專利名稱：生產(chǎn)天然殺傷細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及獲得用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的高純度天然殺傷細(xì)胞群的方法。本申請(qǐng)要求基于于2009年9月11日提交的日本專利申請(qǐng)?zhí)?009-210178的優(yōu)先權(quán)，其完整內(nèi)容并入到本文中。
背景技術(shù)：
天然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)是在免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用的淋巴細(xì)胞。由于天然殺傷細(xì)胞具有多種功能，特別是具有強(qiáng)的殺傷腫瘤細(xì)胞的活性，因而認(rèn)為該細(xì)胞是免疫學(xué)監(jiān)督機(jī)制的重要成員，所述機(jī)制用于去除在活體內(nèi)已變得腫瘤性或正變得腫瘤性的異常細(xì)胞。因此，對(duì)于在腫瘤治療中有效利用該細(xì)胞已進(jìn)行了長(zhǎng)時(shí)間的研究。例如，當(dāng)向外周血單核細(xì)胞(PBMC)的培養(yǎng)基中添加大量的白介素(IL)_2 (—種淋巴因子)時(shí)，所謂的淋巴因子激活性殺傷淋巴細(xì)胞(LAK細(xì)胞)在人中增殖約一周。普遍已知LAK細(xì)胞包括許多NK細(xì)胞。在腫瘤的過繼性免疫療法中普遍使用LAK細(xì)胞。也已知LAK細(xì)胞在感染性疾病中有效，并作為治療難以用抗生素治愈的感染性疾病的對(duì)策引起注意。迄今為止，已報(bào)道了多種離體培養(yǎng)NK細(xì)胞的方法(例如，非專利文獻(xiàn)1)，其分為使用輔助細(xì)胞的方法和不使用輔助細(xì)胞的方法。不使用輔助細(xì)胞的方法是包括用IL-2或IL-15刺激PBMC的方法。然而，該方法通常導(dǎo)致低的細(xì)胞擴(kuò)增率(cell expansion rate)和培養(yǎng)后低的NK細(xì)胞含有率，因此，可能不能獲得根據(jù)PBMC供體的治療必需量的NK細(xì)胞。此外，已報(bào)道當(dāng)為了獲得大量的NK細(xì)胞而延長(zhǎng)培養(yǎng)期時(shí)，細(xì)胞毒性活性降低。另一方面，使用輔助細(xì)胞的方法是例如包括使用已經(jīng)受放射線的K562細(xì)胞(其為B淋巴細(xì)胞株)、Daudi細(xì)胞(其為惡性淋巴細(xì)胞株)或HFWT細(xì)胞(其為腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞株)的方法。此外，也已經(jīng)報(bào)道了這樣的方法，所述方法包括使用轉(zhuǎn)染了細(xì)胞因子表達(dá)基因的上述腫瘤細(xì)胞作為輔助細(xì)胞。然而，由于這些輔助細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞、異源細(xì)胞和基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，因而從向活體內(nèi)注射與輔助細(xì)胞混合培養(yǎng)的NK細(xì)胞的觀點(diǎn)出發(fā)，必需大量地注意來確保安全性。此外，也已經(jīng)報(bào)道了包括使用放射線照射的PBMC作為輔助細(xì)胞的方法(專利文獻(xiàn)1)。然而，該方法必需去除⑶3陽性細(xì)胞作為含有NK細(xì)胞的細(xì)胞群的步驟，并且還必需從供體制備大量的PBMC。在開始培養(yǎng)22天后，該方法的細(xì)胞擴(kuò)增率最大是約140倍。生物應(yīng)答修飾劑是調(diào)節(jié)活體的免疫機(jī)制的物質(zhì)，預(yù)期對(duì)多種疾病具有治療效果，且用于癌癥的免疫療法中。然而，已知所述試劑不活化淋巴細(xì)胞功能至預(yù)期的這種程度。出于該原因，在目前情況下，向需要活化淋巴細(xì)胞功能的患者直接施用所述試劑以活化該功能的這種治療一般不進(jìn)行，并且僅用于有限的情況。生物應(yīng)答修飾劑的作用機(jī)制不包括對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接作用，并且認(rèn)為生物應(yīng)答修飾劑活化施用該試劑的活體固有的免疫細(xì)胞，并通過免疫細(xì)胞的作用施加抗腫瘤效果。因此，施用生物應(yīng)答修飾劑的效果受接受生物應(yīng)答修飾劑施用的活體的天然免疫學(xué)狀態(tài)的極大影響，并受活體的背景因子的影響。因而，認(rèn)為通常存在個(gè)體之間的抗腫瘤效果差異以及取決于患者的臨床狀態(tài)的作用強(qiáng)度差異。引用列表專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn) 1 :W02007/103901
非專利文獻(xiàn)
非專利文獻(xiàn) 1 :Cho D 和 Campana D, Korean J Lab ]^(1，2009，第四卷，第 89-96 頁。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題
對(duì)于預(yù)期具有高治療效果的NK細(xì)胞，在目前的情況下尚未建立有效獲得高純度NK細(xì)胞的方法。因此，需要開發(fā)其他的細(xì)胞增殖方法用于制備NK細(xì)胞。解決問題的手段
本發(fā)明人持續(xù)地深入研究各種培養(yǎng)條件，特別是淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)(expansionculture)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了有效擴(kuò)增培養(yǎng)NK細(xì)胞的方法。因而完成了本發(fā)明。換言之，本發(fā)明涉及用于制備含有天然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞群的方法，包括在存在生物應(yīng)答修飾劑和已經(jīng)受消除增殖能力處理的細(xì)胞的情況下，擴(kuò)增培養(yǎng)含有天然殺傷細(xì)胞和/或能夠分化成天然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞的細(xì)胞群的步驟，根據(jù)[1]的方法，其中生物應(yīng)答修飾劑是細(xì)菌來源的制劑，根據(jù)[2]的方法，其中生物應(yīng)答修飾劑是選自0K-432、BCG、化膿性鏈球菌(Streptcoccus pyogenes)、短棒桿菌(Corynebacterium parvum)及其細(xì)胞壁骨架白勺細(xì)菌來源的制劑，根據(jù)[1]_[3]的任一項(xiàng)的方法，其中已經(jīng)受消除增殖能力處理的細(xì)胞是選自已經(jīng)受消除增殖能力處理的外周血單核細(xì)胞、T細(xì)胞、T細(xì)胞子集和B細(xì)胞的細(xì)胞，根據(jù)W]的方法，其中已經(jīng)受消除增殖能力處理的細(xì)胞是已經(jīng)受消除增殖能力處理的人工擴(kuò)增培養(yǎng)的T細(xì)胞，根據(jù)[1]_[5]的任一項(xiàng)的方法，其中已經(jīng)受消除增殖能力處理的細(xì)胞是源自與天然殺傷細(xì)胞或者能夠分化成天然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞相同的個(gè)體的細(xì)胞，根據(jù)[1]_[6]的任一項(xiàng)的方法，其中在存在已經(jīng)受消除增殖能力處理的細(xì)胞的情況下擴(kuò)增培養(yǎng)的步驟包括實(shí)施多次的細(xì)胞添加，根據(jù)[1]_[6]的任一項(xiàng)的方法，其中外周血單核細(xì)胞用作天然殺傷細(xì)胞和/或能夠分化成天然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞，通過根據(jù)[1]_[8]的任一項(xiàng)的方法獲得的細(xì)胞群，含有從根據(jù)[9]的細(xì)胞群分離的NK細(xì)胞的細(xì)胞亞群，含有根據(jù)[9]的細(xì)胞群和/或根據(jù)[10]的細(xì)胞亞群的藥物，根據(jù)[9]的細(xì)胞群和/或根據(jù)[10]的細(xì)胞亞群在生產(chǎn)藥物中的用途，治療或預(yù)防疾病的方法，包括向受試者施用有效量的根據(jù)[9]的細(xì)胞群和/或根據(jù)[10]的細(xì)胞亞群的步驟，用于制備含有天然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞群和/或細(xì)胞亞群的方法，包括冷凍根據(jù)[9]的細(xì)胞群和/或根據(jù)[10]的細(xì)胞亞群、解凍冷凍的細(xì)胞群和/或細(xì)胞亞群、然后在存在細(xì)胞因子的情況下培養(yǎng)細(xì)胞群和/或細(xì)胞亞群的步驟，和用于制備含有天然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞群的方法，包括在存在生物應(yīng)答修飾劑的情況下，擴(kuò)增培養(yǎng)含有天然殺傷細(xì)胞和/或能夠分化成天然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞的分離的和/或純化的細(xì)胞群的步驟。發(fā)明的效果
根據(jù)本發(fā)明，提供了用于制備NK細(xì)胞的新方法。由于本發(fā)明的方法可以提供具有高的細(xì)胞增殖率和強(qiáng)的細(xì)胞毒性活性的細(xì)胞，本發(fā)明獲得的NK細(xì)胞可以優(yōu)選用于例如過繼性免疫療法。因此，預(yù)期本發(fā)明的方法大大有助于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
具體實(shí)施例方式
如本文中使用的，“NK細(xì)胞”意指含有大顆粒淋巴細(xì)胞的細(xì)胞群，所述大顆粒淋巴細(xì)胞在沒有抗原敏化的情況下非MHC限制性地?fù)p傷腫瘤細(xì)胞和感染病毒的細(xì)胞，并用于維持活體的穩(wěn)態(tài)。NK細(xì)胞的代表性表面標(biāo)志物已知⑶56、⑶94和⑶16。此外，NK細(xì)胞是⑶3陰性的。如本文中使用的，“外周血單核細(xì)胞(PBMC)”意指包含源自外周血的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的細(xì)胞群，并包括T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞。如本文中使用的，“具有源自纖連蛋白的氨基酸序列的多肽”意指在分子中含有源自纖連蛋白的氨基酸序列或其一部分的多肽，并且其實(shí)例包括纖連蛋白或纖連蛋白的片段。纖連蛋白或纖連蛋白的片段可以是天然來源的分離多肽、人工合成多肽或通過遺傳工程制備的重組多肽中的任一種。纖連蛋白可以從天然存在的物質(zhì)中以基本純的形式制備，例如基于Ruoslahti E.等人，J. Biol. Chem. , vol. 256,No. 14，第7277_7沘1 頁(1981)的公開內(nèi)容。在本文中，用于本發(fā)明中的纖連蛋白或具有源自纖連蛋白的氨基酸序列的多肽基本不含自然界中與纖連蛋白共存的其他蛋白質(zhì)。上述多肽在本發(fā)明中可以單獨(dú)使用或作為多種的混合物使用。此外，有許多纖連蛋白的已知剪切變體。本發(fā)明中使用的多肽可以是具有源自任何變體的氨基酸序列的多肽，只要它產(chǎn)生本發(fā)明所需的效果。例如，在源于血漿的纖連蛋白的情況下，已知缺失了在細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域上游存在的被稱為ED-B的區(qū)域，和在細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域與肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間存在的被稱為ED-A的區(qū)域。具有此類血漿來源的纖連蛋白的氨基酸序列的多肽也可用于本發(fā)明中。關(guān)于可用于本發(fā)明中的纖連蛋白片段和片段制備的有用信息可自J. Biochem.，vol. 110, p. 284-291 (1991)、EMBO J. , vol. 4, No. 7, p. 1755-1759 (1985)、Biochemistry, vol. 25, No. 17, p. 4936-4941 (1986)、W02007/142300 等獲得。此外，編碼纖連蛋白的核酸序列和纖連蛋白的氨基酸序列公開在Genbank登錄號(hào)NM002(^6和NP002017 中。纖連蛋白的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)分為7個(gè)結(jié)構(gòu)域。纖連蛋白的氨基酸序列含有三種相似的序列，且其整體由每種這些序列的重復(fù)構(gòu)成。三種相似序列分別被稱為I型、II型和III型。其中，III型由71至96個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，且這些氨基酸殘基的匹配率是17%至40%。纖連蛋白中有14個(gè)III型序列，其中，第8、第9和第10個(gè)序列(在后文中，分別被稱為111-8、111-9和III-10)包含在細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域中，且第12、第13和第14個(gè)序列(在后文中，分別被稱為111-12、111-13和111-14)包含在肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域中。此外，被稱為IIICS的區(qū)域存在于肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的C端側(cè)。在IIICS中，存在被稱為CS-I的區(qū)域，該區(qū)域由25個(gè)氨基酸殘基組成，且具有結(jié)合VLA-4的活性。可用于本發(fā)明中的纖連蛋白片段可以是包括III-7、8、9、11、12、13或CS-I的任何結(jié)構(gòu)域的片段，或進(jìn)一步地，可以是其中重復(fù)連接了復(fù)
5數(shù)個(gè)結(jié)構(gòu)域的片段?？捎糜诒景l(fā)明中的纖連蛋白片段的實(shí)例包括含有細(xì)胞粘附結(jié)構(gòu)域、肝素結(jié)構(gòu)域或作為VLA-4的配體的CS-I結(jié)構(gòu)域的片段，所述細(xì)胞粘附結(jié)構(gòu)域包括VLA-5的配體。片段的實(shí)例包括在J. Biochem.，第110卷，第觀4-291頁(1991)中描述的CH-271、CH-296.H-271和H496，及其衍生物或修飾物。CH-296是以名稱RetroNectin (注冊(cè)商標(biāo))可商購(gòu)的。在本文中，“生物應(yīng)答修飾劑”也被稱為生物學(xué)應(yīng)答修飾劑(BRM)，意指一類改善活體內(nèi)的非特異性免疫學(xué)應(yīng)答能力的物質(zhì)。作為生物應(yīng)答修飾劑，已知細(xì)菌來源的制劑(0K-432、BCG (卡介苗)、化膿鏈球菌、短棒桿菌及其細(xì)胞壁骨架)、擔(dān)子菌來源的多糖(香菇多糖、裂裥菌素、PSK等)、合成物質(zhì)(吡喃共聚物、左旋咪唑)和細(xì)胞因子?！?K-432”意指通過用青霉素處理A類3型溶血性化膿鏈球菌的減毒天然突變菌株(Su菌株)而獲得的細(xì)菌來源的制劑的一般名稱。該制劑以Picibanil (注冊(cè)商標(biāo))作為商標(biāo)名銷售。本發(fā)明具體說明如下。如本文中使用的，“消除增殖能力的處理”沒有特別的限制，只要所述處理使細(xì)胞喪失或降低其增殖能力。處理的實(shí)例包括化學(xué)處理和/或物理處理?；瘜W(xué)處理的實(shí)例包括用化學(xué)藥物(福爾馬林等)處理和用抗癌劑(有絲分裂抑制劑，例如絲裂霉素C等)處理。物理處理的實(shí)例包括放射處理、溫和加熱(加熱/加溫)處理、冷凍/解凍處理或超聲處理。例如，當(dāng)通過放射實(shí)施處理時(shí)，可以使用例如Y射線和X射線。由于已經(jīng)受消除增殖能力的處理的細(xì)胞喪失或降低了涉及增殖的能力，例如細(xì)胞分裂和DNA合成，因而相比未處理過細(xì)胞，細(xì)胞的增殖能力是降低的。例如，雖然已經(jīng)受放射處理的細(xì)胞降低了增殖能力，但細(xì)胞表現(xiàn)出與剛處理過的活細(xì)胞相同的形式和特征，并維持分泌例如細(xì)胞因子等蛋白質(zhì)的代謝能力。1、制備NK細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的制備NK細(xì)胞的方法包括在存在生物應(yīng)答修飾劑和已經(jīng)受消除增殖能力處理的細(xì)胞的情況下，擴(kuò)增培養(yǎng)含有NK細(xì)胞和/或能夠分化成NK細(xì)胞的細(xì)胞的細(xì)胞群的步驟。根據(jù)本發(fā)明的制備NK細(xì)胞的方法，相比常規(guī)的方法，可以穩(wěn)定地制備具有極高擴(kuò)增培養(yǎng)率、極高NK細(xì)胞含有率和極高的NK細(xì)胞細(xì)胞毒性活性的細(xì)胞群。在本文中，擴(kuò)增培養(yǎng)率意指相對(duì)于培養(yǎng)開始的時(shí)間的增殖率，并且該倍率是通過用培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的細(xì)胞數(shù)除以培養(yǎng)開始時(shí)的細(xì)胞數(shù)、然后用所獲得的值除以傳代培養(yǎng)時(shí)使用的細(xì)胞數(shù)的比率來計(jì)算的。本發(fā)明方法的一個(gè)特征是使用已經(jīng)受消除增殖能力處理的細(xì)胞。已經(jīng)受消除增殖能力處理的細(xì)胞沒有特殊的限制。在本發(fā)明的優(yōu)選的方面，使用PBMC、T細(xì)胞、T細(xì)胞子集(例如，⑶4陰性T細(xì)胞、⑶8陽性T細(xì)胞等)、B細(xì)胞或通過培養(yǎng)這些細(xì)胞制備的細(xì)胞群。制備PBMC的方法沒有特殊的限制?？梢詮难夯蜓?xì)胞組分制備PBMC，所述血細(xì)胞組分是通過分離來自血液的血漿獲得的，其通過已知的方法例如密度梯度離心法進(jìn)行?？梢酝ㄟ^已知的方法，從PBMC或另一種生物學(xué)樣品(外周血、骨髓液、臍帶血等)中分離B細(xì)胞、T細(xì)胞或T細(xì)胞子集。此外，通過培養(yǎng)上述細(xì)胞而增加細(xì)胞數(shù)所獲得的細(xì)胞群也可用于本發(fā)明中。例如，還使用通過擴(kuò)增培養(yǎng)含有T細(xì)胞或T細(xì)胞前體細(xì)胞的細(xì)胞群獲得的T細(xì)胞群。在T細(xì)胞群配制中，通過共存具有源自纖連蛋白的氨基酸序列的多肽，改善了 T細(xì)胞的增殖效率。換言之，可以從少量的材料(血液或PBMC)中獲得大量的T細(xì)胞。如下實(shí)施在存在具有源自纖連蛋白的氨基酸序列的多肽的情況下T細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)。在存在具有源自纖連蛋白的氨基酸序列的多肽的情況下培養(yǎng)的細(xì)胞群可以是含有T細(xì)胞或T細(xì)胞的前體細(xì)胞的細(xì)胞群，并可以使用體液，例如外周血、骨髓液、臍帶血和淋巴液?？蛇x地，可以使用從這些體液或各種身體部分或器官分離的細(xì)胞群，例如PBMC、T細(xì)胞、T細(xì)胞子集或其混合物。在制備用于治療目的移植到活體中的NK細(xì)胞中，這些細(xì)胞或細(xì)胞群可以源自相同的個(gè)體，即，與后文所述的“NK細(xì)胞和/或能夠分化成NK細(xì)胞的細(xì)胞”相同的供體。特別優(yōu)選地，期望“NK細(xì)胞和/或能夠分化成NK細(xì)胞的細(xì)胞”和“已經(jīng)受消除增殖能力處理的細(xì)胞”都源自患者本身。在存在具有源自纖連蛋白的氨基酸序列的多肽的情況下細(xì)胞群的培養(yǎng)可以參考WO 03/080817的詳細(xì)描述來實(shí)施。當(dāng)在存在具有源自纖連蛋白的氨基酸序列的多肽的情況下培養(yǎng)細(xì)胞群時(shí)，擴(kuò)增培養(yǎng)率變得極高，且可以容易地制備大量的細(xì)胞。用于T細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)的培養(yǎng)開始時(shí)的細(xì)胞濃度是例如1-1 X IO8細(xì)胞/mL，優(yōu)選10-5 X IO7細(xì)胞/mL，更優(yōu)選1 X 102_2 X IO7細(xì)胞/mL，但并非特別限制于此。用于T細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)的培養(yǎng)基可以是用于細(xì)胞培養(yǎng)的已知培養(yǎng)基，且培養(yǎng)基可進(jìn)一步含有各種細(xì)胞因子、合適的蛋白質(zhì)或其他組分。細(xì)胞因子的實(shí)例包括IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IFN-Y等。優(yōu)選地，使用含有IL-2的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中的IL-2的濃度沒有特殊的限制，且培養(yǎng)基可優(yōu)選含有0. 01-1 X IO5 U/mL,更優(yōu)選1_1 X IO4 U/mL的IL-2。合適的蛋白質(zhì)的實(shí)例包括抗CD3抗體和抗IL-4抗體。用于本發(fā)明的抗CD3抗體的實(shí)例包括但不限于優(yōu)選地抗人CD3單克隆抗體，更優(yōu)選0KT3(Science, 1979，第206卷，第347-349頁)。還可以向培養(yǎng)基中添加淋巴細(xì)胞刺激因子，例如凝集素等。此外，可以使用包括下列的培養(yǎng)基基于雙聚羧酸乙基次膦酸(bisphosphinic acid)的化合物例如帕米膦酸(pamidronate)或唑來膦酸(zoledronate)、基于焦磷酸單酯的化合物例如異戊烯焦磷酸或2_甲基_3_ 丁烯基-1-焦磷酸、磷酸鹵代醇、磷酸環(huán)氧化物等。培養(yǎng)基中的組分濃度沒有特別的限制，只要獲得所需的效果。此外，還可以向培養(yǎng)基中添加血清或血漿。添加到培養(yǎng)基中的血清或血漿的量沒有特殊的限制，為按體積計(jì)大于O至20%，優(yōu)選大于按體積計(jì)0至10%。例如，可以使用自體來源的血清或血漿。用于培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)儀器沒有特殊的限制，可以使用例如培養(yǎng)皿、搖瓶、袋子、生物反應(yīng)器等。袋子可以使用例如可滲透CO2氣體的袋子用于細(xì)胞培養(yǎng)。當(dāng)工業(yè)制備大量的淋巴細(xì)胞時(shí)，使用生物反應(yīng)器是有利的。盡管培養(yǎng)可以在開放系統(tǒng)或密閉系統(tǒng)的任一中進(jìn)行，從得到的淋巴細(xì)胞的安全性的觀點(diǎn)看來，優(yōu)選在密閉系統(tǒng)中進(jìn)行培養(yǎng)?？梢栽谝阎呐囵B(yǎng)條件下實(shí)施培養(yǎng)，并且可以應(yīng)用在正常細(xì)胞培養(yǎng)中使用的條件。例如可以在37°C、5% CO2等的條件下實(shí)施培養(yǎng)。可以通過在合適的時(shí)間間隔下向細(xì)胞培養(yǎng)液中添加新鮮的培養(yǎng)基來稀釋細(xì)胞，培養(yǎng)基可以用新鮮的培養(yǎng)基交換，或者可以更換細(xì)胞培養(yǎng)儀器。如下文所述，根據(jù)制備的淋巴細(xì)胞的種類，可以恰當(dāng)?shù)剡x擇所使用的培養(yǎng)基、同時(shí)使用的其他組分等。培養(yǎng)期是例如1至40天，優(yōu)選2至35天，更優(yōu)選3至30天，從實(shí)現(xiàn)更高的擴(kuò)增培養(yǎng)率的觀點(diǎn)出發(fā)，3至25天的培養(yǎng)期是優(yōu)選的。用于培養(yǎng)中的包括具有源自纖連蛋白的氨基酸序列的多肽的組分可以溶解并存在于培養(yǎng)基中，或者可以固定在合適的固相上，例如用于細(xì)胞培養(yǎng)的載體，如細(xì)胞培養(yǎng)儀器、珠子、膜或載玻片。例如，可以根據(jù)WO 97/18318描述的方法實(shí)施抗CD3抗體的固定，并且可以根據(jù)WO 00/09168描述的方法實(shí)施具有源自纖連蛋白的氨基酸序列的多肽的固定。對(duì)于消除增殖能力的處理，可以使用抗癌劑，例如絲裂霉素C。用于抗癌劑處理的條件沒有特殊的限制，只要受處理細(xì)胞的增殖能力喪失或降低。絲裂霉素C的濃度是例如1至100 μ g/mL,優(yōu)選2至50 μ g/mL,合適的是5至30 μ g/mL。處理溫度是例如30至40°C，優(yōu)選35°C至38°C。處理溫度是例如0. 1至2小時(shí)，優(yōu)選0. 5至1小時(shí)。當(dāng)通過放射線(例如Y-射線或X-射線)照射實(shí)施消除增殖能力的處理時(shí)，放射線的照射量沒有特殊的限制，只要受照射的細(xì)胞的增殖能力喪失，例如，所述量是100至20000R (0. 88 至 176 Gy)，優(yōu)選 1000 至 8000 R (8. 8 至 70 Gy)。當(dāng)消除增殖能力的處理是通過溫?zé)崽幚韺?shí)施時(shí)，處理溫度和處理時(shí)間沒有特殊的限制，只要細(xì)胞的增殖能力喪失。處理溫度是例如40至55°C，優(yōu)選42至50°C，處理時(shí)間是例如0. 1至8小時(shí)，優(yōu)選0. 2至4小時(shí)。在培養(yǎng)含有NK細(xì)胞和/或能夠分化成NK細(xì)胞的細(xì)胞的細(xì)胞群中，已經(jīng)受消除增殖能力處理的細(xì)胞的細(xì)胞濃度沒有特殊的限制，是例如1至1 X IO8細(xì)胞/mL，優(yōu)選1 X IO1至5 X IO7細(xì)胞/mL，更優(yōu)選1 X IO2至2 X IO7細(xì)胞/mL。本發(fā)明的方法的特征是，在存在生物應(yīng)答修飾劑和已經(jīng)受消除增殖能力處理的細(xì)胞的情況下，擴(kuò)增培養(yǎng)含有NK細(xì)胞和/或能夠分化成NK細(xì)胞的細(xì)胞的細(xì)胞群。在本發(fā)明中，使用含有NK細(xì)胞和/或能夠分化成NK細(xì)胞的細(xì)胞的細(xì)胞群。在本文中，能夠分化成NK細(xì)胞的細(xì)胞沒有特殊的限制，只要細(xì)胞具有分化成NK細(xì)胞的能力。作為細(xì)胞群，本發(fā)明中可以使用體液，例如外周血、骨髓液、臍帶血或淋巴液，或者從體液、或各個(gè)機(jī)體部分或器官分離的細(xì)胞群(例如，PBMC、臍帶血單核細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、造血干細(xì)胞等)。作為細(xì)胞或細(xì)胞群，可以直接使用或在冷凍保藏后使用從活體收集的細(xì)胞或細(xì)胞群。此外，本發(fā)明中還可以使用通過各種衍生操作或分離操作從該細(xì)胞群中獲得的細(xì)胞群，例如基于特定的細(xì)胞表面標(biāo)志物從細(xì)胞例如PBMC中分離的細(xì)胞子集，例如分離的NK細(xì)胞群或去除了 CD3陽性細(xì)胞的細(xì)胞群。此外，本發(fā)明中可使用純化的NK細(xì)胞群或NK細(xì)胞株。本發(fā)明方法的特征是，例如，即使當(dāng)從具有低含量NK細(xì)胞的PBMC直接開始培養(yǎng)時(shí)，也可以有效獲得具有高的NK細(xì)胞含量和具有強(qiáng)的細(xì)胞毒性活性的細(xì)胞群。在本發(fā)明的方法中，含有NK細(xì)胞和/或能夠分化成NK細(xì)胞的細(xì)胞的細(xì)胞群的培養(yǎng)期是例如3至40天，優(yōu)選5至35天，更優(yōu)選10至30天，從實(shí)現(xiàn)更高的擴(kuò)增培養(yǎng)率的觀點(diǎn)出發(fā)，14至25天的培養(yǎng)期是優(yōu)選的。在含有NK細(xì)胞和/或能夠分化成NK細(xì)胞的細(xì)胞的細(xì)胞群的培養(yǎng)中，NK細(xì)胞和/或能夠分化成NK細(xì)胞的細(xì)胞的濃度沒有特殊的限制，是例如1至1 X IO8細(xì)胞/mL，優(yōu)選1 X IO1至5X IO7細(xì)胞/mL，更優(yōu)選1 X IO2至2X IO7細(xì)胞/mL。含有NK細(xì)胞和/或能夠分化成NK細(xì)胞的細(xì)胞的細(xì)胞群的細(xì)胞數(shù)與已經(jīng)受消除增殖能力處理的細(xì)胞群的細(xì)胞數(shù)的比例沒有特殊的限制，是例如1:0. 1至20，優(yōu)選1:1至10。在開始培養(yǎng)含有NK細(xì)胞和/或能夠分化成NK細(xì)胞的細(xì)胞的細(xì)胞群時(shí)，向培養(yǎng)基中添加已經(jīng)受消除增殖能力處理的細(xì)胞群。此外，除開始培養(yǎng)時(shí)以外，通過一次或多次(例如在培養(yǎng)過程中1次、2次或3次)添加已經(jīng)受消除增殖能力處理的細(xì)胞群，刺激含有NK細(xì)胞和/或能夠分化成NK細(xì)胞的細(xì)胞的細(xì)胞群，從而可進(jìn)一步改善擴(kuò)增培養(yǎng)率。在沒有特殊
8限制的情況下，例如，在開始培養(yǎng)含有NK細(xì)胞和/或能夠分化成NK細(xì)胞的細(xì)胞的細(xì)胞群后第5至第9天之間的優(yōu)選時(shí)間和/或在第11至第15天之間的優(yōu)選時(shí)間，可以再次添加已經(jīng)受消除增殖能力處理的細(xì)胞?？梢酝ㄟ^合適的方法冷凍保存已經(jīng)受消除增殖能力處理的細(xì)胞群，直到使用為止。作為本發(fā)明方法的另一個(gè)特征的生物應(yīng)答修飾劑沒有特殊的限制，只要其具有所需的NK細(xì)胞增殖誘導(dǎo)活性。在優(yōu)選的方面，用于本發(fā)明中的生物應(yīng)答修飾劑可以是微生物來源的制劑，特別優(yōu)選地，使用0K-432、BCG、化膿性鏈球菌(Sti^ptcoccus pyogenes)、短棒桿菌(Corynebacterium parvum)或其細(xì)胞壁骨架。添加到培養(yǎng)基中的生物應(yīng)答修飾劑的量沒有特殊的限制，其可以根據(jù)進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)的細(xì)胞的使用量和共同應(yīng)用的已經(jīng)受消除增殖能力處理的細(xì)胞群的量來恰當(dāng)選擇。當(dāng)使用0K-432時(shí)，以終濃度0. 001至1 KE/mL、優(yōu)選0. 005至0. 5 KE/mL、更優(yōu)選0. 01至0. 2KE/mL將0K-432添加到培養(yǎng)基中，本發(fā)明中沒有特殊的限制。一般地，生物應(yīng)答修飾劑可以在培養(yǎng)開始時(shí)添加到培養(yǎng)基中。除了使用生物應(yīng)答修飾劑和已經(jīng)受消除增殖能力處理的細(xì)胞外，用于本發(fā)明方法中的培養(yǎng)基沒有特殊的限制?？梢允褂靡阎m合培養(yǎng)淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)基。例如，可以使用用于 NK 細(xì)胞的可商購(gòu)的培養(yǎng)基(CellGenix 的 CellGro SCGM, TAKARA BIO INC.的 GT-T50等)。除本發(fā)明的活性組分外，培養(yǎng)基可含有合適的蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子或其他組分。優(yōu)選地，含有IL-2的培養(yǎng)基用于本發(fā)明中。培養(yǎng)基中的IL-2的濃度沒有特殊的限制，是例如0. 01至 1 X IO5 U/mL,優(yōu)選 0. 1 至 1 X IO4 U/mL。培養(yǎng)基中可以添加血清或血漿。他們向培養(yǎng)基中添加的量沒有特殊的限制，其按體積計(jì)大于0至20%，優(yōu)選按體積計(jì)大于0至5%。當(dāng)含有NK細(xì)胞的制備細(xì)胞群或從該細(xì)胞群分離的細(xì)胞亞群轉(zhuǎn)移到活體中時(shí)，優(yōu)選使用與NK細(xì)胞和/或能夠分化成NK細(xì)胞的細(xì)胞具有相同來源(換言之，來自相同的個(gè)體)的血清或血漿。此外，可以向培養(yǎng)基中添加血液來源的蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白。在此情況下，優(yōu)選使用分離的血液來源的蛋白質(zhì)，即，基本不含其它源自血液的組分的血液來源的蛋白質(zhì)。還可以使用可獲得的重組的血液來源的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明方法的培養(yǎng)過程中，可以按合適的時(shí)間間隔或根據(jù)細(xì)胞數(shù)的增加實(shí)施細(xì)胞培養(yǎng)液的稀釋、培養(yǎng)基的交換或細(xì)胞培養(yǎng)儀器的更換。此外，還可以根據(jù)培養(yǎng)NK細(xì)胞或LAK細(xì)胞的一般條件，實(shí)施本發(fā)明的方法。例如，該方法可以根據(jù) Klin Padiatr，2005，第 217 卷，第 345-350 頁 Journal of ExperimentalMedicine, 1982, 第 155 卷’ 第 1823-1841 頁；Current Protocols in Immunology,Supplement 17，UNIT 7.7。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于制備含有天然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞群的方法，特征是包括在存在生物應(yīng)答修飾劑的情況下，擴(kuò)增培養(yǎng)含有天然殺傷細(xì)胞和/或能夠分化成天然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞的分離的和/或純化的細(xì)胞群的步驟。例如，提供了用于制備含有天然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞群的方法，包括在存在0K-432的情況下培養(yǎng)純化的CD3陰性CD56陽性細(xì)胞。在該方法中，通過在存在已經(jīng)受消除增殖能力處理的細(xì)胞的情況下培養(yǎng)細(xì)胞群，改善含有天然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞群的擴(kuò)增培養(yǎng)率。2、通過本發(fā)明的方法獲得的含有NK細(xì)胞的細(xì)胞群、含有細(xì)胞群的藥物、細(xì)胞群的用途、和使用細(xì)胞群的治療方法或預(yù)防方法
此外，本發(fā)明提供了通過用于制備本發(fā)明的NK細(xì)胞的方法獲得的含有NK細(xì)胞的細(xì)胞群，和從該細(xì)胞群分離的細(xì)胞亞群。此外，本發(fā)明提供了含有細(xì)胞群和/或細(xì)胞亞群作為活性成分的藥物(治療劑);細(xì)胞群和/或細(xì)胞亞群用于生產(chǎn)藥物的用途；以及治療或預(yù)防疾病的方法，包括向受試者施用有效量的細(xì)胞群和/或細(xì)胞亞群的步驟。相比通過常規(guī)方法獲得的細(xì)胞群，通過本發(fā)明的方法獲得的含有NK細(xì)胞的細(xì)胞群和/或細(xì)胞亞群(在下文中，簡(jiǎn)單稱為本發(fā)明的細(xì)胞群)具有極高的NK細(xì)胞含量，極高的細(xì)胞毒性活性，包括抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)，和極高的多功能能力。特別是在本發(fā)明的細(xì)胞群中，CD3陰性(NK細(xì)胞表面標(biāo)志物)CD56陽性(NK細(xì)胞表面標(biāo)志物)細(xì)胞占至少50%或更多。本發(fā)明的細(xì)胞群含有高比例的具有高細(xì)胞毒性活性的CD16陽性CD56 陽性細(xì)胞。⑶16陽性⑶56陽性細(xì)胞占細(xì)胞群的至少50%，優(yōu)選60%或更多，更優(yōu)選70%或更多。此外，本發(fā)明的細(xì)胞群含有高比例的CD94和CD56陽性的細(xì)胞，所述細(xì)胞是成熟的NK 細(xì)胞。⑶94陽性⑶56陽性細(xì)胞占細(xì)胞群的至少50%，優(yōu)選60%或更多，更優(yōu)選70%或更多。 本發(fā)明的細(xì)胞群是高度功能化的NK細(xì)胞群，含有高比例的表達(dá)下列的細(xì)胞被認(rèn)為涉及NK 細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性的NKp44和NKG2D，NK細(xì)胞常見的表面抗原標(biāo)志物NKp46，在活化的NK 細(xì)胞中表達(dá)的⑶25，涉及淋巴細(xì)胞歸巢的⑶62L，也已知作為活化誘導(dǎo)分子(AIM)、在白細(xì)胞活化初期階段表達(dá)并涉及NK細(xì)胞中的靶向細(xì)胞溶解作用的CD69，或者是趨化因子CXCL9 和CXCLlO的配體并被認(rèn)為表現(xiàn)出向表達(dá)這些趨化因子的癌細(xì)胞遷移或在癌細(xì)胞中積累的高能力的CXCR3。NK細(xì)胞的多功能能力一般允許生產(chǎn)細(xì)胞因子例如干擾素(IFN) - γ或腫瘤壞死因子(TNF) - α，或通過細(xì)胞表面抗原例如CD107a評(píng)估細(xì)胞群的免疫應(yīng)答。含有通過本發(fā)明制備的NK細(xì)胞的細(xì)胞群含有高比例的生產(chǎn)多數(shù)細(xì)胞因子或者表現(xiàn)出多種細(xì)胞表面抗原的細(xì)胞，并且在細(xì)胞免疫療法中作為具有多功能能力的多功能細(xì)胞群非常有效?？梢酝ㄟ^本發(fā)明的細(xì)胞群與合適的細(xì)胞因子例如干擾素α (IFN-α)的共存來增強(qiáng)本發(fā)明的細(xì)胞群的細(xì)胞毒性。此類處理的細(xì)胞群可以對(duì)多種癌細(xì)胞施加細(xì)胞毒性?？梢詫⒒蜣D(zhuǎn)移到本發(fā)明的細(xì)胞群中。例如，可以導(dǎo)入編碼對(duì)靶物質(zhì)具有親和力的蛋白質(zhì)(例如，T細(xì)胞受體(TCR)、抗體、受體等)、細(xì)胞表面抗原、酶、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子(例如， 細(xì)胞因子)、其功能結(jié)構(gòu)域(例如，抗體或TCR的可變區(qū)、單鏈抗體、受體的信號(hào)結(jié)構(gòu)域)、或具有功能結(jié)構(gòu)域的嵌合蛋白的基因。轉(zhuǎn)移基因的方法沒有特殊的限制，合適的方法可選自并可使用已知的基因轉(zhuǎn)移方法。作為基因轉(zhuǎn)移方法，本發(fā)明中可使用使用病毒載體的方法或不使用載體的方法。關(guān)于此類方法的細(xì)節(jié)，許多文獻(xiàn)都已公開。本發(fā)明的細(xì)胞群可以冷凍保存。當(dāng)本發(fā)明的細(xì)胞群冷凍/解凍時(shí)，通過在解凍后再培養(yǎng)細(xì)胞群，細(xì)胞可以恢復(fù)為保留冷凍前的細(xì)胞毒性活性的細(xì)胞。細(xì)胞群的培養(yǎng)可以實(shí)施例如一天(過夜)。通過在再培養(yǎng)中共存細(xì)胞與合適的細(xì)胞因子、例如IL-2，可以進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞毒性能力。從本發(fā)明的含有NK細(xì)胞的細(xì)胞群分離的細(xì)胞亞群的實(shí)例包括使用NK細(xì)胞的至少一種表面標(biāo)志物作為指標(biāo)從NK細(xì)胞分離的細(xì)胞亞群，所述表面標(biāo)志物選自CD16、CD56、 NKp44、NKG2D、NKp46、CD25、CD62L、CD69、CXCR3 和 CD94。含有本發(fā)明的細(xì)胞群的藥物(治療劑)適合用于過繼性免疫療法。在過繼性免疫療法中，適合患者治療的本發(fā)明的細(xì)胞群例如向患者靜脈內(nèi)施用。該藥物非常有效地用于后文所述的疾病和供體淋巴細(xì)胞輸注?？梢愿鶕?jù)制藥領(lǐng)域已知的方法制備藥物，例如通過混合作為活性成分的本發(fā)明的細(xì)胞群與已知的適合胃腸外施用的有機(jī)或無機(jī)載體、賦形劑、 穩(wěn)定劑等?？梢愿鶕?jù)已知的過繼性免疫療法，恰當(dāng)確定本發(fā)明的細(xì)胞群在藥物中的含量、藥物的劑量和關(guān)于藥物的各種條件，并且沒有特殊的限制。例如，藥物劑量?jī)?yōu)選是本發(fā)明的細(xì)胞群每個(gè)成人1 X IO5至1 X IO12細(xì)胞/天，更優(yōu)選5 X IO5至5 X IO11細(xì)胞/天，更優(yōu)選1 X IO6 至1 X IO11細(xì)胞/天。一般地，含有NK細(xì)胞的細(xì)胞群可以通過注射、輸注等施用到靜脈、動(dòng)脈、皮下、腹腔、腫瘤等中。本發(fā)明的藥物還可以與例如可作為針對(duì)待治療疾病的疫苗發(fā)揮作用的成分一起施用，沒有特殊的限制。例如，對(duì)于治療癌癥，還可以施用腫瘤抗原、能夠呈遞抗原的細(xì)胞、 抗原呈遞細(xì)胞、源自腫瘤組織的通過人工操作而丟失了增殖能力的細(xì)胞、來自腫瘤組織的提取物等。與藥物施用組合，還可以恰當(dāng)?shù)厥┯昧馨图?xì)胞刺激因子，例如抗CD3抗體、抗 ⑶沘抗體、細(xì)胞因子(IL-2、IL-15、IL-7、IL-12、IFN- y、IFN- α、IFN-β 等)、趨化因子等。 本發(fā)明的藥物可含有用這些淋巴細(xì)胞刺激因子處理的本發(fā)明的細(xì)胞群作為活性成分。如本文中使用的，淋巴細(xì)胞刺激因子包括淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)因子。對(duì)其施用本發(fā)明的細(xì)胞群的疾病的實(shí)例包括但不特別限于惡性腫瘤病例如癌癥和白血病、肝炎、流感，和由病毒例如HIV、細(xì)菌或真菌(例如，結(jié)核、MRSA、VRE或深部真菌病) 引起的感染性疾病。含有通過本發(fā)明方法制備的NK細(xì)胞的細(xì)胞群可以與常規(guī)治療方法組合利用，例如在骨髓移植或放射線照射后的感染性疾病預(yù)防、出于緩解復(fù)發(fā)性白血病目的的供體淋巴細(xì)胞輸注、抗癌劑治療、放射治療、抗體治療、溫?zé)嶂委煛⑵渌庖忒煼ǖ?。本發(fā)明的細(xì)胞群用于生產(chǎn)藥物的用途，例如生產(chǎn)用于治療癌性疾病或感染性疾病的藥物的用途，也包括在本發(fā)明中。用于治療疾病的本發(fā)明的細(xì)胞群也包括在本發(fā)明中。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了使用藥物治療疾病的方法。治療疾病的方法的特征是使用本發(fā)明的細(xì)胞群，并且根據(jù)已知的過繼性免疫療法或本文的施用藥物的公開內(nèi)容，可以確定施用藥物的各種條件。下面通過實(shí)施例將進(jìn)一步具體、詳細(xì)地解釋本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于此。 實(shí)施例實(shí)施例1 使用0K-432和自體照射細(xì)胞(AIC)培養(yǎng)NK細(xì)胞 (I)PBMC的分離和保存
在已獲得知情同意書的健康人供體中，實(shí)施組分血液收集(在本文中，組分血液收集是出于收集單核細(xì)胞的目的的血液收集)。在用Dulbecco PBS (由hvitrogen公司生產(chǎn)或由 NISSUI PHARMACEUTICAL CO. , LTD.生產(chǎn)；在后文中稱為DPBS)或含1%人血清白蛋白(產(chǎn)品名Buminate，由Baxter生產(chǎn)；在后文中稱為HSA)的生理鹽水(在后文中稱為1% HSA/生理鹽水)稀釋組分收集的血液后，每30 mL稀釋的組分收集的血液在15 mL的Ficoll-Paque PREMIUM或Ficoll-Paque PLUS(都由GE Healthcare Bioscience生產(chǎn))上分層，再在700Xg 和室溫下離心20分鐘。在離心后，用移液器回收分離的層中的PBMC層，并用RPMI1640培養(yǎng)基或1% HSA/生理鹽水補(bǔ)充至45 mL。在650 X g和4°C下離心10分鐘后，去除上清液。相似地，順序?qū)嵤╇x心操作，同時(shí)逐步降低離心G，例如600 X g、然后500 X g，重復(fù)洗滌共計(jì) 3次，收集PBMC。將收集的PBMC懸浮在由等量的包含8% HSA的CP-1 (由Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co. , Ltd.生產(chǎn))和 RPMI1640 培養(yǎng)基(由 hvitrogen 公司、Sigma 公司或 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.生產(chǎn))組成的儲(chǔ)液(在后文中稱為CP1/HSA)中，并保存在液氮中。為了擴(kuò)增培養(yǎng)NK細(xì)胞，在37°C水浴中快速解凍保存的PBMC，并用包含10 μ g/mL DNase (由Calbiochem生產(chǎn))的RPMI1640培養(yǎng)基或含0. 5%人AB型血清(由Lonza生產(chǎn))的 GT-T551 (由TAKARA BIO INC.生產(chǎn)，在后文中稱為0. 5HGT-T551)洗滌，并通過臺(tái)盼藍(lán)染色方法計(jì)算活細(xì)胞數(shù)。該細(xì)胞用于每個(gè)實(shí)驗(yàn)中。(2)制備 PBMC AIC
將必需量的實(shí)施例I-(I)中制備的PBMC懸浮在含5%人AB型血清、0. 1 mM NEAA混合物、1 mM丙酮酸鈉和2 mM L-谷氨酰胺(都由Lonza生產(chǎn))以及1%青霉素-鏈霉素(由 Gibco BRL生產(chǎn))或100 μ g/mL硫酸鏈霉素(由Meiji Co. , Ltd.生產(chǎn))的RPMI1640培養(yǎng)基(在后文中稱為5HRPMI)中，然后使用X射線照射裝置用3400 R (29. 8 Gy)的X射線照射(在后文中，X射線照射后的細(xì)胞被稱為PBMC AIC)0將制備的PBMC AIC懸浮在5HRPMI 中至2 X IO6細(xì)胞/mL。(3)擴(kuò)增培養(yǎng)NK細(xì)胞
在將實(shí)施例1- (1)中制備的PBMC (源自與PBMC AIC相同的供體)懸浮在5HRPMI中至 2X IO6細(xì)胞/mL后，將其用作響應(yīng)細(xì)胞。將響應(yīng)細(xì)胞和PBMC AIC以各自0. 5 mL/孔的量添加至1J 24 孑L細(xì)胞培養(yǎng)板(由 Becton, Dickinson and Company 生產(chǎn)，或由 Corning Incorporated 生產(chǎn))中，達(dá)到共計(jì)1 mL/孔(AIC刺激組)。此時(shí)，制備不添加PBMC AIC的組(非AIC刺激組)。向每個(gè)孔添加 0K-432 (產(chǎn)品名稱 Picibanil ；由 Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.生產(chǎn))，終濃度為0.05 KE/mL。向所有孔添加IL-2 (產(chǎn)品名稱ftx)leukin ；由Chiron 生產(chǎn)，或由Novartis生產(chǎn))，終濃度為500 U/mL。在37°C存在5% CO2的情況下開始培養(yǎng)這些平板(培養(yǎng)第O天)。在第二天，向每個(gè)孔添加各1 mL的5HRPMI，以500 U/mL終濃度添加 IL-2。在第四天，以500 U/mL終濃度向每個(gè)孔添加IL-2。在第七天和第九天，使用 5HRPMI將每個(gè)孔的細(xì)胞液3倍稀釋，以500 U/mL終濃度向每個(gè)孔添加IL-2，之后將2 mL 的稀釋細(xì)胞液轉(zhuǎn)移到新的M孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。在開始培養(yǎng)后第11天，將細(xì)胞液4倍稀釋， 將4 mL的稀釋細(xì)胞液轉(zhuǎn)移到新的12孔細(xì)胞培養(yǎng)板(由Becton, Dickinson and Company 生產(chǎn)，或由Corning Incorporated生產(chǎn))中，之后，以500 U/mL終濃度添加IL-2。繼續(xù)培養(yǎng)直到開始培養(yǎng)后第14天為止。在開始培養(yǎng)后第14天，通過臺(tái)盼藍(lán)染色方法測(cè)量活細(xì)胞數(shù)，并將該數(shù)目與開始培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞數(shù)比較，以計(jì)算擴(kuò)增培養(yǎng)率。結(jié)果顯示在表1中。在下表中，“_”意指無添加，“ + ”意指添加。在實(shí)施例中，AIC添加與AIC刺激具有相同的含義， 并且AIC無添加與AIC無刺激具有相同的含義。[表1]
權(quán)利要求
1.用于制備含有天然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞群的方法，包括在存在生物應(yīng)答修飾劑和已經(jīng)受消除增殖能力處理的細(xì)胞的情況下，擴(kuò)增培養(yǎng)含有天然殺傷細(xì)胞和/或能夠分化成天然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞的細(xì)胞群的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述生物應(yīng)答修飾劑是細(xì)菌來源的制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述生物應(yīng)答修飾劑是選自0K-432、BCG、化膿性鏈球lif (Streptcoccus pyogenes)、短棒桿菌(Corynebacterium parvum)及其細(xì)胞壁骨架白勺細(xì)菌來源的制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項(xiàng)的方法，其中所述已經(jīng)受消除增殖能力處理的細(xì)胞是選自已經(jīng)受消除增殖能力處理的外周血單核細(xì)胞、T細(xì)胞、T細(xì)胞子集和B細(xì)胞的細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述已經(jīng)受消除增殖能力處理的細(xì)胞是已經(jīng)受消除增殖能力處理的人工擴(kuò)增培養(yǎng)的T細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5的任一項(xiàng)的方法，其中所述已經(jīng)受消除增殖能力處理的細(xì)胞是源自與天然殺傷細(xì)胞或者能夠分化成天然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞相同的個(gè)體的細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任一項(xiàng)的方法，其中在存在已經(jīng)受消除增殖能力處理的細(xì)胞的情況下擴(kuò)增培養(yǎng)的步驟包括實(shí)施多次的細(xì)胞添加。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任一項(xiàng)的方法，其中所述外周血單核細(xì)胞用作天然殺傷細(xì)胞和/或能夠分化成天然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞。
9.通過根據(jù)權(quán)利要求1-8的任一項(xiàng)方法獲得的細(xì)胞群。
10.含有根據(jù)權(quán)利要求9的細(xì)胞群的藥物。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的細(xì)胞群，其用于治療疾病。
12.治療或預(yù)防疾病的方法，包括向受試者施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求9的細(xì)胞群的步驟ο
全文摘要
生產(chǎn)含有天然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞群的方法，其特征是涉及在存在生物應(yīng)答修飾劑和已經(jīng)受處理而喪失增殖能力的細(xì)胞的情況下，對(duì)含有天然殺傷細(xì)胞和/或能夠分化成天然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞的細(xì)胞群進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)的步驟等。
文檔編號(hào)A61P37/04GK102597223SQ20108005064
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2010年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月11日
發(fā)明者佐藤優(yōu)江, 出野美津子, 榎龍嗣, 神芽衣子, 蘆田尚子, 藪內(nèi)美江 申請(qǐng)人:寶生物工程株式會(huì)社