專利名稱：增強的瘧疾msp-1亞單位疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組亞單位蛋白，其已經(jīng)被設(shè)計用作疫苗來針對瘧疾進(jìn)行保護(hù)。具體地，所述重組亞單位蛋白源自惡性痕原蟲(Plasmodium falciparum)的裂殖子表面蛋白I (Merozoite Surface Protein 1,“MSP_1”)的C-端區(qū)域,且被進(jìn)一步修飾以增強免疫原性潛力。MSP-IC-端區(qū)域的核心是pl9。pl9核心區(qū)域含有表位，所述表位是寄生生物生長抑制抗體的靶標(biāo)；但是，P19核心區(qū)域自身具有較差的免疫原性。已經(jīng)證實，在pl9核心區(qū)域之前緊鄰處的MSP-I的p33區(qū)域含有T細(xì)胞表位。已經(jīng)假定，這些T細(xì)胞表位可以增強針對P19核心區(qū)域的抗體應(yīng)答。這些潛在T細(xì)胞表位在重組蛋白的背景下能夠引起增強的且穩(wěn)定的免疫應(yīng)答的功能性和實用性尚未完全證實。在目前的應(yīng)用中，通過選擇性地添加源自MSP-I的p33區(qū)域的片段，增強了 pl9核心區(qū)域的免疫原性潛力。將這些選定的片段連接至P19核心區(qū)域，以生產(chǎn)具有增強的免疫原性潛力的新穎蛋白。這些新穎的蛋白在自然界中沒有發(fā)現(xiàn)。在細(xì)胞生產(chǎn)系統(tǒng)中生產(chǎn)具有增強的免疫原性潛力的重組亞單位蛋白，并且在純化以后，將其配制為疫苗，以生成適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答。經(jīng)證實，與生成不穩(wěn)定的或減少的寄生生物生長抑制抗體的其它MSP-IC-端亞單位相比，所述增強的重組亞單位蛋白會誘導(dǎo)強寄生生物生長抑制抗體。所述增強的亞單位蛋白具有用作人用疫苗來保護(hù)免于瘧疾的潛力。
背景技術(shù)：
據(jù)估計，瘧疾的每年發(fā)病率是約2. 5億病例，每年導(dǎo)致大于100萬人死亡(WH0，2008)。大多數(shù)病例發(fā)生在非洲，盡管該威脅擴大至世界上的許多其它熱帶和亞熱帶區(qū)域。全世界有大約30億人處于感染風(fēng)險中。為此，非常需要控制該疾病的傳播，因為蚊子載體和瘧原蟲屬寄生生物已經(jīng)形成對以前的控制措施的抗性。在過去的10至15年中，主要焦點已經(jīng)放在針對寄生生物的不同發(fā)育階段的瘧疾疫苗的開發(fā)上。盡管已經(jīng)有大量工作來建立重組亞單位瘧疾疫苗的技術(shù)，并且?guī)追N候選亞單位已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗，然而尚未完全實現(xiàn)基于重組亞單位蛋白技術(shù)的有效瘧疾疫苗。一種靶向瘧疾的環(huán)子孢子階段的候選疫苗仍然在臨床試驗中進(jìn)行評價，盡管關(guān)于它進(jìn)一步成為被許可疫苗的潛力存在不同意見。迄今為止，在臨床試驗中的靶向于寄生生物的裂殖子階段的疫苗候選物已經(jīng)失敗。因此，尚不存在被許可的可用于瘧疾的疫苗。存在許多瘧疾寄生生物物種，每個物種具有確定的宿主范圍。存在多個感染人類的物種。惡性瘧原蟲是在人類中造成疾病的主要物種。除非另外指出，術(shù)語“寄生生物”在本文中是指瘧原蟲屬物種。瘧疾寄生生物的生命周期是復(fù)雜的。所述寄生生物在它的生命周期的許多階段發(fā)生眾多發(fā)育的和形態(tài)的變化。當(dāng)被感染的蚊子給它的宿主接種子孢子時，該周期開始。所述子孢子快速地滲入肝細(xì)胞中，它們?nèi)缓笤谶@里發(fā)育成肝裂殖體。在成熟后，裂殖子被釋放進(jìn)血流中。所述裂殖子接著侵入紅細(xì)胞中，并在紅細(xì)胞中無性地繁殖，直到受感染的細(xì)胞破裂，導(dǎo)致釋放出額外的裂殖子，隨后所述額外的裂殖子侵入額外的紅細(xì)胞中。裂殖子的繁殖和紅細(xì)胞的裂解與瘧疾的臨床癥狀有關(guān)。有些裂殖子繼續(xù)發(fā)育成雄性和雌性配子母細(xì)胞，他們?nèi)缓蟊灰允芨腥緜€體為食的蚊子攝入。一旦進(jìn)入蚊子中，雄性配子對雌性配子的受精會導(dǎo)致進(jìn)一步發(fā)育成所述寄生生物的子孢子階段。因而，所述周期再次開始。所述生命周期被分成3個階段前紅細(xì)胞階段、無性紅細(xì)胞階段和有性階段。關(guān)于疫苗開發(fā)，所述3個階段經(jīng)常被稱作子孢子或肝階段(前紅細(xì)胞階段)、血液階段(無性紅細(xì)胞階段)和傳播阻斷(有性階段)。過去十年的工作已經(jīng)證實，盡管這樣的疫苗存在開發(fā)瘧疾疫苗的潛 力，但疫苗的開發(fā)是一項艱難的任務(wù)。在鑒別和開發(fā)作為瘧疾疫苗候選物的蛋白中，已經(jīng)取得了進(jìn)展。選擇用于瘧疾疫苗中的蛋白的主要方法是，篩選對人免疫血清具有反應(yīng)性的那些蛋白。以此方式，已經(jīng)將在每個生命周期階段中的許多蛋白鑒別為疫苗候選物。可作為疫苗候選物的蛋白中，大多數(shù)是在寄生生物的表面上表達(dá)的蛋白。因為較難培養(yǎng)寄生生物來作為抗原的來源，瘧疾疫苗的開發(fā)必須依賴于替代方法，諸如重組DNA。該技術(shù)已經(jīng)成功地用于確定重要的肽序列、表達(dá)亞單位抗原和開發(fā)基于DNA的疫苗。盡管靶向所述寄生生物的每個發(fā)育階段的瘧疾疫苗的開發(fā)工作正在進(jìn)行中，靶向血液階段的疫苗可能具有最大影響，因為這是導(dǎo)致疾病表現(xiàn)的階段(Good等人，1998)。在已經(jīng)鑒別出的許多血液階段的抗原中，主要的裂殖子表面蛋白l(Merozoite SurfaceProtein, MSP-1)是已經(jīng)被充分研究的一種。天然的MSP-I蛋白具有大約195kD的分子量。它是一種主要出現(xiàn)在裂殖子表面上的膜錨定分子。它被加工成4個主要片段,根據(jù)它們的相對分子量,將它們稱作p83、p28、p38和p42(Hall等人，1984，Lyon等人，1986和Holder等人，1987)。所有片段的功能是未知的。已經(jīng)確定，C-端p42片段(它錨定在裂殖子表面上)被進(jìn)一步加工成叫做p33和pl9的2個片段,并且該加工是紅細(xì)胞侵入的必要條件(Blackman等人，1990,1991及Blackman和Holder，1992)。FUP菌株的MSP_lp42的氨基酸序列顯示在圖I中。許多發(fā)現(xiàn)都支持MSP-I作為重要的瘧疾疫苗候選物。已經(jīng)證實，當(dāng)用源自培養(yǎng)的寄生生物的MSP-I進(jìn)行免疫時，可以保護(hù)猴免受惡性瘧原蟲攻擊(Hall等人1984，Siddiqui等人1987，和Etlinger等人1991)。另外，在攻擊研究中也已經(jīng)證實，代表MSP-I的不同部分的重組肽或合成肽會引起不同水平的保護(hù)(Hall等人，1984, Cheung等人，1986,Patarroyo 等人，1987, Herrera 等人，1990, Kumar 等人，1995,和 Chang 等人，1996, Kumar 等人，2000, Stowers等人,2001, Darko等人,2005)。另外,從生活在病區(qū)的人中收集的血清的分析結(jié)果已經(jīng)證實，針對MSP-IC-端區(qū)域的IgG抗體的生成與對抗瘧原蟲瘧疾的臨床免疫的形成有關(guān)(Riley 等人，1992，Shai 等人，1995，Al-Yaman 等人，1996，和 Shi 等人，1996)。最后，已經(jīng)證實，針對MSP-I的單克隆抗體能夠在體外防止寄生生物侵入紅細(xì)胞中(Pirson和 Perkins, 1985 和 Blackman 等人，1990)。已經(jīng)將MSP-IC-端p42片段和它的pl9加工片段鑒別為源自MSP-I蛋白的主要亞單位疫苗候選物。P19核心區(qū)域的序列(在圖I中顯示為粗斜體)在不同的惡性瘧原蟲菌株中是高度保守的。圖2提供了來自3個惡性瘧原蟲菌株FUP、3D7和FVO的MSP-lp42蛋白的氨基酸序列的比對。P33區(qū)域在FUP和3D7菌株之間是保守的，但是，F(xiàn)VO菌株的p33稍微不同于其它2個惡性瘧原蟲菌株。pl9核心區(qū)域在3個菌株之間是高度保守的，且也含有6個二硫鍵，所述二硫鍵導(dǎo)致高度折疊的結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為2個表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域(Blackman等人,1991)。已經(jīng)證實,針對pl9核心區(qū)域的多克隆和單克隆抗體會在體外抑制寄生生物發(fā)育(Blackman 等人，1990, Chang 等人，1992, Chappel 和 Holder, 1993)。開發(fā)基于MSP-I的p42或pl9片段的重組亞單位疫苗的工作中，已經(jīng)利用了幾種不同的異源蛋白表達(dá)系統(tǒng)。在下面總結(jié)了這些亞單位在大腸桿菌、酵母和桿狀病毒載體系統(tǒng)中的表達(dá)。在大腸桿菌中表達(dá)抗原的早期工作，在免疫接種以后僅誘導(dǎo)了低水平的可與天然蛋白反應(yīng)的抗體(Holder等人，1988, Burghaus等人，1996)。因此,大多數(shù)工作目前聚焦于具有引導(dǎo)MSP-I亞單位的天然樣折疊的能力的表達(dá)系統(tǒng)上，以嘗試生產(chǎn)更多的具有更大的誘導(dǎo)相關(guān)免疫應(yīng)答潛力的相關(guān)產(chǎn)物。 盡管能夠表達(dá)更多的具有更大抗原潛力的天然樣MSP-IC-端重組亞單位蛋白，迄今為止的所有工作卻導(dǎo)致了不穩(wěn)定的和/或不相關(guān)的抗體應(yīng)答。例如，Kumar等人(1995)能夠證實，當(dāng)用在酵母中表達(dá)的pl9亞單位進(jìn)行免疫時,會在夜猴(Aotus Monkey)中產(chǎn)生保護(hù)作用；但是，沒有在免疫的所有猴中實現(xiàn)保護(hù)，這證實了使用P19亞單位的免疫應(yīng)答的不穩(wěn)定性。此外，來自受保護(hù)的猴的血清不能在體外抑制寄生生物生長，這表明，免疫應(yīng)答的質(zhì)量(抗體特異性)不如預(yù)期。在另一組實例中，Chang等人(Infect. Immun. (1996)64 253-261和美國專利6，855，316)能夠證實使用在桿狀病毒系統(tǒng)中生產(chǎn)的p42產(chǎn)物對夜猴的保護(hù)作用；但是，所述保護(hù)是不穩(wěn)定的，因為并非所有動物都受到保護(hù)。這違背來自受保護(hù)的猴的血清能夠在體外抑制寄生生物生長的事實。在另一個實例中，Darko等人(2005)評價了桿狀病毒表達(dá)的P42產(chǎn)物在攻擊夜猴模型中的效力。盡管有相對高水平的抗體應(yīng)答，但該桿狀病毒表達(dá)的P42產(chǎn)物對于攻擊提供了非常少的保護(hù)作用。最后，由于免疫應(yīng)答水平較低而且不穩(wěn)定，現(xiàn)在已經(jīng)放棄了在大腸桿菌中生產(chǎn)并用于II期臨床試驗的P42產(chǎn)物(Ogutu等人，2009)。從這些實例顯而易見，尚未實現(xiàn)從作為有效的疫苗候選物的MSP-IC-端區(qū)域生產(chǎn)重組亞單位蛋白的解決方案。如以前所述，MSP_lp42片段由p33和pl9片段組成。錨定在裂殖子表面上的MSP-I的pl9核心區(qū)域是裂殖子在紅細(xì)胞侵入過程中裂殖子的必要元件，其中在裂殖子與紅細(xì)胞結(jié)合以后，所述P33片段被釋放進(jìn)血漿中。所述pl9片段除了在紅細(xì)胞侵入中的作用以外，還是體外寄生生物生長抑制抗體的靶標(biāo)。P33片段的作用不明。在p33區(qū)域內(nèi)已經(jīng)鑒別出許多T細(xì)胞表位(Udhayakumar等人，1995 ;Lee等人，2001 ;Malhotra等人，2008)，且有人建議p33在引起保護(hù)性免疫中起間接作用，這通過提供在pl9中缺少的T輔助表位來實現(xiàn)(Tian等人，1996 ;Lee等人，2001)。臨床研究已經(jīng)證實，MSPI-42疫苗接種會引起記憶T細(xì)胞應(yīng)答，并且這些應(yīng)答位于MSP1-33片段(Huaman等人，2008)。盡管如此，在重組亞單位蛋白和主動免疫的背景下，尚未證實T細(xì)胞表位的對pl9特異性地增強抗體應(yīng)答的能力。為了實現(xiàn)重組MSP-IC-端亞單位蛋白作為可行候選疫苗的潛力，存在需要進(jìn)一步研究的關(guān)鍵問題。第一個問題涉及到，關(guān)于引起特異性的保護(hù)性抗體應(yīng)答，要鑒別出MSP-IC-端區(qū)域的有關(guān)的免疫原性片段。特異性的保護(hù)性抗體是能夠在體外抑制寄生生物生長的那些抗體。第二個研究領(lǐng)域涉及到，鑒別出無關(guān)的免疫原性片段，所述片段產(chǎn)生的應(yīng)答不會引起所需的適當(dāng)?shù)奶禺愋詰?yīng)答。第三個研究領(lǐng)域涉及到，以生產(chǎn)具有增強的免疫原性潛力的重組亞單位蛋白產(chǎn)物并作為疫苗候選物的方式，評價來自MSP-IC-端區(qū)域的不連續(xù)序列的連接。MSP-IC-端亞單位蛋白被定義為這樣的任意重組蛋白包括MSP_lpl9核心區(qū)域和來自MSP-lp33區(qū)域的額外序列，無論p33序列是否是連續(xù)的(像在自然界中一樣)或不連續(xù)的(產(chǎn)生新穎的蛋白)。在開發(fā)增強的MSP-IC-端亞單位蛋白的初期工作中，基于p33區(qū)域的N-端截短制備了 3種構(gòu)建體。截短點是基于p33中的假定的T細(xì)胞表位。在一種構(gòu)建體中，將來自p33區(qū)域的額外表位連接至截短處。來自這3種構(gòu)建體的初步數(shù)據(jù)沒有證實增強序列的存在， 因為不存在寄生生物抑制抗體方面的免疫增強。這前3種構(gòu)建體A、B和C的序列如圖3所示。意外的是，隨后在構(gòu)建體C上得到的數(shù)據(jù)顯示，在該構(gòu)建體中的31個氨基酸的p33片段含有抑制免疫應(yīng)答的序列(以寄生生物生長抑制性抗體的方式)，除了強烈的總抗體應(yīng)答以外。因此，基于MSP-IC-端區(qū)域的應(yīng)用而進(jìn)一步開發(fā)可行的瘧疾重組亞單位疫苗，需要鑒別在P33區(qū)域內(nèi)的適當(dāng)序列，所述序列可以與pl9核心區(qū)域相組合以產(chǎn)生具有增強的免疫原性的組合序列。更具體地，所述增強的免疫原性是指，誘導(dǎo)穩(wěn)定的且特異性的抗體的能力，所述抗體能夠在體外抑制寄生生物生長，并針對由瘧疾造成的疾病提供保護(hù)。此外，為了完全實現(xiàn)增強序列的潛力，去除這樣的序列也是重要的所述序列抑制具有增強性質(zhì)的那些序列的免疫原性潛力。最終的目的是選擇“增強性”p33序列，選擇性去除“抑制性”p33序列，以及將“增強性”序列連接至P19核心區(qū)域，以產(chǎn)生能夠在靈長類動物模型和人類中引起穩(wěn)定的且增強的保護(hù)性免疫應(yīng)答的新穎的重組蛋白。但是，以前尚未報道“增強性”和“抑制性”序列的鑒別。因此，要解決的技術(shù)問題是(I)鑒別P33區(qū)域中含有假定T細(xì)胞表位的序列，所述序列當(dāng)與P19核心區(qū)域相組合時，會產(chǎn)生增強的免疫應(yīng)答(“增強性序列”)，(2)鑒別和去除P33區(qū)域中的抑制pl9表位的免疫原性潛力的序列(“抑制性序列”)，和(3)證實能夠通過將來自P33區(qū)域的不連續(xù)增強性序列與pl9核心區(qū)域連接來生產(chǎn)重組亞單位蛋白產(chǎn)物的能力，所述連接的方式使得所述產(chǎn)物可以在基于細(xì)胞的系統(tǒng)中有效地表達(dá)。以此方式生產(chǎn)的重組亞單位蛋白具有下述潛力克服使用以前的基于P42的疫苗所出現(xiàn)的問題，并穩(wěn)定地誘導(dǎo)特異性的抗-裂殖子抗體，所述抗體會在動物模型和人類中提供針對瘧疾的保護(hù)性免疫。因此，要解決的總技術(shù)問題是基于源自MSP-IC-端區(qū)域的序列，設(shè)計、構(gòu)建和表達(dá)一種新穎的重組亞單位蛋白，以產(chǎn)生增強的免疫原性和提高的保護(hù)效力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種具有增強的免疫原性的重組亞單位蛋白，所述性質(zhì)使所述蛋白適合作為疫苗來在動物模型和人類中針對瘧疾提供保護(hù)。重組亞單位蛋白包含所述蛋白的MSP-IC-端pl9核心區(qū)域和選自MSP-IC-端p33區(qū)域的選定片段。添加選定的p33片段導(dǎo)致增強的免疫原性。具體地，所述增強的免疫原性潛力在于，引起穩(wěn)定的且保護(hù)性的抗體應(yīng)答的能力。所述增強的抗體應(yīng)答具有在體外和在體內(nèi)抑制寄生生物生長的潛力，針對由瘧疾寄生生物造成的疾病提供保護(hù)。本發(fā)明的重組亞單位蛋白是由轉(zhuǎn)化的昆蟲細(xì)胞表達(dá)，所述昆蟲細(xì)胞含有整合在所述細(xì)胞基因組內(nèi)的適當(dāng)表達(dá)盒的拷貝。所述昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)會提供具有天然樣構(gòu)象的重組亞單位蛋白的高產(chǎn)率。具體地，所述重組亞單位蛋白由轉(zhuǎn)化的昆蟲細(xì)胞分泌，并表現(xiàn)為在自然界中未發(fā)現(xiàn)的瘧疾MSP-IC-端區(qū)域的新穎形式。更具體地，所述重組亞單位蛋白是新穎的衍生物，它們已經(jīng)被制備以提供提高的免疫原性潛力，針對由瘧疾寄生生物造成的疾病提供保護(hù)。在動物模型中，在具有增強的免疫原性潛力的重組亞單位蛋白的疫苗接種中所產(chǎn)生的抗體能夠在體外抑制寄生生物生長。本發(fā)明也提供了使用所述重組亞單位蛋白作為疫苗來誘導(dǎo)抗體生產(chǎn)的方法，所述抗體能夠在哺乳動物宿主中賦予針對瘧疾的保護(hù)作用。


圖I示出了來自MAD型的惡性瘧原蟲菌株FUP (Uganda Palo Alto (烏干達(dá)帕洛阿 爾托))的MSP-lp42的氨基酸序列；p33區(qū)域以正常字體顯示，pl9核心區(qū)域以粗斜體顯示；圖2示出了來自3個惡性瘧原蟲菌株FUP、3D7和FVO的MSP_lp42氨基酸序列的比對；用+符號指示在3D7和FVO中與FUP菌株相同的氨基酸，顯示了與FUP菌株不同的氨基酸，pl9核心區(qū)域中的氨基酸以粗體顯示；用-符號指示在比對中的間隙；P19核心區(qū)域以粗斜體顯示；圖3示出了來自3個N-端截短的亞單位即構(gòu)建體A、構(gòu)建體B和構(gòu)建體C的氨基酸序列相對于FUP p42序列的比對；在p33序列中的CT、C72和p33_7表位顯示為粗體，并帶有下劃線；P19核心區(qū)域以粗斜體顯示；圖4示出了來自所有MSP-IC-端亞單位蛋白構(gòu)建體的氨基酸序列相對于FUPMSP-lp33序列的比對；圖5示出了所有MSP-IC-端亞單位構(gòu)建體的簡圖按照據(jù)名稱排序；圖6示出了所有MSP-IC-端亞單位構(gòu)建體的簡圖，按照組排序；圖7示出了第2組MSP-IC-端構(gòu)建體的ELISA抗體滴度；圖8示出了第I組和第2組MSP-IC-端亞單位的ELISP0T分析。
具體實施例方式本發(fā)明提供了瘧疾MSP-IC-端重組亞單位蛋白，所述蛋白包含pl9核心區(qū)域和p33區(qū)域的選定片段。從已經(jīng)用適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的穩(wěn)定的昆蟲細(xì)胞系，生產(chǎn)和分泌得到這種重組亞單位蛋白。用本發(fā)明的重組亞單位蛋白免疫接種動物，可以有效地誘導(dǎo)穩(wěn)定的抗體應(yīng)答。具體地，這些抗體應(yīng)答能夠抑制惡性瘧原蟲的生長。選定的P33片段與pl9核心的組合，對于誘導(dǎo)特異性的且穩(wěn)定的免疫應(yīng)答是至關(guān)重要的，所述免疫應(yīng)答會產(chǎn)生這樣的抗體所述抗體能夠抑制寄生生物生長，并最終提供免受瘧疾的保護(hù)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，證實了本文所述的重組瘧疾MSP-IC-端亞單位蛋白能夠引起比MSP-lp42重組蛋白(在自然界中發(fā)現(xiàn)的形式)增強的且穩(wěn)定的免疫應(yīng)答。更優(yōu)選地，所述增強的重組MSP-IC-端亞單位蛋白能夠引起穩(wěn)定的寄生生物抑制性的抗體應(yīng)答。優(yōu)選地，所有的免疫受試者具有大于50%的體外生長抑制性的抗體滴度。更優(yōu)選地，所有的免疫受試者具有大于60%的體外生長抑制性的抗體滴度。甚至更優(yōu)選地，免疫受試者具有大于70%的體外生長抑制性的抗體滴度。甚至更優(yōu)選地，免疫受試者具有大于80%的體外生長抑制性的抗體滴度。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，“增強性”序列選自MSP_lp33區(qū)域，并與pl9核心區(qū)域相連，以產(chǎn)生新穎的MSP-IC-端重組亞單位蛋白。除了選擇“增強性”序列以外，還從MSP-lp33區(qū)域去除了“抑制性”序列，以進(jìn)一步增強新穎的MSP-IC-端重組亞單位蛋白的免疫原性潛力。在更優(yōu)選的實施方式中，與MSP-I的pl9核心區(qū)域相連的選自p33區(qū)域的選定片段含有T細(xì)胞輔助表位。這些T細(xì)胞輔助表位負(fù)責(zé)引導(dǎo)針對P19核心區(qū)域的增強的免疫應(yīng) 答，所述P19核心區(qū)域自身具有較差的免疫原性。更優(yōu)選地，選定的p33片段不含有抑制或遏制引起增強的抗體應(yīng)答(以針對P19核心區(qū)域的抑制性抗體的形式)的能力的序列和/或表位。因此，得到的重組蛋白與天然的P33區(qū)域的差別僅在于，提供益處的片段被保留，并且具有不利影響的那些片段被去除。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方式中，所述重組瘧疾MSP-IC-端亞單位蛋白包含MSP-I的pl9核心和選定的p33片段，pl9核心和選定的p33片段以使重組蛋白可以在基于細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)為分泌產(chǎn)物的方式相連。然后純化分泌的重組亞單位蛋白，并用作免疫原。當(dāng)用于使動物免疫時，所述純化的蛋白會產(chǎn)生增強的免疫應(yīng)答。在另一個優(yōu)選的實施方式中，使用果蠅(Drosophila) S2細(xì)胞作為宿主細(xì)胞來表達(dá)“MSP-1C-端亞單位蛋白”。“MSP-1C-端亞單位蛋白”是指這樣的任意重組蛋白其含有MSP-lpl9核心區(qū)域和來自MSP-lp33區(qū)域的額外序列，無論p33序列是否是連續(xù)的(像在自然界中一樣)或不連續(xù)的(產(chǎn)生新穎的蛋白)。這些“MSP-1C-端亞單位蛋白”可以源自任意惡性瘧原蟲菌株。圖4提供了在本申請所提及的所有“MSP-1C-端亞單位蛋白”中使用的P33序列的片段。在本發(fā)明中，如下采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的果蠅S2細(xì)胞表達(dá)和分泌亞單位蛋白，所述亞單位蛋白包含MSP-IC-端pl9核心區(qū)域和源自MSP-IC-端p33區(qū)域的片段，所述表達(dá)和分泌使用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA方法，將這些蛋白的編碼序列可操作地連接至功能性的分泌信號上，并使這些蛋白由經(jīng)證實在果蠅細(xì)胞中功能性的啟動子來控制。本文所述的重組MSP-IC-端亞單位蛋白代表源自惡性瘧原蟲物種的3個不同菌株。編碼MSP-IC-端亞單位蛋白的序列來自2個惡性瘧原蟲菌株，S卩，MAD型的FUP (UgandaPalo Alto (烏干達(dá)帕洛阿爾托))、威爾卡姆(Wellcome)型的NF-54 (克隆3D7)和Kl型的FVO (Vietnam-Oak Noll)。將所有序列克隆進(jìn)果蠅表達(dá)質(zhì)粒中，然后用于轉(zhuǎn)化果蠅S2細(xì)胞。因而，本發(fā)明的MSP-IC-端亞單位都是相關(guān)的，因為它們都含有圖5所示的MSP-IC-端pl9核心區(qū)域。此外，盡管每個構(gòu)建體中的p33序列存在差異，但是所有構(gòu)建體都被設(shè)計成引導(dǎo)和增強針對P19核心區(qū)域的免疫應(yīng)答的能力和特異性。針對pl9核心區(qū)域的抗體應(yīng)答增強多少與針對由瘧疾感染造成的疾病提供保護(hù)作用的能力增加有關(guān)。所述MSP-IC-端亞單位蛋白由所述選定的S2細(xì)胞系表達(dá)和分泌，并首次通過免疫親和色譜法進(jìn)行純化。所述抗-MSP-I單克隆抗體5. 2 (Chang等人，1992) (“5. 2抗體”或“MAb5.2”)被用于純化。將 5. 2 抗體通過生產(chǎn)商(NHS-Sepharose, Pharmacia, Piscataway (皮斯卡塔韋)，NJ(美國新澤西州))推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法，化學(xué)結(jié)合至適當(dāng)?shù)闹|(zhì)上，以制備合適的柱。
優(yōu)選地，所述MSP-IC-端亞單位源自惡性瘧原蟲裂殖子表面蛋白的部分，即p42 ；在FUP和3D7菌株中，p42包含MSP-I的氨基酸Ala1333至Ser17(l5。如本文所述，從穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的昆蟲細(xì)胞重組地生產(chǎn)和分泌MSP-IC-端亞單位蛋白。所述MSP-IC-端亞單位可能含有MSP-I的整個p42區(qū)域或部分p42區(qū)域。更優(yōu)選地，所述MSP-IC-端亞單位含有與MSP_lp33序列相連的MSP-IplO核心區(qū)域，MSP-IplO核心區(qū)域相對于天然p42而言是連續(xù)的或不連續(xù)的，但是所有MSP-IC-端亞單位蛋白的長度比FUP和3D7菌株的天然p42短了至少28個氨基酸。所述MSP-IC-端亞單位可以源自惡性瘧原蟲的3個等位基因類型中的任一個；諸如，K、MAD20和威爾卡姆型，以及間日瘧原蟲(P. vivax)、三日瘧原蟲(P. malariae)和卵形瘧原蟲(P. ovale)的等位基因類型。在所有實施方式中，MSP-IC-端亞單位蛋白的分泌由功能性分泌信號來引導(dǎo)，所述分泌信號能夠引導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物穿過昆蟲細(xì)胞分泌途徑并進(jìn)入培養(yǎng)基中。在本文中，使用tPA 前/原分泌前導(dǎo)物和合成的分泌信號，證實MSP-IC-端亞單位蛋白的分泌。令人驚訝地是，且與以前描述的MSP_lpl9和MSP_lp42重組亞單位的報道(其中認(rèn)為，非常高的抗體滴度是寄生生物生長活性的關(guān)鍵指示物)不同，在本申請中描述的幾種重組MSP-IC-端亞單位的引起顯著的寄生生物生長抑制活性的能力，不依賴于對產(chǎn)生高滴度抗體應(yīng)答的需要。經(jīng)發(fā)現(xiàn)，引起中等抗體滴度的幾種MSP-IC-端亞單位蛋白也產(chǎn)生顯著的寄生生物生長抑制活性。因而，所述MSP-IC-端蛋白是新穎的，因為它們在功能上不同于以前描述的基于MSP-I的重組蛋白之處在于，它們具有引起顯著的寄生生物生長抑制活性的能力。本發(fā)明因而考慮并提供了重組亞單位蛋白，所述蛋白可以用于疫苗制劑中，作為用于預(yù)防或減弱瘧原蟲屬物種感染的措施。所述重組亞單位蛋白可以與佐劑聯(lián)合使用，作為針對由痕疾感染造成的疾病提供保護(hù)的措施。盡管上面提供的描述和下面的實施例主要涉及從惡性瘧原蟲表達(dá)MSP-IC-端亞單位，但所述方法也可以應(yīng)用于其它瘧原蟲屬物種。例如也危害人類健康的間日瘧原蟲、三日瘧原蟲(P. malariae)和卵形瘧原蟲物種也可以用于人類的健康治療?？梢苑謩e為間日瘧原蟲、三日瘧原蟲和卵形瘧原蟲開發(fā)與本文所述的惡性瘧原蟲的那些構(gòu)建體類似的構(gòu)建體，用作預(yù)防由瘧疾感染造成的疾病的疫苗。
實施例下面的實施例證實了可以從MSP_lp33區(qū)域選擇并去除序列，以及將選定序列的與MSP_lpl9核心區(qū)域相連從而產(chǎn)生新穎的、具有增強的免疫原性潛力的重組亞單位蛋白，以作為疫苗候選物。還使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的昆蟲細(xì)胞，證實了所述新穎的MSP-IC-端亞單位蛋白的表達(dá)和分泌。也證實了表達(dá)的亞單位蛋白的純化。提供了證實所述新穎的MSP-IC-端亞單位蛋白的增強的免疫原性的實施例。下面顯示的結(jié)果表明，增強的免疫原性潛力的選擇和證實，會產(chǎn)生高度可變的結(jié)果，所述結(jié)果可以是缺少特異性免疫應(yīng)答，也可以是高度集中的免疫應(yīng)答。因而，為了是免疫應(yīng)答集中而從P33區(qū)域選擇的增強性序列即pl9核心區(qū)域，并不是完全可預(yù)測的，必須以經(jīng)驗為依據(jù)來測定。幾種MSP-IC-端亞單位蛋白意外地能夠引起增強的顯著的免疫原性，即大于50%的寄生生物抑制活性，盡管實際上所述新穎的重組蛋白產(chǎn)生中等的普遍抗體應(yīng)答。因此,本文所述的發(fā)明在所述重組亞單位蛋白的組成以及由此得到的免疫原性方面是獨特的。下面的實施例旨在示意性說明，而不是限制本發(fā)明。實施例IMSP-lp42的p33區(qū)域中的T細(xì)胞表位的評估為了開發(fā)瘧疾疫苗，在許多研究中都使用了 MSP-I的pl9或p42亞單位。已有報道記載每一種這些MSP-I亞單位的成功以及失敗，如上面所述的和在下面進(jìn)一步討論的。因為結(jié)果互相矛盾，因此不清楚這些亞單位的哪些區(qū)域在它們作為抗原時的下列能力最相關(guān)所述抗原引起能夠在體外抑制寄生生物生長的抗體應(yīng)答或所述抗原保護(hù)動物免受攻擊。已經(jīng)存在的理論是，針對pl9核心區(qū)域的生長抑制性抗體的誘導(dǎo)是由p33區(qū)域中的T 輔助表位的特異性決定。支持該理論的一項研究直接對比了重組的P19和p42亞單位的誘導(dǎo)寄生生物生長抑制性抗體的能力(Hui等人，1994)。使用相同的佐劑(FCA)，基于ELISA測定，P19和p42重組體都引起高滴度的抗體。但是，由p42抗原產(chǎn)生的抗體對寄生生物生長是抑制性的，由P19產(chǎn)生的抗體不能抑制寄生生物生長。盡管pl9產(chǎn)生的抗體不能抑制寄生生物生長，但是經(jīng)證實，P42產(chǎn)生的抗體能夠結(jié)合寄生生物衍生的MSP-I，使用所述pl9抗原可以交叉吸附所述p42產(chǎn)生的抗體。Udhayakumar等人(1995)的一項研究也支持了該理論，所述研究對于生活在肯尼亞(Kenya)(瘧原蟲瘧疾非常流行的地區(qū))的個體的免疫應(yīng)答，表征了在p42區(qū)域的B和T細(xì)胞表位。該研究揭示，B細(xì)胞表位主要在pl9核心區(qū)域中，并且能夠提供增殖應(yīng)答的T細(xì)胞表位位于p33區(qū)域中。Lee等人(2001)和Malhotra等人(2008)的研究也已經(jīng)鑒別出在p33區(qū)域中的其它潛在的T細(xì)胞表位，這些T細(xì)胞表位可能關(guān)系到MSP-IC-端區(qū)域的保護(hù)性免疫應(yīng)答的增強。盡管沒有確定在這些研究中鑒別出的T細(xì)胞表位會直接地提供T細(xì)胞輔助功能，但是已經(jīng)提出，這些T細(xì)胞表位可能負(fù)責(zé)使針對重要的寄生生物生長抑制性表位P19的抗體應(yīng)答集中。盡管這些結(jié)果支持了在P33區(qū)域中的T細(xì)胞輔助功能的理論，但是沒有關(guān)于重組亞單位的表達(dá)的數(shù)據(jù)，其中所述重組亞單位被設(shè)計用來增強動物模型中誘發(fā)寄生生物生長抑制性抗體或保護(hù)性應(yīng)答的能力。使用計算機程序來輔助分析，以引導(dǎo)P33的適當(dāng)片段的選擇，保留相關(guān)的T細(xì)胞表位。首先，分析與為T細(xì)胞表位建立的模式擬合的序列在p33區(qū)域中的存在(Margalit等人，1987)。所述算法是Menendez-Arias和Rodriguez (1990)的為了選擇潛在T細(xì)胞表位而編寫的計算機程序的一部分。該分析得到14個T細(xì)胞表位的預(yù)測。含有最高兩親性分?jǐn)?shù)的表位，是在P33的N-端處的保守區(qū)域中的表位，LKPLAGVYRSLKKQ。該表位被稱作CT (保守的T)。鑒別出的下一個表位位于pl9序列起點之前72個氨基酸處，AHVKITKLSDLKAID，并被稱作C72。第三個T細(xì)胞表位的鑒別是使用計算機程序ΤΕΡΙΤ0ΡΕ，且所述鑒別基于在p33區(qū)域中的 MHC II 類表位的進(jìn)一步分析(Sturniolo T.等人,Nat. Biotechnology (1999) 17 555-561 ；Singh,H.和 Raghava，G. P. S. (2001) Bioinformatics, 17 (12), 1236-37) 該表位位于pl9序列起點之前22個氨基酸處，LVQNFPNTIISKLIEGK,并被稱作p33_7。下面的表I列出了在惡性瘧原蟲的MSP_lp42的p33區(qū)域中的潛在MHC II類T細(xì)胞表位。這些表位通過計算機算法預(yù)測得出，或基于上述的公開報道得出。表I.在MSP_lp42的p33區(qū)域中的潛在T細(xì)胞表位
權(quán)利要求
1.一種具有增強的免疫原性的MSP-IC-端重組亞單位蛋白，包括 C-端區(qū)域的惡性瘧原蟲MSP-I蛋白的P19核心區(qū)域，所述P19核心區(qū)域添加有p33區(qū)域的選定片段； 所述重組亞單位蛋白在基于細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)和分泌。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組亞單位蛋白，其特征在于，所述增強的免疫原性通過增加的且穩(wěn)定的寄生生物生長抑制活性來測量。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組亞單位蛋白，其特征在于，所有被免疫的動物產(chǎn)生大于50%的寄生生物生長抑制活性。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組亞單位蛋白，其特征在于，通過刪除在SEQID NO=USEQID N0:2、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :7 和 SEQ ID NO :17 中所示的所述 p33 區(qū)域的 N-端，從而衍生出所述亞單位。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組亞單位蛋白，其特征在于，通過連接在SEQID N0:8、SEQID NO =IUSEQ ID NO :14和SEQ ID NO : 18中所示的選定的p33區(qū)域片段，從而衍生出所述亞單位。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組亞單位蛋白的表達(dá)，其特征在于，所述表達(dá)系統(tǒng)是真核細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組亞單位蛋白的表達(dá)，其特征在于，所述細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)系統(tǒng)使用昆蟲細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組亞單位蛋白的表達(dá)，其特征在于，所述昆蟲細(xì)胞是果蠅S2細(xì)胞。
9.一種疫苗制劑，其特征在于，包括能夠針對瘧疾感染提供保護(hù)的MSP-IC-端亞單位蛋白。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的疫苗制劑，其特征在于，所述MSP-IC-端亞單位蛋白示于SEQID NO: I、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 11、SEQ IDNO: 14、SEQ ID NO :17 和 SEQ ID NO :18。
全文摘要
本發(fā)明提供一種源自寄生蟲惡性瘧原蟲的MSP-1C-端區(qū)域的重組亞單位蛋白，所述重組亞單位蛋白具有增強的免疫原性。將p33的選定區(qū)域與p19組合，以增強p19核心區(qū)域的免疫原性潛力。由于所述構(gòu)建體表現(xiàn)為不連續(xù)片段融合以建立獨特的蛋白，因此所表達(dá)的重組蛋白在自然界中沒有發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明揭露的重組蛋白的增強的免疫原性潛力會帶來強烈的、穩(wěn)定的且特異性的抗體應(yīng)答。本發(fā)明所揭露的重組亞單位蛋白是用于保護(hù)免受瘧疾感染的疫苗候選物。
文檔編號A61K39/002GK102648209SQ201080052479
公開日2012年8月22日 申請日期2010年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月18日
發(fā)明者D·E·克萊門茨, G·S·N·輝, K·M·普斯克 申請人:夏威夷大學(xué), 夏威夷生物技術(shù)公司