專利名稱：新型肝素實體及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及滅菌后保持其生物活性的具有固定的生物活性實體的醫(yī)用底物。具體地，本發(fā)明涉及新的肝素實體及其使用方法。
背景技術(shù)：
用作機體內(nèi)和機體上的替代血管、合成人工晶體、電極、導(dǎo)尿管等的醫(yī)療裝置或用作連接機體以輔助手術(shù)或透析的體外裝置的醫(yī)療裝置是眾所周知的。但是，在醫(yī)療裝置中使用生物材料會引起不良機體反應(yīng)，包括迅速形成血栓作用。各種血漿蛋白對在生物材料 表面上引發(fā)血小板和纖維蛋白沉積起作用。這些作用導(dǎo)致阻礙血液流動的血管收縮，隨之而來的炎性反應(yīng)會導(dǎo)致醫(yī)療裝置功能的喪失。對血液接觸裝置而言，人們特別感興趣的是能減少或抑制在生物材料和/或覆蓋材料的表面上形成血栓的生物活性實體。糖胺聚糖(glycosaminoglycan)通常是優(yōu)選的抗血栓劑；特別優(yōu)選肝素、肝素類似物和衍生物。已對在生物材料上固定的糖胺多糖，如肝素，作出廣泛研究來改進生物相容性和血相容性。肝素化材料在降低形成血栓中的機理被認為在于肝素通過抗凝血酶III (ATIII)加速絲氨酸蛋白酶(凝血酶)失活的能力。該方法中，ATIII與肝素中定義明確的五糖序列形成絡(luò)合物，進行構(gòu)象變化，從而提高ATIII與絲氨酸蛋白酶如凝血酶的活性位點形成共價鍵的能力。形成的絲氨酸蛋白酶-ATIII絡(luò)合物再從肝素中釋放，留下所述肝素經(jīng)過催化過程經(jīng)歷后續(xù)循環(huán)失活。使生物活性實體，如肝素，以生物活性形式固定在底物上涉及對這些實體和生物材料的化學特性的了解。在醫(yī)療裝置領(lǐng)域，陶瓷、聚合物和/或金屬材料是常見的生物材料。這些材料可用于可植入裝置、診斷裝置或體外裝置。常常需要改性生物材料的化學組成以使生物活性實體固定在底物上。通常這樣進行這種改性處理生物材料表面以產(chǎn)生一群化學活性部分或基團，然后用合適的方法固定這些生物活性實體。對于其它生物材料，用其中摻有反應(yīng)性化學基團的材料覆蓋或涂覆生物材料的表面。然后通過覆蓋材料的反應(yīng)性化學基團將生物活性實體固定在生物材料上。已經(jīng)記載過各種用于覆蓋或涂覆生物材料的方案。固定到帶有覆蓋物或涂覆物的生物材料上的生物活性實體的代表性例子參見美國專利 4，810，784 ;5，213，898 ;5，897，955 ;5，914，182 ;5，916，585 ;和 6，461，665。當生物活性化合物、組合物或?qū)嶓w被固定時，固定過程可能對這些“生物制劑”的生物活性造成負面影響。許多生物制劑的生物學活性取決于該生物制劑在其固定狀態(tài)下的構(gòu)象和結(jié)構(gòu)(即伯、仲、叔等)。除了仔細選擇固定過程外，可能還需要對生物制劑進行化學改變才能將生物制劑以特定的構(gòu)象和結(jié)構(gòu)摻入覆蓋材料中，所述的構(gòu)象和結(jié)構(gòu)使所述的生物制劑具有足夠高的生物學活性來實現(xiàn)所需功能。盡管有優(yōu)化的覆蓋和固定方案，但其它處理如滅菌可能降低固定的生物制劑的生物學活性。在可移植醫(yī)療裝置中，需要在臨用前進行滅菌。也可能需要對具有污染物敏感性的體外診斷裝置進行滅菌。這類裝置的滅菌通常需要使裝置暴露于升高的溫度、壓力和濕度，通常是若干循環(huán)。在一些情況下，滅菌過程中包括抗微生物殺菌劑，如環(huán)氧乙烷氣體(EtO)或過氧化氫蒸汽。除滅菌外，機械壓縮和膨脹，或長期儲存固定的生物制劑會降低該生物制劑的活性。需要其上固定有生物活性實體的醫(yī)療裝置，可以在不顯著降低生物活性的前提下對醫(yī)療裝置進行滅菌、機械壓縮和膨脹和/或儲存。這類醫(yī)療裝置包括生物相容性組合物或化合物與固定的生物實體，以便最大程度減少滅菌、機械壓縮和膨脹和/或儲存期間該實體生物學活性的降低。在一些情況下，額外的生物相容性組合物或化合物可提高一些生物活性實體在滅菌后的生物學活性。發(fā)明概述因此，本發(fā)明包括醫(yī)療底物，所述醫(yī)療底物包括固定在底物上的肝素實體。與其他涂覆的醫(yī)療底物相比，本發(fā)明的肝素實體在固定、滅菌、機械壓縮和膨脹、和/或儲存之后保持明顯的生物學活性。本發(fā)明的一個實施方式包括醫(yī)療底物，所述醫(yī)療底物包括通過至少一個肝素分子結(jié)合到底物上的肝素實體，所述結(jié)合的肝素實體對肝素酶敏感。在另一個實施方式中，所述底物選自聚乙烯、聚氨酯、硅酮、含聚酰胺的聚合物、聚丙烯、聚四氟乙烯、膨脹型聚四氟乙烯、含氟聚合物、聚烯烴、陶瓷和生物相容性金屬。在另一個實施方式中，所述底物是膨脹型聚四氟乙烯。在另一個實施方式中，所述生物相容性金屬是鎳-鈦合金，如鎳鈦諾(Nitinol)。在另一個實施方式中，所述底物是醫(yī)療裝置的組件。在另一個實施方式中，所述醫(yī)療裝置選自移植物、人造血管、支架、支架-移植物、分叉狀移植物、分叉狀支架、分叉狀支架-移植物、貼片、塞子(Plug)、藥物遞送裝置、導(dǎo)尿管、心臟起搏器導(dǎo)線、氣囊和留置脈管濾器。在另一個實施方式中，在肝素酶處理之后，所述底物上檢測不到肝素或其片段。本發(fā)明的另一個實施方式包括肝素實體，所述肝素實體包括至少一個肝素分子和至少一個核心分子，當所述肝素實體通過至少一個肝素分子結(jié)合到底物上時，所述肝素實體對肝素酶敏感。在一個實施方式中，所述核心分子選自蛋白質(zhì)(包括多肽)、烴、氨基糖苷、多糖和聚合物。在另一個實施方式中，所述肝素實體通過至少一個肝素分子結(jié)合到底物上，所述結(jié)合的肝素分子通過端點連接與所述底物相連。在另一個實施方式中，所述肝素實體通過至少一個肝素分子結(jié)合到底物上，所述結(jié)合的肝素分子通過環(huán)狀連接(loopattachment)與所述底物相連。本發(fā)明的另一個實施方式包括ATIII結(jié)合實體，其包括核心分子、連接在所述核心分子上的至少一個多糖鏈和所述多糖鏈上的至少一個游離末端醛部分(moiety)。在一個實施方式中，所述多糖鏈是肝素或肝素片段。在另一個實施方式中，所述核心分子選自蛋白質(zhì)(包括多肽)、烴、氨基糖苷(aminoglycoside)、多糖和聚合物。在另一個實施方式中,所述底物選自聚乙烯、聚氨酯、硅酮、含聚酰胺的聚合物、聚丙烯、聚四氟乙烯、膨脹型聚四氟乙烯、含氟聚合物、聚烯烴、陶瓷和生物相容性金屬。在另一個實施方式中，所述ATIII結(jié)合實體通過端點連接或環(huán)狀連接結(jié)合到底物上。在另一個實施方式中，所述底物是醫(yī)療裝置的組件。本發(fā)明的另一個實施方式包括確定結(jié)合在底物上的肝素實體結(jié)構(gòu)的方法，其包括以下步驟提供包含肝素實體的底物，解聚所述肝素實體以生成可溶性肝素片段的混合物，采用柱色譜在所述混合物中檢測各可溶性肝素片段，確定來自上述步驟的各檢測肝素片段 的身份特征(identity)，以及從檢測到的肝素片段的身份特征得出所述肝素實體的結(jié)構(gòu)。在一個實施方式中，所述解聚通過肝素酶解聚進行。在另一個實施方式中，所述柱色譜是強陰離子交換高效液相色譜(SAX-HPLC)。本發(fā)明的另一個實施方式包括用于確定與底物結(jié)合的肝素實體結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括解聚溶液、標記試劑溶液和檢測器。在另一個實施方式中，所述解聚溶液包含肝素酶。在另一個實施方式中，所述標記試劑溶液包含甲苯胺藍和三(4-甲硫基)苯甲酸鋱。在另一個實施方式中，所述檢測器包括SAX-HPLC、表面熒光(印ifluoroscent)顯微鏡和吸收分光儀。附圖簡要說明圖I示出本發(fā)明的幾種肝素實體和所述肝素實體與底物的連接類型。圖2示出各種偶聯(lián)(conjugated)到膨脹型聚四氟乙烯(ePTFE)上并進行多次EtO滅菌的含醛肝素實體的ATIII結(jié)合能力。含醛肝素實體根據(jù)合成所述肝素實體時使用的核心分子進行分類。因此，實施例I中作為核心的是硫酸粘菌素(colistin sulfate),實施例2中的是新霉素，實施例4中的是聚-L-賴氨酸，實施例3中的是卷曲霉素，實施例5中的是聚乙烯亞胺(PEI)，實施例6中的是乙二胺(EDA)。所有的柱狀物表示樣品數(shù)的平均值，標出相對于標準偏差的誤差線。圖3A和B示出通過單端點連接方法固定在ePTFE底物上的包含游離末端醛的肝素實體用肝素酶-I處理并且用甲苯胺藍染色之前(3A)和之后(3B)的光學顯微圖。圖B與圖A相比未著色，證明通過單端點連接方法固定在ePTFE底物上的包含游離末端醛的肝素實體在肝素酶-I處理之后基本上從所述底物上解聚。圖3C示出通過端點醛連接和多點連接固定的肝素、包含通過端點連接和多點連接固定的新霉素核心和至少一個肝素分子的肝素實體和通過多點連接固定的USP肝素用肝素酶-I處理之前和之后的亮度歸一化變化(normalized change)。對于所有多點連接到所述底物上的肝素端點醛、具有端點醛的包含肝素和新霉素核心的肝素實體和USP肝素，亮度值的歸一化變化小，表示表面對肝素酶-I不敏感，在所述表面上仍存在大量肝素。圖4A-C示出通過單端點連接方法固定在ePTFE底物上的包含肝素和EDA核心的肝素實體用肝素酶-I處理并且用甲苯胺藍染色之前(4A和4B)和之后(4C)的光學顯微圖。染色樣品證明存在肝素實體。樣品4B和4C進行一輪滅菌，在滅菌后僅用去離子水清洗。經(jīng)過滅菌和肝素酶-I處理之后的圖4C的顏色表明肝素酶-I不能識別表面上的肝素實體。圖4D和E示出通過單端點連接方法固定在ePTFE底物上的包含肝素和EDA核心的肝素實體用肝素酶-I處理并且用甲苯胺藍染色之前(4D)和之后(4E)的光學顯微圖。這些樣品進行一輪滅菌并在滅菌后用去離子水和硼酸清洗。經(jīng)過滅菌之后的圖4E沒有顏色表明肝素酶-I能識別所述表面上的肝素實體并將其解聚。圖5A-C示出由肝素酶-I解聚(A)USP肝素、(B)由肝素和硫酸粘菌素構(gòu)成的肝素實體和(C)由肝素和硫酸新霉素構(gòu)成的肝素實體得到的SAX-HPLC色譜。圖6A和B示出由肝素酶-I解聚ePTFE表面固定的(a)通過游離末端醛結(jié)合的USP 肝素和(b)通過游離末端醛結(jié)合的由肝素和硫酸粘菌素構(gòu)成的肝素實體得到的SAX-HPLC色譜。
具體實施方式
本發(fā)明包括醫(yī)療底物，所述醫(yī)療底物包括固定到底物上的肝素實體。與其他涂覆的醫(yī)療底物相比，本發(fā)明的肝素實體在固定和滅菌之后保持顯著的生物學活性。在本發(fā)明公開的內(nèi)容中，使用了一些術(shù)語。給出以下定義。本文和所附權(quán)利要求書所用的單數(shù)形式“一個”、“一種”和“所述”包括復(fù)數(shù)含義，除非上下文另有明確說明。本文中使用的術(shù)語“肝素實體”表示共價連接在核心分子上的肝素分子。所述肝素分子可以通過端點連接(如下所述和基本如美國專利第4，613，665號所述，其通過引用結(jié)合入本文用于所有目的)或本領(lǐng)域已知的其他方法(參見例如GT Hermanson，《生物偶聯(lián)技術(shù)》Bioconjugate Techniques),學術(shù)出版社，1996 ；HG Garg等,肝素和硫酸肝素的化學和生物學性質(zhì)(Chemistry and Biology of Heparin and Heparan Sulfate), Elsevier,2005)連接到所述核心分子上。
本文中使用的術(shù)語“核心分子”表示其上連接肝素的多官能分子。出于本發(fā)明的目的，所述核心分子和底物不相同，雖然核心分子和底物可以由同樣的材料制成。在本文中，術(shù)語“基本純的”表示目標物質(zhì)是存在的主要物質(zhì)(即與組合物中的任意其他獨立的物質(zhì)相比，其摩爾基準更大)，優(yōu)選基本純的餾分是目標物質(zhì)構(gòu)成存在的所有大分子物質(zhì)的至少約50% (摩爾基準)的組合物。通常，基本上純的組合物包含存在于所述組合物中的大于約80 %至約90 %的所有大分子物質(zhì)。更優(yōu)選地，所述目標物質(zhì)純化成基本均勻(通過常規(guī)檢測方法在組合物中無法檢測到污染物質(zhì))，其中所述組合物基本上由單一的大分子物質(zhì)構(gòu)成。在本文中，術(shù)語“肝素酶”表示解聚(即消化)肝素的任何酶反應(yīng)。肝素酶的例子包括但不限于能解聚肝素的肝素酶-I、肝素酶-2、肝素酶-3、類肝素酶(heparanase)、外硫酸酯酶(exosulphatase)、細菌外酶和糖苷酶。在本文中，術(shù)語“對肝素酶敏感”表示用肝素酶處理包含肝素實體的底物并且用甲苯胺藍染色所述底物之后，所述底物未觀察到染色(基本如圖3B和圖4E所示)。該術(shù)語還表示可忽略量的甲苯胺藍與殘余肝素或其片段結(jié)合，能測量底物上甲苯胺藍(或其他標記物)量的檢測器，如分光光度計、亮度計、密度計、液體閃爍計數(shù)器、或Y計數(shù)器等的讀數(shù)約為背景水平，或者與不含肝素實體并用甲苯胺藍染色的底物相比時與背景水平?jīng)]有明顯不同，或者與未經(jīng)肝素酶處理的包含肝素實體并用甲苯胺藍染色的底物相比時低于所述檢測器的靈敏度。該術(shù)語還表示在用肝素酶處理包含肝素實體的底物之后，與肝素或其片段結(jié)合的標記物不能檢測到明顯量的肝素或其片段。在本文中，術(shù)語“結(jié)合”、“連接”和“偶聯(lián)”和其派生詞涉及肝素實體和/或肝素時表示共價結(jié)合，除非另外說明。參照

圖1A-C，本發(fā)明的一個實施方式包括醫(yī)療底物，所述醫(yī)療底物包括通過至少一個肝素分子104結(jié)合到底物106上的肝素實體100，所述結(jié)合的肝素實體對肝素酶敏感。用于固定或結(jié)合所述肝素實體的合適的底物材料包括聚合物，例如但不限于聚酰胺、聚碳酸酯、聚酯、聚烯烴、聚苯乙烯、聚氨酯、聚(醚氨酯)、聚氯乙烯、硅酮、聚乙烯、聚丙烯、聚異戊二烯、聚四氟乙烯和膨脹型聚四氟乙烯(ePTFE，如U. S專利第4，187，390號所述)。在一個實施方式中，所述底物是膨脹型或多孔聚四氟乙烯(ePTFE)。其他的底物包括但不限于疏水性底物，如聚四氟乙烯、膨脹型聚四氟乙烯、多孔聚四氟乙烯、氟化乙烯-丙烯、六氟丙烯、聚乙烯、聚丙烯、尼龍、聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚氨酯、橡膠、娃酮橡膠、聚苯乙烯、聚砜、聚酯、聚輕基酸(polyhydroxyacid)、聚碳酸酯、聚酰亞胺、聚酰胺、聚氨基酸、再生纖維素和蛋白質(zhì)如絲、羊毛和皮革。制備多孔聚四氟乙烯材料的方法如美國專利第3，953，566和4，187，390號所述，它們各自通過引用納入本文。在另一個實施方式中，所述ePTFE可以用至少一種已知的化合物浸潰、填充、浸潤(imbibe)或涂覆來引起生物活性應(yīng)答。引起生物活性應(yīng)答的化合物包括抗微生物劑(例如抗菌劑和抗病毒劑)、抗炎劑(例如地塞米松和潑尼松)、抗增殖劑(例如紫杉酚、紫杉醇(paclitaxel)和多烯紫杉醇(docetaxel))和抗聚結(jié)劑(例如阿昔單抗(abciximab)、依替巴肽(eptifibatide)和替羅非班(tirofibran))。在一個實施方式中，所述抗炎劑是類固醇。在另一實施方式中，所述類固醇是地塞米松。涂覆底物的方法為本領(lǐng)域熟知。在另一個實施方式中，所述底物包括本發(fā)明的肝素實體和涂層，所述涂層包含引起生物活性應(yīng)答的化合物。所述底物包括以上和以下所述的材料。在一個實施方式中，所述底物是ePTFE。 其他合適的底物包括但不限于纖維質(zhì)材料、瓊脂糖、藻酸鹽、聚羥基乙基甲基丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚烯丙基胺、聚烯丙基醇、聚丙烯酰胺和聚丙烯酸。此外，某些金屬和陶瓷可以用作本發(fā)明的底物。合適的金屬包括但不限于例如鈦、不銹鋼、金、銀、銠、鋅、鉬、銣和銅。合適的合金包括鈷-鉻合金如L-605、MP35N、埃爾吉洛伊耐蝕游絲合金(Elgiloy),鎳-鉻合金(如鎳鈦諾(Nitinol)),和銀合金如Nb-I % Zr等。用于陶瓷底物的合適的材料包括但不限于氧化硅(silicone oxide)、氧化鋁、鋁土、娃土、輕基磷灰石(hydroxyapapitite)、玻璃、氧化韓、聚娃燒醇(polysilanol)和氧化磷。在另一個實施方式中，可以使用基于蛋白質(zhì)的底物，如膠原。在另一個實施方式中，可以使用基于多糖的底物，如纖維素。一些底物可以具有大量反應(yīng)活性化學基團，增加至少一部分其上可結(jié)合本發(fā)明肝素實體的表面。本發(fā)明的所述肝素實體通過所述反應(yīng)活性化學基團與底物材料共價結(jié)合。所述底物的表面可以是光滑、粗糙、多孔、彎曲、平坦、有角、不規(guī)則的表面或其組合。在一些實施方式中，具有表面孔隙的底物含有由該材料多孔表面延伸到材料本體內(nèi)的內(nèi)部孔隙空間。這些多孔性底物的內(nèi)部底物材料約束了這些孔隙，常常提供適合固定生物活性實體的表面。無論是否具多孔性，底物都可以是細絲、薄膜、片層、管狀、網(wǎng)狀、織物、無紡織物和其組合。表面上缺少反應(yīng)活性化學基團(或缺少適當反應(yīng)活性的化學基團)的底物可以至少部分用聚合物覆蓋材料覆蓋，所述覆蓋材料上具有可以與所述肝素實體結(jié)合的大量反應(yīng)活性基團。聚合物底物也可以使用多種方法沿其表面或沿其聚合物主鏈進行改性，這些方法包括水解、氨解、光解、蝕刻、等離子體改性、等離子體聚合、碳烯插入、氮烯插入(nitreneinsertion)等。所述肝素實體通過覆蓋材料的反應(yīng)活性化學基團與聚合物覆蓋材料共價連接或結(jié)合，或者直接與已改性的底物共價連接或結(jié)合。所述聚合物覆蓋材料可以在至少一部分底物上形成至少一層。有多種其他的表面改性方法，例如美國專利第4，600, 652和6，642，242號所述，這些方法基于可以通過共價連接將具有聚氨酯脲層的底物與通過亞硝酸或高碘酸鹽氧化來包含醛基的改性肝素結(jié)合而作出。類似的技術(shù)如美國專利第5，032，666號所述，其中底物表面在用抗血栓形成劑(如醛活化的肝素)固定之前，用富胺的氟化聚氨酯脲涂覆。公開出版物W087/07156中描述的是另一種可能提及的抗血栓形成的表面改性方法。裝置的表面通過用溶菌酶或其衍生物層涂覆其上粘附有肝素的表面進行改性。制備抗血栓形成制品的另一種表面改性方法如美國專利第4，326，532號所述。在這種情況下，層狀抗血栓形成表面包括聚合物底物、與所述聚合物底物結(jié)合的殼聚糖和與所述殼聚糖涂層結(jié)合的抗血栓形成劑。其他文獻報道了也使用殼聚糖層來結(jié)合肝素的抗血栓形成的血濾器(hemofilter)。制備抗血栓形成表面的另一種方法如W097/07834所述，其中肝素與足量高碘酸鹽混合，從而不會以超過每肝素分子兩個糖單位(2糖單位/肝素分子)進行反應(yīng)。將該混合物加入醫(yī)療裝置的表面改性底物中，所述表面改性包含氨基。以上列出的向底物添加反應(yīng)活性基團的方法僅僅是如何將其實現(xiàn)的小例子。以上列舉沒有窮盡。此外，應(yīng)清楚用來向底物添加反應(yīng)活性化學基團的方法取決于本領(lǐng)域技術(shù)人員對底物性質(zhì)的認識。在本發(fā)明的另一個實施方式中，通過至少一個肝素分子包含所述結(jié)合的肝素實體的醫(yī)療底物是醫(yī)療裝置的組件。醫(yī)療裝置包括但不限于移植物、人造血管、支架、 支架-移植物、分叉狀移植物、分叉狀支架、分叉狀支架-移植物!貼片(hernia patch)、_塞(hernia plugs)、牙周移植物(periodontal graft)、手術(shù)用織物、藥物遞送裝置、導(dǎo)尿管、心臟導(dǎo)線氣囊(cardiac leads balloon)和留置濾器。在一個實施方式中，所述支架可以用于心臟、外周或神經(jīng)學應(yīng)用中。在一個實施方式中，所述支架-移植物可以用于心臟、夕卜周或神經(jīng)學應(yīng)用中。本發(fā)明的另一個實施方式包括一種肝素實體，所述肝素實體包含至少一個肝素分子和至少一個核心分子。如圖I所示，核心分子102是肝素實體100的“骨架”，肝素分子104結(jié)合在核心分子上。所述核心分子102可以是環(huán)狀(102a，圖IA和1C)、直線狀(102b，圖1B)、支鏈狀、樹枝狀、“Y”形、“T”形或“星”形，如Freudenberg, U.，《生物材料》，30，5049-5060，2009 和 Yamaguchi，N.，《生物大分子》，6，1921-1930，2005 中所述。在一個實施方式中，所述核心分子選自蛋白質(zhì)(包括多肽)、烴、脂質(zhì)、氨基糖苷、多糖和聚合物。蛋白質(zhì)包括但不限于抗體、酶、受體、生長因子、激素、絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpin)和任意球蛋白。特定的蛋白質(zhì)和多肽包括但不限于白蛋白、粘菌素、膠原、聚賴氨酸、抗凝血酶III、纖維蛋白、纖維蛋白原、凝血酶、層連蛋白(Iaminin)、和角蛋白等。在另一個實施方式中，所述核心分子可以是多肽。所述多肽無需很長，可以包括一種或多種氨基酸的重復(fù)，例如絲氨酸、甘氨酸(例如Ser-Gly-Gly-Ser-Gly)、賴氨酸或鳥氨酸殘基的重復(fù)?；蛘呖梢允褂闷渌陌被嵝蛄?，例如粘菌素、聚賴氨酸和多粘菌素。多糖的例子包括但不限于中性多糖如纖維素、淀粉、瓊脂糖、羧甲基纖維素、硝基纖維素和右旋糖苷，陰離子型多糖如藻酸鹽、肝素、硫酸肝素、硫酸右旋糖酐、黃原膠、透明質(zhì)酸、角叉菜膠、阿拉伯膠、黃蓍膠(tragacanth)、阿拉伯半乳聚糖和果膠；大環(huán)多糖如環(huán)糊精和羥丙基環(huán)糊精；和多陽離子型多糖如殼多糖和殼聚糖。合成聚合物的例子包括但不限于聚乙二醇(PEG) 200，300，400，600，1000，1450，3350，4000，6000，8000和20000、聚四氟乙烯、聚丙二醇、聚(乙二醇-共-丙二醇)、聚乙
二醇的共聚物、聚丙二醇的共聚物、四氟乙烯與乙酸乙烯酯和乙烯醇的共聚物、乙烯與乙酸乙烯酯和乙烯醇的共聚物、聚乙烯醇、聚乙烯亞胺、聚丙烯酸；多元醇如聚乙烯醇和聚烯丙基醇；聚陰離子如丙烯酸和聚(甲基丙烯酸)。聚陽離子共聚物包括聚(烯丙胺)、聚(乙烯亞胺)、聚(胍)、聚(乙烯胺)、聚乙二醇-二胺、乙二胺和聚(季胺)；聚丙烯腈如水解聚丙烯腈、聚(丙烯酰胺-共-丙烯腈)和它們的共聚物。其他共聚物包括氟化共聚物，所述氟化共聚物包括四氟乙烯與乙烯醇、乙酸乙烯酯、乙烯甲酰胺、丙烯酰胺和乙烯胺的共聚物。在另一個實施方式中，所述核心分子可以是氨基糖苷，包括但不限于丁胺卡那霉素、阿貝卡星(arbekacin)、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、乙基西梭霉素、巴龍霉素、紅鏈霉素(rhodostreptomycin)、鏈霉素、妥布霉素和阿普拉霉素。肝素是從豬腸或牛肺中分離的粘多糖，其分子大小和化學結(jié)構(gòu)是不均勻的。肝素由交替的葡糖醛酸和葡糖胺單元構(gòu)成。葡糖醛酸單元由D-葡糖醛酸和L-艾杜糖醛酸組成。分別是D-和L-(l，4)_結(jié)合至D-葡糖胺單元。較大比例的L-艾杜糖醛酸殘基在2-位被硫酸化。D-葡糖胺單元為N-硫酸化，在6-位被硫酸化，a-(1，4)_結(jié)合到糖醛酸殘基上。一些D-葡糖胺單元也在3-位被硫酸化。肝素包含分子量約為6，000-30, 000道爾頓的材料。通過硫酸化和乙?；圆煌某潭妊苌闪u基和胺基。肝素中產(chǎn)生抗凝血性質(zhì)的活性序列是與配體抗凝血酶III (ATIII)結(jié)合的獨特五糖序列。該序列由三個D-葡糖胺和兩個 糖醛酸殘基組成。肝素分子也可以根據(jù)其五糖含量進行分類。約三分之一的肝素包含具有對ATIII有高親和性的一個拷貝的獨特五糖序列的鏈(參見Choay，血栓和止血研討會(Seminars in Thrombosis and Hemostasis) 11 :81-85 (1985),其通過引用納入本文)，而較小的比例(估計約為總肝素的1% )由含超過一個拷貝的高親和性五糖的鏈組成(參見Rosenberg 等，Biochem. Biophys. Res. Comm. 86 :1319-1324(1979)，其通過引用納入本文)。剩余的肝素(約66%)不包含五糖序列。因此，所謂的“標準肝素”由以下三種物質(zhì)的混合物構(gòu)成“高親和性”肝素，其富含含有至少一個拷貝的五糖的物質(zhì)，“極高親和性”肝素表示大約I %的分子包含超過一個拷貝的五糖序列。這三種物質(zhì)可以使用常規(guī)色譜法彼此分離，例如在抗凝血酶親和柱上進行色譜(例如Sepharose-AT ;參見,例如Lam等，Biochem.Biophys. Res. Comm. 69 :570-577(1976)和 Horner Biochem. J. 262 :953-958 (1989)，其通過引用納入本文)。在一個實施方式中，所述肝素來自動物。在另一個實施方式中，所述肝素來自?；蜇i。在另一個實施方式中，所述肝素是合成肝素，即非動物來源(例如磺達肝素(fondaparinux)或依諾肝素(enoxaparin))。在另一個實施方式中，本發(fā)明的肝素實體包括濃縮的肝素，并且包含基本上純的“高親和性”肝素。在另一個實施方式中，本發(fā)明的肝素實體包括濃縮的肝素，并且包含基本上純的“極高親和性”肝素。在另一個實施方式中，本發(fā)明的肝素實體包括濃縮的肝素，并且包含基本上純的“高親和性”和“極高親和性”肝素的組合。本發(fā)明的另一個實施方式包括通過至少一個肝素分子將所述肝素實體與醫(yī)療底物結(jié)合。如圖I所示，本發(fā)明的肝素實體通過至少一個肝素分子與所述底物結(jié)合。這樣，在一個實施方式中，所述結(jié)合的肝素分子通過端點連接與所述底物相連(如圖IA和IB所示)。在另一個實施方式中，所述結(jié)合的肝素分子通過端點醛與所述底物相連。這可以基本上如美國專利第4，613，665號(其全文內(nèi)容通過引用納入本文)所述并且如以下所述完成。在另一個實施方式中，所述肝素實體通過至少一個肝素分子結(jié)合到底物上，所述結(jié)合的肝素分子通過環(huán)狀連接(loop attachment)與所述底物相連。如圖IC所示,環(huán)狀連接是所述肝素實體通過至少一個肝素連接的連接方式，其中所述肝素在少量位置上與所述底物松散地連接，從而使得相當部分的結(jié)合肝素與肝素酶相接觸(與將肝素緊密地連接在大量位置上的更常見的方法相反)。將肝素與底物偶聯(lián)的更常見的方法包括使大部分沿肝素分子長度無規(guī)定位的官能團反應(yīng)(例如使用偶聯(lián)劑如碳二亞胺、環(huán)氧化物和聚醛)。這些方法使得所述活性序列(上述獨特的五糖序列)有很大的可能與所述底物結(jié)合，得到降低的活性和/或喪失活性。在肝素的環(huán)狀連接中，只有肝素上的一些官能團反應(yīng)并與所述底物結(jié)合。因此，很可能連接的肝素中的活性序列未與所述底物相結(jié)合，從而使得所述活性序列與其配體結(jié)合。在另一個實施方式中，本發(fā)明包括與所述底物有多種連接方式的肝素實體，其中所述活性序列未與所述底物結(jié)合。在另一個實施方式中，所述結(jié)合的肝素分子通過環(huán)狀連接與所述底物相連。如上所述，端點連接和環(huán)狀連接使得至少一個肝素分子中的相當部分(在肝素實體中)未與底物結(jié)合。本文中，術(shù)語“相當部分”表示約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%的肝素分子未與所述底物結(jié)合。在另一個實施方式中，該術(shù)語還表示與所述底物結(jié)合的所述至少一個肝素分子(在肝素實體中)不通過其活性序列與底物結(jié)合。因此，由于所述活性序列未與所述底物的表面結(jié)合，所述活性序列與其配體相互作用的可能性較高。換言之，如果所述活性序列與所述底物的表面結(jié)合，則肝素與其配體結(jié)合的機會就小。但是，由于所述肝素實體通過端點連接和/或環(huán)狀連接由肝素相連，所述肝素對肝素酶敏感。因此，在肝素酶處理之后，在所述底物的表面上有極少(如果有的話)的肝素或其片段。相反，一些更常見的將肝素與底物表面相連的方法(如上所述，其沿肝素分子的長度包含多個鍵)在肝素酶處理之后，將仍有大量肝素或其片段與所述底物表面相連。因此，在肝素酶處理之后，可以在所述底物表面上檢測到肝素或其片段。不限于任何具體理論，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了結(jié)合肝素或肝素實體對肝素酶越敏感，所述結(jié)合肝素或肝素實體的生物活性越高。這可能是因為結(jié)合肝素或肝素實體的活性序列不與底物的表面相連，因此所述結(jié)合肝素或肝素實體與其配體結(jié)合的機會更大。肝素必須具有完整的構(gòu)象和結(jié)構(gòu)來被ATIII識別，如果所述構(gòu)象和結(jié)構(gòu)損失，肝素將表現(xiàn)出很差的活性。此外，所述構(gòu)象和結(jié)構(gòu)損失導(dǎo)致其他蛋白質(zhì)如肝素酶-I的識別性差，使得損失肝素難以解聚。例如，用碳二亞胺改性可溶性肝素以不再被肝素酶-I識別的方式改變所述可溶性肝素結(jié)構(gòu)，改性的可溶性肝素具有降低的全血抗凝血活性(參見Olivera, G. B.，生物材料(Biomaterials)，24，4777-4783，2003)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)連接的肝素或肝素實體的肝素酶敏感性可通過所述連接肝素或肝素實體的ATIII結(jié)合活性來預(yù)測。不希望受限于任何具體理論，如果連接的肝素或肝素實體保持對特定酶如肝素酶-I的特異性(specificity)，則所述連接的肝素或肝素實體保持對其基本上足夠的初級/二級/三級結(jié)構(gòu)，也具有對ATIII的特異性。因此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當連接的肝素或肝素實體被肝素酶-I識別時，所述連接的肝素或肝素實體也被ATIII識別，即具有高結(jié)合活性。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)硼酸清洗能恢復(fù)失活的連接肝素或肝素實體(例如通過滅菌、機械壓縮和膨脹或長期儲存失活)對肝素酶敏感性。因此，本發(fā)明的另一個實施方式包括一種恢復(fù)結(jié)合在底物上的肝素或肝素實體的肝素酶敏感性的方法，其包括在硼酸溶液中清洗所述底物。在一個實施方式中，對所述底物進行滅菌循環(huán)。在另一個實施方式中，對所述底物進行降低肝素酶-I活性的機械處理。 在本發(fā)明的另一個實施方式中，在用肝素酶對具有本發(fā)明的結(jié)合肝素實體的醫(yī)療底物進行處理之后，在所述底物上檢測不到肝素或其片段。在另一個實施方式中，在用肝素酶對具有本發(fā)明的結(jié)合肝素實體的醫(yī)療底物進行處理之后，與肝素酶處理之前相比，檢測到的肝素或其片段水平明顯更低。明顯更低水平的檢測包括對肝素染色和/或標記之后的極少檢測。在另一個實施方式中，所述肝素或其片段在染色或標記之后視覺上(宏觀上)觀察不到。肝素或其片段可以通過直接或間接與肝素或其片段結(jié)合的標記物進行檢測。在一個實施方式中，與肝素或其片段結(jié)合的所述標記物選自染料、抗體和蛋白。標記物的例子包括但不限于蛋白，包括抗肝素抗體(多克隆或單克隆)和ATIII ;異染性染料，包括甲苯胺藍、天青 A(azure A)、阿辛藍(alcian blue)、維多利亞藍 4R(victoria blue 4R)、夜藍(night blue)、亞甲藍；放射性碘化標記物，包括放射性碘化甲苯胺藍、放射性碘化亞甲藍、放射性碘化肝素抗體、放射性碘化ATIII ;氚化標記物，包括氚化甲苯胺藍、氚化天青A、氚化阿辛藍、氚化維多利亞藍4R、氚化夜藍、氚化亞甲藍；碳-14標記物，包括14C-甲苯胺藍、14C-天青A、14C-阿辛藍、14C-維多利亞藍4R、14C-夜藍、14C-亞甲藍；熒光標記物，包括若丹明(rhodamine)標記的肝素抗體、突光素標記的肝素抗體、若丹明標記的ATIII、突光素標記的ATIII。在另一個實施方式中，所述染料是甲苯胺藍。在另一個實施方式中，在肝素酶處理之后，可忽略量的甲苯胺藍與肝素或其片段結(jié)合，但在所述底物上目測檢測不到(基本上如圖3B和4E所示)。在另一個實施方式中，在肝素酶處理之后，可忽略量的甲苯胺藍與殘余的肝素或其片段結(jié)合，能測量底物上甲苯胺藍(或上述其他標記物)量的檢測器(例如分光光度計、亮度計、密度計、液體閃爍計數(shù)器、或Y計數(shù)器等)的讀數(shù)約為背景水平，或者與不含肝素實體的底物相比時與背景水平?jīng)]有明顯差別。在另一個實施方式中，在肝素酶處理之后，能測量底物上甲苯胺藍(或上述其他標記物)量的檢測器讀數(shù)與未經(jīng)肝素酶處理的包含肝素實體并用甲苯胺藍染色的底物相比時明顯不同。本發(fā)明的另一個實施方式包括肝素實體，所述肝素實體包括至少一個與核心分子相連的肝素分子，其中所述實體通過肝素分子與底物結(jié)合，在與肝素酶和甲苯胺藍接觸之后，所述底物宏觀上顯示其表面上基本上無甲苯胺藍(如圖3B和4E所示)。本發(fā)明的另一個實施方式包括肝素實體，所述肝素實體包括至少一個肝素分子和至少一個核心分子，當所述肝素實體通過至少一個肝素分子結(jié)合到底物上時，所述肝素實體對肝素酶敏感。在另一個實施方式中，所述底物選自聚乙烯、聚氨酯、硅酮、含聚酰胺的聚合物、聚丙烯、聚四氟乙烯、膨脹型聚四氟乙烯、生物相容性金屬、陶瓷、蛋白質(zhì)、多糖和任意上述底物。在另一個實施方式中，所述底物是膨脹型聚四氟乙烯。在另一個實施方式中，所述底物是醫(yī)療裝置的組件。在另一個實施方式中，所述醫(yī)療裝置選自移植物、人造血管、支架、支架-移植物、分叉狀移植物、分叉狀支架、分叉狀支架-移植物、貼片、塞子(Plug)、藥物遞送裝置、導(dǎo)尿管和心臟導(dǎo)線。在另一個實施方式中，所述支架可以用于心臟、外周或神經(jīng)學應(yīng)用中。在一個實施方式中，所述支架-移植物可以用于心臟、外周或神經(jīng)學應(yīng)用中。在另一個實施方式中，所述醫(yī)療裝置可以用于矯形外科、皮膚科或婦科應(yīng)用中。在另一個實施方式中，所述核心分子包括環(huán)形、直鏈、支鏈、樹枝狀、“Y”、“T”或星狀分子結(jié)構(gòu)。在另一個實施方式中，所述核心分子選自蛋白質(zhì)、多肽、烴、多糖、氨基糖苷、聚合物和含氟聚合物。
在另一個實施方式中，通過與肝素或其片段結(jié)合的標記物檢測肝素或其片段。在另一個實施方式中，與肝素或其片段結(jié)合的所述標記物選自染料、多克隆抗體和蛋白質(zhì)。在另一個實施方式中，所述染料是甲苯胺藍。在另一個實施方式中，在肝素酶處理之后，可忽略量的甲苯胺藍與殘余肝素或其片段結(jié)合，在所述底物上目測檢測不到。在另一個實施方式中，在肝素酶處理之后，可忽略量的甲苯胺藍與殘余的肝素或其片段結(jié)合，能測量底物上甲苯胺藍(或上述其他標記物)量的檢測器(例如分光光度計、亮度計、密度計、液體閃爍計數(shù)器、或Y計數(shù)器等)的讀數(shù)約為背景水平，或者與不含肝素實體的底物相比時與背景水平?jīng)]有明顯差別。在另一個實施方式中，在肝素酶處理之后，能測量底物上甲苯胺藍(或上述其他標記物)量的檢測器讀數(shù)與未經(jīng)肝素酶處理的包含肝素實體并用甲苯胺藍染色的底物相比時明顯不同。在另一個實施方式中，所述肝素實體通過至少一個肝素分子結(jié)合在底物上，所述結(jié)合的肝素分子通過端點連接與所述底物相連。在另一個實施方式中，所述肝素實體通過至少一個肝素分子結(jié)合在底物上，所述結(jié)合的肝素分子通過端點醛與所述底物相連。在另一個實施方式中，所述肝素實體通過至少一個肝素分子結(jié)合在底物上，所述結(jié)合的肝素分子通過環(huán)狀連接(loop attachment)與所述底物相連。在另一個實施方式中，所述肝素實體通過至少一個肝素分子結(jié)合在底物上，所述結(jié)合的肝素分子通過醛 沿所述肝素長度與所述底物相連。本發(fā)明的另一個實施方式包括ATIII結(jié)合實體，其包括核心分子、與所述核心分子相連的多糖鏈和在所述多糖鏈上的游離末端醛部分。該ATIII結(jié)合實體則可以通過末端醛與底物相連。本發(fā)明的另一個實施方式包括ATIII結(jié)合實體，其包括核心分子、與所述核心分子相連的多糖鏈和沿所述多糖鏈長度的游離末端醛部分。該ATIII結(jié)合實體則可以通過醛沿著所述多糖鏈的長度與底物環(huán)狀連接。在另一個實施方式中，所述多糖鏈是肝素。在另一個實施方式中，所述核心分子選自蛋白質(zhì)(包括多肽)、烴、氨基糖苷、多糖、聚合物、含氟聚合物或本文所述的任意核心分子。在另一個實施方式中，肝素通過端點連接結(jié)合在所述核心分子上。在另一個實施方式中，所述底物選自聚乙烯、聚氨酯、硅酮、含聚酰胺的聚合物、聚丙烯、聚四氟乙烯、膨脹型聚四氟乙烯、生物相容性金屬或本文所述的任意底物。在另一實施方式中，所述生物相容性金屬是鎳鈦諾(Nitinol)。在另一個實施方式中，所述底物是膨脹型聚四氟乙烯。在另一個實施方式中，所述底物是醫(yī)療裝置的組件。在另一個實施方式中，所述醫(yī)療裝置選自移植物、人造血管、支架、支架-移植物、分叉狀移植物、分叉狀支架、分叉狀支架-移植物、貼片、塞子(Plug)、藥物遞送裝置、導(dǎo)尿管和心臟導(dǎo)線。在另一個實施方式中，所述醫(yī)療裝置可以用于心臟、外周、神經(jīng)學、矯形外科、皮膚科或婦科應(yīng)用中。本發(fā)明的另一個實施方式包括可植入的醫(yī)療裝置，所述醫(yī)療裝置包括醫(yī)療底物、所述醫(yī)療底物包括通過至少一個肝素分子結(jié)合在底物上的肝素實體，所述結(jié)合的肝素實體對肝素酶敏感。在一個實施方式中，所述醫(yī)療裝置選自移植物、人造血管、支架、支架-移植物、分叉狀移植物、分叉狀支架、分叉狀支架-移植物、貼片、塞子(Plug)、藥物遞送裝置、導(dǎo)尿管和心臟導(dǎo)線。在另一個實施方式中，所述支架可以用于心臟、外周或神經(jīng)學應(yīng)用中。在另一個實施方式中，所述支架可以是可擴張氣囊的和/或自膨脹型支架。所述支架可以由任意生物相容性材料制備，所述生物相容性材料包括上述任意聚合物或金屬。在另一個實施方式中，所述支架由鎳鈦諾和/或不銹鋼制成。在另一個實施方式中，所述支架包括移植物。在另一個實施方式中，所述移植物和/或支架包括本發(fā)明的肝素實體。與其他涂覆的醫(yī)療底物相比，本發(fā)明的肝素實體在固定和滅菌之后保持明顯的生物學活性。因此，在一個實施方式中，所述金屬底物包括通過至少一個肝素分子結(jié)合到底物上的肝素實體，所述結(jié)合的肝素實體對肝素酶敏感，其ATIII活性約為300皮摩爾/平方厘米。在另一個實施方式中，所述ATIII活性約為250皮摩爾/平方厘米、約200皮摩爾/平方厘米、約150皮摩爾/平方厘米、約100皮摩爾/平方厘米、約50皮摩爾/平方厘米、約40皮摩爾/平方厘米、約30皮摩爾/平方厘米、約20皮摩爾/平方厘米、約10皮摩爾/平方厘米或約5皮摩爾/平方厘米。在另一個實施方式中，在第一輪滅菌之后，所述醫(yī)療底物的ATIII活性約為250皮摩爾/平方厘米、約200皮摩爾/平方厘米、約150皮摩爾/平方厘米、約100皮摩爾/平方厘米、約50皮摩爾/平方厘米、約40皮摩爾/平方厘米、約30皮摩爾/平方厘米、約20皮摩爾/平方厘米、約10皮摩爾/平方厘米或約5皮摩爾/平方厘米。在另一個實施方式中，在第二輪滅菌之后，所述醫(yī)療底物的ATIII活性約為100皮摩爾/平方厘米、約90皮摩爾/平方厘米、約80皮摩爾/平方厘米、約70皮摩爾/平方厘米、約60皮摩爾/平方厘米、約50皮摩爾/平方厘米、約40皮摩爾/平方厘米、約30皮摩爾/平方厘米、約20皮摩爾/平方厘米、約10皮摩爾/平方厘米或約5皮摩爾/平方厘米。在另 一個實施方式中，在第三輪滅菌之后，所述醫(yī)療底物的ATIII活性高于約50皮摩爾/平方厘米、或者約為70皮摩爾/平方厘米、約60皮摩爾/平方厘米、約50皮摩爾/平方厘米、約40皮摩爾/平方厘米、約30皮摩爾/平方厘米、約20皮摩爾/平方厘米、約10皮摩爾/平方厘米或約5皮摩爾/平方厘米。ATIII活性鑒定方法是本領(lǐng)域熟知的，至少一種如下所述。在另一個實施方式中，本發(fā)明的所述肝素實體在壓縮和膨脹醫(yī)療裝置之后保持明顯的生物活性。在另一個實施方式中，本發(fā)明的所述肝素實體在經(jīng)過醫(yī)療裝置的壓縮和/或膨脹狀態(tài)下的儲存條件之后保持明顯的生物活性。本發(fā)明的另一個實施方式包括確定與底物結(jié)合的肝素實體結(jié)構(gòu)的方法。確定與底物結(jié)合的肝素實體結(jié)構(gòu)的一種方法包括以下步驟提供包含肝素實體的底物，解聚所述肝素實體以產(chǎn)生可溶性肝素片段的混合物，用柱色譜檢測所述混合物中的各可溶性肝素片段，確定以上檢測到的可溶性肝素片段的身份特征，和從所述檢測到的可溶性肝素片段的身份特征得到所述肝素實體的結(jié)構(gòu)。在一個實施方式中，所述解聚通過肝素酶-I進行。在另一個實施方式中，柱色譜是強陰離子交換高效液相色譜或SAX-HPLC。本發(fā)明的另一個實施方式包括可植入的醫(yī)療裝置，所述醫(yī)療裝置包括醫(yī)療底物、所述醫(yī)療底物包括通過至少一個肝素分子結(jié)合在底物上的肝素實體，所述結(jié)合的肝素實體對肝素酶敏感。在一個實施方式中，所述醫(yī)療裝置選自移植物、人造血管、支架、支架-移植物、分叉狀移植物、分叉狀支架、分叉狀支架-移植物、貼片、塞子(Plug)、藥物遞送裝置、導(dǎo)尿管、心臟導(dǎo)線、氣囊和留置濾器。在另一個實施方式中，所述支架可以用于心臟、外周或神經(jīng)學應(yīng)用中。在另一個實施方式中，所述支架可以是可擴張氣囊的和/或自膨脹型支架。所述支架可以由任意生物相容性材料制備，所述生物相容性材料包括上述任意聚合物或金屬。在另一個實施方式中，所述支架由鎳鈦諾和/或不銹鋼制成。在另一個實施方式中，所述支架包括移植物。在另一個實施方式中，所述移植物和/或支架包括本發(fā)明的肝素實體。本發(fā)明的另一個實施方式包括確定與底物結(jié)合的肝素實體的空間分布的方法。確定與底物結(jié)合的肝素實體的空間分布的一種方法包括以下步驟提供包含肝素實體的底物，解聚所述肝素實體以產(chǎn)生包含表面結(jié)合的不飽和肝素片段的表面，使所述表面與標記試劑反應(yīng)，所述標記試劑向所述表面結(jié)合的不飽和肝素片段引入可檢測組分，通過所述可檢測組分檢測所述表面結(jié)合的不飽和肝素片段，以及從存在的表面結(jié)合的不飽和肝素片段得到所述肝素實體的空間分布。在一個實施方式中，解聚通過肝素酶-I進行。在另一個實施方式中，所述肝素試劑是鑭系邁克爾類加成有機絡(luò)合物(lanthanoid Michael-Iikeaddition organo-complex)。在另一個實施方式中，所述標記試劑是三(4-甲硫基)苯甲酸鋱。在另一個實施方式中，所述有機絡(luò)合物包含化學吸收的金納米顆粒。在另一個實施方式中，所述檢測通過表面熒光顯微鏡或透射電子顯微鏡進行。本發(fā)明的另一個實施方式包括用于確定與底物結(jié)合的肝素實體結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括解聚溶液、標記試劑溶液和檢測器。系統(tǒng)是用來檢測與底物結(jié)合的肝素實體結(jié)構(gòu)和類型的試劑和設(shè)備的組合件。在一個實施方式中，所述解聚溶液包括肝素酶-I。在另一個 實施方式中，所述標記試劑溶液包含甲苯胺藍和三(4-甲硫基)苯甲酸鋱。在另一個實施方式中，所述檢測器包括SAX-HPLC、表面熒光(印ifluoroscent)顯微鏡和吸收分光儀。在另一個實施方式中，所述試劑的組合件可以是試劑盒。在對端點連接的肝素和/或肝素實體進行酶促肝素酶-I解聚之后，留在表面上的肝素片段是不飽和的，即它們包含碳碳雙鍵(“殘根(nub)”)。酶促肝素酶解聚涉及將非還原性末端糖醛酸殘基切割成4，5-不飽和衍生物。這得到與底物結(jié)合的剩余表面結(jié)合的不飽和肝素片段，所述肝素片段包括碳碳雙鍵。因此，所述剩余表面結(jié)合的不飽和肝素片段結(jié)構(gòu)是不飽和的，可以與各種檢測分子反應(yīng)，這些檢測分子包括邁克爾類加成絡(luò)合物，如含硫醇的化合物和含硫醇的熒光化合物，如三(4-甲硫基)苯甲酸鋱。因此，在本發(fā)明的另一個實施方式中，對端點連接的肝素實體進行酶促肝素酶-I解聚之后，檢測到與底物結(jié)合的所述剩余表面結(jié)合的不飽和肝素片段包含碳碳雙鍵。該方法可以確定肝素和/或肝素實體是否與底物端點連接。在另一個實施方式中，殘根檢測與任一種上述檢測和/或標準方法組合使用。通過以下實施例進一步說明本發(fā)明，所述實施例不應(yīng)解釋為具有限制性。所有附圖和參考文獻的內(nèi)容通過參考結(jié)合于此。實施例實施例I本實施例描述包含肝素和硫酸粘菌素作為核心的肝素實體的構(gòu)造。該肝素實體包含可用于連接底物表面的游離末端醛。將硫酸粘菌素(0. 10g, Alpharma股份有限公司(Alpharma, Inc.))溶解在300毫升含MES緩沖液(pH 4. 7, BupH 熱科學公司(Thermo Scientific))的去離子(DI)水中。向其中加入10克USP肝素、4克N-羥基磺基琥珀酰亞胺(磺基-NHS，熱科學公司)和4克I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(鹽酸EDC，密蘇里州圣路易斯的西格瑪-艾爾德里奇公司(EDC hydrochloride, Sigma-Aldrich, St. Louis,MO))。使反應(yīng)在室溫下進行 4小時，接著用50,000 MWCO膜(Spectra/p0r )透析過夜。將滯留物(從500毫升得到約350毫升)轉(zhuǎn)移至燒杯中，冷卻至0°C。加入亞硝酸鈉(10毫克)和乙酸(2毫升)，使反應(yīng)在0°C進行I小時。用50，000MWC0膜進行透析，向透析液中加入I克NaCl，透析過夜。冷凍并凍干滯留物，得到細粉末。實施例2本實施例描述包含肝素和硫酸新霉素作為核心的肝素實體的構(gòu)造。該肝素實體包含可用于連接底物表面的游離末端醛。將硫酸新霉素(0. 0646克，光譜化學公司(Spectrum Chemical))溶解在300毫升含MES緩沖液(pH 4. 7, BupH 熱科學公司(Thermo Scientific))的去離子(DI)水中。向其中加入10克USP肝素、4克N-羥基磺基琥珀酰亞胺(磺基-NHS)和4克鹽酸EDC。使反應(yīng)在室溫下進行4小時，接著用50,000 MWCO膜(Spectra/por )透析過夜。將滯留物(從505毫升得到約400毫升)轉(zhuǎn)移至燒杯中，冷卻至0°C。加入亞硝酸鈉(10毫克)和乙酸(2毫升)，使反應(yīng)在0°C進行I小時。用50，000MWC0膜進行透析，向透析液中加入I克NaCl，透析過夜。使用20微米、0. 00079英寸的美國標準測試篩(A. S. T. M. E. -11第635號說明)過濾透析滯留物兩次，以去除小顆粒。冷凍滯留物并凍干，得到細粉末。實施例3
本實施例描述包含肝素和硫酸卷曲霉素作為核心的肝素實體的構(gòu)造。該肝素實體包含可用于連接底物表面的游離末端醛。將硫酸卷曲霉素(0. 0501克，密蘇里州圣路易斯的西格瑪-艾爾德里奇公司)溶解在300毫升含MES緩沖液(pH 4. 7, BupH 熱科學公司(Thermo Scientific))的去離子(DI)水中。向其中加入10克USP肝素、4克N-羥基磺基琥珀酰亞胺(磺基-NHS)和4克鹽酸EDC。使反應(yīng)在室溫下進行4小時。使用20微米、0. 00079英寸的美國標準測試篩(A. S. T. M. E. -11第635號說明)過濾反應(yīng)混合物一次，以去除小顆粒，并用50，000MWC0膜(Spectra/ por )透析濾液過夜。將滯留物(從515毫升得到約400毫升)轉(zhuǎn)移至燒杯中，冷卻至0°C。加入亞硝酸鈉(10毫克)和乙酸(2毫升)，使反應(yīng)在0°C進行I小時。用50，000MWC0膜進行透析，向透析液中加入I克NaCl，透析過夜。使用20微米、0. 00079英寸的美國標準測試篩(A. S. T. M. E. -11第635號說明)過濾滯留物兩次，以去除小顆粒。冷凍滯留物并凍干，得到細粉末。實施例4本實施例描述包含肝素和聚-L-賴氨酸作為核心的肝素實體的構(gòu)造。該肝素實體包含可用于連接底物表面的游離末端醛。將聚-L-賴氨酸(0. 1776克，西格瑪-艾爾德里奇公司，分子量為1，000-5, 000克/摩爾)溶解在300毫升含MES緩沖液(pH 4. 7，BupH 熱科學公司(Thermo Scientific))的去離子(DI)水中。向其中加入10克USP肝素、4克N-羥基磺基琥珀酰亞胺(磺基-NHS)和4克鹽酸EDC。使反應(yīng)在室溫下進行4小時，接著用50，000MWC0膜(Spectra/ Por )透析過夜。將滯留物(從505毫升得到約400毫升)轉(zhuǎn)移至燒杯中，冷卻至(TC。加入亞硝酸鈉(10毫克)和乙酸(2毫升)，使反應(yīng)在0°C進行I小時。用50，000MWC0膜進行透析，向透析液中加入I克NaCl，透析過夜。冷凍滯留物并凍干，得到細粉末。實施例5本實施例描述包含肝素和聚乙烯亞胺(PEI)作為核心的肝素實體的構(gòu)造。該肝素實體包含可用于連接底物表面的游離末端醛。將PEI (Lupasol，BASF，I. 7756 克)溶解在 300 毫升含 MES 緩沖液(pH 4. 7, BupH 熱科學公司(Thermo Scientific))的去離子(DI)水中。向其中加入10克USP肝素、4克N-羥基磺基琥珀酰亞胺(磺基-NHS)和4克鹽酸EDC。使反應(yīng)在室溫下進行4小時，接著用50，000MWC0膜(Spectra/ por )透析過夜。將滯留物(從505毫升得到約400毫升)轉(zhuǎn)移至燒杯中，冷卻至0°c。加入亞硝酸鈉(10毫克)和乙酸(2毫升)，使反應(yīng)在0°C進行I小時。用50，000MWC0膜進行透析，向透析液中加入I克NaCl，透析過夜。冷凍滯留物并凍干，得到細粉末。實施例6本實施例描述包含肝素和乙二胺(EDA)作為核心的肝素實體的構(gòu)造。該肝素實體包含可用于連接底物表面的游離末端醛。采用冰浴，用等體積的HCl和去離子水稀釋液將EDA(0. 0043克，密蘇里州圣路易斯的西格瑪-艾爾德里奇公司)中和至PH為4. 7，再溶解在含MES緩沖液(pH 4. 7，BupH 熱科學公司(Thermo Scientific))的300毫升去離子水中。向其中加入10克USP肝素、 4克N-羥基磺基琥珀酰亞胺(磺基-NHS)和4克鹽酸EDC。使反應(yīng)在室溫下進行4小時，接著用50，000MWC0膜(Spectra/ Por )透析過夜。將滯留物(從505毫升得到約400毫升)轉(zhuǎn)移至燒杯中，冷卻至0°C。加入亞硝酸鈉(10毫克)和乙酸(2毫升)，使反應(yīng)在0°C進行I小時。用50，000MWC0膜進行透析，向透析液中加入I克NaCl，透析過夜。冷凍滯留物并凍干，得到細粉末。實施例I將實施例1-6中含游離末端醛的肝素實體固定在ePTFE底物的表面上，并測試ATIII活性。片層形式的ePTFE底物材料獲自亞利桑那州弗拉格斯塔夫的W. L.戈爾聯(lián)合公司(ff. L. Gore&Associates, Inc. ,Flagstaff,AZ),商品名為 GORETM 微孔過濾介質(zhì)(GMM-406)。將底基涂層形式的覆蓋材料施加于ePTFE材料，具體是將該材料設(shè)置到直徑十厘米(IOcm)的塑料繡花圈(embroidery hoop)上,并將支持的ePTFE材料浸入100%異丙醇(IPA)約五分鐘(5分鐘)，然后浸入聚乙烯亞胺(PEI，Lupasol，BASF)和IPA的一比一(I I)溶液中。LUPASOL 無水PEI獲自BASF，將其稀釋至約4%的濃度，并調(diào)節(jié)至pH 9. 6。將ePTFE材料浸入該溶液約15分鐘后，由該溶液中取出該材料，并用PH 9. 6的去離子水沖洗15分鐘。保留在ePTFE材料上的PEI與pH 9. 6的0. 05%戊二醛水溶液(安氏公司(Amresco))交聯(lián)15分鐘。將該構(gòu)造放入pH 9. 6的0. 5% PEI水溶液中15分鐘，然后再次用pH 9. 6的DI水沖洗15分鐘，以使附加的PEI加入該構(gòu)造。用氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)溶液(5g溶解于I升去離子水中，PH 9. 6)還原戊二醛與PEI層之間反應(yīng)形成的亞胺15分鐘，并用DI水沖洗30分鐘。將該構(gòu)造物浸入pH 9.6的0.05%戊二醛水溶液15分鐘，然后浸入pH 9. 6的0. 5% PEI水溶液15分鐘，以便將另一層PEI加入該構(gòu)造物。然后用pH 9. 6的DI水沖洗該構(gòu)造物15分鐘。將該構(gòu)造物浸入NaCNBH3溶液(5g溶解于I升去離子水，pH 9. 6) 15分鐘，然后用DI水沖洗30分鐘，將得到的亞胺還原。通過重復(fù)這些步驟將第三層施加于該構(gòu)造物。產(chǎn)物是多孔疏水性氟聚合物基料或圓盤，該基料的基本上所有暴露表面和間隙表面上都具有親水性交聯(lián)聚合物基料涂層。在將另一層PEI設(shè)置到該構(gòu)造物上的制備過程中，可將中間化學層粘附于聚合物底基涂層。在硫酸葡聚糖(安瑪西亞生物技術(shù)公司(Amersham Pharmacia Biotech))和氯化鈉(0. 15g硫酸葡聚糖和IOOg NaCl溶解于IL DI水，pH 3)的60°C溶液中處理該構(gòu)造90分鐘，然后用DI水沖洗15分鐘，以制備中間離子電荷層。
將該構(gòu)造物放置在0. 3% PEI水溶液(pH 9)中約45分鐘，然后用氯化鈉溶液(50gNaCl溶解于IL DI水)沖洗20分鐘，將本文中稱為“加帽層”的PEI層粘附于中間層。最后用DI水沖洗20分鐘。通過將構(gòu)造物放置在含肝素實體的氯化鈉鹽溶液(約0. 9克含游離末端醛的肝素實體、5. 88克NaCl溶解在200毫升去離子水中，pH 3. 9)中并在60°C保持10分鐘將實施例1-6中含游離末端醛的肝素實體連接或偶聯(lián)到PEI層上。向肝素實體溶液(200毫升)加入體積為572微升的2. 5% (w/v)NaCNBH3水溶液。在上述溫度下再保持樣品110分鐘。然后用DI水沖洗樣品15分 鐘，用硼酸鹽緩沖液(10. 6g硼酸，2. Ig NaOH和0. IgNaCl溶解于IL DI水，pH 9. 0)沖洗20分鐘，最后用DI水沖洗15分鐘，然后凍干整個構(gòu)造，得到包含結(jié)合于ePTFE底物材料表面的肝素實體的干燥構(gòu)造物。用甲苯胺藍對該構(gòu)造樣品的兩側(cè)染色，以測定肝素大分子構(gòu)造物的存在和均勻性。染色產(chǎn)生均勻的染色表面，表明存在肝素，且肝素均勻地與ePTFE材料結(jié)合。將標稱尺寸約I平方厘米的樣品從構(gòu)造物中切出，通過測量包含端點連接在ePTFE底物表面上的游離末端醛的肝素實體的ATIII結(jié)合能力來測定肝素活性° 該測定參見 Larsen M. L.等，“Assay of plasma heparin using thrombin andthe chromogenic substrate H-D-Phe-Pip-Arg-pNA (S-2238)(用凝血酶和發(fā)色底物H-D-Phe-Pip-Arg-pNA(S-2238)測定血漿肝素)”。Thromb Res 13 :285-288(1978)和Pasche B.等，“A binding of antithrombin to immobilized heparin under varyingflow conditions(抗凝血酶在不同流動條件下與固定肝素的結(jié)合)”，Artif. Organs 15 281-491 (1991)，它們通過引用納入本文用于所有目的。結(jié)果表示為每單位表面積底物材料結(jié)合的ATIII量，單位是皮摩爾/平方厘米(pmol/cm2)。在整個測定中，將所有樣品保持在濕潤條件下。重要的是，注意到如果考慮到材料的兩面，則約一平方厘米(Icm2)的各樣品的總表面積為2平方厘米(2cm2)，以pmol/cm2計算ATIII肝素實體結(jié)合活性時只考慮樣品的一個表面(即Icm2)。將表示實施例1-6中制備的各偶聯(lián)構(gòu)造物的凍干樣品放入單獨的Tower DUALPEEL 自密封袋(伊利諾州麥克格的安利真健康護理公司(AllegianceHealthcare Corp.，McGaw Park, IL))中并密封，以進行EtO滅菌。在調(diào)理I小時(Ihr)、EtO氣體停留時間I小時(Ihr)、設(shè)定溫度為55°C、曝氣時間12小時(12hr)的條件下進行環(huán)氧乙烷滅菌。對各EtO滅菌之后的樣品用EtO滅菌，重復(fù)3次。圖2是示出實施例1-6中固定在ePTFE表面上含游離末端醛的肝素實體和進行最高達三次EtO滅菌循環(huán)的肝素實體的ATIII結(jié)合能力的柱狀圖。抗凝血酶III結(jié)合活性表示為每平方厘米底物材料上的結(jié)合抗凝血酶III的皮摩爾數(shù)。從結(jié)果中可以看出，在滅菌之前和接著進行三次EtO滅菌之前，所有含游離末端醛的偶聯(lián)肝素實體具有高的抗凝血酶III結(jié)合活性。所有的柱狀物表示樣品數(shù)的平均值，標出相對于標準偏差的誤差線。實施例8對實施例2、3、4和6中制得的含游離末端醛的肝素實體進行分析，以確定其絕對
分子量。Waters 2414RI檢測器與Wyatt ASTRA 5. 3. 4. 10軟件結(jié)合使用，來確定激光器的波長為660nm時在含0. 02% NaN3的IOOmM NaNO3中USP肝素的dn/dc。對已知的肝素濃度對RI檢測器響應(yīng)作圖并計算斜率，確定USP肝素的dn/dc (折射率變化除以濃度變化)。用Wyatt-Dawn Helleos-II 18-角光散射檢測器(Wyatt-DawnHelIeos-1118-angle light scattering detector)(懷亞特技術(shù)公司(Wyatt TechnologyCorp.))分析肝素實體，進行絕對分子量測量，不使用檢測器1，2，3，4，17和18。在具有0. 02% NaN3流動相的IOOmM NaNO3中制備肝素實體的母液。從該母液得到以下濃度對實施例 3 和 4 的肝素實體為 0. 5mg/mL, I. Omg/mL, I. 5mg/mL, 2. Omg/mL 和 2. 5mg/mL。對于實施例 2 和 6 的肝素實體，制備濃度為 0. 25mg/mL, 0. 5mg/mL, I. Omg/mL, I. 5mg/mL 和 2. Omg/mL。各樣品在注入光散射檢測器之前，使用5毫升注射器用0. 02微米的注射器過濾器進行過濾。使用Zimm曲線和USP肝素(0. 126L/g)的dn/dc對所有樣品進行批料數(shù)據(jù)分析。表I不出絕對分子量。表I.肝素實體的絕對分子量
權(quán)利要求
1.一種醫(yī)療底物，其包括 通過至少一個肝素分子結(jié)合到底物上的肝素實體，所述結(jié)合的肝素實體對肝素酶敏感。
2.如權(quán)利要求I所述的醫(yī)療底物，其特征在于，所述底物選自聚こ烯、聚氨酷、硅酮、含聚酰胺的聚合物、聚丙烯、聚四氟こ烯、膨脹型聚四氟こ烯和生物相容性金屬。
3.如權(quán)利要求2所述的醫(yī)療底物，其特征在于，所述底物是膨脹型聚四氟こ烯。
4.如權(quán)利要求2所述的醫(yī)療底物，其特征在于，所述生物相容性金屬是鎳鈦諾。
5.如權(quán)利要求I所述的醫(yī)療底物，其特征在于，所述底物是醫(yī)療裝置的組件。
6.如權(quán)利要求5所述的醫(yī)療底物，其特征在于，所述醫(yī)療裝置選自移植物、人造血管、支架、支架-移植物、分叉狀移植物、分叉狀支架、分叉狀支架-移植物、貼片、塞子、藥物遞送裝置、導(dǎo)尿管、心臟導(dǎo)線、氣囊和留置濾器。
7.如權(quán)利要求6所述的醫(yī)療底物，其特征在于，所述支架可以用于心臟、外周或神經(jīng)應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求6所述的醫(yī)療底物，其特征在于，所述支架-移植物可以用于心臟、外周或神經(jīng)應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求I所述的醫(yī)療底物，其特征在于，所述肝素實體包括至少ー個肝素分子和至少ー個核心分子。
10.如權(quán)利要求9所述的醫(yī)療底物，其特征在于，所述核心分子是環(huán)狀、直線狀、支鏈狀、樹枝狀、Y形、T形或星形的。
11.如權(quán)利要求9所述的醫(yī)療底物，其特征在于，所述核心分子選自蛋白質(zhì)、烴、氨基糖苷、多糖和聚合物。
12.如權(quán)利要求11所述的醫(yī)療底物，其特征在于，所述蛋白質(zhì)選自白蛋白、粘菌素和聚賴氨酸。
13.如權(quán)利要求11所述的醫(yī)療底物，其特征在于，所述多糖選自環(huán)糊精、纖維素和殼聚糖。
14.如權(quán)利要求11所述的醫(yī)療底物，其特征在于，所述聚合物選自聚こニ醇(PEG)和四氟こ烯共聚物。
15.如權(quán)利要求I所述的醫(yī)療基材底物，其特征在于，所述肝素從?；蜇i來源中得到。
16.如權(quán)利要求I所述的醫(yī)療底物，其特征在于，在肝素酶處理之后，在所述底物上將檢測不到肝素或其片段。
17.如權(quán)利要求I所述的醫(yī)療底物，其特征在于，在肝素酶處理之后，在所述底物上檢測到的肝素或其片段的水平與肝素酶處理之前相比明顯更低。
18.如權(quán)利要求16所述的醫(yī)療底物，其特征在于，通過與肝素或其片段結(jié)合的標記物檢測肝素或其片段。
19.如權(quán)利要求18所述的醫(yī)療底物，其特征在于，與肝素或其片段結(jié)合的所述標記物選自染料、多克隆抗體和蛋白質(zhì)。
20.如權(quán)利要求19所述的醫(yī)療底物，其特征在于，所述染料是甲苯胺藍。
21.如權(quán)利要求I所述的醫(yī)療底物，其特征在于，在肝素酶處理之后，可忽略量的甲苯胺藍將與殘余肝素或其片段結(jié)合，但在所述底物上目測檢測不到。
22.如權(quán)利要求I所述的醫(yī)療底物，其特征在于，在肝素酶處理之后，可忽略量的甲苯胺藍將與殘余肝素或其片段結(jié)合，檢測器讀數(shù)約為背景水平或者與不含肝素實體的底物相比與背景沒有明顯差別。
23.如權(quán)利要求I所述的肝素實體，其特征在于，所述肝素實體通過至少一個肝素分子結(jié)合到底物上，所述結(jié)合的肝素分子通過端點連接與所述底物相連。
24.如權(quán)利要求I所述的肝素實體，其特征在于，所述肝素實體通過至少一個肝素分子結(jié)合到底物上，所述結(jié)合的肝素分子通過環(huán)狀連接與所述底物相連。
25.如權(quán)利要求I所述的肝素實體，其特征在于，所述肝素實體通過至少一個肝素分子結(jié)合到底物上，所述結(jié)合的肝素分子通過端點醛與所述底物相連。
26.如權(quán)利要求I所述的肝素實體，其特征在于，所述肝素實體通過至少一個肝素分子結(jié)合到底物上，所述結(jié)合的肝素分子通過沿著所述肝素的長度的醛與所述底物相連。
27.ー種肝素實體，其包含 至少ー個肝素分子和至少ー個核心分子，當所述肝素實體通過至少一個肝素分子結(jié)合到底物上時，所述肝素實體對肝素酶敏感。
28.如權(quán)利要求27所述的肝素實體，其特征在于，所述底物選自聚こ烯、聚氨酷、硅酮、含聚酰胺的聚合物、聚丙烯、聚四氟こ烯、膨脹型聚四氟こ烯和生物相容性金屬。
29.如權(quán)利要求27所述的肝素實體，其特征在于，所述底物是膨脹型聚四氟こ烯。
30.如權(quán)利要求28所述的肝素實體，其特征在于，所述生物相容性金屬是鎳鈦諾。
31.如權(quán)利要求27所述的肝素實體，其特征在于，所述底物是醫(yī)療裝置的組件。
32.如權(quán)利要求31所述的肝素實體，其特征在干，所述醫(yī)療裝置選自移植物、人造血管、支架、支架-移植物、分叉狀移植物、分叉狀支架、分叉狀支架-移植物、貼片、塞子、藥物遞送裝置、導(dǎo)尿管、心臟導(dǎo)線、氣囊和留置濾器。
33.如權(quán)利要求32所述的肝素實體，其特征在于，所述支架可以用于心臟、外周或神經(jīng)應(yīng)用。
34.如權(quán)利要求32所述的肝素實體，其特征在于，所述支架-移植物可以用于心臟、夕卜周或神經(jīng)應(yīng)用。
35.如權(quán)利要求27所述的肝素實體，其特征在于，所述核心分子是環(huán)狀、直線狀、支鏈狀、樹枝狀、T形、Y形或星形的。
36.如權(quán)利要求27所述的肝素實體，其特征在于，所述核心分子選自蛋白質(zhì)、多肽、烴、多糖、氨基糖苷和聚合物。
37.如權(quán)利要求36所述的肝素實體，其特征在于，所述蛋白質(zhì)選自白蛋白、粘菌素和聚賴氨酸。
38.如權(quán)利要求36所述的肝素實體，其特征在于，所述多糖選自環(huán)糊精、纖維素和殼聚糖。
39.如權(quán)利要求36所述的肝素實體，其特征在于，所述聚合物選自聚こニ醇(PEG)和四氟こ烯共聚物。
40.如權(quán)利要求27所述的肝素實體，其特征在于，所述肝素從牛或豬來源中得到。
41.如權(quán)利要求27所述的肝素實體，其特征在于，在肝素酶處理之后，在所述底物上將檢測不到肝素或其片段。
42.如權(quán)利要求27所述的肝素實體，其特征在于，在肝素酶處理之后，檢測到的肝素或其片段的水平與肝素酶處理之前相比明顯更低。
43.如權(quán)利要求41所述的肝素實體，其特征在于，通過與肝素或其片段結(jié)合的標記物檢測肝素或其片段。
44.如權(quán)利要求45所述的肝素實體，其特征在干，與肝素或其片段結(jié)合的所述標記物選自染料、抗體和蛋白質(zhì)。
45.如權(quán)利要求46所述的肝素實體，其特征在于，所述染料是甲苯胺藍。
46.如權(quán)利要求27所述的肝素實體，其特征在于，在肝素酶處理之后，可忽略量的甲苯胺藍將與殘余肝素或其片段結(jié)合，但在所述底物上目測檢測不到。
47.如權(quán)利要求27所述的肝素實體，其特征在于，在肝素酶處理之后，可忽略量的甲苯胺藍將與殘余肝素或其片段結(jié)合，檢測器讀數(shù)約為背景水平或者與不含肝素實體的底物相比背景水平?jīng)]有明顯差別。
48.如權(quán)利要求27所述的肝素實體，其特征在于，所述肝素實體通過至少一個肝素分子結(jié)合到底物上，所述結(jié)合的肝素分子通過端點連接與所述底物相連。
49.如權(quán)利要求27所述的肝素實體，其特征在于，所述肝素實體通過至少一個肝素分子結(jié)合到底物上，所述結(jié)合的肝素分子通過環(huán)狀連接與所述底物相連。
50.如權(quán)利要求27所述的肝素實體，其特征在干，所述肝素實體通過至少一個肝素分子結(jié)合到底物上，所述結(jié)合的肝素分子通過端點醛與所述底物相連。
51.如權(quán)利要求27所述的肝素實體，其特征在于，所述肝素實體通過至少一個肝素分子結(jié)合到底物上，所述結(jié)合的肝素分子通過沿所述肝素長度的醛與所述底物相連。
52.ー種ATIII結(jié)合實體，其包含 核心分子， 與所述核心分子相連的多糖鏈，和 位于所述多糖鏈上的游離末端醛部分。
53.如權(quán)利要求54所述的ATIII結(jié)合實體，其特征在于，所述多糖鏈是肝素。
54.如權(quán)利要求54所述的ATIII結(jié)合實體，其特征在于，所述核心分子選自蛋白質(zhì)、烴、氨基糖苷、多糖和聚合物。
55.如權(quán)利要求56所述的ATIII結(jié)合實體，其特征在于，所述蛋白質(zhì)選自白蛋白、粘菌素和聚賴氨酸。
56.如權(quán)利要求56所述的ATIII結(jié)合實體，其特征在于，所述多糖選自環(huán)糊精、纖維素和殼聚糖。
57.如權(quán)利要求56所述的ATIII結(jié)合實體，其特征在于，所述聚合物選自聚こニ醇(PEG)和四氟こ烯共聚物。
58.如權(quán)利要求55所述的ATIII結(jié)合實體，其特征在于，所述肝素從?；蜇i來源中得至IJ。
59.如權(quán)利要求55所述的ATIII結(jié)合實體，其特征在于，所述肝素通過端點連接結(jié)合到所述核心分子上。
60.如權(quán)利要求55所述的ATIII結(jié)合實體，其特征在于，所述肝素通過端點連接結(jié)合到所述底物上。
61.如權(quán)利要求62所述的ATIII結(jié)合實體，其特征在于，所述底物選自聚こ烯、聚氨酷、硅酮、含聚酰胺的聚合物、和聚丙烯、聚四氟こ烯、膨脹型聚四氟こ烯和生物相容性金屬。
62.如權(quán)利要求63所述的ATIII結(jié)合實體，其特征在于，所述底物是膨脹型聚四氟こ烯。
63.如權(quán)利要求63所述的ATIII結(jié)合實體，其特征在于，所述生物相容性金屬是鎳鈦諾。
64.如權(quán)利要求62所述的ATIII結(jié)合實體，其特征在于，所述底物是醫(yī)療裝置的組件。
65.如權(quán)利要求66所述的肝素實體，其特征在于，所述醫(yī)療裝置選自移植物、人造血管、支架、支架-移植物、分叉狀移植物、分叉狀支架、分叉狀支架-移植物、貼片、塞子、藥物遞送裝置、導(dǎo)尿管和心臟導(dǎo)線。
66.如權(quán)利要求67所述的肝素實體，其特征在于，所述支架可以用于心臟、外周或神經(jīng)應(yīng)用。
67.一種確定與底物結(jié)合的肝素實體結(jié)構(gòu)的方法，其包括以下步驟 a)提供包含肝素實體的底物， b)解聚所述肝素實體，以產(chǎn)生可溶性肝素片段的混合物， c)使用柱色譜檢測所述混合物中的各肝素片段， d)確定從步驟(c)得到的各被檢測肝素片段的身份特征，和 e)從被檢測的肝素片段的身份特征得到肝素實體的結(jié)構(gòu)。
68.如權(quán)利要求69所述的方法，其特征在于，所述解聚通過肝素酶-I解聚進行。
69.如權(quán)利要求69所述的方法，其特征在于，所述柱色譜是SAX-HPLC。
70.一種確定與底物結(jié)合的肝素實體結(jié)構(gòu)的方法，其包括以下步驟 a)提供包含肝素實體的底物， b)解聚所述肝素實體，以產(chǎn)生包含表面-結(jié)合的肝素片段的表面， c)用能向所述表面-結(jié)合的肝素片段引入可檢測組分的標記試劑與所述表面反應(yīng)， d)通過所述可檢測組分檢測所述表面-結(jié)合的肝素片段， 和 e)從存在的表面-結(jié)合的肝素片段得到所述肝素實體的結(jié)構(gòu)。
71.如權(quán)利要求72所述的方法，其特征在于，所述解聚通過肝素酶-I解聚進行。
72.如權(quán)利要求72所述的方法，其特征在干，所述標記試劑是鑭系邁克爾類加成有機絡(luò)合物。
73.如權(quán)利要求72所述的方法，其特征在于，所述有機絡(luò)合物是三(4-甲硫基)苯甲酸鋪。
74.如權(quán)利要求72所述的方法，其特征在于，所述標記試劑是異染性染料。
75.如權(quán)利要求72所述的方法，其特征在于，所述異染性染料是甲苯胺藍。
76.如權(quán)利要求72所述的方法，其特征在于，所述檢測通過表面熒光法、吸收光譜法和目測進行。
77.一種確定與底物結(jié)合的肝素實體的空間分布的方法，其包括以下步驟 a)提供包含肝素實體的底物， b)解聚所述肝素實體，以產(chǎn)生包含表面-結(jié)合的肝素片段的表面，c)用能向所述表面-結(jié)合的肝素片段引入可檢測組分的標記試劑與所述表面反應(yīng)， d)通過所述可檢測組分檢測所述表面-結(jié)合的肝素片段， 和 e)從存在的表面-結(jié)合的肝素片段得到所述肝素實體的空間分布。
78.如權(quán)利要求79所述的方法，其特征在于，所述解聚通過肝素酶-I解聚進行。
79.如權(quán)利要求79所述的方法，其特征在干，所述標記試劑是鑭系邁克爾類加成有機絡(luò)合物。
80.如權(quán)利要求79所述的方法，其特征在于，所述標記試劑是三(4-甲硫基)苯甲酸鋪。
81.如權(quán)利要求79所述的方法，其特征在干，所述有機絡(luò)合物包含化學吸收的金納米顆粒。
82.如權(quán)利要求79所述的方法，其特征在于，所述檢測通過表面熒光顯微鏡或透射電子顯微鏡進行。
83.—種確定與底物結(jié)合的肝素實體結(jié)構(gòu)的系統(tǒng),其包括 a)解聚溶液， b)標記試劑溶液，和 (c)檢測器。
84.如權(quán)利要求85所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述解聚溶液包含肝素酶-I。
85.如權(quán)利要求85所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述標記試劑溶液包含甲苯胺藍和三(4-甲硫基)苯甲酸鋱。
86.如權(quán)利要求85所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述檢測器包括SAX-HPLC、表面熒光顯微鏡和吸收分光儀。
全文摘要
本發(fā)明涉及經(jīng)過處理之后保持明顯生物活性的固定生物活性實體。本發(fā)明還包括醫(yī)療底物，所述醫(yī)療底物包括通過至少一個肝素分子結(jié)合到底物上的肝素實體，所述結(jié)合的肝素實體對肝素酶-1敏感。
文檔編號A61L31/16GK102695530SQ201080051584
公開日2012年9月26日 申請日期2010年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月17日
發(fā)明者C·D·克勞德, M·李, N·馬迪羅夏, P·D·德拉姆赫勒, R·L·克里克, R·比朗 申請人:戈爾企業(yè)控股股份有限公司