實現(xiàn)將基于血清白蛋白或血清蛋白的組合物注入待治療位置，在該處所述組合物聚合成為水凝膠形成材料，或者將已聚合的水凝膠形成材料直接植入。向患者植入之后，在一段確定的時間內(nèi)，交聯(lián)的白蛋白分解，在此過程中，例如存在于材料中的細(xì)胞原位發(fā)展為細(xì)胞周的基質(zhì)，并且因此構(gòu)造在所述環(huán)境中。同吋，抑制了內(nèi)皮細(xì)胞的粘連和増殖及因此觸發(fā)的基于材料的新血管形成。在此，根據(jù)本發(fā)明所述的應(yīng)用的一個實施方式設(shè)計為，聚合的水凝膠形成材料中的白蛋白濃度處于約5至約20特別是約10mg/ml材料。制造用于根據(jù)本發(fā)明所述應(yīng)用的組合物的范例方法，可在上文已述的DE 10 2008008 071. 3中找到，其內(nèi)容明確通過引用結(jié)合在此。根據(jù)本發(fā)明所述的ー個優(yōu)選的實施方式設(shè)計為，將例如活的哺乳動物細(xì)胞，特別是人類的活細(xì)胞，以及藥理學(xué)試劑，生物效應(yīng)試劑，或者其中的一種或多種或其混合物，與所述組合物/材料共同應(yīng)用。此處，哺乳動物細(xì)胞指任何從哺乳動物導(dǎo)出或源自哺乳動物的細(xì)胞，其中特別要提到人類和動物的細(xì)胞。這些細(xì)胞能夠例如選自無肌肉骨架細(xì)胞，特別是軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、纖維軟骨細(xì)胞、以及調(diào)節(jié)新陳代謝的腺細(xì)胞、島細(xì)胞(Inselzellen)、生成褪黑素的細(xì)胞、前體細(xì)胞以及干細(xì)胞、特別是間充質(zhì)干細(xì)胞，因此就是那些對組合物的各種使用或各種注入位置來說適合的和所期望的細(xì)胞。這些細(xì)胞能夠在組合物或聚合的水凝膠形成材料中存活，并且在吸收材料的同時發(fā)展新的組織。根據(jù)本發(fā)明所述的應(yīng)用還適合用于防止療法中的新血管形成，所述療法目的是原位生產(chǎn)激素，如胰島素、甲狀腺素或褪黑素。如果將產(chǎn)生這些或其它激素的細(xì)胞通過所述組合物或材料引入患者體內(nèi)的治療位置，它們產(chǎn)生各種激素并且將其釋放到環(huán)境中，而同時抑制新血管形成?？梢岳斫?，根據(jù)本發(fā)明所述的應(yīng)用也能夠與生物或藥物活性物質(zhì)共同起作用。“生物活性物質(zhì)或起生物學(xué)效果的物質(zhì)”和“藥物活性物質(zhì)或起藥物效果的物質(zhì)”在此應(yīng)當(dāng)表示每ー種天然的或合成的物質(zhì)，該物質(zhì)要么對細(xì)胞或組織能夠有生物或藥物的影響，要么能夠在細(xì)胞上或細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)。與此同時，這些影響能夠限制在特定的細(xì)胞和特定的條件下，而所述物質(zhì)并不失去其生物或藥物活性含義。與此同吋，已有的可用物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)并不局限于特定(化合物)類，而能夠包含任何天然和合成的物質(zhì)，所述物質(zhì)通過其天然性質(zhì)和/或以其改性形式對生物細(xì)胞產(chǎn)生任意影響。因此特別優(yōu)選的是，使用例如抗生素、消炎藥、新陳代謝激素、軟骨保護(hù)劑、基因治療劑、生長激素或分化和/或調(diào)節(jié)因子、免疫抑制劑、刺激免疫的物質(zhì)、一般的肽、蛋白質(zhì)、 核酸、有機(jī)活性物質(zhì)、透明質(zhì)酸、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性物質(zhì)、受體激動劑和受體拮抗劑、或它們的混合物，作為生物或藥物活性或效應(yīng)物質(zhì)。此外，可以使用胞外基質(zhì)的蛋白質(zhì)、細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)、以及一般的多糖、脂類、抗體、生長因子、糖、凝集素、碳水組合物、細(xì)胞因子、 DNA、RNA、siRNA、適配體、以及對結(jié)合和性能重要的片段、以及所謂的疾病修飾骨關(guān)節(jié)炎藥劑，或上述物質(zhì)的混合物。在此，全部物質(zhì)能夠被合成制造或由天然得到，或來自重組的源。 “疾病修飾骨關(guān)節(jié)炎藥劑”(DMOA)在此指一系列物質(zhì)，其目前作為藥物使用，特別是用于關(guān)節(jié)炎——其中也包括其它自身免疫疾病——以緩解疼痛和發(fā)炎，而其嚴(yán)格的起效機(jī)理至今尚未完全明確。大多數(shù)這種物質(zhì)含有葡糖胺和硫酸軟骨素的混合物。在根據(jù)本發(fā)明所述應(yīng)用的一個實施方式中特別優(yōu)選生物效應(yīng)物質(zhì)是透明質(zhì)酸，井且其在材料中的最終濃度為約1至約10mg/ml材料，特別是約％ig/ml材料。其它實例包括但不限于下列合成的或天然的或由其重組的源生長激素，包括人類生長激素和重組生長激素(rhGH)、牛生長激素、豬生長激素；生長激素釋放激素；干擾素，包括干擾素-α、-β和-Y ；白介素-1 ；白介素-2 ；胰島素；類胰島素生長因子，包括 IGF-I ；肝素；紅細(xì)胞生成素；促生長素抑制素；促生長素；蛋白酶抑制劑；促皮質(zhì)素；前列腺素；以及這些化合物的類似物、片段、模擬物或聚乙ニ醇(PEG)修飾的衍生物；或它們的組合?？梢岳斫猓话阏f來，所有目前使用原位從載體/基體中釋放出(藥)物的疾病療法領(lǐng)域?qū)Ρ景l(fā)明的應(yīng)用來講都是可行的，而使用的(藥)物或是使用的細(xì)胞依賴于當(dāng)時的治療情況，這對于專業(yè)技術(shù)人員而言每次都需要明確。在根據(jù)本發(fā)明所述應(yīng)用的一個實施方式中優(yōu)選的是，將血清白蛋白或血清蛋白用選自下列基團(tuán)中的基團(tuán)功能化馬來酰亞胺_、乙烯基磺基-、丙烯酸酷-、烷基鹵化物-、 1-氮雜環(huán)丙烯(Azirin)-、吡啶基-、硫代硝基苯甲酸基團(tuán)或芳基化基團(tuán)?！肮δ芑摹被蚬δ芑侵脯F(xiàn)有的每個——完成的——過程，在該過程中向聚合物——例如通過向聚合物添加基團(tuán)——提供其通常沒有的功能。通過用馬來酰亞胺基團(tuán)對聚合物功能化，可以在將其引入所述組合物/材料中時保證聚合物良好的交聯(lián)以及同時保證細(xì)胞的生存能力或物質(zhì)的生物功能性。在某些情況下，待引入組合物的細(xì)胞或物質(zhì)通過將與細(xì)胞/物質(zhì)交聯(lián)的功能化聚合物在組合物中進(jìn)行分散而引入。如上文所述，本發(fā)明還涉及所述組合物或材料在植入物覆層和表面改性方面的應(yīng)用，該植入物由與隨后由所述組合物聚合而成的材料不同的材料制成。這種覆層或改性提供了對由其它不具可比的兼容性的材料制成的植入物進(jìn)行涂覆的可能性，以使這些通常促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖且由此促進(jìn)血管生成的植入物成為非血管生成的。與此同時，對每個植入物加以考慮，特別是那些進(jìn)而本身基于水凝膠，但不基于所述組合物的植入物。這在下面的情況下更加特別有利，即有可能發(fā)生直接的化學(xué)成鍵化學(xué)，正如將應(yīng)用于聚合的材料那些。這允許在植入物材料上有ー層薄材料層的共價連接。如上文所述，本發(fā)明還涉及所述組合物或聚合的水凝膠形成材料的應(yīng)用，用于治療或預(yù)防與血管生成有關(guān)的疾病。這種措施的優(yōu)點是，所述疾病能夠通過根據(jù)本發(fā)明所述的應(yīng)用，通過抑制血管生成，得到減輕或甚至預(yù)防。ー份與血管生成有關(guān)的疾病的列表可在例如Carmeliet，〃 Angiogenesisin health and disease"，Nature Medicine (2003)，Vol. 9Nr. 6 :653-660 中找到，特別是在該文中列出的表1中找到，其中，列出了以過度血管生成為特征的疾病，例如包括癌癥、某些傳染病、自身免疫疾病、迪格奧爾格綜合征、動脈硬化、肥胖癥、銀屑病、卡波濟(jì)肉瘤、糖尿病視網(wǎng)膜病變、原發(fā)性肺高血壓、支氣管哮喘、腹膜粘連、子宮內(nèi)膜異位癥、關(guān)節(jié)炎、滑膜炎、骨贅形成、骨髄炎。其它的優(yōu)點由描述和附圖給出?？梢岳斫?，在不脫離本發(fā)明的范圍的情況下，目前所述及下文即將敘述的特征不僅能夠應(yīng)用于各個給出的組合，也還能應(yīng)用于其它的組合或単獨(dú)情況。本發(fā)明的實施例在附圖中示出，并在接下來的描述中詳細(xì)解釋。其中

圖1示出了在一種基于血清白蛋白的聚合的水凝膠形成材料(下文中也稱之為 “白蛋白凝膠”(AUximingel或Albugel))上的內(nèi)皮細(xì)胞粘連試驗的結(jié)果在白蛋白凝膠上的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)的示意圖(A) ；1天和5天之后在白蛋白凝膠上的內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量的定量圖 (B)；用鬼筆毒環(huán)肽染色的不同培養(yǎng)條件下的內(nèi)皮細(xì)胞(C)；圖2示出了在白蛋白凝膠上的內(nèi)皮細(xì)胞的活力的證據(jù)在白蛋白凝膠上的內(nèi)皮細(xì)胞的定量圖(A)；白蛋白凝膠的提取物對內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞毒害效果的研究圖(B)；用鈣黃緑素和DAPI染色的不同培養(yǎng)條件下的內(nèi)皮細(xì)胞(C，E，G，I)和使用DiI-Ac-LDL的照片(D，F(xiàn)，
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圖3示出了對在白蛋白凝膠上的內(nèi)皮細(xì)胞増殖的研究結(jié)果用DAPI和BrdU染色的不同培養(yǎng)條件下的內(nèi)皮細(xì)胞(A-D)；在白蛋白凝膠上的內(nèi)皮細(xì)胞増殖的定量圖(E)；圖4示出了對穿過白蛋白凝膠的內(nèi)皮細(xì)胞侵入的研究結(jié)果裝置示意圖㈧；通過白蛋白凝膠移動的內(nèi)皮細(xì)胞的定量圖(B)；趨化性指數(shù)分析圖(C)；化學(xué)侵入指數(shù)分析圖 (D)；孟加拉玫瑰紅染色的在Transwell過濾器下腔面上的內(nèi)皮細(xì)胞(E-L)；圖5示出了在白蛋白凝膠中的尿囊絨膜血管生長的研究結(jié)果胚胎內(nèi)(in ovo)植入物的照片(A，B)；帶有白蛋白凝膠的外植尿囊絨膜的照片(C，D) ；HE(蘇木精-曙紅)染色的帶有白蛋白凝膠的尿囊絨膜(E，F(xiàn))；接骨木花黑質(zhì)凝集素染色的帶有白蛋白凝膠的尿囊絨膜(G，H)；以及G和H的相差照片(I,J)；圖6示出了 Skid/nu小鼠背上皮下白蛋白凝膠的植入試驗結(jié)果帶有周邊小鼠組織的白蛋白凝膠的HE染色(A)；帶有周邊小鼠組織的白蛋白凝膠的接骨木花黑質(zhì)凝集素染色和DAPI染色⑶；以及圖7示出了在白蛋白凝膠上的無限増殖化的內(nèi)皮細(xì)胞的粘連試驗的結(jié)果用鬼筆毒環(huán)肽染色的不同培養(yǎng)條件下的內(nèi)皮細(xì)胞(A-F) ；1天之后白蛋白凝膠上的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量的定量圖(G)。實施例A)制備由馬來酰亞胺修飾的血清白蛋白將250mg人、家兔或羊的血清白蛋白(Sigma-Aldrich)溶于5ml IM的硼酸鈉(pH 8. 2)。向其加入75 μ 1的在PBS/硼酸鈉(pH 8.2)(1 1)中的260mM的N-馬來?；?β-丙氨酸(Sigma-Aldrich Kat. -Nr 63285)溶液，并在室溫培養(yǎng)90min。將106mg的3-馬來酰亞胺-丙酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯(SMP，Obiter Research, Urbana, IL, USA)溶于 950 μ 1 ニ甲基甲酰胺(DMF)中。將不能溶解的物質(zhì)通過離心法分離。將500μ1上層清液加入白蛋白溶液中，隨后將其在室溫培養(yǎng)60min。隨后向其中加入500μ1 3Μ乙酸鈉(pH 4. 7)，并且在冰上對1升PBS滲析三次。隨后將滲析液通過超濾(ΥΜ-3膜，Millipore)濃縮至體積為3. 5ml，過濾消毒并且在_80°C存放。如此功能化后的血清白蛋白/蛋白能夠通過加入SH-交聯(lián)劑進(jìn)行聚合。在此，特別考慮在兩端都帶有SH基團(tuán)的交聯(lián)劑雙硫代聚乙ニ醇。除了雙硫代-PEG，通?？紤]作為交聯(lián)劑的物質(zhì)為帶有SH-基團(tuán)的物質(zhì)，特別是聚合物，例如ニ硫代-PEG或SH修飾的葡聚糖、 SH修飾的聚乙烯醇、SH修飾的聚乙烯吡咯烷酮等等。雙硫代-PEG是商業(yè)可得的，使用摩爾質(zhì)量為10000 g/mol的交聯(lián)劑。如果摩爾質(zhì)量小于此值，它將減少凝膠形成，在更高的質(zhì)量吋，凝膠過快凝膠化，不能夠形成充分的物質(zhì)混合。當(dāng)交聯(lián)劑的SH基團(tuán)和白蛋白中的馬來酰亞胺基團(tuán)具有相同摩爾濃度吋，凝膠形成達(dá)到最優(yōu)。使用在凝膠中最終濃度各自為3mM的馬來酰亞胺和SH基團(tuán)。此外，羊白蛋白凝膠包含細(xì)g/ml在聚合前混合入其中并且因此從物理上講牢固地固定存在的高分子透明質(zhì)酸(在下文和附圖中也用“HS”表示/縮寫)。但是作為白蛋白來源，可使用多種動物和人的血清白蛋白。B)用于證明白蛋白凝膠的非血管生成性質(zhì)的試驗1.作為用于人內(nèi)皮細(xì)胞的基材的白蛋白凝膠的測試
a)為了研究白蛋白凝膠對內(nèi)皮細(xì)胞(‘ Ζ”)的效果，傳代3至9的初級人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC) (PromoCe 1, Heidelbergl)在凝膠中培養(yǎng)，隨后研究細(xì)胞的粘連、活力和増殖。為此，在48孔板上每個孔中聚合100 μ 1羊白蛋白凝膠，并將處于300 μ 1內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中的1. 5xl04HUVEC在凝膠上培養(yǎng)M小時或5天(試驗裝置見圖1A)。為了對照，在一個明膠化的(0. 5% )48孔板上培養(yǎng)相同數(shù)量的細(xì)胞，并且制備含附加0. 5%明膠(凝膠中的最終濃度)的白蛋白凝膠。同吋，在10mg/ml的Matrigel 上培養(yǎng)所述細(xì)胞，Matrigel 是ー種幾乎尚未定義的來自Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤的基底膜提取物，其在基礎(chǔ)研究中作為基底膜等價物。白蛋白凝膠的制備(在下文和附圖中縮寫/標(biāo)記為“AG”)
權(quán)利要求
1.ー種生物相容性組合物用于抑制和/或預(yù)防血管生成或內(nèi)皮細(xì)胞增殖的應(yīng)用，所述組合物可聚合為水凝膠形成材料并且所述組合物基于親水性聚合物，其特征在于所述親水性聚合物是可交聯(lián)的血清白蛋白或可交聯(lián)的血清蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于所述組合物具有下述中的至少ー種哺乳動物細(xì)胞、藥理學(xué)試劑、生物效應(yīng)試劑，或其中的ー項或多項或混合物。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求中任ー項所述的應(yīng)用，其特征在于所述血清白蛋白或血清蛋白通過選自馬來酰亞胺_、乙烯基磺基_、丙烯酸酯_、烷基鹵化物_、1-氮雜環(huán)丙烯_、吡啶基-、硫代硝基苯甲酸基團(tuán)、或芳基化基團(tuán)的基團(tuán)官能化。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任ー項所述的應(yīng)用，其特征在于所述血清白蛋白和血清蛋白是人血清白蛋白和人血清蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求2至4中任一項所述的應(yīng)用，其特征在干，所述起藥理學(xué)作用的試劑選自下述中的至少ー種抗生素、消炎藥、新陳代謝激素、軟骨保護(hù)劑、基因治療劑、生長激素、 分化或調(diào)節(jié)因子、免疫抑制劑、刺激免疫的物質(zhì)、DM0A、核酸、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性物質(zhì)、粘連調(diào)節(jié)活性物質(zhì)、受體激動劑和受體拮抗劑、或它們的混合物。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任ー項所述的應(yīng)用，其特征在于所述材料中的白蛋白濃度為約5至約15mg/ml材料，特別為約10mg/ml材料。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任ー項所述的應(yīng)用，其特征在于所述組合物以可注入的形式使用。
8.一種聚合的水凝膠形成材料用于抑制和/或預(yù)防血管生成或內(nèi)皮細(xì)胞增殖的應(yīng)用， 所述材料通過對基于血清白蛋白或血清蛋白的組合物的聚合獲得。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于將所述材料作為植入物安置。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的組合物或根據(jù)權(quán)利要求8所述的材料的應(yīng)用， 其特征在干，所述應(yīng)用用作植入物的表面層。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物相容性組合物的應(yīng)用，所述組合物能夠聚合為水凝膠形成材料并基于親水性聚合物，用于抑制和/或預(yù)防血管生成或內(nèi)皮細(xì)胞增殖，其中所述親水性聚合物是可交聯(lián)的血清白蛋白或可交聯(lián)的血清蛋白。本發(fā)明還涉及一種聚合的水凝膠形成材料用于抑制和/或預(yù)防血管生成或內(nèi)皮細(xì)胞增殖的用途，所述聚合的水凝膠形成材料通過將基于血清白蛋白或血清蛋白的組合物聚合而得到。
文檔編號A61K9/00GK102596182SQ201080048495
公開日2012年7月18日 申請日期2010年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月26日
發(fā)明者伊爾根·莫倫豪爾, 布克哈德·施羅斯豪爾, 比特·舒爾茨 申請人:蒂賓根大學(xué)Nmi自然科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究所