專利名稱：豬放線桿菌抗原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用于抑制、治療、防御(protecting)或預(yù)防(preventing)豬放線桿菌感染的方法和組合物。B.相關(guān)技術(shù)在美國(guó)，豬放線桿菌(Actinobacillus suis)近來(lái)已成為養(yǎng)豬業(yè)的新威脅。先前認(rèn)為豬放線桿菌與“高健康(high health)”豬群的高死亡率有關(guān)，現(xiàn)已認(rèn)識(shí)到其為普通豬群的重要病原體。其對(duì)年幼動(dòng)物尤其有害。感染會(huì)引起放線桿菌病，且可導(dǎo)致新出生的豬及斷奶的豬猝死。斷奶豬中的癥狀包括厭食、發(fā)熱、發(fā)紺、四肢充血、呼吸窘迫、肺炎、壞死性肺炎、持續(xù)咳嗽、皮膚損傷和致命性敗血癥。已知在肥育豬(finishing pig)中會(huì)發(fā)生肺炎、 關(guān)節(jié)炎、敗血癥癥狀、胸膜炎、心包炎和粟粒性膿腫。放線桿菌病還會(huì)造成母豬子宮炎和流產(chǎn)。放線桿菌病的肉眼可見(jiàn)的病變的特征在于在肺、腎、心臟、肝、脾、腸和皮膚中發(fā)現(xiàn)損傷；出血合壞死；以及類似于胸膜肺炎的肺損傷。就組織病理學(xué)而言，該疾病的特征在于在多種組織的血管中存在細(xì)菌性血栓栓塞且伴隨纖維素性出血性壞死 (fibrinohemorrhagic necrosis)；壞死性支氣管肺炎；和胸膜炎。感染的原因及促成因素包括大面積發(fā)生豬生殖及呼吸綜合征(PRRQ感染、剪牙(teeth clipping)、斷尾 (de-tailing)、擦破膝蓋(scrubbed knees)及經(jīng)由呼吸、切ロ或擦傷侵入。豬放線桿菌是寄居于上呼吸道中的機(jī)會(huì)性、革蘭氏陰性、非運(yùn)動(dòng)性的好氧兼性厭氧球桿菌。對(duì)從北美豬群中的臨床病例獲得的豬放線桿菌分離株的基因分型已經(jīng)掲示了有限的遺傳變異性，在從四個(gè)不同豬群獲得的74株分離株中僅鑒定出13種株系。豬放線桿菌基因型的辛普森多祥性指數(shù)(Simpson' s diversity index)(還稱為物種多樣性指數(shù)，參見(jiàn)Simpson，1949)為0. 64，這意味著使用例如B0X-PCR吋，隨機(jī)分離株具有64%的概率被包括于獨(dú)特的基因型組中(Simpson，1949 ；Versalovic等人，1991 ；Oliveira等人， 2007)。例如，與多樣性指數(shù)為0. 93的副豬嗜血桿菌(H. parasuis) (Oliveira等人，2007) 相比，豬放線桿菌是相對(duì)純系的。豬放線桿菌的表型多祥性也是相對(duì)有限的。迄今僅公開(kāi)了兩種血清變型(即01 及02) (Rullo、Papp-Szabo和Michael, 2006)以及三種莢膜類型(即K1-3)。病原性研究表明，來(lái)自血清群02的分離株往往比01分離株更有毒力(Slavic.DeLay和HayeS，2000)。 用于自身疫苗制備的豬放線桿菌分離株的血清分型還證實(shí)，與01分離株相比較高百分比的02分離株與臨床疾病有關(guān)(Slavic.Toffner和MonteiroJOOO)。盡管已知豬放線桿菌的一些毒カ因子(例如RTX毒素Apx Ivar.suis和Apx IIvar. suis)，但可觸發(fā)全身性感染的因子仍有待確定。這些潛在因子中的ー些因子包括脂多糖(LPQ和英膜多糖(CPQ、外膜蛋白 A(OmpA)、蛋白酶和鐵獲取。
目前，沒(méi)有市售疫苗可用于控制豬放線桿菌，且大多數(shù)農(nóng)場(chǎng)獸醫(yī)依賴于自身疫苗及抗微生物治療來(lái)控制疾病。需要開(kāi)發(fā)出可強(qiáng)效防御農(nóng)場(chǎng)中的大多數(shù)分離株的疫苗；然而， 關(guān)于與豬放線桿菌感染的發(fā)病機(jī)制有關(guān)的基因型、血清變型、毒素、蛋白質(zhì)分布及因子間的聯(lián)系的必要數(shù)據(jù)仍有待確定。本文提供這些數(shù)據(jù)以及針對(duì)豬放線桿菌的疫苗及其使用方法。發(fā)明概述本發(fā)明提供可用于防止受試者受到豬放線桿菌感染的新的免疫原性組合物 (immunogenic compositions)。這些組合物還可用于抑制、治療或預(yù)防多種株系(strain) 或類型的豬放線桿菌的感染。本發(fā)明組合物包含從生長(zhǎng)至0. 650 OD650至0. 850 OD650的一種或多種豬放線桿菌培養(yǎng)物收集的上清液；和助劑。優(yōu)選地，該上清液經(jīng)滅活，最優(yōu)選經(jīng)福爾馬林(formalin)滅活。該上清液優(yōu)選還經(jīng)過(guò)濾，例如通過(guò)45微米過(guò)濾器過(guò)濾。在給定情形下可視情況在滅活之前或之后實(shí)施過(guò)濾。上清液(更優(yōu)選為經(jīng)過(guò)濾的上清液)基本上不含豬放線桿菌細(xì)胞， 但可含有多種細(xì)胞組分。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明組合物可包括任一種適宜的助劑。ー種例示性助劑為Emulsigen -D。助劑的確定部分地取決于要接受組合物的受試者的情況； 給予至受試者的方法；以及給予組合物的條件。例如，可將助劑與上清液或經(jīng)過(guò)濾的上清液在給予至受試者之前混合在一起，同時(shí)給予或者相繼給予至受試者。本發(fā)明免疫原性組合物的適宜受試者包括動(dòng)物及人。通過(guò)使用本發(fā)明組合物或方法刺激免疫應(yīng)答的動(dòng)物包括家畜，例如豬、小牛、雞、山羊及綿羊；以及馴養(yǎng)動(dòng)物，例如小鼠、 兔、狗、貓及馬。優(yōu)選的動(dòng)物包括豬科動(dòng)物(porcines)、鼠類動(dòng)物、馬科動(dòng)物、兔類動(dòng)物及?？苿?dòng)物。最優(yōu)選地，該動(dòng)物為豬科動(dòng)物。本發(fā)明還提供在受試者中激發(fā)抗放線桿菌屬(Actinobacillus)免疫應(yīng)答以降低與豬放線桿菌感染有關(guān)的臨床病征的發(fā)生率或嚴(yán)重性的方法，其包括向該受試者給予本發(fā)明的免疫原性組合物。受試者中與豬放線桿菌有關(guān)的且可降低發(fā)生率或嚴(yán)重性的臨床病征包括腦膜炎、敗血癥、子宮炎、肺炎、丹毒樣損傷(crysipelas-like lesions)和流產(chǎn)。相對(duì)于未接受該免疫原性組合物的受試者，上述任一病征均可通過(guò)給予本發(fā)明組合物而降低。 優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物引發(fā)使豬放線桿菌感染的至少ー種臨床病征減少至少10%的保護(hù)性免疫應(yīng)答?？赏ㄟ^(guò)給予本發(fā)明組合物減少的一種優(yōu)選的豬放線桿菌感染為豬放線桿菌 ISU-8594。本發(fā)明還提供制造或制備本發(fā)明的免疫原性組合物(可用于制造藥物)的方法。 此類方法包括以下步驟使豬放線桿菌培養(yǎng)物生長(zhǎng)至0.650 OD65tl至0. 850 OD65tl ；從該培養(yǎng)物收集上清液；將該上清液過(guò)濾，獲得濾液；和將該濾液與助劑混合。這些方法還可包括將該上清液滅活，優(yōu)選在將該上清液與助劑混合之前實(shí)施?？稍谶^(guò)濾該上清液之前或之后實(shí)施滅活。本發(fā)明還提供在受試者中診斷豬放線桿菌感染的方法。此類方法包括a)提供經(jīng)過(guò)濾的上清液，該上清液如下制備使豬放線桿菌培養(yǎng)物生長(zhǎng)至0. 6500D·至0. 850 OD650, 從該培養(yǎng)物收集上清液，并過(guò)濾該上清液；b)將經(jīng)濾的上清液與從該受試者獲得的樣品接觸；和c)若在樣品中檢測(cè)到能夠與經(jīng)過(guò)濾的上清液中的組分結(jié)合的抗體，則認(rèn)為該受試者患有豬放線桿菌感染。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟悉多種適于確定抗體是否能夠結(jié)合組分的技木。例如， 可通過(guò)利用能夠與樣品中的抗體結(jié)合的第二抗體來(lái)檢測(cè)該結(jié)合?？赏ㄟ^(guò)比色分析或其它適宜方法來(lái)檢測(cè)這些第二抗體的結(jié)合。本發(fā)明還提供試劑盒，其包括a)經(jīng)過(guò)濾的上清液，該上清液如下制備使豬放線桿菌培養(yǎng)物生長(zhǎng)至0.650 OD65tl至0.850 OD65tl，從該培養(yǎng)物收集上清液，并過(guò)濾該上清液；b) 助劑；和c)用于包裝該上清液和助劑的容器。所述經(jīng)過(guò)濾的上清液與助劑可包裝在一起或分開(kāi)包裝。試劑盒可進(jìn)ー步包括該試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)。其還可包括將經(jīng)過(guò)濾的上清液和助劑給予至受試者的裝置。試劑盒中還可包括將該上清液與助劑混合在一起的裝置。本發(fā)明組合物可進(jìn)ー步包含獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體、第二助劑或其組合。這些組合物可用作疫苗，且包含減毒疫苗、滅活疫苗或其組合。此類疫苗引發(fā)對(duì)抗至少ー種與放線桿菌屬有關(guān)的疾病的保護(hù)性免疫應(yīng)答。用于本發(fā)明方法的優(yōu)選的滅活劑選自ニ乙烯亞胺(binary ethyleneimine) (BEI) 和福爾馬林。福爾馬林是更優(yōu)選的滅活劑。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，其它滅活劑及方法(即加熱、改變PH等)在本領(lǐng)域中是已知的，且可互換地用于實(shí)施本發(fā)明，只要這些試劑或滅活方法不會(huì)不利地改變所制備組合物的免疫原性特性或安全性即可。本發(fā)明的方法還可包括將本發(fā)明的組合物與獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體、助劑或其組合混合。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，載體、助劑或組合的選擇由遞送途徑、個(gè)人偏好及動(dòng)物物種來(lái)決定。優(yōu)選的給予途徑包括鼻內(nèi)、ロ服、真皮內(nèi)及肌內(nèi)。優(yōu)選于飲用水中進(jìn)行給予，最優(yōu)選以單ー劑量給予。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明的組合物還可以以兩次或更多次劑量以及通過(guò)其它給予途徑來(lái)給予。例如，此類其它途徑包括皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、血管內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、氣管內(nèi)、皮內(nèi)、心臟內(nèi)、肺葉內(nèi)(intralobally)、髓內(nèi)、肺內(nèi)或陰道內(nèi)給予。根據(jù)治療所期望的持續(xù)時(shí)間及有效性而定，本發(fā)明的組合物可給予一次或數(shù)次，還可間歇給予，例如以不同劑量每天給予并持續(xù)數(shù)天、數(shù)周或數(shù)月。本發(fā)明還提供用于為受試者接種疫苗的試劑盒，其包括一套印刷說(shuō)明書(shū)；能夠?qū)⒁呙缃o予至動(dòng)物的分配器；和豬放線桿菌培養(yǎng)物的上清液，其具有ー種或多種可有效地在受試者中刺激免疫應(yīng)答的組分。本發(fā)明的試劑盒可進(jìn)ー步包括獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體、 助劑或其組合。本發(fā)明的試劑盒中的分配器能夠?qū)⑵鋬?nèi)容物作為滴劑(droplets)分配；且包括于試劑盒中的豬放線桿菌上清液能夠在給予至受試者時(shí)降低豬放線桿菌感染的至少ー種臨床病征的嚴(yán)重性。優(yōu)選地，與未經(jīng)治療的感染受試者相比，臨床病征的嚴(yán)重性降低至少 10%。"免疫原性組合物(immunogeniccomposition) ” 或“免疫組合物(immunological composition)，，是指包含至少ー種豬放線桿菌上清液或其免疫原性部分的物質(zhì)的組合物， 其在受試者中引發(fā)對(duì)該組合物的細(xì)胞免疫應(yīng)答或抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。在本發(fā)明的ー個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，免疫原性組合物誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，且其更優(yōu)選對(duì)抗放線桿菌屬感染的ー種或多種臨床病征賦予保護(hù)性免疫?！懊鉀](méi)/^答(immune response 或 immunological response)，，是指(但不限于) 出現(xiàn)對(duì)目標(biāo)組合物或疫苗的細(xì)胞和/或抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。通常，免疫應(yīng)答包括(但不限于)ー種或多種下述效應(yīng)產(chǎn)生或激活特異性地針對(duì)目標(biāo)組合物或疫苗中所包括的抗原的抗體、B細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞、抑制性T細(xì)胞和/或細(xì)胞毒性T細(xì)胞。優(yōu)選地，接種疫苗的受試者會(huì)呈現(xiàn)治療性或保護(hù)性免疫(記憶)應(yīng)答以增強(qiáng)對(duì)新感染的抵抗和/或降低疾病的臨床嚴(yán)重性。該保護(hù)可由以下來(lái)證實(shí)與病原體感染有關(guān)的癥狀數(shù)量減少、癥狀嚴(yán)重性降低或ー種或多種癥狀消失、臨床癥狀發(fā)作的延遲、病原體持續(xù)時(shí)間縮短、總病原體負(fù)載降低和 /或病原體分泌減少?！皩?duì)抗豬放線桿菌的保護(hù)”、“保護(hù)性免疫”、“功能性免疫”及類似術(shù)語(yǔ)是指由免疫方案產(chǎn)生的抗豬放線桿菌免疫應(yīng)答，與在未預(yù)先暴露于豬放線桿菌的未免疫化受試者中相比，預(yù)期該免疫方案產(chǎn)生較少有害效應(yīng)。即，由于受試者的免疫系統(tǒng)抵抗細(xì)菌，故在免疫化受試者中感染的有害效應(yīng)的嚴(yán)重性減少。在免疫化受試者(優(yōu)選為豬)中，可減少、減緩或可能完全預(yù)防感染。在本文中，當(dāng)該術(shù)語(yǔ)表示完全預(yù)防感染時(shí)會(huì)明確指出。若未指出為完全預(yù)防，則該術(shù)語(yǔ)包括部分預(yù)防。在本文中，“臨床病征的發(fā)生率和/或嚴(yán)重性降低”或“臨床癥狀的減少”是指(但不限于)與野生型感染相比，組中感染受試者的數(shù)量減少、呈現(xiàn)感染臨床病征的受試者的數(shù)量減少或消除、或者存在于受試者中的任一臨床病征的嚴(yán)重性降低。例如，其應(yīng)指病原體負(fù)載的任何降低、病原體脫落、病原體傳播的減少或豬放線桿菌感染的任一癥狀性臨床病征的減少。優(yōu)選地，與未接受本發(fā)明組合物且可能被感染的受試者相比，在接受本發(fā)明組合物的受試者中這些臨床病征減少至少10%。更優(yōu)選地，在接受本發(fā)明組合物的受試者中臨床病征減少至少20%、優(yōu)選至少30%、更優(yōu)選至少40%且甚至更優(yōu)選至少50%。術(shù)語(yǔ)“増加的保護(hù)”在本文中是指(但不限干)與未接種疫苗的受試者對(duì)照組相比，在接種疫苗的受試者組中與豬放線桿菌感染有關(guān)的ー種或多種臨床癥狀統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著減少。術(shù)語(yǔ)“臨床癥狀的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著減少”是指(但不限干)在使用感染性放線桿菌屬細(xì)菌攻擊后，與未接種疫苗的對(duì)照組相比，在接種疫苗的受試者組中至少ー種臨床癥狀的發(fā)生頻率降低至少20 %、優(yōu)選30 %、更優(yōu)選50 %且甚至更優(yōu)選70 %。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員會(huì)了解，本文所用組合物可與已知的可注射的生理學(xué)上可接受的無(wú)菌溶液混合。對(duì)于制備用于非經(jīng)腸注射或輸注的即用溶液，水性等滲溶液(例如鹽水或血漿蛋白質(zhì)溶液)可便利地獲得。另外，本發(fā)明的免疫原性及疫苗組合物可包括獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、等滲劑、穩(wěn)定劑或助劑。本文所用的“獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體”包括任ー以及全部的溶劑、分散介質(zhì)、包衣劑、助劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、防腐剤、抗細(xì)菌及抗真菌劑、等滲劑、吸收延遲劑等。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，尤其是在包括凍干的免疫原性組合物的實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的穩(wěn)定劑包括用于凍干或冷凍干燥的穩(wěn)定劑。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物含有助劑。本文所用的“助劑”可包括氫氧化鋁和磷酸鋁；皂苷，例如Quil A、QS-21 (Cambridge Biotech公司，Cambridge MA)、GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals 公司，Birmingham, AL)；油包水乳劑；7jC 包油乳剤；水包油包水乳剤。該乳劑可尤其基干輕質(zhì)液體石蠟油(歐洲藥典類型(EuropeanPharmacopea type))；類異戊ニ烯油，例如角鯊?fù)榛蚪酋徬挥上N(尤其是異丁烯或癸烯)寡聚產(chǎn)生的油；含有直鏈烷基的酸或醇的酷，更具體地為植物油、油酸乙酷、丙ニ醇 ニ-(辛酸酷/癸酸酯)、甘油三-(辛酸酷/癸酸酯)或丙ニ醇ニ油酸酯；支鏈脂肪酸或醇的酷，尤其為異硬脂酸酷。所述油可與乳化劑組合使用以形成乳剤。乳化劑優(yōu)選為非離子型表面活性剤，具體地為去水山梨糖醇、ニ縮甘露醇(例如無(wú)水甘露醇油酸酷)、ニ醇、聚甘油、丙ニ醇、油酸、異硬脂酸、蓖麻油酸或羥基硬脂酸酷，它們?nèi)芜x經(jīng)乙氧基化，以及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，具體地為普朗尼克(Pluronic)產(chǎn)品，尤其是L121。參見(jiàn)Hunter 等人，Tne Theory and PracticalApplication of Adjuvants(Ed. Stewart-Tul1,D. E. S.), John Wiley and Sons，NY，第 51-94 頁(yè)(1995)和 iTodd 等人，Vaccine 15:564-570(1997)。其它例示性助劑為闡述于M. Powell及M. Newman編輯的“Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach"(Plenum Press, 1995)的第 147 頁(yè)上的 SPT 乳劑以及公開(kāi)于同一本書(shū)第183頁(yè)上的乳劑MF59。助劑的另一實(shí)例是選自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物及馬來(lái)酸酐與烯基衍生物的共聚物的化合物。有利的助劑化合物為丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，其為交聯(lián)的，尤其與糖類或多元醇的聚烯基醚交聯(lián)。這些化合物被稱為卡波姆(carbomer) (Phameuropa, 第8卷，第2期，1996年6月)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員還可參考美國(guó)專利2，909，462，其公開(kāi)了與聚羥基化化合物交聯(lián)的丙烯酸此類聚合物，該聚羥基化化合物具有至少3個(gè)(優(yōu)選不多于8個(gè))羥基，至少3個(gè)羥基的氫原子被具有至少2個(gè)碳原子的不飽和脂肪族基團(tuán)替換。優(yōu)選的基團(tuán)為含有2個(gè)至4個(gè)碳原子的基團(tuán)，例如乙烯基、烯丙基及其它烯烴系不飽和基團(tuán)。所述不飽和基團(tuán)自身可含有例如甲基等其它取代基。以名稱Carbopol (卡波普)(BF Goodrich, Ohio, USA)出售的產(chǎn)品尤其適合。它們與烯丙基蔗糖或與烯丙基季戊四醇交聯(lián)。其中可提及Carbopol 974P、934P和971P。最優(yōu)選使用Cabopol 971P。共聚物 EMA(Monsanto)屬于馬來(lái)酸酐與烯基衍生物的共聚物，其為馬來(lái)酸酐與乙烯的共聚物。將這些聚合物溶解于水中會(huì)產(chǎn)生酸性溶液，優(yōu)選將其中和至生理PH以得到助劑溶液，將免疫原性、免疫或疫苗組合物本身?yè)胶现猎撝鷦┤芤褐小Ｆ渌m宜的助劑尤其包括(但不限干)RIBI助劑系統(tǒng)(Ribi公司)、嵌段共聚物 (CytRx,Atlanta GA) ,SAF-M(Chiron,Emeryvilie CA)、單磷酰脂質(zhì)Α、阿夫立定(Avridine) 脂質(zhì)-胺助劑、來(lái)自大腸桿菌(重組的或其它性質(zhì)的)的不耐熱腸毒素、霍亂毒素、IMS 1314或胞壁酰ニ肽、或者天然存在或重組的細(xì)胞因子或其類似物、或者內(nèi)源細(xì)胞因子釋放的刺激物。“稀釋劑”可包括水、鹽水、葡萄糖、乙醇、甘油等。等滲劑可尤其包括氯化鈉、葡萄糖、甘露醇、山梨醇及乳糖。穩(wěn)定劑尤其包括白蛋白及乙ニ胺四乙酸的堿金屬鹽。預(yù)期，助劑可以約100 μ g至約IOmg/劑、優(yōu)選以約100 μ g至約IOmg/劑、更優(yōu)選以約500 μ g至約5mg/劑、甚至更優(yōu)選以約750 μ g至約2. 5mg/劑且最優(yōu)選以約Img/劑的量添加?；蛘撸宰罱K產(chǎn)物的體積計(jì)，助劑的濃度可為約0. 01至50%，優(yōu)選為約2%至30%， 更優(yōu)選為約5 %至25 %，更優(yōu)選為約7 %至22 %，且最優(yōu)選為10 %至20 %。在本文中，“有效劑量”是指(但不限于)豬放線桿菌上清液或經(jīng)過(guò)濾的上清液在給予該上清液的受試者中引發(fā)或能夠引發(fā)臨床癥狀減少的免疫應(yīng)答的量?！鞍踩浴笔侵附臃N疫苗后在接種疫苗的受試者中不存在包括但不限于以下在內(nèi)的不利后果基于細(xì)菌的疫苗毒力可能的恢復(fù)、臨床上顯著的副作用(例如全身持續(xù)性疾病或在疫苗給予部位不可接受的炎癥)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“接種疫苗”或“疫苗接種”或其變化形式是指(但不限干)包括給予本發(fā)明組合物的操作，當(dāng)將本發(fā)明組合物給予至受試者吋，其在受試者中引發(fā)或能夠直接或間接地引發(fā)抗豬放線桿菌免疫應(yīng)答。本發(fā)明還公開(kāi)了治療或預(yù)防由豬放線桿菌引起的感染的方法。該方法包括向受試者給予有效量的本發(fā)明的免疫原性組合物，其中該治療或預(yù)防選自豬放線桿菌感染的病征減少、豬放線桿菌感染臨床病征的嚴(yán)重性或發(fā)生率降低、由豬放線桿菌感染引起的受試者死亡率降低，及其組合。在本發(fā)明上下文中，“死亡率”是指由豬放線桿菌感染引起的死亡，且包括由于嚴(yán)重感染而將動(dòng)物無(wú)痛處死以防止受苦及人道地終結(jié)其生命的情形?！皽p毒(attenuation)”是指降低病原體的毒力。在本發(fā)明中，“減毒”與“無(wú)毒カ (avirulent)，，同義。在本發(fā)明中，減毒細(xì)菌是已降低毒力從而不會(huì)引起豬放線桿菌感染的臨床病征但能夠在目標(biāo)受試者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的細(xì)菌；但也可指與感染未減毒豬放線桿菌且未接受減毒細(xì)菌的受試者“對(duì)照組”相比，在感染減毒豬放線桿菌的受試者中臨床病征的發(fā)生率或嚴(yán)重性降低。在該上下文中，術(shù)語(yǔ)“降低”是指與如上文所定義的對(duì)照組相比降低至少10 %、優(yōu)選25 %、甚至更優(yōu)選50 %、更優(yōu)選60 %、甚至更優(yōu)選70 %、更優(yōu)選80 %、甚至更優(yōu)選90%且最優(yōu)選100%。對(duì)本發(fā)明的目的而言，“有效量”是指能夠在受試者中誘導(dǎo)使豬放線桿菌感染發(fā)生率降低或嚴(yán)重性降低的免疫應(yīng)答的免疫原性組合物的量。有效量是指菌落形成単位(CFU)/ 劑或logs/劑?！伴L(zhǎng)期保護(hù)，，應(yīng)指“改良的功效，，持續(xù)至少3周，但更優(yōu)選至少3個(gè)月，仍更優(yōu)選至少6個(gè)月。最優(yōu)選地，該長(zhǎng)期保護(hù)應(yīng)持續(xù)至豬動(dòng)物以肉出售的平均年齢。在本文中，除非上下文另有要求，否則單數(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)包括復(fù)數(shù)且復(fù)數(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)包括單數(shù)。在本申請(qǐng)中，除非另有說(shuō)明，否則使用“或”是指“和/或”。由下列詳細(xì)說(shuō)明可了解本發(fā)明的其它目標(biāo)、特征及益處。然而，應(yīng)了解，當(dāng)闡述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案吋，詳細(xì)說(shuō)明及具體實(shí)施例僅以例示的方式給出，這是由于本領(lǐng)域技術(shù)人員由該詳細(xì)說(shuō)明可了解本發(fā)明精神及范圍內(nèi)的各種變化及修改。


以下附圖構(gòu)成本說(shuō)明書(shū)的一部分，且包括在內(nèi)以進(jìn)一歩展示本發(fā)明的某些方面。 與本文所提供具體實(shí)施方案的詳細(xì)說(shuō)明結(jié)合，可參考這些圖示中的一個(gè)或多個(gè)以更好地理解本發(fā)明。圖1.本研究的第0天至第41天各治療組的日平均溫度。發(fā)明詳述本發(fā)明提供可用于抑制、治療、防御或預(yù)防豬放線桿菌感染的方法及組合物。本文闡述豬放線桿菌原型疫苗對(duì)抗多種豬放線桿菌血清型或分離株異源攻擊的效力。已證實(shí)這些疫苗可在所治療動(dòng)物中有效地刺激免疫原性反應(yīng)。一些疫苗刺激的反應(yīng)足以防御豬放線桿菌。
豬放線桿菌疫苗原型由不同培養(yǎng)物部分(例如全細(xì)胞、上清液或外膜蛋白(omp)) 和對(duì)抗胸膜肺炎放線桿菌(a. pleuropneumoniae) (APP)的:Ingelvac APP-ALC活疫苗組
成。全細(xì)胞疫苗由對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物實(shí)施離心旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的沉淀物質(zhì)制得。培養(yǎng)物上清液由離心旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的上清液制得，且可包括外毒素、內(nèi)毒素、分泌或脫落的omp，以及旋轉(zhuǎn)期間未除去的其它細(xì)胞組分(參見(jiàn)實(shí)施例1)。因?yàn)锳PP編碼與豬放線桿菌毒素非常類似的Apx I及 Apx II毒素，因此包括Ingelvac APP-ALC活疫苗。假設(shè)該Ingdvac APP-ALC疫苗可針對(duì)豬放線桿菌提供ー些交叉保護(hù)。該功效研究由含有3周齡士7日齡的斷奶豬的6個(gè)治療組組成。治療組1(15頭豬)分別在研究的第0天及第21天經(jīng)肌內(nèi)(IM)接受IX 2mL劑量的福爾馬林滅活的豬放線桿菌全細(xì)胞部分。治療組2 (15頭豬)分別在研究的第0天及第21天經(jīng)IM接受IX 2mL 劑量的福爾馬林滅活的豬放線桿菌培養(yǎng)物上清液部分。治療組3(15頭豬)分別在第0天及第21天經(jīng)IM接受lX2mL劑量的豬放線桿菌外膜蛋白(omp)細(xì)胞部分。治療組4(15頭豬)分別在第0天及第21天經(jīng)IM接受1X 2mL劑量的Ingelvac APP-ALC。指定為“攻擊對(duì)照”的治療組5 (15頭豬)分別在第0天及第21天經(jīng)IM接受IX 2mL劑量的安慰劑。治療組6 (10頭豬)指定為“嚴(yán)格對(duì)照”，且未接受疫苗或安慰劑治療。在攻擊之日(第35天)，對(duì)于組1至5中的豬，每頭豬經(jīng)由鼻內(nèi)(IN)接種接受6mL 劑量的豬放線桿菌菌株ISU-8594(含有IX IO9 ciIogs/劑)，每ー鼻孔施用3mL。在整個(gè)研究期間(第0天至第41天)監(jiān)測(cè)總體觀察，以記錄豬的總體健康狀況以及注射部位反應(yīng)性和直腸溫度。在研究第41天，將所有動(dòng)物無(wú)痛處死，且對(duì)所有肺切片進(jìn)行評(píng)分，以測(cè)定肺病變的百分比。從每只動(dòng)物采集肺(若存在，取3個(gè)具有損傷的肺葉)、肝、腎、脾、扁桃體、以及鼻甲、氣管、支氣管、腦脊膜以及心臟血液的抹片的新鮮且固定的(僅對(duì)于肺而言)樣品， 并進(jìn)行培養(yǎng)，用于細(xì)菌分離及組織病理學(xué)(僅對(duì)于肺而言)。豬放線桿菌部分及安慰劑組以tmulsigen -D作為助劑，且在這些組中觀察到數(shù)種不利的注射部位反應(yīng)。在第一次疫苗接種事件期間，觀察到上清液組(組幻中的ー頭豬在注射部位有輕微反應(yīng)?？傊?，在上清液及omp組中，Emulsigen -D與測(cè)試物品的組合未產(chǎn)生任何明顯的注射部位反應(yīng)。然而，全細(xì)胞組中確實(shí)有數(shù)只動(dòng)物在尸體剖檢時(shí)出現(xiàn)膿腫，這可能是由于濃縮的全細(xì)胞原液組成的測(cè)試物品制劑所致。這些疫苗原型(即全細(xì)胞、上清液及omp)的給予，在給予時(shí)間期間似乎耐受良好。APP-ALC組出現(xiàn)ー些注射部位腫脹，這與產(chǎn)品文獻(xiàn)的記載(在11%的接種疫苗動(dòng)物中觀察到腫脹)一致。在攻擊前階段期間，各治療組中的豬的一般總體健康狀況良好。僅治療組4中的一頭豬在該階段期間從該研究除去。該豬由于被認(rèn)為與給予APP疫苗無(wú)關(guān)的細(xì)菌感染而被除去。進(jìn)ー步觀察顯示攻擊對(duì)照組中的一頭豬在研究第7天至第M天右腿跛行。該豬偏移了攻擊前階段期間的臨床觀察結(jié)果，且可視為離群值而自研究數(shù)據(jù)分析除去。此外，全細(xì)胞組中的一頭豬顯示身體狀況較差，且在數(shù)天后死亡。在接種疫苗前階段沒(méi)有一頭豬顯示呼吸困難病征。通過(guò)與嚴(yán)格對(duì)照組(治療組6)相比，攻擊對(duì)照組(治療組5)中發(fā)生的損傷形成顯著增加(P <0.05)，可驗(yàn)證主要及次要參數(shù)的評(píng)估。該評(píng)估的結(jié)果在豬中驗(yàn)證了有毒力的純凈培養(yǎng)物豬放線桿菌攻擊模型。組1至4與攻擊對(duì)照組進(jìn)一歩作比較，但不與嚴(yán)格對(duì)
10照組進(jìn)一歩作比較。在為期6天的攻擊階段期間，全細(xì)胞組中的一頭豬在攻擊后1天由于豬放線桿菌感染而死于急性死亡?；谙惹暗墓粞芯浚莾?nèi)途徑及效能適于在測(cè)試動(dòng)物中引起顯著損傷形成及明顯的致命猝死，這與全細(xì)胞組中這一只豬的情形一祥?；谄骄螕p傷評(píng)分和具有損傷的百分比，攻擊組中的肉眼可見(jiàn)肺損傷評(píng)分似乎最嚴(yán)重。比較組1至5吋，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示平均肺損傷評(píng)分或存在損傷的百分比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(ρ <0.05)。在數(shù)值方面，總體而言，攻擊對(duì)照組具有最高的平均肉眼可見(jiàn)肺損傷評(píng)分；全細(xì)胞組及omp組次之，這兩個(gè)組也具有相對(duì)較高的評(píng)分。在上清液及APP組中損傷形成較少，與其它組相比，其具有較低的數(shù)值評(píng)分。所有組1至5中至少50 %的豬具有肉眼可見(jiàn)損傷評(píng)分，且攻擊及omp組多達(dá)80%的豬具有損傷形成。此外，顯微鏡可見(jiàn)的肺損傷分析是基于豬放線桿菌感染的標(biāo)志特征(即支氣管肺炎、壞死和胸膜炎)的嚴(yán)重性。在攻擊對(duì)照及omp組中支氣管肺炎及壞死較嚴(yán)重，而顯微鏡可見(jiàn)損傷評(píng)分低于上清液及APP組?；陲@微鏡可見(jiàn)損傷數(shù)據(jù)，APP組顯示最佳的防御豬放線桿菌感染的跡象，其與組3 (omp)的壞死及胸膜炎與組5 (攻擊)的胸膜炎之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P < 0. 05)。所有組中存在的細(xì)菌菌落介于約20%至約46. 7%的范圍內(nèi)，其中在全細(xì)胞及APP (20.0% )組中寄居百分比最低。對(duì)于各治療組，使用所監(jiān)測(cè)的次要參數(shù)來(lái)支持由疫苗及攻擊而引起的主要功效參數(shù)(即，肉眼可見(jiàn)及顯微鏡可見(jiàn)(IHC)損傷)應(yīng)答。攻擊階段期間所實(shí)施的臨床觀察顯示， 與疫苗治療組1至4相比，攻擊對(duì)照組具有總體較高的評(píng)分，表明攻擊對(duì)照組對(duì)攻擊有應(yīng)答。上清液組似乎臨床上未受感染。然而，所有組中均有ー些豬具有ー些呼吸問(wèn)題并伴隨咳嗽、身體狀況或行為反應(yīng)。在第一次疫苗接種事件后4小吋，發(fā)現(xiàn)治療組的平均直腸溫度升高，高于104° F。 對(duì)于APP及omp組，溫度峰值在104. 9° F或高于104.9° F, 104. 9° F是接種疫苗后4小時(shí)發(fā)熱的界限值(cut-off)，且對(duì)于omp組持續(xù)約M小吋。到第1天或第3天，所述組的溫度恢復(fù)正常。對(duì)于加強(qiáng)免疫事件，僅在第觀天采集溫度，且不像第一次接種疫苗那樣在接種疫苗后4小時(shí)或第1、3及5天采集溫度。在加強(qiáng)免疫階段期間，在第觀天，APP組與全細(xì)胞及上清液組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P <0.05)。在攻擊階段期間，攻擊對(duì)照組在該階段開(kāi)始及結(jié)束時(shí)均具有總體較高的直腸溫度。在第38天及第39天期間全細(xì)胞組具有最高的直腸溫度。攻擊對(duì)照組具有最高的總發(fā)熱動(dòng)物百分比(10/15)，其次分別為全細(xì)胞(8/15)、 0MP(5/15)、上清液(2/15) ^P APP(1/15)組。在肺及扁桃體樣品中細(xì)菌分離最高。在攻擊對(duì)照組中豬放線桿菌的回收率最高。 除鼻及扁桃體樣品(分別為3/10及1/10)夕卜，嚴(yán)格對(duì)照組中豬放線桿菌呈陰性。這些結(jié)果記錄為陽(yáng)性，未通過(guò)BCA或其它手段進(jìn)行證實(shí)。這些結(jié)果的可能原因是由于疏忽讀錯(cuò)瓊脂板或在抹片處理期間發(fā)生交叉污染事件。此外，三種參數(shù)(脾、腦脊膜和心臟血液)具有非常低的豬放線桿菌回收率，且因此未包括在分析中。總之，由于內(nèi)臟器官及心臟血液中的豬放線桿菌回收率較低，故敗血癥率較低。還有證據(jù)表明，在嚴(yán)重受感染的三只動(dòng)物中該攻擊透過(guò)了血腦屏障。檢測(cè)到的其它細(xì)菌博德特菌屬(Bordetella)、α及β鏈球菌 ^streptococci)0使用蛋白印跡分析法操作實(shí)施血清學(xué)測(cè)試，以測(cè)試對(duì)用于為治療組接種疫苗的測(cè)試物品的反應(yīng)性。蛋白印跡分析法顯示在以1 100稀釋時(shí)可檢測(cè)到全細(xì)胞、上清液及omp 部分的血清轉(zhuǎn)化。APP部分具有最佳的反應(yīng)性且可在以1 1000稀釋時(shí)檢測(cè)到，證實(shí)宿主識(shí)別了用于為各治療組接種疫苗的各部分的某些部分?？傊?，使用APP及上清液原型疫苗接種疫苗的豬得到了最佳的保護(hù)。相比之下，全細(xì)胞及omp疫苗或LPS衍生抗原不能從豬放線桿菌攻擊提供較多保護(hù)。該攻擊研究的細(xì)節(jié)提供于下文實(shí)施例中。除非另有定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語(yǔ)皆具有與申請(qǐng)?zhí)峤粫r(shí)熟悉本發(fā)明的本領(lǐng)域技術(shù)人員通常所了解含義相同的含義。若明確定義，則本文提供的定義優(yōu)先于任何詞典或外來(lái)定義。此外，除非上下文另有要求，否則單數(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)包括復(fù)數(shù)，且復(fù)數(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)包括単數(shù)。在本文中，除非另有說(shuō)明，否則使用“或”是指“和/或”。本文所提及的所有專利及出版物皆以引用方式并入本文中。
實(shí)施例本發(fā)明包括下列實(shí)施例以闡述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解， 下列實(shí)施例中公開(kāi)的技術(shù)代表了本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)可良好用于實(shí)施本發(fā)明的技術(shù)，且因此可認(rèn)為這些技術(shù)為實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選方式。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容應(yīng)了解，可對(duì)所公開(kāi)具體實(shí)施方案實(shí)施多種改變且仍獲得相同或類似的結(jié)果，這并不背離本發(fā)明的精神及范圍。實(shí)施例1 原型疫苗及攻擊處理A.疫苗原型的制備豬放線桿菌(KSU-I)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)在250ml旋轉(zhuǎn)器中使用1毫升豬放線桿菌 (103007-1KSU)(批號(hào)為 201-9，10，11)來(lái)接種 150ml BHI 培養(yǎng)基(批號(hào)為 195-121)。將接種的培養(yǎng)基在37°C在約72rpm下放置6小吋。然后，將約2. 5ml接種的培養(yǎng)基添加至約 2500ml新鮮BHI培養(yǎng)基中。重復(fù)該步驟直至制得四份2500ml批料。將這四份批料在37°C 以約72rpm培育過(guò)夜。使用兩份批料以用于分離全細(xì)胞OMP及上清液部分，使用一份批料以用于制備濃全細(xì)胞部分，且最后一份批料用于LPS提取。收獲細(xì)胞部分在接種后15小時(shí)讀取批料的光密度。在600nm光密度介于0. 775 至0. 815范圍內(nèi)。在BAP上劃線將各培養(yǎng)物劃開(kāi)，以證實(shí)這些培養(yǎng)物只含豬放線桿菌。為了收集OMP及上清液部分，將兩份培養(yǎng)物批料轉(zhuǎn)移至500ml離心管中，放置于 JA-10轉(zhuǎn)子中，并以IOK旋轉(zhuǎn)10分鐘。輕輕倒出上清液，并將沉淀物轉(zhuǎn)移至250mL的無(wú)菌 Corning離心管中。將沉淀物在約5000rpm于JA-10轉(zhuǎn)子中離心10分鐘，并移除剩余的上清液。合并沉淀物并放置于-80°C，直至十二烷基肌氨酸鈉(sarcosyl)提取(見(jiàn)下文)。合并輕輕倒出的上清液，并通過(guò)0. 45 μ m過(guò)濾器(Nalgene 0. 45SFCA)過(guò)濾至2L的無(wú)菌Pyrex 瓶中。將過(guò)濾的上清液等分至2X850cm RB、81 X5mL小瓶及4X250mL Nalgene瓶中。將過(guò)濾的上清液儲(chǔ)存于_20°C直至使用。為了收集濃(IOx)全細(xì)胞沉淀物部分，如上文所述收獲ー份培養(yǎng)物批料，但是將沉淀物再懸浮于300mL TSP緩沖液中。將溶液充分混合并等分至50 X 2mL小瓶及4 X 50mL 疫苗瓶中。將再懸浮的全細(xì)胞沉淀物儲(chǔ)存于-80°C下直至使用。為了制備LPS部分，如上文所述收獲豬放線桿菌培養(yǎng)物。將沉淀物再懸浮于IXPBS緩沖液中，并以IOK rpm再離心10分鐘。輕輕倒出上清液，并將沉淀物再懸浮于1L1XPBS緩沖液中。約600nm下讀取的光密度為1. 003，其在LPS提取的預(yù)期范圍 0.8-1. 200內(nèi)。將LPS部分等分至3X250mL Nalgene瓶中，并儲(chǔ)存于_80°C直至使用。將剰余體積的LPS部分儲(chǔ)存于4°C以用于LPS提取。KSU-I全細(xì)胞福爾馬林滅活的疫苗收獲吋，在600納米波長(zhǎng)下測(cè)量的細(xì)胞培養(yǎng)物的光密度(OD)為0. 775。在先前研究中，基于按菌落形成単位(cfu)確定logs/mL的對(duì)數(shù)估計(jì)曲線，該光密度與logs/mL的相關(guān)性約為8. 71ogs/mL。將全細(xì)胞部分濃縮IOX并冷凍。隨后將冷凍的原液經(jīng)福爾馬林滅活，并稀釋(將54mL培養(yǎng)物稀釋于沈mL的1 X磷酸鹽緩沖鹽水(Pbs)中)至占總部分的67.5%。隨后將滅活的稀釋疫苗原液儲(chǔ)存于4°C。將全細(xì)胞福爾馬林滅活的疫苗原液從4°C取出以用于調(diào)配。在生物安全柜(bio-safety hood)中工作，將80mL物質(zhì)等分至IOOmL的具有磁力攪拌棒的無(wú)菌Pyrex瓶中。將瓶放置于攪拌板上，并在持續(xù)攪拌下經(jīng)1分鐘添加20mL(20% ν/ ν)助劑(tmulsigen -D)。隨后將加有助劑的原型再攪拌10分鐘。將物質(zhì)轉(zhuǎn)移至 IOOmL疫苗瓶中，蓋上蓋子并放置于4°C。全細(xì)胞福爾馬林滅活的疫苗原型的批號(hào)為 N201-110-WC-073108 (第 7 天)及 N201-122-WC-082108 (第 21 天)。通過(guò)分別在第0天及第21天于37°C好氧培育28小時(shí)及30小時(shí)后5%綿羊血瓊脂板(BAP)上無(wú)生長(zhǎng)來(lái)證實(shí)無(wú)菌性。在給予至測(cè)試動(dòng)物之前及整個(gè)疫苗給予操作期間，將疫苗原型物質(zhì)保持于冰上。KSU-I上清液福爾馬林滅活的疫苗通過(guò)收集上清液并通過(guò)0. 45微米過(guò)濾器過(guò)濾而從全細(xì)胞部分制備品的10X濃縮步驟(見(jiàn)上文)配制上清液原型。冷凍所得經(jīng)過(guò)濾的上清液。隨后將此上清液經(jīng)福爾馬林滅活，并儲(chǔ)存于4°c直至調(diào)配。調(diào)配步驟與全細(xì)胞福爾馬林滅活疫苗一祥。上清液福爾馬林滅活的疫苗原型的批號(hào)為N201-110-Supe-073108(第 7 天)及 N201-122-Supe-082108 (第 21 天)。證實(shí)了無(wú)菌性，并在給予至測(cè)試動(dòng)物之前及整個(gè)疫苗給予操作期間如先前所述來(lái)保持疫苗原型物質(zhì)。KSU-10MP部分疫苗通過(guò)利用以下OMP十二烷基肌氨酸鈉提取操作而從由KSU-I 培養(yǎng)物(分離株BI-103007-1KSU)制備并儲(chǔ)存于_80°C的沉淀物來(lái)產(chǎn)生OMP部分。在試驗(yàn)臺(tái) (benchtop)上解凍沉淀物。使用130mL的IOmMHEPES平衡鹽溶液將該沉淀物再懸浮5g 濕重)，并等分至四個(gè)50mL圓錐形hlcon管(40mL/管)中。(保留ImL再懸浮沉淀物樣品以用于蛋白質(zhì)定量及分析)。將再懸浮沉淀物放置于冰浴中，并使用(大的/微尖端)探針(50mL等分量)超聲處理1分鐘，其中超聲脈沖設(shè)置為1個(gè)脈沖/秒。將該超聲處理重復(fù)三次。(保留ImL超聲處理后樣品)。將超聲處理的沉淀物在50mL管中于17，OOOXg下離心20分鐘。然后，輕輕倒出上清液，并合并至單獨(dú)的容器中。將沉淀物儲(chǔ)存于4°C直至雙金雞寧酸分析(BCA)之后，隨后丟棄。將合并的上清液在超速離心機(jī)中進(jìn)行處理(約0. 0128kg/管)，離心機(jī)設(shè)置為 124, 000 Xg (30, OOOrpm), 1 10小時(shí)，4°C，最大加速度，且關(guān)閉突然制動(dòng)功能(no brake)。 輕輕倒出上清液，與先前的上清液合并，并儲(chǔ)存于4°C。將約ImL的IOmM HEPES添加于超速離心管中的各沉淀物上部，并將沉淀物在4°C培育過(guò)夜以使沉淀物自管松動(dòng)。向各管中再添加2mL的IOmM HEPES以再懸浮沉淀物。將各再懸浮沉淀物溶液使用適量IOmM HEPES補(bǔ)足至6mL(總體積)，并向各溶液中添加6mL的2%十二烷基肌氨酸鈉。將溶液在室溫培育 30分鐘。然后，使用2%十二烷基肌氨酸鈉使管在超速離心桶(約0.012 /管)中平衡， 并在超速離心機(jī)中進(jìn)行處理，離心機(jī)設(shè)置為1 ，000Xg，l 10小吋，4°C，最大加速度，且關(guān)閉突然制動(dòng)功能。將上清液收集至容器中，井向各沉淀物中添加ImL的IOmM HEPES0將 OMP沉淀物在4°C儲(chǔ)存1小吋，隨后測(cè)量蛋白質(zhì)濃度或使蛋白質(zhì)可見(jiàn)。在還原MOPS10-12% Bis-Tris SDS PAGE凝膠或NuPAGE 4-12% Bis-Tris凝膠上處理一式兩份的樣品(1 10稀釋)以使蛋白質(zhì)帶可見(jiàn)。使用BCA來(lái)測(cè)定最終OMP原液的總蛋白質(zhì)濃度，并在與助劑調(diào)配之前進(jìn)行測(cè)定?；谕ㄟ^(guò)BCA獲得的數(shù)值，OMP提取原液中所含蛋白質(zhì)的總質(zhì)量為1.75yg/mL?；谠摂?shù)值，所調(diào)配疫苗OMP原型的效能為250 μ g/ 劑。將再懸浮的所提取OMP部分等分成200 μ 1樣品，貼上標(biāo)簽，并冷凍于-70°C。將含有0. 5mL所提取OMP部分的5個(gè)小瓶從_70°C取出。使這些小瓶在室溫解凍。 在生物安全柜中工作，將23. 25mL的1 X磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)及2. 35mL的OMP物質(zhì)等分至IOOmL的具有磁力攪拌棒的無(wú)菌Pyrex瓶中。將瓶放置于攪拌板上，并在持續(xù)攪拌下經(jīng) 1分鐘添加6. 4mL(20% ν/ν)助劑(Emulsigen -D)。隨后將加有助劑的OMP原型疫苗再
攪拌10分鐘。將OMP原型疫苗轉(zhuǎn)移至60mL疫苗瓶中，蓋上蓋子并放置于4°C。OMP疫苗原型的批號(hào)為 N201-110-0MP-073108 (第 7 天)及 N201-122-0MP-082108 (第 21 天)。證實(shí)了無(wú)菌性，并在給予至測(cè)試動(dòng)物之前及整個(gè)疫苗給予操作期間如先前所述來(lái)保持疫苗原型物質(zhì)。Ingeivac APP-ALC疫苗將ー個(gè)APP-ALC瓶從_70°C取出，并在溫水中解凍。
解凍后，使用16號(hào)無(wú)菌針取出樣品，并放置于疫苗瓶中以用于效能測(cè)試。將疫苗瓶放置于 40C。在第0天及第21天對(duì)hgelvac APP-ALC實(shí)施滴定以測(cè)定每劑的菌落形成単位(CFU)。 將樣品連續(xù)稀釋10倍并鋪板至Mueller Hinton巧克カ瓊脂板上。重復(fù)實(shí)施三次，并在37°C 培育M小吋，隨后測(cè)定CFU。分別地，第0天的菌落形成單位為9. 991ogs/劑，且第21天為 10. 21ogs/ 劑。ingelvac APP-ALC 疫苗的批號(hào)為 N201-110-APP-073108(第 0 天)及 N201-122-APP-082108 (第 21 天)。在給予至測(cè)試動(dòng)物之前及整個(gè)疫苗給予操作期間如先前所述來(lái)保持疫苗原型物質(zhì)。安慰劑疫苗在生物安全柜中工作，將60mL的1 X磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)等分至 IOOmL的具有磁力攪拌棒的無(wú)菌Pyrex瓶中。將瓶放置于攪拌板上，并在持續(xù)攪拌下經(jīng)1分鐘添加15mL(20% ν/ν)助劑(Emulsigen -D)。隨后將加有助劑的原型再攪拌10分鐘。 將物質(zhì)轉(zhuǎn)移至IOOmL疫苗瓶中，蓋上蓋子并放置于4°C下。安慰劑疫苗的批號(hào)為N201-109。證實(shí)了無(wú)菌性，并在給予至測(cè)試動(dòng)物之前及整個(gè)疫苗給予操作期間如先前所述來(lái)保持安慰劑原型物質(zhì)。B.攻擊處理的準(zhǔn)備所用攻擊菌株為豬放線桿菌分離株ISU-8594p5。通過(guò)使用5mLISU_8594p4接種含有SOOmL豬腦心浸液(BHI-豬)培養(yǎng)基的1升Belco旋轉(zhuǎn)燒瓶來(lái)產(chǎn)生攻擊物質(zhì)。將旋轉(zhuǎn)器放置至約IOOrpm的37°C培育箱中。在接種后約5小時(shí)30分鐘時(shí)，培養(yǎng)物生長(zhǎng)至光密度 (0D600)為0. 109。隨后將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至6X IOOmL疫苗瓶(含有IOOmL總體積)中，用塞子塞住并蓋上蓋子。將5個(gè)瓶放置至含有冰袋的冷卻器中，并將用以代表其它5個(gè)瓶實(shí)施滴定的1個(gè)瓶放置于含有冰袋的另ー個(gè)冷卻器中。通過(guò)從將10倍連續(xù)稀釋物鋪板至5%綿羊血瓊脂板上產(chǎn)生的CFU計(jì)數(shù)來(lái)測(cè)定攻擊物質(zhì)的效價(jià)。獲得的攻擊效價(jià)為1.69X108cfu/ mL或9. 01ogs/6mL劑量。該攻擊物質(zhì)的批號(hào)為N201-138。在給予至測(cè)試動(dòng)物之前及整個(gè)攻擊操作期間將攻擊物質(zhì)保持于冰上。實(shí)施例2 為豬接種疫苗從Wilson Prairie View農(nóng)場(chǎng)獲得市售的雜交(cross)且3周士7日齡的雌性與閹割的雄性豬動(dòng)物的混合豬群。動(dòng)物健康且無(wú)臨床呼吸系統(tǒng)疾病跡象，且對(duì)例如下述細(xì)菌性呼吸系統(tǒng)病原體呈陰性胸膜肺炎放線桿菌(A. pleuropneumonia)、副豬嗜血桿菌 (H.parasuis)、豬鏈球菌(S. suis)、多殺巴斯德氏菌(P. multocida)、支氣管炎博德特菌 (B.bronchis印tica)、紅斑丹毒絲菌(E. rhusiopathiae)及豬放線桿菌。盡管如果以及當(dāng)與接種疫苗或攻擊無(wú)關(guān)的健康問(wèn)題變得明顯時(shí)允許將動(dòng)物從研究中排除，但沒(méi)有動(dòng)物被排除。在到達(dá)測(cè)試地點(diǎn)時(shí)，給所有動(dòng)物注射ImL的Excenei (一種短效抗生素)。將動(dòng)物圈養(yǎng)在測(cè)試地點(diǎn)直至研究結(jié)束。到達(dá)后在動(dòng)物耳朵上加上標(biāo)簽，并針對(duì)種類、年齢、體格及狀況適當(dāng)圈養(yǎng)。將攻擊及嚴(yán)格對(duì)照豬一起圈養(yǎng)在遠(yuǎn)離其他治療組的単獨(dú)建筑中的單獨(dú)圍欄中。攻擊吋，將攻擊對(duì)照組移到與治療組相同的建筑中。整個(gè)研究期間將所有治療組圈養(yǎng)在單獨(dú)圍欄中。定量給動(dòng)物提供不含抗生素且適于動(dòng)物種類、年齢、體格及狀況的食物。 在研究開(kāi)始時(shí)動(dòng)物健康及營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)良好。在納入研究之前由臨床獸醫(yī)按照普遍認(rèn)可的獸醫(yī)規(guī)范對(duì)每ー只動(dòng)物實(shí)施健康檢查。使用計(jì)算機(jī)隨機(jī)號(hào)碼產(chǎn)生器(Microsoft Office Excel)給每ー只動(dòng)物指定ー個(gè)獨(dú)特的隨機(jī)號(hào)碼。隨后將隨機(jī)號(hào)碼按遞增順序排序。從隨機(jī)號(hào)碼的最低區(qū)段開(kāi)始對(duì)治療組分配實(shí)驗(yàn)單元，并將其指定至治療組1至6來(lái)實(shí)施指定。增大隨機(jī)號(hào)碼，隨后將下一實(shí)驗(yàn)單元區(qū)段指定至治療組，以此類推，直至將所有動(dòng)物都指定至治療組。該功效研究由含有3周齡士7日齡的斷奶豬的6個(gè)治療組組成。治療組1(15頭豬)分別在研究的第0天及第21天經(jīng)肌內(nèi)(IM)接受IX 2mL劑量的福爾馬林滅活的全細(xì)胞豬放線桿菌。治療組2 (15頭豬)分別在研究的第0天及第21天經(jīng)IM接受IX 2mL劑量的福爾馬林滅活的豬放線桿菌培養(yǎng)物上清液。治療組3 (15頭豬)分別在第0天及第21天經(jīng)IM接受IX 2mL劑量的豬放線桿菌外膜蛋白(omp)。治療組4 (15頭豬)分別在第0天及
第21天經(jīng)IM接受1X 2mL劑量的Ingelvac APP-ALC。指定為“攻擊對(duì)照”的治療組5 (15
頭豬)分別在第0天及第21天經(jīng)IM給予途徑接受IX 2mL劑量的安慰劑。治療組6 (10頭豬)指定為“嚴(yán)格對(duì)照”，且未接受疫苗或安慰劑治療。所有組均觀察41天。在研究第35天，組1至5的每頭豬經(jīng)由鼻內(nèi)(IN)接種接受6mL劑量(每頭豬每只鼻孔施用3mL)的豬放線桿菌菌株ISU-8594(含有l(wèi)X109_°logS/·)。組6為“嚴(yán)格對(duì)照”組，未接受任何治療或攻擊。在第0天治療之前；在接種后4小時(shí)；和在接種后1天(下文用DPI表示接種后的天數(shù))、3、5、7、14、21、28、34、35、36、37、38、39、40 及 41DPI 采集所有動(dòng)物的直腸溫度。在第0天治療之前及每周(第7、14、21、28、34及41天)采集每ー只動(dòng)物的靜脈全血(6-10mL)以用于以后的血清學(xué)測(cè)試。
在治療之前及在接種后4、M、48及72小時(shí)檢查組1至5的所有豬的注射部位。檢查注射部位的腫脹、硬度及大小情況。記錄數(shù)據(jù)。以下評(píng)分系統(tǒng)用于注射部位觀察腫脹(0 =無(wú)，1 =存在腫脹)、外觀(0 =正常，1 =硬，2 =軟，3 =膿腫，4 =流出液體(draining)), 大小(0 =正常；對(duì)于所有其他情況，記錄長(zhǎng)度乘以寬度尺寸(厘米)(即長(zhǎng)度X寬度X直徑))。在第0天至第41天每天對(duì)于呼吸窘迫的任何癥狀實(shí)施臨床觀察，包括用力呼吸、 打噴嚏、咳嗽、呼吸運(yùn)動(dòng)改變、食欲減退、跛行、關(guān)節(jié)腫脹、脫水、站立能力、歩行(paddling)、 連續(xù)兩天或更多天垂死、或者死亡。將研究期間具有嚴(yán)重臨床癥狀的動(dòng)物人道地?zé)o痛處死，并進(jìn)行尸體剖檢以確定死亡原因。在研究第41天，將所有動(dòng)物無(wú)痛處死，且對(duì)所有肺切片進(jìn)行評(píng)分以測(cè)定肺病變的百分比。從每只動(dòng)物采集肺(若存在，取3個(gè)具有損傷的肺葉)、肝、腎、脾、扁桃體、及鼻甲、 氣管、支氣管、腦脊膜以及心臟血液的抹片的新鮮及固定的(僅對(duì)于肺而言)樣品，并進(jìn)行培養(yǎng)以用于細(xì)菌分離及組織病理學(xué)(僅對(duì)于肺而言)。實(shí)施例3 評(píng)估原型疫苗的功效A.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SAS 9. 1. 3版實(shí)施統(tǒng)計(jì)學(xué)分析以進(jìn)行數(shù)據(jù)管理及分析。合適時(shí)產(chǎn)生所有數(shù)據(jù)的概括統(tǒng)計(jì)表，包括平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、標(biāo)準(zhǔn)誤差、中值、范圍、95%置信區(qū)間、變異系數(shù)及頻率分布。分析包括所有仔豬治療組之間的所有配對(duì)比較。所有顯著性檢驗(yàn)均為P < 0. 05 水平的雙尾檢驗(yàn)，以測(cè)定各治療組間的差異。主要功效參數(shù)為非正態(tài)分布的顯微鏡可見(jiàn)損傷評(píng)分及肉眼可見(jiàn)損傷評(píng)分，通過(guò) Wilcoxon雙樣本檢驗(yàn)及Fisher精確檢驗(yàn)(Exact Test)對(duì)其進(jìn)行比較。次要功效參數(shù)系 (1)使用Wilcoxon雙樣本檢驗(yàn)比較的臨床癥狀；(2)使用Fisher精確檢驗(yàn)及ANOVA比較的發(fā)熱；和( 使用Fisher精確檢驗(yàn)比較的細(xì)菌分離。B.垂死的動(dòng)物在研究開(kāi)始后兩只動(dòng)物從該研究除去。在研究第11天發(fā)現(xiàn)動(dòng)物ID#31(治療組 4)死亡。肉眼檢查顯示該豬狀況較差且纖痩。其肺具有紅色及紫色污點(diǎn)，且其腹部具有膿性滲出物且患有纖維性腹膜炎。推測(cè)診斷為HPS或鏈球菌感染。使用本領(lǐng)域內(nèi)認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)新鮮組織及抹片樣品實(shí)施細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)。對(duì)回收的細(xì)菌菌落進(jìn)行分析，且分析發(fā)現(xiàn)該豬感染了化膿隱秘桿菌(Arcanobacterium pyrogenes)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophilia)及弗氏檸檬酸桿菌(CitrcAacter freundii)。固定肺樣品的組織病理學(xué)顯示無(wú)肺炎、壞死、胸膜炎或細(xì)菌菌落存在跡象。在第36天，即攻擊后1天發(fā)現(xiàn)動(dòng)物ID#32(治療組1)死亡。肉眼檢查顯示該豬的肺嚴(yán)重纖維化且胸腔中具有流體。其肺具有固結(jié)且較大的出血性區(qū)域。推測(cè)診斷為由豬放線桿菌攻擊引起的急性死亡。對(duì)新鮮組織及抹片樣品實(shí)施細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)?；厥账薪M織及抹片樣品中的豬放線桿菌(脾及氣管除外)。固定肺樣品的組織病理學(xué)顯示嚴(yán)重肺炎、壞死、 胸膜炎及細(xì)菌菌落存在的跡象。C.大體觀察從接種疫苗/安慰劑給予到攻擊(第0天至第35天)，每天觀察動(dòng)物的歸因于使用測(cè)試/對(duì)照物品進(jìn)行治療的不良事件或其它非由治療引起的健康異常。
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攻擊對(duì)照組及嚴(yán)格對(duì)照組(組5及6)中的豬的大體健康觀察結(jié)果如下豬#71(攻擊對(duì)照組)在第7天開(kāi)始顯示右前腿跛行癥狀，且持續(xù)至第M天，隨后癥狀消失。該觀察階段期間其余豬正常。疫苗治療組(組1至4)中的豬的大體健康觀察結(jié)果如下豬ID#51 (全細(xì)胞，組
1)在第1天顯示身體狀況較差且持續(xù)三天。在治療組4(APP，組4)中，豬ID#31如上文所述從該研究除去。組1至4中的其余豬具有正常的健康觀察結(jié)果。經(jīng)IM接種疫苗的治療組1、2、3及4的注射部位反應(yīng)情況如下豬#35 (上清液，組
2)及豬#10(APP，組4)在研究第1、2及3天記錄有IXIcm2區(qū)域的腫脹。對(duì)于第21天的疫苗接種事件未記錄注射部位評(píng)估。臨床觀察顯示，在第4天及第5天豬#10 (APP,組4)、 在第沈天及第四天豬#20 (APP,組4)、在第19天至第35天豬#40 (APP,組4)、在第沈天至第35天豬#41 (APP,組4)及在第14天至第35天豬#46 (APP,組4)觀察到頸部腫脹。所有其余動(dòng)物在該觀察階段期間均具有正常的健康傾向(disposition)。尸體剖檢時(shí)，治療組1 (全細(xì)胞)中的豬#69及豬#75 二者記錄為在注射部位具有頸部膿腫。尸體剖檢期間沒(méi)有報(bào)告其它不利的注射部位記錄。D.主要功效參數(shù)1.肉眼可見(jiàn)損傷尸體剖檢時(shí)(研究第41天)，取出每頭豬的肺并針對(duì)肉眼可見(jiàn)損傷進(jìn)行檢查。針對(duì)損傷百分比(percent involvement)對(duì)各肺葉進(jìn)行評(píng)分，并將總評(píng)分指定給各個(gè)體豬。 表1顯示各治療組的平均肺損傷評(píng)分及每ー組中具有陽(yáng)性評(píng)分(positive score)的動(dòng)物的數(shù)量。表1.各治療組的平均肉眼可見(jiàn)肺損傷評(píng)分及組內(nèi)具有陽(yáng)性肉眼可見(jiàn)評(píng)分的動(dòng)物的數(shù)量
權(quán)利要求
1.免疫原性組合物，其用于防止受試者受到豬放線桿菌感染，其包含a)從生長(zhǎng)至0.650OD65tl至0.850 OD65tl的一種或多種豬放線桿菌培養(yǎng)物收集的上清液；和b)助劑。
2.權(quán)利要求1的免疫原性組合物，其中該上清液基本上不含豬放線桿菌細(xì)胞。
3.權(quán)利要求1的免疫原性組合物，其中該上清液經(jīng)滅活。
4.權(quán)利要求3的免疫原性組合物，其中該上清液經(jīng)福爾馬林滅活。
5.權(quán)利要求1的免疫原性組合物，其中該助劑為Emulsigen -D。
6.權(quán)利要求1的免疫原性組合物，其中該受試者為豬科動(dòng)物。
7.一種在受試者中激發(fā)針對(duì)放線桿菌屬的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括向該受試者給予權(quán)利要求1的免疫原性組合物。
8.權(quán)利要求7的方法，其中該受試者為豬科動(dòng)物。
9.一種降低與豬放線桿菌感染有關(guān)的臨床病征的發(fā)生率或嚴(yán)重性的方法，所述方法包括向受試者給予權(quán)利要求1的免疫原性組合物的步驟，其中所述臨床病征的發(fā)生率或嚴(yán)重性的降低是相對(duì)于未接受該免疫原性組合物的受試者而言的。
10.權(quán)利要求9的方法，其中該臨床病征選自腦膜炎、敗血癥、子宮炎、肺炎、丹毒樣損傷和流產(chǎn)。
11.權(quán)利要求9的方法，其中該豬放線桿菌感染為豬放線桿菌ISU-8594感染。
12.權(quán)利要求9的方法，其中該受試者為豬科動(dòng)物。
13.一種制備權(quán)利要求1的免疫原性組合物的方法，所述方法包括a)使豬放線桿菌培養(yǎng)物生長(zhǎng)至0.650 OD650至0. 850 OD650 ；b)從該培養(yǎng)物收集上清液；c)將該上清液過(guò)濾，獲得濾液；和d)將該濾液與助劑混合。
14.權(quán)利要求13的方法，其還包括將該上清液滅活。
15.權(quán)利要求14的方法，其中在與助劑混合之前將該上清液滅活。
16.權(quán)利要求13的方法，其中該助劑為Emulsigen -D。
17.一種在受試者中診斷豬放線桿菌感染的方法，所述方法包括a)提供經(jīng)過(guò)濾的上清液，該上清液如下制備使豬放線桿菌培養(yǎng)物生長(zhǎng)至0.650 0D650至0. 850 0D650,從該培養(yǎng)物收集上清液，并將該上清液過(guò)濾；b)使該經(jīng)過(guò)濾的上清液與從該受試者獲得的樣品接觸；和c)若在該樣品中檢測(cè)到能夠與該經(jīng)過(guò)濾的上清液中的組分結(jié)合的抗體，則鑒定該受試者患有豬放線桿菌感染。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述結(jié)合利用能夠與該樣品中的抗體結(jié)合的第二抗體檢測(cè)。
19.試劑盒，其包括a)經(jīng)過(guò)濾的上清液，該上清液如下制備使豬放線桿菌培養(yǎng)物生長(zhǎng)至0. 650 OD650至 0. 850 OD650,從該培養(yǎng)物收集上清液，并將該上清液過(guò)濾；b)助劑；和c)用于包裝該上清液和助劑的容器。
20.權(quán)利要求19的試劑盒，其還包括該試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)。
21.權(quán)利要求19的試劑盒，其還包括將該經(jīng)過(guò)濾的上清液給予至受試者的裝置。
22.用于制備權(quán)利要求1的免疫原性組合物的試劑盒，其包括(i)上清液和(ii)助劑， 其中(i)和(ii)分開(kāi)包裝。
23.權(quán)利要求22的試劑盒，其還包括該試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)。
全文摘要
本發(fā)明涉及可用于抑制、治療、防御或預(yù)防豬放線桿菌感染的免疫原性組合物。已證實(shí)這些免疫原性組合物可在治療的豬中有效地刺激免疫原性應(yīng)答。有些疫苗刺激的反應(yīng)足以防御豬放線桿菌。另外，本發(fā)明提供包括所述免疫原性組合物的試劑盒；以及使用這些組合物和試劑盒的方法。
文檔編號(hào)A61K39/102GK102596242SQ201080050830
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2010年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月10日
發(fā)明者D.M.M.喬丹, J.J.克羅爾, P.厄特利 申請(qǐng)人:貝林格爾.英格海姆維特梅迪卡有限公司