專利名稱：用于甲狀腺癌診斷和治療的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與甲狀腺癌、特別是侵襲性甲狀腺癌有關(guān)的標(biāo)志物，用于檢測、診斷、預(yù)測、監(jiān)測和表征甲狀腺癌以及治療甲狀腺癌的組合物、試劑盒和方法。
背景技術(shù)：
上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)是ー種40kDa跨膜糖蛋白，在幾種人惡性腫瘤中頻繁過表達(dá)[Spizzo等，2004 ；ffent P等，2006 ；ffenqi D等，2009]。EpCAM最初被鑒定為癌癥標(biāo)志物，這可歸于其在快速增殖性上皮腫瘤中的高表達(dá)[有關(guān)綜述見Trzpis M等，2007]。正常上皮以可變但一般低于癌細(xì)胞的水平表達(dá)EpCAM。它還在正常的干細(xì)胞和祖細(xì)胞[StinglJ等,2001 ；Schmelzer E等,2007 ；Trzpis M等,2008]和在乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和前列腺癌的癌引發(fā)細(xì)胞[Al-Hajj M 等，2003 ;0’Brien CA 等，2007 ;Ricci_Vitiani L 等，2007]中過表達(dá)。最近，在根治性子宮切除術(shù)后的子宮頸癌患者的外周血中，在表達(dá)E6/E7-HPV癌基因的循環(huán)腫瘤細(xì)胞中檢出EpCAM[WeiSmann P等，2009]。對于許多癌癥和正常組織，有大量有關(guān)EpCAM染色的數(shù)據(jù)庫。然而，所有這些研究采用針對EpCAM的胞外域的抗體，其可檢測EpCAM前體或結(jié)合細(xì)胞的EpEx或兩者[Wenqi D等，2009]。EpCAM是在細(xì)胞粘附、細(xì)胞増殖、分化、遷移、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中起重要作用的多效分子并涉及癌癥和干細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[Munz等，2009]。并不完全了解調(diào)節(jié)EpCAM表達(dá)的分子機(jī)制。最近，研究表明調(diào)節(jié)性膜內(nèi)蛋白酶解(RIP)體外和體內(nèi)起其促有絲分裂信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的作用[Maetzel等，2009]。EpCAM胞外域EpEx通過蛋白酶-TACE和早老蛋白_2的切割和脫落，釋放其易位至核的胞內(nèi)域(Ep-I⑶)。Ep-I⑶與FHL2和Wnt途徑組分β -聯(lián)蛋白和Lef-I的締合形成核復(fù)合體，該核復(fù)合體在Lef-I共有位點(diǎn)上結(jié)合DNA，并誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)胞增殖増加，而且已經(jīng)表明該核復(fù)合體在免疫缺陷型小鼠中具有致癌性[Maetzel，2009]。鑒于EpCAM作為致癌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、細(xì)胞粘附分子和癌癥干細(xì)胞標(biāo)志物的多重作用[Litvinov SV等，1997 ；Munz等，2009]，確立核Ep-ICD在人類癌癥中的臨床重要性是非常重要的。最近報(bào)導(dǎo)了核Ep-ICD在人結(jié)腸癌中的初歩研究，但未報(bào)導(dǎo)在正常結(jié)腸上皮中的情況[Maetzel，2009]。鑒于在實(shí)體瘤中的極大異質(zhì)性，其它人類癌癥中的核Ep-I⑶的臨床重要性依然有待確立。此外，已經(jīng)表明EpCAM通過上調(diào)c-myc、細(xì)胞周期蛋白A和E而增加細(xì)胞增埴[Munz等,2004]。甲狀腺癌(TC)代表全部內(nèi)分泌惡性腫瘤的90%，估計(jì)全球年發(fā)病率為122，800例，美國新診斷病例約為33，000例[Reis等，2005 Jemal等，2008]。退行發(fā)育性甲狀腺癌(ATC)是罕見的但卻是這種惡性腫瘤極具侵襲性的形式，占全部甲狀腺癌的不足2%。ATC通常表現(xiàn)為快速増大的頸部皰塊，在局部擴(kuò)散，壓迫鄰近結(jié)構(gòu)，具有擴(kuò)散到局部淋巴結(jié)和遠(yuǎn)端位置的趨勢[Pasieka JL等，2003;Are C和Shaha 2006]。大多數(shù)高度分化的甲狀腺癌具有極好預(yù)后，5年相對存活率高于95%，盡管其具有早期轉(zhuǎn)移趨勢。然而，分化較低的甲狀腺腫瘤-退行發(fā)育性和其它侵襲性轉(zhuǎn)移性甲狀腺癌可以是致命的，其生存時(shí)間中值范圍為4個月到5年[Are C和Shaha，2006]。臨床結(jié)局的這種變化可歸因于侵襲性和非侵襲性甲狀腺腫瘤在其惡性演變期間獲得的遺傳損傷的差異。ATC 的發(fā)病機(jī)制與 BRAF、RAS、β -聯(lián)蛋白、PIK3CA、TP53、AXIN1、PTEN 和 APC 基因的突變有關(guān)[有關(guān)綜述見Smallridge RC等，2009]。已經(jīng)確定在ATC中的基因表達(dá)特征，其顯示絲氨酸/蘇氨酸激酶Polo樣激酶I (PLKl)上調(diào)，并且已對其作為ATC中的治療靶標(biāo)的潛力進(jìn)行了研究[Salvatore G等，2007CR ;Nappi TC等，2009]。然而，沒有已證實(shí)的鑒定侵襲性TC的預(yù)測性分子標(biāo)志物。發(fā)明概沭本發(fā)明涉及甲狀腺癌的標(biāo)志物。具體地說，EpCAM多肽及其結(jié)構(gòu)域(特別是胞外域 EpEx和胞內(nèi)域EP-ICD)和β-聯(lián)蛋白(本文統(tǒng)稱為“多肽甲狀腺癌標(biāo)志物”)及編碼這類多肽及其結(jié)構(gòu)域的多核苷酸(本文統(tǒng)稱為“多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物”)構(gòu)成甲狀腺癌、特別是侵襲性甲狀腺癌、更特別是退行發(fā)育性甲狀腺癌(ATC)的生物標(biāo)記。多肽甲狀腺癌標(biāo)志物和多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物及其部分或片段有時(shí)在本文中統(tǒng)稱為“甲狀腺癌標(biāo)志物”。
在本發(fā)明的ー些方面，術(shù)語“甲狀腺癌標(biāo)志物”可包括Wnt蛋白和編碼Wnt蛋白的多核苷酸；因此在ー些方面“多肽甲狀腺癌標(biāo)志物”包括fct蛋白，在ー些方面“多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物”包括編碼fct蛋白的多核苷酸。因此，甲狀腺癌標(biāo)志物和與甲狀腺癌標(biāo)志物相互作用的物質(zhì)，可用于檢測、診斷、表征、分類和監(jiān)測甲狀腺癌(即監(jiān)測癌癥的進(jìn)展或治療性治療的功效)，用于鑒定易患甲狀腺癌的受試者，以及用于測定預(yù)后或患者生存率。在本發(fā)明的多個方面，甲狀腺癌標(biāo)志物，特別是Ep-I⑶、β-聯(lián)蛋白和EpEx，用于表征甲狀腺癌的侵襲性。在本發(fā)明的ー些方面，甲狀腺癌標(biāo)志物用于測定轉(zhuǎn)移潛力或患者生存率。本發(fā)明還考慮用于評價(jià)甲狀腺組織的狀態(tài)的方法和甲狀腺癌的診斷和治療的方法。與測定其它標(biāo)志物的方法相比，其中測定ー種或多種甲狀腺癌標(biāo)志物的本發(fā)明方法可具有提高的靈敏度和/或特異性。提高的臨床靈敏度可以是靈敏度提高約5-10%、特別是提高6-9 %、更特別是提高8 %。在本發(fā)明方法的一個實(shí)施方案中，在腫瘤樣品檢出的ー種或多種甲狀腺癌標(biāo)志物提供至少約80-99%甲狀腺癌臨床靈敏度，特別是90-95%、更特別是91%、92%、93%、94%、95%或98%甲狀腺癌臨床靈敏度。在其中在腫瘤樣品中檢出核Ep-ICD、核β-聯(lián)蛋白和胞質(zhì)聯(lián)蛋白中的一種或多種的本發(fā)明的實(shí)施方案中，臨床靈敏度可大于約80-90%，更特別地大于約80-85%，最特別地大于約83%、84%、85%、90%臨床靈敏度和特異性可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知方法測定。根據(jù)本發(fā)明的方法，可通過檢測樣品中以下物質(zhì)的存在情況來評價(jià)樣品中的甲狀腺癌標(biāo)志物(a)對應(yīng)于標(biāo)志物的多肽或多肽片段；(b)具有標(biāo)志物與之基本相同的至少ー部分的轉(zhuǎn)錄的核酸或其片段；和/或(C)轉(zhuǎn)錄的核酸或其片段，其中所述核酸與標(biāo)志物雜交。在本發(fā)明的ー個方面，提供用于檢測患者中與甲狀腺癌、特別是侵襲性甲狀腺癌、更特別是退行發(fā)育性甲狀腺癌相關(guān)的甲狀腺癌標(biāo)志物的方法，所述方法包括或基本由以下步驟組成(a)從患者中獲得樣品；(b)檢測或鑒定樣品中的ー種或多種甲狀腺癌標(biāo)志物，和(C)將檢測到的量與對標(biāo)準(zhǔn)物檢測到的量進(jìn)行比較。
根據(jù)本發(fā)明的方法，可通過例如檢測樣品中以下物質(zhì)的存在情況，來對甲狀腺組織進(jìn)行評價(jià)或表征(a)甲狀腺癌標(biāo)志物；(b)具有多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物與之基本相同的至少一部分的轉(zhuǎn)錄的核酸或其片段；和/或(C)轉(zhuǎn)錄的核酸或其片段，其中所述核酸與多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物雜交。樣品中的甲狀腺癌標(biāo)志物可通過本文描述的和本領(lǐng)域普遍已知的方法測定。一方面，本發(fā)明提供用于表征或分類甲狀腺樣品的方法，所述方法包括檢測相對于對照的第一多個甲狀腺癌標(biāo)志物的表達(dá)差異，所述第一多個標(biāo)志物由Ep-I⑶、β -聯(lián)蛋白和任選EpEx組成。本發(fā)明的ー個方面提供用于檢測患者的甲狀腺癌的方法，所述方法包括測定獲自患者的樣品中的甲狀腺癌標(biāo)志物的狀態(tài)，其中樣品狀態(tài)異常表明存在甲狀腺癌。甲狀腺癌標(biāo)志物可與特定疾病期有夫。因此，本發(fā)明的另ー個方面提供診斷患者的甲狀腺癌的特定 疾病期的方法，所述方法包括測定獲自患者的樣品中的甲狀腺癌標(biāo)志物的狀態(tài)，其中標(biāo)志物的異常狀態(tài)表明存在特定疾病期。本發(fā)明的另ー個方面提供篩查患者的甲狀腺癌的方法，所述方法包括鑒定有患甲狀腺癌的風(fēng)險(xiǎn)或需要篩查和測定獲自患者的樣品中的甲狀腺癌標(biāo)志物的狀態(tài)的患者，其中標(biāo)志物的異常狀態(tài)表明存在甲狀腺癌或其特定病期。另ー方面提供診斷方法，所述方法包括鑒定作為甲狀腺癌治療的候選者的患者，并且測定獲自患者的樣品中的甲狀腺癌標(biāo)志物的狀態(tài)，其中樣品中甲狀腺癌標(biāo)志物的異常狀態(tài)表明治療是需要的或是必需的。在本發(fā)明的多個方面，異常狀態(tài)可以是高狀態(tài)、低狀態(tài)或負(fù)狀態(tài)。在用于檢測或診斷甲狀腺癌的本發(fā)明的實(shí)施方案中，異常狀態(tài)是高狀態(tài)。一方面，本發(fā)明提供用于診斷受試者的ATC的方法，所述方法包括(a)使受試者的樣品與試劑接觸，所述試劑能夠測量目標(biāo)甲狀腺癌標(biāo)志物、特別是選自Ep-I⑶、β -聯(lián)蛋白及任選EpEx和c-myc的至少ー種甲狀腺癌標(biāo)志物的水平；和(b)根據(jù)與獲自取自未患ATC的受試者或在不同時(shí)間取自受試者的類似樣品的對照水平相比，受試者的樣品中Ep-ICD和β -聯(lián)蛋白中的至少ー種及任選c-myc的水平提高以及任選EpEx降低，提供在所述受試者中的ATC的診斷。在本發(fā)明這個方面的實(shí)施方案中，所測定的甲狀腺癌標(biāo)志物是核Ep-ICD、核β-聯(lián)蛋白、胞質(zhì)β -聯(lián)蛋白和任選ΕρΕχ。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，提供用于在患者中檢測與甲狀腺癌、特別是侵襲性甲狀腺癌、更特別是退行發(fā)育性甲狀腺癌有關(guān)的Ep-I⑶、β -聯(lián)蛋白、EpEx和EpCAM中的一種或多種的方法，所述方法包括或基本由以下步驟組成(a)從患者中獲得樣品；(b)檢測或鑒定樣品中的Ep-I⑶、β -聯(lián)蛋白、EpEx和EpCAM中的ー種或多種；和
(c)將檢測到的量與對標(biāo)準(zhǔn)物檢測到的量進(jìn)行比較。在本發(fā)明的ー個具體實(shí)施方案中，提供用于診斷患者的ATC的方法，所述方法包括或基本由以下步驟組成(a)檢測或鑒定樣品中的核Ep-I⑶、核β -聯(lián)蛋白和胞質(zhì)β _聯(lián)蛋白中的ー種或多種；和
(b)將檢測到的量與對標(biāo)準(zhǔn)物檢測到的量進(jìn)行比較，其中核Ep-ICD、核β -聯(lián)蛋白和胞質(zhì)β -聯(lián)蛋白中一種或多種增的加表明ATC。在本發(fā)明的ー個具體實(shí)施方案中，提供用于診斷患者的ATC的方法，所述方法包括或基本由以下步驟組成(a)檢測或鑒定樣品中的核Ep-I⑶、核β-聯(lián)蛋白、胞質(zhì)β _聯(lián)蛋白和EpEx (例如膜EpEx)中的ー種或多種；和(b)將檢測到的量與對標(biāo)準(zhǔn)物檢測到的量進(jìn)行比較，其中核Ep-I⑶、核β -聯(lián)蛋白和胞質(zhì)β -聯(lián)蛋白中一種或多種的增加和EpEx降低或缺乏表明ATC。 在本發(fā)明的ー個具體方面，提供用于檢測患者的與侵襲性或轉(zhuǎn)移性甲狀腺癌有關(guān)的甲狀腺癌標(biāo)志物、優(yōu)選Ep-ICD和/或β -聯(lián)蛋白的方法，所述方法包括或基本由以下步驟組成(a)從患者中獲取樣品(例如腫瘤樣品)；(b)檢測樣品中的甲狀腺癌標(biāo)志物、優(yōu)選Ep-I⑶和/或β -聯(lián)蛋白；和(c)將檢測到的量與對標(biāo)準(zhǔn)物檢測到的量或截?cái)嘀颠M(jìn)行比較。術(shù)語“檢測”或“檢出”包括進(jìn)行分析試驗(yàn)或以別的方式證實(shí)ー種或多種目標(biāo)標(biāo)志物、亞單位或試劑結(jié)合的靶標(biāo)的組合等的存在或缺乏，或進(jìn)行分析試驗(yàn)以確定、證實(shí)或以別的方式測定甲狀腺癌的一個或多個實(shí)際特性，例如侵襲性、轉(zhuǎn)移潛力或患者生存率。標(biāo)準(zhǔn)可相當(dāng)于對來自未患疾病或患早期疾病(例如低級別甲狀腺癌例如甲狀腺乳頭狀癌)的對照受試者的樣品或來自受試者的其它樣品的樣品進(jìn)行定量測定的水平。本發(fā)明提供評價(jià)患者是否患有甲狀腺癌、特別是侵襲性或轉(zhuǎn)移性甲狀腺癌、更特別是ATC或者是否易患甲狀腺癌、特別是侵襲性或轉(zhuǎn)移性甲狀腺癌、更特別是ATC的方法，所述方法包括比較(a)患者的甲狀腺癌標(biāo)志物的水平；和(b)獲自未患有甲狀腺癌或患較低級別甲狀腺癌的對照患者的相同類型的樣品中甲狀腺癌標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)水平，其中與甲狀腺癌標(biāo)志物的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)水平相比，甲狀腺癌標(biāo)志物水平的改變表明患者患有甲狀腺癌、特別是侵襲性或轉(zhuǎn)移性甲狀腺癌、更特別是ATC。在用于評價(jià)患者是否患有侵襲性或轉(zhuǎn)移性甲狀腺癌、特別是ATC的本發(fā)明方法的ー個方面，與相應(yīng)的正常水平或患較低級別甲狀腺癌的患者的水平相比，樣品中核Ep-ICD、核聯(lián)蛋白或胞質(zhì)聯(lián)蛋白的較高水平，以及EpEx (例如膜EpEx)的較低水平或缺乏，表明患者患有侵襲性或轉(zhuǎn)移性甲狀腺癌，特別是ATC。在用于評價(jià)患者是否患有退行發(fā)育性甲狀腺癌的本發(fā)明方法的一個實(shí)施方案中，將患者樣品的核Ep-ICD水平與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，與標(biāo)準(zhǔn)相比，核Ep-ICD的較高水平表明退行發(fā)育性甲狀腺癌。在用于評價(jià)患者是否患有退行發(fā)育性甲狀腺癌的本發(fā)明方法的一個實(shí)施方案中，將患者樣品的核β_聯(lián)蛋白水平與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，與標(biāo)準(zhǔn)相比，核β_聯(lián)蛋白的較高水平表明退行發(fā)育性甲狀腺癌。在用于評價(jià)患者是否患有退行發(fā)育性甲狀腺癌的本發(fā)明方法的一個實(shí)施方案中，將患者樣品的胞質(zhì)β_聯(lián)蛋白水平與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，與標(biāo)準(zhǔn)相比，胞質(zhì)β_聯(lián)蛋白的較高水平表明退行發(fā)育性甲狀腺癌。
在用于評價(jià)患者是否患有退行發(fā)育性甲狀腺癌的本發(fā)明方法的一個實(shí)施方案中，將患者樣品的膜EpEx水平與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，與標(biāo)準(zhǔn)相比，膜EpEx的較低水平或缺乏表明退行發(fā)育性甲狀腺癌。在用于評價(jià)患者是否患有甲狀腺濾泡癌(FTC)的本發(fā)明方法的一個實(shí)施方案中，將患者樣品的膜EpExJS Ep-I⑶、胞質(zhì)Ep-I⑶和β -聯(lián)蛋白水平與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。在用于評價(jià)患者是否患有甲狀腺濾泡癌(FTC)的本發(fā)明方法的一個實(shí)施方案中，將患者樣品的膜EpExJS Ep-I⑶和胞質(zhì)Ep-I⑶水平與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行 比較。在一個實(shí)施方案中，不存在核Ep-ICD或存在低水平的核Ep-ICD和任選較高水平的胞質(zhì)β -聯(lián)蛋白。在用于評價(jià)患者是否患有甲狀腺乳頭狀癌(PTC)的本發(fā)明方法的一個實(shí)施方案中，將患者樣品的膜ΕρΕχ、核Ep-I⑶、胞質(zhì)Ep-I⑶和β -聯(lián)蛋白水平與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。在一個實(shí)施方案中，不存在核Ep-I⑶和β-聯(lián)蛋白或存在低水平的核Ep-I⑶和β-聯(lián)蛋白。在用于評價(jià)患者是否患有甲狀腺鱗狀細(xì)胞癌的本發(fā)明方法的一個實(shí)施方案中，將患者樣品的膜EpExJS Ep-I⑶、胞質(zhì)Ep-I⑶和β -聯(lián)蛋白水平與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。在具體方面，本發(fā)明的方法用于診斷受試者的甲狀腺癌病期或表征受試者的甲狀腺癌。在一個實(shí)施方案中，所述方法包括比較(a)患者樣品的甲狀腺癌標(biāo)志物(例如活組織檢查樣品)的水平；和(b)獲自無甲狀腺癌的患者或患不同期的甲狀腺癌(例如低級別甲狀腺癌)的對照患者的相同類型的對照樣品或在不同時(shí)間取自患者的樣品的甲狀腺癌標(biāo)志物水平，其中相對于對照樣品的相應(yīng)水平，甲狀腺癌標(biāo)志物水平的改變表明患者患有更大侵襲性或轉(zhuǎn)移性的甲狀腺癌。在實(shí)施方案中，侵襲性甲狀腺癌是ATC，甲狀腺癌標(biāo)志物是核Ep-I⑶、核β -聯(lián)蛋白和胞質(zhì)聯(lián)蛋白中的一種或多種。在具體實(shí)施方案中，甲狀腺癌標(biāo)志物是核Ep-ICD。本發(fā)明還提供用于檢測或診斷受試者的甲狀腺癌、特別是侵襲性或轉(zhuǎn)移性甲狀腺癌、更特別是ATC的非侵入性非手術(shù)方法，所述方法包括從受試者中獲取樣品(例如活組織檢查樣品)；對樣品進(jìn)行檢測一種或多種甲狀腺癌標(biāo)志物的步驟；通過將一種或多種甲狀腺癌標(biāo)志物的水平與獲自無甲狀腺癌或較低級別甲狀腺癌的對照受試者或在不同時(shí)間取自患者的樣品的一種或多種甲狀腺癌標(biāo)志物的水平進(jìn)行比較，來檢測或診斷甲狀腺癌。在本發(fā)明該方法的實(shí)施方案中，一種或多種甲狀腺癌標(biāo)志物是核Ep-ICD、核β-聯(lián)蛋白、胞質(zhì)聯(lián)蛋白中的一種或多種。在具體實(shí)施方案中，甲狀腺癌標(biāo)志物是核Ep-ICD。在本發(fā)明的多個方面，通過確定在與獲自對照或在不同時(shí)間取自患者的樣品的這類水平進(jìn)行比較時(shí)核Ep-ICD、核β_聯(lián)蛋白、胞質(zhì)β_聯(lián)蛋白中的一種或多種水平升高，來檢測、診斷或表征侵襲性甲狀腺癌、特別是ATC。在一個具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于診斷受試者的甲狀腺癌的侵襲性的方法，所述方法包括(a)測定受試者樣品(例如腫瘤樣品)中核Ep-ICD的量；(b)測定樣品中核β -聯(lián)蛋白和β -聯(lián)蛋白中的一種或兩種的量；(c)測定樣品中EpEx的量；(d)以數(shù)學(xué)方法組合步驟(a)和步驟(b)及任選步驟(C)的結(jié)果，得到數(shù)學(xué)組合；和
(e)將數(shù)學(xué)組合與甲狀腺癌的侵襲性相比較或者使數(shù)學(xué)組合與甲狀腺癌的侵襲性相關(guān)聯(lián)。優(yōu)選將組合與預(yù)先確定的標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)學(xué)組合進(jìn)行比較。一方面，本發(fā)明提供用于監(jiān)測患者的甲狀腺癌進(jìn)展的方法，所述方法包括(a)在第一時(shí)間點(diǎn)檢測患者樣品(例如活組織檢查樣品)中的一種或多種甲狀腺癌標(biāo)志物；(b)在隨后的時(shí)間點(diǎn)上重復(fù)步驟(a);和(c)比較在(a)和(b)中檢出的水平，從而監(jiān)測患者的甲狀腺癌的進(jìn)展。
本發(fā)明提供將患有甲狀腺癌的患者分類的方法，所述方法包括測定患者樣品(例如腫瘤樣品)的一種或多種甲狀腺癌標(biāo)志物，使所測定的值與對分類組別中已分級的甲狀腺癌患者的甲狀腺癌標(biāo)志物測定的值相關(guān)聯(lián)。該方法可用于預(yù)測患者生存率，其中一種或多種甲狀腺癌標(biāo)志物預(yù)測生存率，且其中分類組別包括已知總體生存率的組別。在本發(fā)明該方法的方面，一種或多種甲狀腺癌標(biāo)志物選自Ep-I⑶和β -聯(lián)蛋白，特別是核Ep-I⑶、核β_聯(lián)蛋白和胞質(zhì)β_聯(lián)蛋白。在各個實(shí)施方案中，可使所測定的值歸一化，以得到更準(zhǔn)確的量化，并糾正實(shí)驗(yàn)偏差。在本發(fā)明特別有用的方面，檢測多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物，優(yōu)選編碼Ep-ICD和/或β_聯(lián)蛋白的多核苷酸，將患者樣品(例如活組織檢查樣品)的多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物的水平與得自無甲狀腺癌、患較低級別甲狀腺癌患者的樣品的多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物水平或者得自相同患者的樣品的水平進(jìn)行比較。本發(fā)明的方法可使用能夠與多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物和優(yōu)選編碼Ep-ICD的多核苷酸雜交的一種或多種多核苷酸、寡核苷酸或核酸。在本發(fā)明的一個方面，檢測Ep-I⑶mRNA。本發(fā)明涉及用于診斷和表征受試者樣品的甲狀腺癌、更特別是甲狀腺癌的病期的方法，所述方法包括從樣品分離核酸、優(yōu)選mRNA，并檢測樣品中的多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物。在一個實(shí)施方案中，與標(biāo)準(zhǔn)或?qū)φ障啾?，樣品中編碼Ep-ICD和/或β-聯(lián)蛋白的多核苷酸水平升高的存在表明甲狀腺癌的侵襲性或轉(zhuǎn)移潛力，特別表明ATC。本發(fā)明還提供用于測定受試者的甲狀腺癌存在與否或甲狀腺癌的侵襲性或轉(zhuǎn)移潛力、特別是測定受試者的ATC的方法，所述方法包括測定樣品中與一種或多種多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物雜交的核酸的水平，將該水平與預(yù)先確定的標(biāo)準(zhǔn)或截?cái)嘀颠M(jìn)行比較，由此測定受試者的甲狀腺癌存在與否或者甲狀腺癌的侵襲性或轉(zhuǎn)移潛力，特別是測定受試者的ATC0在一個實(shí)施方案中，提供用于測定受試者的甲狀腺癌的侵襲性或轉(zhuǎn)移潛力的方法，所述方法包括(a)使取自受試者的樣品與同編碼Ep-ICD和/或β_聯(lián)蛋白的多核苷酸雜交的寡核苷酸接觸；和(b)檢測樣品中相對于預(yù)先確定的標(biāo)準(zhǔn)或截?cái)嘀档呐c寡核苷酸雜交的核酸的水平，由此測定受試者的癌癥的侵襲性或轉(zhuǎn)移潛力。一方面，本發(fā)明提供評價(jià)患者的甲狀腺癌的侵襲性或轉(zhuǎn)移潛力的方法，所述方法包括比較(a)患者樣品中一種或多種多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物的水平；和(b)獲自未患甲狀腺癌或患較低級別甲狀腺癌的對照患者的相同類型的樣品或者在不同時(shí)間取自患者的樣品中的一種或多種多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物的對照水平，其中與相應(yīng)的一種或多種多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物的對照水平相比，一種或多種多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物水平的改變表明甲狀腺癌的侵襲性或轉(zhuǎn)移潛力。在用于評價(jià)患者是否患有侵襲性或轉(zhuǎn)移性甲狀腺癌、特別是ATC的本發(fā)明的一個具體方法中，與相應(yīng)的對照水平相比，樣品中Ep-ICD和/或β -聯(lián)蛋白的較高水平表明患者患有侵襲性或轉(zhuǎn)移性甲狀腺癌。在某些實(shí)施方案中，使用例如與一種或多種多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物或這類多核苷酸的互補(bǔ)序列雜交的至少一種寡核苷酸引物，通過擴(kuò)增反應(yīng)例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，檢測是mRNA的核酸的量。在其它實(shí)施方案中，使用與一種或多種多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物或其互補(bǔ)序列雜交的寡核苷酸探針，應(yīng)用雜交技術(shù)檢測mRNA的量。當(dāng)采用mRNA檢測時(shí)，可如下進(jìn)行該方法通過按照標(biāo)準(zhǔn)方法將分離的mRNA與試劑混合以轉(zhuǎn)化成cDNA ;所轉(zhuǎn)化的cDNA用擴(kuò)增反應(yīng)試劑連同引物的合適混合物處理以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物；和分析擴(kuò)增產(chǎn)物以檢測樣品中一種或多種多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物的存在情況。對于mRNA，可采用RT-PCR分析以檢測一種或多種多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物的存在情況，來 完成分析步驟。可如下來完成分析步驟通過定量檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中一種或多種多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物的存在情況，和對針對使用類似引物得到的已知在正常和惡性腫瘤樣品(例如組織樣品，特別是患有不同期甲狀腺癌的患者的組織樣品)存在或缺乏的一組預(yù)期值檢測的一種或多種多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物的量進(jìn)行比較。因此，本發(fā)明提供其中通過以下步驟檢測mRNA的方法(a)從樣品中分離mRNA，使mRNA與試劑混合以將其轉(zhuǎn)化成cDNA ； (b)轉(zhuǎn)化的cDNA用擴(kuò)增反應(yīng)試劑和與一種或多種多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物雜交的核酸引物處理以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物；(d)分析擴(kuò)增產(chǎn)物以檢測一種或多種mRNA多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物的量；和(e)將mRNA的量與針對用類似核酸引物得到的正常組織和惡性腫瘤組織(例如患有不同病期的甲狀腺癌的患者的組織)的一組預(yù)期值檢測的量進(jìn)行比較。基于蛋白質(zhì)的方法也可用于診斷和監(jiān)測受試者的甲狀腺癌、特別是甲狀腺癌的侵襲性或轉(zhuǎn)移潛力、更特別是ATC，所述方法包括檢測受試者樣品中的甲狀腺癌標(biāo)志物?？墒褂眉谞钕侔?biāo)志物的結(jié)合劑，優(yōu)選與甲狀腺癌標(biāo)志物或其組成部分有特異性反應(yīng)的抗體，來檢測甲狀腺癌標(biāo)志物。本發(fā)明提供評價(jià)患者是否患有甲狀腺癌、特別是侵襲性或轉(zhuǎn)移性甲狀腺癌、更特別是ATC的方法，所述方法包括比較(a)患者樣品中多肽甲狀腺癌標(biāo)志物的水平；和(b)非癌樣品或患較低級別甲狀腺癌的患者的樣品或在不同時(shí)間取自患者的樣品中的多肽甲狀腺癌標(biāo)志物的對照水平，其中與對照水平相比，患者樣品中多肽甲狀腺癌標(biāo)志物顯著不同的水平(例如患者樣品中的較高水平)表明患者患有甲狀腺癌或侵襲性或轉(zhuǎn)移性甲狀腺癌，特別是ATC。在另一方面，本發(fā)明提供用于測定患者中甲狀腺癌存在與否或者甲狀腺癌的侵襲性或轉(zhuǎn)移潛力、特別是ATC的方法，所述方法包括以下步驟(a)使獲自患者的生物樣品與特異性結(jié)合一種或多種多肽甲狀腺癌標(biāo)志物的結(jié)合劑接觸；和(b)檢測樣品中相對于預(yù)先確定的標(biāo)準(zhǔn)或截?cái)嘀档慕Y(jié)合一種或多種結(jié)合劑的一種或多種多肽甲狀腺癌標(biāo)志物的量，由此確定患者的甲狀腺癌的侵襲性或轉(zhuǎn)移潛力存在與否。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過定量測定受試者的生物樣品中一種或多種多肽甲狀腺癌標(biāo)志物，對受試者的甲狀腺癌進(jìn)行檢測、診斷、分期和監(jiān)測的方法，所述方法包括(a)使生物樣品與對一種或多種多肽甲狀腺癌標(biāo)志物有特異性的抗體反應(yīng)，所述抗體用可檢測物質(zhì)直接或間接標(biāo)記；和(b)檢測所述可檢測物質(zhì)。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供使用抗體檢測樣品中一種或多種多肽甲狀腺癌標(biāo)志物的表達(dá)的方法，所述方法包括(a)在允許抗體蛋白質(zhì)復(fù)合物形成的條件下，將對一種或多種多肽甲狀腺癌標(biāo)志物有特異性的抗體與樣品混合；和(b)檢測復(fù)合物形成，其中復(fù)合物形成表明樣品中一種或多種多肽甲狀腺癌標(biāo)志物的表達(dá) 。可將表達(dá)與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，并對甲狀腺癌或甲狀腺癌的侵襲性或轉(zhuǎn)移潛力、特別是ATC作出診斷。一方面，本發(fā)明提供用于監(jiān)測患者中甲狀腺癌的進(jìn)展的方法，所述方法包括(a)在第一時(shí)間點(diǎn)檢測患者樣品中的一種或多種多肽甲狀腺癌標(biāo)志物；和(b)在隨后的時(shí)間點(diǎn)上重復(fù)步驟(a);和(c)比較在(a)和(b)中檢出的水平，從而監(jiān)測患者的甲狀腺癌的進(jìn)展。本發(fā)明還涉及評價(jià)治療患者的甲狀腺癌、更特別是侵襲性或轉(zhuǎn)移性甲狀腺癌的功效的方法。該方法包括比較(a)在向患者提供至少一部分治療前獲自患者的第一樣品中的甲狀腺癌標(biāo)志物的水平；和(b)在治療后獲自患者的第二樣品中的甲狀腺癌標(biāo)志物的水平。與第一樣品相比，第二樣品中顯著不同的甲狀腺癌標(biāo)志物水平表明治療對抑制甲狀腺癌、更特別是退行發(fā)育性甲狀腺癌有效。在一個實(shí)施方案中，方法用來評價(jià)治療抑制甲狀腺癌、更特別是侵襲性或轉(zhuǎn)移性甲狀腺癌的功效，與第一樣品相比，第二樣品中核Ep-ICD、核β-聯(lián)蛋白或胞質(zhì)聯(lián)蛋白的較低水平，表明治療對抑制癌癥或轉(zhuǎn)移有效。治療可以是用于治療甲狀腺癌的任何療法，包括但不限于化學(xué)療法、免疫療法、基因療法、放射療法和組織的手術(shù)切除。因此，在治療之前、期間和之后，該方法可用于評價(jià)患者，例如用于評價(jià)腫瘤負(fù)荷、腫瘤的侵襲性或轉(zhuǎn)移潛力的降低。本發(fā)明考慮用于測定環(huán)境因素對甲狀腺組織或甲狀腺癌的作用的方法，所述方法包括比較在環(huán)境因素存在和不存在的情況下的甲狀腺癌標(biāo)志物。本發(fā)明還提供用于評價(jià)試驗(yàn)物質(zhì)治療甲狀腺癌的潛在功效的方法和選擇治療甲狀腺癌的物質(zhì)的方法。本發(fā)明考慮評價(jià)試驗(yàn)化合物有助于甲狀腺癌的潛力的方法，所述方法包括(a)在試驗(yàn)化合物存在和不存在的情況下，維持單獨(dú)的患病細(xì)胞的等分部分；和(b)將各個等分部分中的甲狀腺癌標(biāo)志物水平進(jìn)行比較。在存在試驗(yàn)化合物的情況下維持(或暴露于試驗(yàn)化合物)的等分部分相對于在不存在試驗(yàn)化合物的情況下維持的等分部分在標(biāo)志物水平之間的顯著差異，表明試驗(yàn)化合物可能有助于甲狀腺癌。本發(fā)明還提供包含甲狀腺癌標(biāo)志物或與甲狀腺癌標(biāo)志物相互作用的物質(zhì)的藥物組合物或診斷組合物。具體地講，本發(fā)明提供包含多肽甲狀腺癌標(biāo)志物或與這類標(biāo)志物結(jié)合或與多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物雜交或擴(kuò)增多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物的物質(zhì)的藥物組合物或診斷組合物。在一個實(shí)施方案中，組合物包含與多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物或其片段特異性雜交的探針。在另一個實(shí)施方案中，提供包含能夠應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴(kuò)增多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物的特異性引物對的組合物。在又一個實(shí)施方案中，組合物包含與多肽甲狀腺癌標(biāo)志物或其片段結(jié)合的一種或多種結(jié)合劑(例如抗體)。探針、引物和結(jié)合劑可用可檢測物楊己O在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物或診斷組合物包含對Ep-I⑶、聯(lián)蛋白和/或EpEx有特異性的抗體。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物或診斷組合物包含與編碼Ep-I⑶、β -聯(lián)蛋白和/或EpEx的多核苷酸雜交的核苷酸(例如探針)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的診斷組合物包含擴(kuò)增編碼Ep-I⑶、β-聯(lián)蛋白和/或EpEx的多核苷酸的引物。另一方面，本發(fā)明涉及與甲狀腺癌標(biāo)志物相互作用的物質(zhì)在制備用于診斷甲狀腺癌、特別是甲狀腺癌的侵襲性或轉(zhuǎn)移潛力、更特別是ATC的組合物中的用途。本發(fā)明的方法可包括檢測Wnt蛋白和編碼Wnt蛋白的多核苷酸。本發(fā)明的方法還 可包括檢測與甲狀腺癌有關(guān)的其它標(biāo)志物，例如半乳凝素_3、甲狀腺球蛋白、E-鈣黏著蛋白、β -肌動蛋白、FHL2和Lef-Ι。此外，甲狀腺癌標(biāo)志物的量可與其它甲狀腺癌的標(biāo)志物在數(shù)學(xué)上組合。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于檢測或診斷受試者的甲狀腺癌的方法，所述方法包括(a)測定受試者樣品中的甲狀腺癌標(biāo)志物的量；(b)測定樣品中與甲狀腺癌有關(guān)的其它標(biāo)志物的量，特別是選自半乳凝素-3、甲狀腺球蛋白、E-鈣黏著蛋白、c-Myc, β -肌動蛋白、FHL2和Lef-I的標(biāo)志物的量；(C)以數(shù)學(xué)方法組合步驟(a)和步驟(b)的結(jié)果，得到數(shù)學(xué)組合；和(d)將數(shù)學(xué)組合與甲狀腺癌的存在情況或甲狀腺癌的侵襲性或轉(zhuǎn)移潛力相比較或者使數(shù)學(xué)組合與甲狀腺癌的存在情況或甲狀腺癌的侵襲性或轉(zhuǎn)移潛力相關(guān)聯(lián)。優(yōu)選將組合與預(yù)先確定的標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)學(xué)組合進(jìn)行比較。在具體方面，本發(fā)明提供用于通過測定受試者樣品中甲狀腺癌標(biāo)志物及半乳凝素-3和甲狀腺球蛋白中的一種或兩種的組合，來檢測、表征或診斷甲狀腺癌的方法。本發(fā)明還包括用于實(shí)施本發(fā)明方法的試劑盒。一方面，本發(fā)明提供包括甲狀腺癌標(biāo)志物的用于檢測、診斷或表征甲狀腺癌的試劑盒。在一個具體方面，本發(fā)明提供用于診斷或表征受試者的甲狀腺癌的試驗(yàn)試劑盒，其包括與一種或多種甲狀腺癌標(biāo)志物相互作用的物質(zhì)。在一個實(shí)施方案中，試劑盒用于評價(jià)患者是否患有侵襲性或轉(zhuǎn)移性甲狀腺癌、特別是ATC,且包括用于鑒定和/或評價(jià)Ep-I⑶、β -聯(lián)蛋白和任選EpEx的水平的試劑。本發(fā)明因此考慮包括將攜帶用于成像的標(biāo)記且與一種或多種甲狀腺癌標(biāo)志物結(jié)合的一種或多種物質(zhì)給予哺乳動物，然后對哺乳動物進(jìn)行成像的體內(nèi)方法。按照本發(fā)明的一個優(yōu)選方面，提供用于使甲狀腺癌成像的體內(nèi)方法，所述方法包括(a)用與一種或多種甲狀腺癌標(biāo)志物結(jié)合的物質(zhì)給患者注射，該物質(zhì)攜帶使甲狀腺癌成像的標(biāo)記；(b)使該物質(zhì)在體內(nèi)溫育并與一種或多種甲狀腺癌標(biāo)志物結(jié)合；和(C)檢測定位于甲狀腺癌的標(biāo)記的存在情況。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，該物質(zhì)是識別一種或多種甲狀腺癌標(biāo)志物的抗體。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，該物質(zhì)是識別一種或多種甲狀腺癌標(biāo)志物的化學(xué)實(shí)體。
該物質(zhì)攜帶使一種或多種甲狀腺癌標(biāo)志物成像的標(biāo)記。用于成像的標(biāo)記的實(shí)例是放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記(例如熒光素和羅丹明)、核磁共振活性標(biāo)記、通過正電子成像術(shù)(“PET”)掃描器可檢測的正電子發(fā)射同位素、化學(xué)發(fā)光物(chemiIuminescer)(例如螢光素)和酶標(biāo)志物(例如過氧化物酶或磷酸酶)。還可采用通過短程檢測器探針可檢測的短程福射發(fā)射體(radiation emitter),例如同位素。本發(fā)明還考慮使用甲狀腺癌的多種標(biāo)志物的本文所述的定位或成像方法。本發(fā)明提供治療甲狀腺癌、特別是ATC的方法，所述方法包括給予受試者本發(fā)明的藥物組合物或使用本發(fā)明的藥物組合物。一方面，本發(fā)明提供可在治療上用于破壞或抑制甲狀腺癌細(xì)胞(例如ATC細(xì)胞)的生長或者阻斷Ep-ICD或β-聯(lián)蛋白活性的對Ep-ICD或β_聯(lián)蛋白有特異性的拮抗劑(例如抗體)。另外，Ep-ICD或β_聯(lián)蛋白可用于各種免疫治療方法以促進(jìn)免疫介導(dǎo)的對表達(dá)Ep-ICD或β -聯(lián)蛋白的腫瘤的破壞或生長抑制。本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)勢從下面的發(fā)明詳述來看將是顯而易見的。然而，應(yīng) 當(dāng)理解的是，在指明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的同時(shí)，僅通過闡述給出發(fā)明詳述和具體實(shí)例，因?yàn)閺谋景l(fā)明詳述來看，在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種改動和修改對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將變得顯而易見。附圖描沭下面將參照附圖對本發(fā)明進(jìn)行描述，其中圖I.甲狀腺癌中ΕρΕχ、Ερ-Ι⑶和β-聯(lián)蛋白的免疫組織化學(xué)分析。退行發(fā)育性甲狀腺癌不顯示可檢測的膜EpEx染色(IA);所分析的甲狀腺癌的所有其它亞型和正常甲狀腺組織顯示質(zhì)膜EpEX染色(IB-IF)。僅在未分化和分化差的甲狀腺癌中觀察到核Ep-I⑶染色(IIA-IIC和IIF)，但在高度分化的甲狀腺癌和正常甲狀腺組織中未觀察到(IID、HE)。與核Ep-ICD染色相關(guān)，在侵襲性甲狀腺癌中觀察到核或胞質(zhì)β-聯(lián)蛋白染色(IIIA-IIIC和IIIF)，而在較低侵襲性甲狀腺癌和正常甲狀腺組織中觀察到膜染色(IIID、IIIE)。圖2.相同甲狀腺癌患者中EpEx、Ep-I⑶和β -聯(lián)蛋白的免疫組織化學(xué)分析。在退行發(fā)育性甲狀腺癌切片中未觀察到膜EpEx染色(IA)，在鱗狀細(xì)胞切片中觀察到微弱的膜EpEx染色(IB)，在分化差的切片和正常切片兩者中觀察到強(qiáng)的膜EpEx染色(1C、ID)。未分化和分化差的切片中的核和胞質(zhì)Ep-ICD染色(IIA-IIC)，在正常組織中的膜和胞質(zhì)染色(IID)。退行發(fā)育性甲狀腺癌切片中的核和胞質(zhì)β聯(lián)蛋白染色(IIIA)，該樣品中其它亞類的膜聯(lián)蛋白染色(IIIB-IIID)。圖3.在甲狀腺癌中EpEx、Ep-I⑶和β -聯(lián)蛋白表達(dá)的箱形圖分析。箱形圖顯示在正常甲狀腺組織和甲狀腺癌的不同類型的石蠟包埋切片中通過免疫組織化學(xué)測定的免疫染色總評分的分布。垂直軸給出如實(shí)施例I中所述得到的免疫染色總評分。組圖A表示EpEx染色的箱形圖-I描繪在正常組織和PTC中的膜定位、在ATC中無可檢測的表達(dá)、在FTC和SCC中表達(dá)的不同降低(其評分中值為3，黑體水平線)。組圖AII描繪EpEx在正常組織、PTC、PDPTC、PDFTC和FTC中的胞質(zhì)定位、在ATC中無可檢測的表達(dá)和在SCC中表達(dá)的不同降低。組圖AIII描繪在正常組織和甲狀腺癌的所有亞型中無可檢測的EpEx核定位。組圖B表示Ep-ICD染色的箱形圖。組圖BI表示在正常組織、PTC、ATC、FTC和SCC、H)PTC和PDFTC中可變的Ep-ICD膜定位。組圖BII描繪在正常組織、PTC、ATC、FTC和SCC、PDPTC和PDFTC中的胞質(zhì)Ep-ICD定位。組圖BIII描繪與評分中值為O的PTC、FTC、roPTC、H)FTC和正常甲狀腺組織相比，在ATC中的核定位和在SCC中的不同表達(dá)(評分中值為3，黑體水平線，范圍0-4，用垂直條形柱表示)。組圖C表示β -聯(lián)蛋白染色的箱形圖-Cl描繪僅ATC中有核染色。組圖CII表示所分析的所有甲狀腺癌亞型的胞質(zhì)β-聯(lián)蛋白。組圖CIII表示正常組織和除大多數(shù)ATC以外的所分析的所有甲狀腺癌亞型中的膜β-聯(lián)蛋白。組圖D表示采用Visiopharm Integrator System的甲狀腺癌不同亞型中的Ep-IO)核染色。所分析的所有ATC和I個PDPTC和I個PDFTC顯示核Ep-ICD表達(dá)。圖4.人甲狀腺原發(fā)性腫瘤中EpCAM的定量實(shí)時(shí)PCR分析。直方圖表示在甲狀腺癌的不同亞類中EpCAM轉(zhuǎn)錄物的水平。圖5.總體生存率的累積比例的Kaplan-Meier估計(jì)(A)膜EpEx表達(dá)的喪失。(B)核Ep-I⑶蓄積。(C)核β-聯(lián)蛋白蓄積。(D)甲狀腺癌中核Ep-I⑶和β-聯(lián)蛋白伴隨表達(dá)。 圖6.人甲狀腺癌衍生細(xì)胞系中的EpCAM表達(dá)。(A)組圖I-免疫細(xì)胞化學(xué)-EpEx染色在ARO (結(jié)腸癌細(xì)胞，之前認(rèn)為是ATC細(xì)胞)、WR0 (結(jié)腸癌細(xì)胞，之前認(rèn)為是侵襲性甲狀腺濾泡癌細(xì)胞)和TT(甲狀腺髓樣癌細(xì)胞)中定位于質(zhì)膜；在CAL-62中檢出胞質(zhì)Ep-Ex，而在TPC-I (低級別甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞)中未觀察到EpEx染色(原始放大倍數(shù)X 200)。組圖II-用Ep-I⑶(1144)的免疫細(xì)胞化學(xué)法。Ep-I⑶染色在ARO(結(jié)腸癌細(xì)胞，之前認(rèn)為是ATC細(xì)胞)、WR0 (結(jié)腸癌細(xì)胞，之前認(rèn)為是侵襲性甲狀腺濾泡癌細(xì)胞)和TT (甲狀腺髓樣癌細(xì)胞)中定位于質(zhì)膜和胞質(zhì)；在CAL-62中檢出胞質(zhì)Ep-ICD，而TPC-I (低級別甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞)中未觀察到Ep-I⑶染色(原始放大倍數(shù)X 200)。組圖III.免疫熒光-EpEx染色定位于AR0、WR0和TT的質(zhì)膜(中間組圖)和CAL-62的胞質(zhì)(原始放大倍數(shù)x 400)。組圖IV-為了界定核定位，顯示了 4' -6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核酸染色(原始放大倍數(shù)X 400)。(B)免疫熒光分析。用M0C-31的強(qiáng)EpEx染色在ARO和WRO細(xì)胞中定位于質(zhì)膜，而Ep-I⑶染色在CAL 62細(xì)胞中定準(zhǔn)于胞質(zhì)和核(原始放大倍數(shù)X 400)。(C)同一組的甲狀腺癌細(xì)胞系中EpCAM表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡分析。細(xì)胞裂解物用SDS-PAGE分離，并使用抗EpCAM抗體(B302)探測EpCAM(上組圖)。為了確保等量加樣，探測相同裂解物的β_肌動蛋白(下組圖)。在AR0、WR0和TT細(xì)胞中觀察到一個40kDa條帶，但在TPC-I細(xì)胞中未檢出條帶。(D)同一組甲狀腺癌細(xì)胞系中EpCAM的定量實(shí)時(shí)PCR分析。顯示了在AR0、WR0、TT細(xì)胞中EpCAM與GAPDH的比率，而在TPC-I細(xì)胞中無法定量檢出轉(zhuǎn)錄物。(E)同一組甲狀腺癌細(xì)胞系中用M0C-31的免疫熒光EpEx染色和β-聯(lián)蛋白。(F)同一組甲狀腺癌細(xì)胞系中用M0C-31的免疫熒光EpEx染色和c-myc。圖7表示用免疫毒素VB4-845/VB6-845治療癌細(xì)胞系和陽性對照結(jié)腸癌細(xì)胞系后EpCAM陽性甲狀腺癌細(xì)胞增殖的抑制。圖8表示在用不同濃度的VB4-845治療之前和之后，通過蛋白質(zhì)印跡法測定的VB4-845對EpCAM在細(xì)胞系中表達(dá)的作用。圖9表示用甲狀腺乳頭狀癌-I (TPC-I)細(xì)胞和VB4(A)和PBS(B)治療的SCID小鼠中腫瘤大小的變化。

圖10是顯示甲狀腺癌中EpEx膜染色的散點(diǎn)圖。圖11是顯示甲狀腺癌中EpEx胞質(zhì)染色的散點(diǎn)圖。圖12是顯示甲狀腺癌中Ep-I⑶膜染色的散點(diǎn)圖。
圖13是顯示甲狀腺癌中Ep-I⑶胞質(zhì)染色的散點(diǎn)圖。圖14是顯示甲狀腺癌中Ep-I⑶核染色的散點(diǎn)圖。圖15是將ATC與PTC區(qū)別開的EpI⑶核染色的ROC曲線分析。
圖16是將ATC與PTC區(qū)別開的EpEx膜染色的ROC分析。圖17表示甲狀腺腫瘤中EpEx和Ep-I⑶表達(dá)的免疫組織化學(xué)分析。顯微照片表示甲狀腺良性腫瘤(A)、甲狀腺非侵襲性惡性腫瘤(C)、甲狀腺侵襲性惡性腫瘤(E)和(G)中膜表達(dá)的EpEx染色；在甲狀腺良性腫瘤(B)、甲狀腺非侵襲性惡性腫瘤(D)、甲狀腺侵襲性惡性腫瘤(F)和(H)中觀察到Ep-I⑶核表達(dá)。M，膜染色；N，核染色。所有顯微照片使用原始放大倍數(shù)X 400。圖18是菲律賓患者中膜EpEx表達(dá)的散點(diǎn)圖分析。散點(diǎn)圖顯示在甲狀腺良性腫瘤、臨床非侵襲性和侵襲性甲狀腺惡性腫瘤中免疫染色總評分的分布。垂直軸給出如實(shí)施例中所述的免疫組織化學(xué)染色總評分。>4的截?cái)嘀涤脕泶_定陽性。在所分析的大多數(shù)侵襲性菲律賓人惡性腫瘤病例中觀察到EpEx的膜表達(dá)減少；在所有良性腫瘤病例和非侵襲性惡性腫瘤病例中觀察到高的膜EpEx表達(dá)。(4的截?cái)嘀翟u分用來確定陽性(膜表達(dá)喪失)。圖19是菲律賓患者中核Ep-ICD表達(dá)的散點(diǎn)圖分析。散點(diǎn)圖顯示在甲狀腺良性腫瘤、臨床非侵襲性和侵襲性甲狀腺惡性腫瘤中測定的免疫染色總評分的分布。垂直軸給出如實(shí)施例中所述的免疫組織化學(xué)染色總評分。>4的截?cái)嘀涤脕泶_定陽性。在所分析的幾乎所有侵襲性菲律賓人甲狀腺惡性腫瘤中觀察到Ep-ICD的核表達(dá)升高，但在良性腫瘤和非侵襲性惡性腫瘤病例中未觀察到。圖20表示菲律賓人甲狀腺良性腫瘤、非侵襲性和侵襲性癌癥中膜EpEX(A、C)和核Ep-I⑶(B、D)的接受者操作特征(ROC)曲線。根據(jù)膜EpEx和核Ep-I⑶表達(dá)的靈敏度和I-特異性繪制ROC曲線。垂直軸表明靈敏度，水平軸表明I-特異性。對于癌癥的靈敏度、特異性和曲線下面積(AUC)值概括于表8。圖21表示核Ep-I⑶⑶的和膜EpEx表達(dá)喪失㈧的箱形圖分析。圖22表示膜EpEx表達(dá)和核Ep-I⑶表達(dá)的箱形圖分析。箱形圖顯示通過對甲狀腺良性腫瘤、臨床非侵襲性和侵襲性甲狀腺惡性腫瘤的組織切片的免疫組織化學(xué)測定的免疫染色總評分的分布。垂直軸給出如實(shí)施例中所述的免疫組織化學(xué)染色總評分。A.在所分析的大多數(shù)侵襲性菲律賓人惡性腫瘤病例中觀察到EpEx的膜表達(dá)減少；在所有良性腫瘤病例和非侵襲性惡性腫瘤病例中觀察到高的膜EpEx表達(dá)。(4的截?cái)嘀涤脕泶_定陽性(膜表達(dá)喪失)。B.在所分析的幾乎所有侵襲性菲律賓人甲狀腺惡性腫瘤中觀察到Ep-ICD的核表達(dá)增加，但在良性腫瘤和非侵襲性惡性腫瘤病例中未觀察到。> 4的截?cái)嘀涤脕泶_定陽性。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及新發(fā)現(xiàn)的甲狀腺癌標(biāo)志物的表達(dá)與甲狀腺癌、特別是甲狀腺癌的侵襲性或轉(zhuǎn)移潛力、更特別是ATC之間的關(guān)系。本文所述甲狀腺癌標(biāo)志物提供用于診斷、檢測或表征甲狀腺癌、特別是甲狀腺癌的侵襲性或轉(zhuǎn)移潛力、更特別是ATC的方法。提供用于診斷或檢測樣品中侵襲性或轉(zhuǎn)移性甲狀腺癌是否存在、用于監(jiān)測甲狀腺癌的進(jìn)展以及提供有關(guān)與患者的甲狀腺癌的診斷和表征有關(guān)的甲狀腺癌的特征的信息的方法。除非另有說明，否則本文所用的所有科技術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義。下面的定義補(bǔ)充本領(lǐng)域的定義，針對本申請，而不歸因于任何相關(guān)或不相關(guān)的情況。雖然在實(shí)施本發(fā)明時(shí)可采用類似或等同于本文所述方法和材料的任何方法和材料，但是本文描述了具體的材料和方法。本文通過端點(diǎn)列舉的數(shù)值范圍包括歸入該范圍內(nèi)的所有數(shù)值和分?jǐn)?shù)(例如1-5包括I、I. 5、2、2. 75,3,3. 90、4和5)。還要理解的是，假定所有數(shù)值及其分?jǐn)?shù)被術(shù)語“約”修飾。術(shù)語“約”意指所提及的數(shù)值正負(fù)O. 1-50%、5-50%或10-40%、優(yōu)選10-20%、更優(yōu)選10%或15%。本文和隨附權(quán)利要求書中使用的單數(shù)形式包括復(fù)數(shù)形式，除非文中另有明確說明。術(shù)語“甲狀腺癌”是指甲狀腺的任何惡性進(jìn)程。甲狀腺癌的實(shí)例包括但不限于甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺乳頭狀癌的濾泡變體、濾泡癌、Hurthle細(xì)胞腫瘤、退行發(fā)育性甲狀腺癌、甲狀腺髓樣癌、甲狀腺淋巴瘤、分化差的甲狀腺癌和甲狀腺血管肉瘤。在本發(fā)明的多方面，甲狀腺癌是甲狀腺髓樣癌。在本發(fā)明的多方面，甲狀腺癌是侵襲性癌或具有轉(zhuǎn)移潛力、特別是侵襲性甲狀腺髓樣癌或甲狀腺濾泡癌或具有轉(zhuǎn)移潛力的甲狀腺髓樣癌或甲狀腺濾 泡癌。在本發(fā)明的多方面，甲狀腺癌是退行發(fā)育性甲狀腺癌(ATC)?！稗D(zhuǎn)移潛力”是指癌細(xì)胞從最初部位(即甲狀腺)移動至機(jī)體的其它部位的能力或可能性。術(shù)語“樣品”等意指已知或疑似表達(dá)或含有甲狀腺癌標(biāo)志物或結(jié)合劑的材料，結(jié)合劑為例如對多肽甲狀腺癌標(biāo)志物有特異性的抗體。樣品可來源于生物來源(“生物樣品”)，例如組織(例如活組織檢查樣品)、提取物或包括細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞)、細(xì)胞裂解物在內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)物和生物或生理流體，例如全血、血漿、血清、唾液、腦髓液、汗、尿液、乳汁、腹膜液等。獲自來源的樣品或在預(yù)處理以改進(jìn)樣品特征(例如從血液制備血漿、稀釋黏液等)后的樣品可直接使用。在本發(fā)明的某些方面，樣品是人生理流體，例如人血清。在本發(fā)明的某些方面，樣品是活組織檢查樣品。在本發(fā)明的某些方面，樣品是良性、惡性或正常組織樣品O可按照本發(fā)明進(jìn)行分析的樣品包括臨床相關(guān)來源的多核苷酸，優(yōu)選表達(dá)的RNA或由此得到的核酸(cDNA或來源于摻入RNA聚合酶啟動子的cDNA的擴(kuò)增RNA)。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的是，靶多核苷酸可包括RNA，包括而不限于細(xì)胞總RNA、聚(A)+信使RNA(mRNA)或其部分、胞質(zhì)mRNA或由cDNA轉(zhuǎn)錄的RNA(即cRNA)?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知方法，在一個或多個核苷酸上對靶多核苷酸進(jìn)行可檢測標(biāo)記。標(biāo)記優(yōu)選沿RNA長度均勻摻入，更優(yōu)選以高度效率進(jìn)行?？蓹z測標(biāo)記可以是而不限于發(fā)光標(biāo)記、熒光標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、放射性標(biāo)記和比色標(biāo)記?？蓪颊邩悠返陌卸嗪塑账徇M(jìn)行區(qū)別于標(biāo)準(zhǔn)物的多核苷酸地標(biāo)記。標(biāo)準(zhǔn)物可包含正常個體(例如未患或易患甲狀腺癌的個體)的靶多核苷酸(特別是由正常個體或患不同病期的患者的樣品合并的)。靶多核苷酸可來源于同一個體，但在不同的時(shí)間點(diǎn)取得，因此在療程期間和之后通過標(biāo)志物表達(dá)的改變或其缺乏來表明治療的功效。術(shù)語“受試者”、“患者”和“個體”在本文可互換使用，是指溫血動物，例如患有或疑似患有、易患或?qū)ζ浜Y查甲狀腺癌、特別是實(shí)際的或疑似的侵襲性甲狀腺癌或轉(zhuǎn)移潛力、更特別是ATC的哺乳動物。該術(shù)語包括但不限于家畜、運(yùn)動動物、靈長類動物和人。優(yōu)選該術(shù)語是指人。
本文所用術(shù)語“疑似患有甲狀腺癌的受試者”是指呈現(xiàn)表明甲狀腺癌的一種或多種癥狀(例如明顯的腫塊或皰塊)或?qū)ζ浜Y查癌癥(例如例行體檢期間)的受試者。疑似患有甲狀腺癌的受試者還可能有一種或多種風(fēng)險(xiǎn)因素。疑似患有甲狀腺癌的受試者一般未針對癌癥進(jìn)行檢測。然而，“疑似患有甲狀腺癌的受試者”包括已接受初步診斷但癌癥病期未知的個體。該術(shù)語還包括曾患癌癥的人(例如消退情況下的個體)。本文所用術(shù)語“有甲狀腺癌風(fēng)險(xiǎn)的受試者”是指具有發(fā)生甲狀腺癌、特別是侵襲性或轉(zhuǎn)移性甲狀腺癌、更特別是ATC的一種或多種風(fēng)險(xiǎn)因素的受試者。風(fēng)險(xiǎn)因素包括但不限于性別、年齡、遺傳傾向性、環(huán)境暴露、之前的癌癥事件、先前存在的非癌癥疾病和生活方式。本文所用術(shù)語在受試者中“表征甲狀腺癌”是指鑒定受試者癌癥樣品的一種或多種性質(zhì)，包括但不限于受試者的預(yù)后或生存率。癌癥可通過鑒定一種或多種標(biāo)志物的表達(dá)來表征，所述標(biāo)志物包括但不限于本文公開的甲狀腺癌標(biāo)志物。
本文所用術(shù)語“治療”是指用于部分或完全減輕、改善、緩解特定病況的一種或多種癥狀或特征、抑制、預(yù)防、延緩特定病況的一種或多種癥狀或特征的發(fā)生、降低特定病況的一種或多種癥狀或特征的嚴(yán)重程度和/或降低特定病況的一種或多種癥狀或特征的發(fā)病率的任何方法?？蓪⒅委熃o予不顯示病況體征和/或只顯示早期病況體征的受試者，目的在于降低發(fā)生與病況有關(guān)的病理的風(fēng)險(xiǎn)。因此，根據(jù)受試者的狀態(tài)，在本發(fā)明的一些方面，該術(shù)語可指預(yù)防病況，并包括預(yù)防發(fā)病或預(yù)防與病況有關(guān)的癥狀。該術(shù)語還包括維持病況和/或癥狀，使得病況和/或癥狀的嚴(yán)重程度不發(fā)展。治療可以急性或慢性方式進(jìn)行。該術(shù)語還指減輕病況或與在患有病況之前與該病況有關(guān)的癥狀的嚴(yán)重程度。這種患病之前病況的預(yù)防或病況嚴(yán)重程度的減輕是指給予在給藥時(shí)未患病的受試者治療。預(yù)防還包括預(yù)防病況或與這類病況有關(guān)的一種或多種癥狀的復(fù)發(fā)。術(shù)語“治療”和“治療上的”是指治療的行動，如上述“治療”的定義。介入的目的是與病況抗?fàn)?，包括給予治療以預(yù)防或延緩癥狀或并發(fā)癥的發(fā)生，或者減輕癥狀或并發(fā)癥，或者消除病況?！岸嚯摹焙汀暗鞍踪|(zhì)”在本文可互換使用，表示通過共價(jià)和/或非共價(jià)鍵連接的氨基酸的至少一個分子鏈。該術(shù)語包括肽、寡肽和蛋白質(zhì)及多肽的翻譯后修飾，例如糖基化、乙?；?、磷酸化等。蛋白質(zhì)片段、類似物、突變蛋白質(zhì)或變體蛋白質(zhì)、融合蛋白等也包括在該術(shù)語的含義中。術(shù)語“EpCAM”是指包含表皮生長因子(EGF)樣結(jié)構(gòu)域和甲狀腺球蛋白重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域的I型膜蛋白。具體地講，它由大的胞外域(265個氨基酸)(EpEx)、23個氨基酸的單一跨膜組成部分(SEQ ID NO. I的氨基酸266-288)和26個氨基酸的短的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(Ep-ICD-SEQ ID NO. I的氨基酸289-413)組成。兩個EGF樣重復(fù)序列位于胞外域內(nèi)(Balzar等，2001)。成熟酶由314個氨基酸組成。[有關(guān)EpCAM(⑶326)的綜述參見Baeuerie PA和
OGires, British Journal of Cancer (2007) 96,第 417-423 頁]。該術(shù)語包括 EpCAM、特別是人EpCAM的天然序列多肽、同種型、前體和嵌合蛋白或融合蛋白?？捎糜诒景l(fā)明的EpCAM多肽包括而不限于包含存在于檢索號NP_002345和SEQ ID NO. I中的序列的多肽。在本發(fā)明的具體方面，EpCAM的結(jié)構(gòu)域被用于本發(fā)明的方法，特別是Ep-ICD和EpEx。術(shù)語“β_聯(lián)蛋白”是指粘附連接蛋白，其含有幾個犰狳重復(fù)序列，即參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的約50個氨基酸的序列。每個重復(fù)序列由3個螺旋組成，具有彼此反向平行并垂直于螺旋2的螺旋I和3及允許螺旋I和2急劇轉(zhuǎn)向的保守氨酸殘基(參見Aberle H 等，J Cell Sci. 1994 Dec ；107 (Ptl2) :3655-63 ;van Hengel, J.等，Cytogenet.Cell Genet. 70 (1-2) ,68-70(1995))。該術(shù)語包括聯(lián)蛋白、特別是人聯(lián)蛋白的天然序列多肽、同種型、前體和嵌合蛋白或融合蛋白?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的β_聯(lián)蛋白多肽包括而不限于包含存在于 Swiss-Prot 檢索號P35222. UGenbank ΝΡ_001091679 和 SEQ ID NO. 7的序列的多肽?！癢nt蛋白”是指在胚胎發(fā)生期間調(diào)節(jié)細(xì)胞-細(xì)胞間相互作用的高度保守的分泌信號分子家族。fct蛋白包括調(diào)節(jié)Wnt信號分子的產(chǎn)生、其與靶細(xì)胞上的受體的相互作用和導(dǎo)致細(xì)胞與Wnt配體(包括革巴蛋白)接觸的革巴細(xì)胞生理反應(yīng)的蛋白質(zhì)。fct蛋白包括而不限于 Wnt 蛋白(例如 ffntl> Wnt3> Wnt4> Wnt5B> Wnt7A> WntlOA、WntlOB)、Frizzled(FRZ)家 族的細(xì)胞表面受體、Dishevelled家族蛋白質(zhì)、軸蛋白(例如Axinl> Axin2)、WTX、PORCURSP04、VANGLl、GSK-3、APC、TCF/LEF家族轉(zhuǎn)錄因子(例如TCF4)、跨膜蛋白LRP、硬化蛋白(sclerostin)、三聚體 G 蛋白、CKl、GSK3、Norrin, WTX、PORCl、RSP04、VANGLl 和靶蛋白例如 Cnyc。(參見 MacDonald BT 等，Dev Cell. 2009 Jul ； 17 (I) :9-26 ;Cadigan KM CurrBiol. 2008 Oct 28; 18 (20) :R943_7)。“天然序列多肽”包括具有與天然來源多肽相同的氨基酸序列的多肽。這類天然序列多肽可從自然界分離出來或可通過重組或合成方法產(chǎn)生。該術(shù)語特別包括多肽的天然存在的截短或分泌形式、多肽變體包括天然存在的變體形式(例如可變剪接形式或剪接變體)和天然存在的等位基因變體。術(shù)語“多肽變體”意指與天然序列多肽具有以下氨基酸序列同一性的多肽至少約 10%、20%、30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97 %、98 %或99 %、特別是至少約70-80 %、更特別是至少約85 %、還更特別是至少約90 %、最特別至少約95%、97%或99%氨基酸序列同一性。特定的多肽變體與檢索號NP_002345和 SEQ ID NO :1 或 Swiss-Prot 檢索號P35222. UGenbank ΝΡ_001091679 和 SEQ ID NO. 7確定的序列具有以下氨基酸序列同一性至少70-80%、85%、90%、95%、97%或99%。這類變體包括例如其中將一個或多個氨基酸殘基加入多肽全長或成熟序列的N端或C端或者從多肽全長或成熟序列的N端或C端缺失一個或多個氨基酸殘基的多肽，包括來自其它物種的變體，但不包括天然序列多肽。在本發(fā)明的多方面，變體保持相應(yīng)的天然序列多肽的免疫原性活性。2個氨基酸序列或2個核酸序列的序列同一性定義為在比對序列和必要時(shí)引入空位以達(dá)到最大百分比序列同一性后，且不考慮任何保守取代作為序列同一性的組成部分，與多肽的氨基酸殘基或核酸序列相同的候選序列的氨基酸殘基或核苷酸的百分比?？梢愿鞣N常規(guī)方式實(shí)現(xiàn)目的是測定百分比氨基酸或核酸序列同一性的比對，例如應(yīng)用可公開獲取的計(jì)算機(jī)軟件，包括 GCG 程序包(Devereux J.等，Nucleic Acids Research 12(1) :387,1984) ；BLASTP, BLASTN 和 FASTA (Atschul, S. F.等，J. Molec. Biol. 215 :403-410,1990)。BLAST X 程序可公開獲自 NCBI 和其它來源(BLAST Manual，Altschul，S.等，NCBI NLM NIHBethesda, Md. 20894 ；Altschul, S.等，J. Mol. Biol. 215 :403-410,1990)。技術(shù)人員可確定用于測定比對的合適參數(shù)，包括在待比較序列全長內(nèi)達(dá)到最大比對所需要的任何算法?？晒_獲取的計(jì)算機(jī)程序?qū)y定同一性和相似性的方法進(jìn)行了編程。
多肽變體包括包含這樣的氨基酸序列的多肽，該氨基酸序列與包含比全長多肽少的氨基酸的天然多肽的氨基酸序列充分相同或來源于包含比全長多肽少的氨基酸的天然多肽的氨基酸序列。多肽的部分或片段可以是長為例如3-5、8-10、10、15、15-20、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個或更多個氨基酸的多肽。其中缺失多肽的區(qū)域的部分或片段可通過重組技術(shù)制備，并可針對一種或多種功能活性進(jìn)行評價(jià)，例如形成對多肽有特異性的抗體的能力。多肽的部分或片段可包含多肽的結(jié)構(gòu)域，特別是胞外域或胞內(nèi)域。還可通過將取代、添加或缺失引入編碼天然多肽序列的核酸，使得將一個或多個氨基酸取代、添加或缺失引入編碼的蛋白質(zhì)中，來產(chǎn)生等位基因變體。突變可通過標(biāo)準(zhǔn)方法引入，例如位點(diǎn)定向誘變和PCR介導(dǎo)的誘變。在一個實(shí)施方案中，保守取代在一個或多個預(yù)測的非必需氨基酸殘基上進(jìn)行?！氨Ｊ匕被崛〈笔瞧渲邪被釟埢痪哂蓄愃苽?cè)鏈的氨基酸殘基置換的取代，若干種具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基是本領(lǐng)域已知的。天然存在的等位基因變體可含有來自天然多肽序列的保守氨基酸取代，或者可含有來自多肽類似物(例如鼠多肽)相應(yīng)位置上的氨基酸的取代。
本文公開的多肽包括嵌合蛋白或融合蛋白?！扒逗系鞍住被颉叭诤系鞍住卑c異源多肽(即不同的多肽)有效連接的多肽的全部或部分(優(yōu)選有生物活性的部分)。在融合蛋白內(nèi)，術(shù)語“有效連接”欲指多肽和異源多肽彼此符合讀框地融合。異源多肽可與多肽的N端或C端融合。一種有用的融合蛋白是GST融合蛋白，其中多肽與GST序列的C端融合。融合蛋白的另一個實(shí)例是免疫球蛋白融合蛋白，其中多肽的全部或部分與來源于免疫球蛋白蛋白質(zhì)家族成員的序列融合。嵌合蛋白和融合蛋白可通過標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。用于本文公開的方法的多肽可分離自多種來源，例如來自人組織類型或來自其它來源，或通過重組或合成方法或者通過這些技術(shù)和類似技術(shù)的任何組合制備?！岸嗪塑账帷笔侵溉魏伍L度的核苷酸的多聚體形式，為核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。該術(shù)語包括雙鏈和單鏈DNA和RNA，例如多核苷酸的甲基化或帽化等修飾形式和未修飾形式。術(shù)語“多核苷酸”和“寡核苷酸”在本文可互換使用。多核苷酸可但非必需包括其它編碼或非編碼序列，或者它可以(但不一定)與其它分子和/或載體或支持材料連接。用于本發(fā)明方法的多核苷酸可具有適于具體方法的任何長度。在某些應(yīng)用中，術(shù)語是指反義核酸分子(例如處于有義多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物的相反方向的mRNA或DNA鏈)。多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物包括編碼多肽甲狀腺癌標(biāo)志物的多核苷酸，多肽甲狀腺癌標(biāo)志物包括天然序列多肽、包括多肽甲狀腺癌標(biāo)志物一部分的多肽變體、同種型、前體和嵌合多肽。編碼可用于本發(fā)明的EpCAM多肽的多核苷酸包括而不限于包含檢索號 UniProtKB/TrEMBL Q6FG26、UniProtKB/Swiss-Prot 16422、Genbank NM_002354 和BC014785或SEQ ID NO. 2的序列或其片段的核酸。編碼可應(yīng)用于本發(fā)明的β -聯(lián)蛋白多肽的多核苷酸包括而不限于包含GenBank檢索號ΝΜ_001904. 3、ΝΜ_001098209、或ΝΜ_001098210、或 SEQ ID NO. 8、9 或 10 的序列的核酸。用于本發(fā)明方法的多核苷酸包括互補(bǔ)核酸序列和與這些序列基本相同的核酸(例如至少約 10%、20%、30%、40%或45%、優(yōu)選50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或 99%序列同一性)。多核苷酸還包括因遺傳密碼簡并而不同于核酸序列的序列。舉例來說，本文公開的甲狀腺癌標(biāo)志物的核苷酸序列內(nèi)的DNA序列多態(tài)性可導(dǎo)致不影響氨基酸序列的沉默突變。一個或多個核苷酸的變異可由于天然等位基因變異而存在于群體內(nèi)的個體中。還可存在導(dǎo)致多肽的氨基酸序列改變的DNA序列多態(tài)性。可用于本文公開的方法的多核苷酸還包括在嚴(yán)格條件下、優(yōu)選高嚴(yán)格性條件下與多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物核酸序列雜交的核酸。促進(jìn)DNA雜交的適當(dāng)嚴(yán)格性條件為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，或可參見 Ausubel 等(主編)Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons’N.Y. (1989),6. 3. 1-6. 3. 6?？偟膩碇v，可選擇比在規(guī)定離子強(qiáng)度和pH下特定序列的熱解鏈溫度(Tm)低約5°C的嚴(yán)格條件。Tm是在其下平衡時(shí)50%與靶序列互補(bǔ)的探針與靶序列雜交的溫度(在規(guī)定的離子強(qiáng)度、PH和核酸濃度下)?？偟膩碇v，嚴(yán)格條件可為這樣的條件,其中鹽濃度小于約I. OM鈉離子或其它鹽(例如約O. 01-1. OM鈉離子)，對于短的探針、引物或寡核苷酸(例如10-50個核苷酸)溫度至少約為30°C，而對于較長的探針、引物和寡核苷酸溫度至少為60°C。例如，雜交可在6. Ox氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)下于約45°C進(jìn)行，接著2. Ox SSC于50°C洗滌，或在含有6xSCC、0. 5% SDS和50%甲酰胺的溶 液中于42°C洗滌，接著在0. Ix SCC和0.5% SDS的溶液中于68°C洗滌。多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物還包括截短核酸或核酸片段和通過可變剪接對應(yīng)于DNA的mRNA而產(chǎn)生的本文公開或引用的核酸的變體形式。多核苷酸片段包括包含對應(yīng)于(即等同于或互補(bǔ)于)規(guī)定核苷酸序列區(qū)的連續(xù)序列的多核苷酸序列，所述連續(xù)序列具有大約至少約6個核苷酸、特別是至少約8個核苷酸、更特別是至少約10-12個核苷酸、甚至更特別是15-20核苷酸。與對照或標(biāo)準(zhǔn)(例如正常水平、不同病期的水平或患者其它樣品的水平)相比，患者樣品中標(biāo)志物“顯著不同的”水平或標(biāo)志物水平的“顯著差異”可表示高于或低于檢測試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)誤差的水平，優(yōu)選水平分別為對照或標(biāo)準(zhǔn)的至少約1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍或者為對照或標(biāo)準(zhǔn)的至多約 1/1. 5、1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9 或 1/10?！拔㈥嚵小焙汀瓣嚵小笔侵缚捎脕頇z測與甲狀腺癌有關(guān)的生物分子(例如測定基因表達(dá))的核酸或核苷酸陣列或蛋白質(zhì)或肽陣列。多種陣列是市售可獲得的，例如由Affymetrix, Inc.制造的原位合成的寡核苷酸陣列GeneChip 或由Incyte Genomics Inc.制造的有斑點(diǎn)的cDNA陣列LifeArray 。微陣列的制造、使用和分析為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。(參見例如 Brennan，T. Μ.等(1995)，美國專利號 5，474，796 ;Schena 等(1996)Proc.Natl. Acad. Sci. 93 :10614-10619 ；Baldeschweiler 等(1995)，PCT 申請 W095/251116 ；Shalon, D.等(1995)PCT 申請 W095/35505 ;Heller，R. A.等(1997)Proc. Natl. Acad.Sci. 94 :2150-2155 ；以及 Heller, M. J.等(1997)，美國專利號 5，605，662)。“結(jié)合劑”是指例如與多肽甲狀腺癌標(biāo)志物特異性結(jié)合的多肽、抗體、核糖體或適體等物質(zhì)。如果物質(zhì)以可檢測的水平與多肽甲狀腺癌標(biāo)志物起反應(yīng)，而不與含有無關(guān)序列或不同多肽的序列的肽可檢測地起反應(yīng)，則它與多肽甲狀腺癌標(biāo)志物“特異性結(jié)合”?？刹捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員可容易進(jìn)行的ELISA來評價(jià)結(jié)合性質(zhì)。結(jié)合劑可以是含或不含肽組分的核糖體、RNA或DNA分子或多肽。結(jié)合劑可以是包含多肽甲狀腺癌標(biāo)志物序列、其肽變體或這類序列的非肽模擬物的多肽。舉例來說，多肽甲狀腺癌標(biāo)志物序列可以是能夠調(diào)節(jié)由多肽介導(dǎo)的功能的多肽的肽部分。適體包括與核酸和蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA或RNA分子。與甲狀腺癌標(biāo)志物結(jié)合的適體可在無需過多實(shí)驗(yàn)的情況下利用常規(guī)技術(shù)產(chǎn)生。[例如參見下列描述適體體外選擇的出版物Klug 等，Mol. Biol. Reports 20 :97-107 (1994) ；ffallis 等，Chem. Biol. 2
543-552(1995) ；Ellington, Curr. Biol. 4 :427-429 (1994) ；Lato 等，Chem. Biol. 2 :291-303 (1995) ；Conrad 等，Mol. Div. I :69-78 (1995)；以及 Uphoff 等，Curr. Opin. Struct.Biol. 6 :281-287(1996)]o用于本發(fā)明的抗體包括但不限于合成抗體、單克隆抗體、多克隆抗體、重組抗體、抗體片段(例如 Fab、Fab'、F(ab' )2)、dAb (結(jié)構(gòu)域抗體；參見 Ward 等，1989,Nature, 341
544-546)、抗體重鏈、胞內(nèi)抗體、人源化抗體、人抗體、抗體輕鏈、單鏈Fvs(ScFv)(例如包括單特異性、雙特異性等)、抗獨(dú)特型(ant-Id)抗體、包含抗體部分的蛋白質(zhì)、嵌合抗體(例如含有鼠抗體的結(jié)合特異性但其中其余部分是人來源的抗體)、衍生物例如酶綴合物或標(biāo)記的衍生物、雙鏈抗體、線性抗體、二硫鍵連接的Fvs (sdFv)、多特異性抗體(例如雙特異性抗 體)、上述任一種的表位結(jié)合片段和包含所需特異性的抗原識別部位的免疫球蛋白分子的任何其它修飾構(gòu)型。抗體包括任何類型(例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM和IgY)、任何類別(例如 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2)或任何亞類(例如 IgG2a 和 IgG2b)的抗體，抗體不必是任何特定的類型、類別或亞類。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，抗體是IgG抗體或其類別或亞類?？贵w可來自任何動物來源，包括鳥類和哺乳動物(例如人、鼠、驢、綿羊、兔、山羊、豚鼠、駱駝、馬或雞)?！爸亟M抗體”包括通過重組方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體，例如使用轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞的重組表達(dá)載體表達(dá)的抗體、自重組的組合抗體文庫分離的抗體、自人免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)基因和/或轉(zhuǎn)染色體的動物(例如小鼠或牛)分離的抗體；或者通過涉及將免疫球蛋白基因序列剪切為其它DNA序列的任何其它方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體。“單克隆抗體”是指自一群同源或大致同源的抗體中得到的抗體。各個單克隆抗體一般識別抗原的單一表位。在本發(fā)明多方面，單克隆抗體是由單一雜交瘤或其它細(xì)胞產(chǎn)生的抗體，只與甲狀腺癌標(biāo)志物特異性結(jié)合，正如例如通過ELISA或本領(lǐng)域已知的其它抗原結(jié)合測定法或競爭結(jié)合測定法所測定的一樣。該術(shù)語不限于用于制備抗體的具體方法，例如它們可通過雜交瘤方法產(chǎn)生，或可采用本領(lǐng)域已知方法自噬菌體文庫分離。包括單克隆和多克隆抗體、片段和嵌合體的抗體可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法制備?？衫梅蛛x的天然多肽甲狀腺癌標(biāo)志物或重組多肽甲狀腺癌標(biāo)志物制備抗體。對于單克隆抗體的制備參見例如Kohler等(1975)Nature 256 :495-497 ;Kozbor等(1985)J. Immunol Methods 81 :31-42 ;Cote 等(1983)Proc Natl Acad Sci 80 :2026-2030和Cole等(1984)Mol Cell Biol 62 :109-120 ;對于單克隆Fab片段的制備參見Huse等(1989) Science 246 :1275-1281 ;而對于鑒定抗體的噬菌?；駼淋巴細(xì)胞免疫球蛋白文庫的制備參見 Pound (1998) Immunochemical Protocols, Humana Press, Totowa, N. J0 對多妝甲狀腺癌標(biāo)志物有特異性的抗體還可獲自學(xué)術(shù)或商業(yè)來源。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，如果它們結(jié)合的Ka大于或等于IO-7M,則抗體具有針對多肽甲狀腺癌標(biāo)志物的反應(yīng)性。對EpCAM多肽有特異性的抗體的實(shí)例見表I。標(biāo)志物的“狀態(tài)”是指標(biāo)志物的存在、缺乏或程度/水平或標(biāo)志物的一些物理、化學(xué)或遺傳特征。這類特征包括而不限于表達(dá)水平、活性水平、結(jié)構(gòu)(序列信息)、拷貝數(shù)、翻譯后修飾等?？芍苯踊蜷g接測定標(biāo)志物的狀態(tài)。在一些實(shí)施方案中，通過測定樣品中標(biāo)志物的水平來確定狀態(tài)。樣品中組分的“水平”具有其在本領(lǐng)域的常規(guī)含義，包括定量測定(例如mg/mL、倍數(shù)變化等)和定性測定(例如測定標(biāo)志物是否存在或確定標(biāo)志物的水平相對于標(biāo)準(zhǔn)是聞、是低還是相等)。術(shù)語“異常狀態(tài)”意指樣品中標(biāo)志物的狀態(tài)不同于標(biāo)志物的參比狀態(tài)。參比狀態(tài)可以是來自正常受試者的樣品、患病受試者的平均樣品或來自相同受試者的在不同時(shí)間取得的一種或多種樣品中的標(biāo)志物狀態(tài)。異常狀態(tài)包括一種或多種標(biāo)志物增加、降低、存在或缺乏。測定樣品中標(biāo)志物的水平可包括測定樣品中標(biāo)志物的水平，異常狀態(tài)可以是與標(biāo)準(zhǔn)相比的較低水平(包括未檢出水平)或較高水平(包括超過零的任何量)。如果受試者樣品中標(biāo)志物的狀態(tài)與病況有關(guān)(例如標(biāo)志物的水平接近標(biāo)準(zhǔn)或參比或者以超過某種閾值的水平存在，其中超過該值與病況有關(guān))，則受試者可患本文所公開的病況的可能性加大?；急疚乃_的病況的可能性加大的受試者包括具有標(biāo)志物異常狀態(tài)的受試者，因此比起受試者不具有該狀態(tài)的情形，受試者具有該病況的可能性較高?！案郀顟B(tài)”意指標(biāo)志物的一個或多個特征高于標(biāo)準(zhǔn)。在本發(fā)明的多方面，該術(shù)語是指與標(biāo)準(zhǔn)相比某特征增加?！暗蜖顟B(tài)”意指標(biāo)志物的一個或多個特征低于標(biāo)準(zhǔn)。在本發(fā)明的多方面，該術(shù)語是指與標(biāo)準(zhǔn)相比某特征降低。“負(fù)狀態(tài)”意指標(biāo)志物的一個或多個特征不存在或未檢出。通用方法多種方法可應(yīng)用于包括甲狀腺癌標(biāo)志物的甲狀腺癌的診斷和預(yù)后評價(jià)和易患這類病癥的受試者的鑒定。這類方法可利用例如多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物和其片段以及針對包括肽片段在內(nèi)的多肽甲狀腺癌標(biāo)志物的結(jié)合劑(例如抗體)。具體地講，多核苷酸和抗體可用于例如(I)檢測多核苷酸突變的存在情況，或檢測相對于非病癥狀態(tài)mRNA的過表達(dá)或表達(dá)不足，或者定性或定量檢測與某些病況或這類病況的易感性有關(guān)的多核苷酸轉(zhuǎn)錄物的可變剪接形式；和(2)檢測相對于非病癥狀態(tài)多肽的過量豐度或豐度不足或者與病癥狀態(tài)或病癥狀態(tài)的進(jìn)展有關(guān)的修飾(例如小于全長)多肽的存在情況。本文所述方法可用于評價(jià)例如從宿主新鮮取出的細(xì)胞群中存在惡性細(xì)胞的概率。這類方法可用來檢測腫瘤、量化和監(jiān)測其生長，并有助于疾病的診斷和預(yù)后。例如，核Ep-ICD、核β_聯(lián)蛋白或胞質(zhì)β_聯(lián)蛋白的較高水平表明侵襲性甲狀腺癌或轉(zhuǎn)移性甲狀腺 癌，特別是ATC。一方面，本發(fā)明考慮用于測定甲狀腺癌、更特別是ATC的侵襲性或病期的方法，所述方法包括得到患者細(xì)胞中的多肽甲狀腺癌標(biāo)志物和與甲狀腺癌有關(guān)的其它標(biāo)志物的水平概況，并將該概況與參比進(jìn)行比較以鑒定表明疾病的侵襲性或病期的試驗(yàn)細(xì)胞的概況。本發(fā)明的方法需要將在待測受試者樣品中定量測定的甲狀腺癌標(biāo)志物的量與預(yù)先確定的標(biāo)準(zhǔn)或截?cái)嘀颠M(jìn)行比較。標(biāo)準(zhǔn)可相當(dāng)于對受試者的另一個樣品或較早期的樣品進(jìn)行定量測定的水平，或?qū)φ諛悠?、特別是患較低級別癌癥的受試者的樣品進(jìn)行定量測定的水平。可通過前瞻性和/或追溯性統(tǒng)計(jì)研究確立健康受試者或癌癥受試者的對照樣品的水平?？蛇x擇沒有臨床明顯疾病或異常情況的健康受試者用于統(tǒng)計(jì)研究?？筛鶕?jù)與對照樣品或?qū)ο嗤茉囌叨繙y定的過往水平相比，甲狀腺癌標(biāo)志物統(tǒng)計(jì)學(xué)上不同水平的研究結(jié)果作出診斷。本發(fā)明還考慮使用甲狀腺癌的多種標(biāo)志物的本文所述方法。因此，本發(fā)明考慮用于分析生物樣品的甲狀腺癌標(biāo)志物和作為甲狀腺癌的特異性指示物的其它標(biāo)志物的存在情況的方法?？赏ㄟ^包括檢測其它標(biāo)志物或編碼該標(biāo)志物的多核苷酸的試劑而對本文所述方法作修改。其它標(biāo)志物的實(shí)例包括而不限于半乳凝素-3、甲狀腺球蛋白、E-鈣黏著蛋白、β _聯(lián)蛋白、FHL2和Lef-I、c-Myc和β _肌動蛋白，特別是半乳凝素_3。核酸方法正如本文所注意到的，可根據(jù)樣品中多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物的水平檢測甲狀腺癌、特別是侵襲性甲狀腺癌或具有轉(zhuǎn)移潛力的甲狀腺癌、更特別是ATC。檢測核酸分子的技術(shù)例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和雜交試驗(yàn)是本領(lǐng)域眾所周知的。探針可用于檢測多核苷酸的雜交技術(shù)。該技術(shù)一般包括將自患者樣品或其它細(xì)胞來源獲得的核酸與探針在有利于探針與核酸中的互補(bǔ)序列特異性退火的條件下(例如在本文論述的嚴(yán)格條件下)接觸和溫育。溫育后，除去未退火的核酸，檢測已與探針雜交的核酸(如有的話)的存在情況。用于檢測樣品的多核苷酸序列的核苷酸探針可用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法構(gòu)建。探針可包含相當(dāng)于生物基因組一部分的DNA或DNA模擬物或者互補(bǔ)RNA或RNA模擬物?？稍趬A基部分、在糖部分或在磷酸骨架上對核酸進(jìn)行修飾。DNA可采用標(biāo)準(zhǔn)方法獲得，例如基因組DNA或克隆序列的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增。本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)程序可用來設(shè)計(jì)具有所需特異性和最適擴(kuò)增性質(zhì)的引物。核苷酸探針可用可檢測物質(zhì)例如提供適當(dāng)信號并具有足夠半壽期的放射性標(biāo)記(例如32P、3H、14C等)標(biāo)記?？墒褂玫钠渌蓹z測物質(zhì)包括被特異性標(biāo)記的抗體識別的抗原、熒光化合物、酶、對標(biāo)記抗原有特異性的抗體和發(fā)光化合物?？煽紤]探針與待檢測核酸的雜交率和結(jié)合率以及可用于雜交的核酸的量，選擇合適標(biāo)記。標(biāo)記的探針可在固相支持體與核酸雜交，固相支持體為例如一般描述于以下文獻(xiàn)的硝化纖維素濾器或尼龍膜=SambiOOk等，1989,Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第 2 版)?？墒褂煤怂崽结槂?yōu)選在人細(xì)胞中檢測多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物。核苷酸探針還可用于診斷涉及多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物的甲狀腺癌，監(jiān)測甲狀腺癌進(jìn)展或監(jiān)測治療性治療。樣品中多核苷酸的檢測可包括采用擴(kuò)增方法(例如PCR)擴(kuò)增特定基因序列，接著采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)對擴(kuò)增分子進(jìn)行分析。舉例來說，寡核苷酸引物可用于基于PCR的試驗(yàn)以擴(kuò)增多核苷酸的一部分和擴(kuò)增來源于樣品的多核苷酸的一部分，其中寡核苷酸引物對多核苷酸有特異性(即與之雜交)。然后采用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)(例如凝膠電泳)分離并檢測擴(kuò)增的cDNA。為了使雜交在試驗(yàn)條件下最大化，用于本發(fā)明方法的弓I物和探針一般與多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物的一部分有至少約60%、優(yōu)選至少約75%和更優(yōu)選至少約90%同一性；也就是說，它們長為至少10個核苷酸、優(yōu)選至少20個核苷酸。在一個實(shí)施方案中，引物和探針的長度為至少約10-40個核苷酸。引物的實(shí)例為SEQ ID NO. 3_6。雜交和擴(kuò)增反應(yīng)也可在本文論述的嚴(yán)格條件下進(jìn)行。本文所述雜交和擴(kuò)增技術(shù)可用于定性和定量測定多核苷酸表達(dá)的方面。例如，RNA可從已知表達(dá)多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物的細(xì)胞類型或組織中分離，并利用雜交(例如標(biāo)準(zhǔn)RNA印跡分析)或PCR技術(shù)測定。引物和探針可原位使用，即直接在獲自活組織檢查或切除術(shù)的患者組織的組織切片(固定和/或冷凍的)上使用。
在本發(fā)明的一個方面，提供利用反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)的方法，其中PCR與反轉(zhuǎn)錄組合應(yīng)用。總的來講，RNA采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從樣品組織中提取，并反轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生cDNA。將cDNA用作聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的模板。使cDNA與特異性針對多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物設(shè)計(jì)的引物組雜交。一旦引物和模板退火，則使用DNA聚合酶從引物延伸，以合成模板的拷貝。使DNA鏈變性，重復(fù)該過程多次直到形成足夠的DNA以供通過溴化乙錠染色和瓊脂糖凝膠電泳顯現(xiàn)?？蓪Λ@自疑似患甲狀腺癌的受試者、未患甲狀腺癌或患早期疾病或患有侵襲性或轉(zhuǎn)移性疾病、特別是ATC的個體的樣品進(jìn)行擴(kuò)增?？稍谌舾煽缭街辽?個數(shù)量級的cDNA稀釋液中進(jìn)行反應(yīng)。與非癌樣品或早期癌癥樣品的相同稀釋液相比，受試者樣品若干稀釋液在表達(dá)方面的統(tǒng)計(jì)顯著性差異可視為癌癥存在情況的陽性。來源于多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物的寡核苷酸或較長片段可在微陣列中用作靶標(biāo)。微陣列可用來監(jiān)測多核苷酸的表達(dá)水平并鑒定遺傳變體、突變和多態(tài)性。來自微陣列的信息可用來確定基因功能，理解病癥的遺傳基礎(chǔ)，診斷病癥，并開發(fā)和監(jiān)測治療藥物的活性。因此，本發(fā)明還包括包含多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物和任選其它甲狀腺癌標(biāo)志物的陣列。陣 列可用來測定陣列中多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物的表達(dá)。本發(fā)明可供定量測定多核苷酸的表達(dá)。本發(fā)明提供包含多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物的微陣列。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于區(qū)分與甲狀腺癌、特別是侵襲性甲狀腺癌或具有轉(zhuǎn)移潛力的甲狀腺癌、特別是ATC有關(guān)的樣品的微陣列，所述微陣列包含與支持體結(jié)合的多核苷酸探針的位置上可尋址的陣列，所述多核苷酸探針包含與多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物互補(bǔ)和雜交的序列。在一個實(shí)施方案中，陣列可用來監(jiān)測陣列中多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物表達(dá)的時(shí)程。這可發(fā)生在各種生物環(huán)境(例如腫瘤進(jìn)展)中。陣列還可用于確定正常和異常細(xì)胞中多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物和任選其它甲狀腺癌標(biāo)志物的差異表達(dá)模式。這可提供可用作診斷或治療介入的分子靶標(biāo)的一系列核酸。蛋白質(zhì)方法結(jié)合劑可用于多種診斷和試驗(yàn)應(yīng)用。有許多技術(shù)人員已知的使用結(jié)合劑檢測樣品中的祀分子的測定方式。(例如參見Harlow和Lane, Antibodies :A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1988)。一般而言,可通過以下步驟測定受試者中侵襲性甲狀腺癌或具有轉(zhuǎn)移潛力的甲狀腺癌、特別是ATC存在與否(a)使受試者的樣品與結(jié)合劑接觸；(b)檢測樣品中與結(jié)合劑結(jié)合的多肽的水平；和(C)將多肽的水平與預(yù)先確定的標(biāo)準(zhǔn)或截?cái)嘀颠M(jìn)行比較。在本發(fā)明的具體方面，結(jié)合劑是抗體。一方面，本發(fā)明提供通過定量測定受試者生物樣品中的多肽甲狀腺癌標(biāo)志物來監(jiān)測或診斷受試者的甲狀腺癌的診斷方法，所述方法包括使樣品與用可檢測物質(zhì)直接或間接標(biāo)記的對多肽甲狀腺癌標(biāo)志物有特異性的抗體反應(yīng)，并檢測所述可檢測物質(zhì)。在本發(fā)明的一個方面，提供用于檢測或診斷甲狀腺癌的侵襲性或轉(zhuǎn)移潛力、特別是ATC的方法，所述方法包括或基本由以下步驟組成(a)獲取疑似含有多肽甲狀腺癌標(biāo)志物的樣品；(b)使所述樣品在有效結(jié)合抗體并形成復(fù)合物的條件下與特異性結(jié)合多肽甲狀腺癌標(biāo)志物的抗體接觸；
(c)通過定量測定復(fù)合物的量來測量樣品中存在的多肽甲狀腺癌標(biāo)志物的量；和(d)將樣品中存在的多肽甲狀腺癌標(biāo)志物的量與對照中的多肽甲狀腺癌標(biāo)志物的量進(jìn)行比較，其中與對照的量相比，樣品中多肽甲狀腺癌標(biāo)志物的量的變化或顯著差異表明侵襲性甲狀腺癌或具有轉(zhuǎn)移潛力的甲狀腺癌、特別是ATC。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明考慮用于監(jiān)測個體的甲狀腺癌進(jìn)展的方法，所述方法包括(a)使與多肽甲狀腺癌標(biāo)志物結(jié)合的抗體與個體的樣品接觸，使得在樣品中形成包含抗體和多肽甲狀腺癌標(biāo)志物的復(fù)合物；(b)測定或檢測樣品中復(fù)合物形成的存在情況或量；(c)在稍后的時(shí)間點(diǎn)上重復(fù)步驟(a)和(b);和
(d)將步驟(b)的結(jié)果與步驟(C)的結(jié)果進(jìn)行比較，其中復(fù)合物形成的量的差異表明所述個體中癌癥的疾病、病期、進(jìn)展、侵襲性和/或轉(zhuǎn)移潛力。還可將復(fù)合物的量與得自未處于甲狀腺癌風(fēng)險(xiǎn)中或患有不同期甲狀腺癌的個體或得自相同個體不同時(shí)間點(diǎn)的復(fù)合物的量的代表值進(jìn)行比較。與多肽甲狀腺癌標(biāo)志物特異性反應(yīng)的抗體或衍生物(例如酶綴合物或標(biāo)記的衍生物)可用來檢測不同樣品(例如生物材料、特別是組織樣品)中的多肽甲狀腺癌標(biāo)志物。它們可用作診斷或預(yù)后試劑，而且它們可用來檢測多肽甲狀腺癌標(biāo)志物水平的異常情況或多肽甲狀腺癌標(biāo)志物的結(jié)構(gòu)和/或時(shí)間、組織、細(xì)胞或亞細(xì)胞位置的異常情況?？贵w還可用來體外篩選潛在的治療化合物，以測定其對涉及多肽甲狀腺癌標(biāo)志物的甲狀腺癌的作用。體外免疫測定法還可用來評價(jià)或監(jiān)測具體療法的功效?？贵w可用于依賴于多肽甲狀腺癌標(biāo)志物的抗原決定簇與抗體之間的結(jié)合相互作用的任何免疫測定法。用于體外檢測樣品中的抗原的免疫測定法也是本領(lǐng)域眾所周知的。[對于免疫測定法的一般描述參見例如Paterson等，Int. J. Can. 37 =659(1986)和Burchell等，Int. J. Can. 34 :763(1984)]。可以直接或間接的方式，通過競爭或非競爭免疫測定法實(shí)現(xiàn)樣品中的多肽甲狀腺癌標(biāo)志物的定性和/或定量測定。使用抗體檢測多肽甲狀腺癌標(biāo)志物可包括例如以正向、逆向或同時(shí)方式運(yùn)行的免疫測定。免疫測定法的實(shí)例為放射免疫測定法(RIA)、酶免疫測定法(例如ELISA)、免疫熒光法、免疫沉淀、膠乳凝集、血細(xì)胞凝集、組織化學(xué)試驗(yàn)和夾心(免疫)測定法?；蛘?，可直接使用例如表面等離振子共振(SPR)方法例如Biacore 、微量熱法或納米懸臂(nano_cantilivers),來檢測抗體與多肽甲狀腺癌標(biāo)志物的結(jié)合。本領(lǐng)域技術(shù)人員十分了解這些術(shù)語，他們將清楚或可容易地認(rèn)出其它免疫測定方式而無需過多實(shí)驗(yàn)。對多肽甲狀腺癌標(biāo)志物有特異性的抗體可用可檢測物質(zhì)標(biāo)記，并可根據(jù)可檢測物質(zhì)的存在情況定位于生物樣品?？蓹z測物質(zhì)的實(shí)例包括但不限于以下物質(zhì)放射性同位素(例如3!1、14(、353、1251、1311)、熒光標(biāo)記(例如FITC、羅丹明、鑭系元素磷光體)、發(fā)光標(biāo)記例如魯米諾；以及酶標(biāo)記(例如辣根過氧化物酶、半乳糖苷酶、螢光素酶、堿性磷酸酶、乙酰膽堿酯酶)、生物素基團(tuán)(其可通過標(biāo)記的抗生物素蛋白例如含有熒光標(biāo)記的鏈霉抗生物素或者可通過光學(xué)或量熱方法檢測的酶活性檢測)以及預(yù)先確定的被第二報(bào)道分子識別的多肽表位(例如亮氨酸拉鏈對序列、第二抗體的結(jié)合部位、金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域、表位標(biāo)簽)。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記通過不同長度的間隔臂連接以減小可能的位阻?？贵w還可與容易通過電子顯微鏡術(shù)觀察到電子致密物質(zhì)例如鐵蛋白或膠態(tài)金偶聯(lián)?？贵w可被可檢測標(biāo)記的一種方式是將其與酶直接連接。當(dāng)酶稍后暴露于其底物時(shí)，可產(chǎn)生可被檢出的產(chǎn)物。作為酶的可檢測物質(zhì)的實(shí)例為辣根過氧化物酶、β -半乳糖苷酶、螢光素酶、堿性磷酸酶、乙酰膽堿酯酶、蘋果酸脫氫酶、核糖核酸酶、脲酶、過氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸、葡萄球菌核酸酶、δ-5-類固醇異構(gòu)酶(steriod isomerase)、酵母醇脫氫酶、α -甘油磷酸、丙糖磷酸異構(gòu)酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶和乙酰膽堿酯酶。為了在免疫測定系統(tǒng)中提高靈敏度，可使用熒光發(fā)射金屬原子例如Eu(銪)和其它鑭系元素。可通過金屬螯合基團(tuán)(例如DTPA或EDTA)使這些與所需分子連接。生物發(fā)光化合物還可用作可檢測物質(zhì)。生物發(fā)光可檢測物質(zhì)的實(shí)例為螢光素、螢光素酶和水母發(fā)光蛋白。還可采用間接方法，其中最初的抗原-抗體反應(yīng)因引入第二抗體而放大，所述第 二抗體對針對多肽甲狀腺癌標(biāo)志物有反應(yīng)性的抗體具有特異性。舉例來說，如果對多肽甲狀腺癌標(biāo)志物具有特異性的抗體是兔IgG抗體，則第二抗體可以是用本文所述可檢測物質(zhì)標(biāo)記的山羊抗兔IgG Fe片段特異性抗體。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可容易地實(shí)現(xiàn)上述綴合或標(biāo)記抗體的方法。本領(lǐng)域已知的使用光學(xué)和電子顯微鏡術(shù)對抗原進(jìn)行定位的細(xì)胞化學(xué)技術(shù)可用來檢測多肽甲狀腺癌標(biāo)志物?？贵w一般可用可檢測物質(zhì)標(biāo)記，可根據(jù)可檢測物質(zhì)的存在情況，在組織和細(xì)胞中對多肽甲狀腺癌標(biāo)志物進(jìn)行定位。在本發(fā)明方法的情況下，可將樣品、結(jié)合劑(例如抗體)或多肽甲狀腺癌標(biāo)志物固定在載體或支持體例如瓊脂糖、纖維素、硝酸纖維、葡聚糖、交聯(lián)葡聚糖、瓊脂糖凝膠、脂質(zhì)體、羧甲基纖維素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、濾紙、離子交換樹脂、塑料膜、尼龍或絲織物上。支持體材料可具有任何可能的形狀，包括球狀、圓柱或扁平形狀。因此，載體可呈例如管、試驗(yàn)板、孔、珠粒、圓盤、球體等形狀。可通過采用已知的化學(xué)或物理方法(例如溴化氰偶聯(lián))，使材料與合適的不溶性載體反應(yīng)，來制備固定化材料?？刹捎脤Φ谝唤Y(jié)合劑有特異性的第二結(jié)合劑，使結(jié)合劑(例如抗體)間接固定化。例如，可使用包被在載體或支持體上的綿羊抗小鼠IgG Fe片段特異性抗體，將對多肽甲狀腺癌標(biāo)志物有特異性的小鼠抗體固定化。如果放射性標(biāo)記用作可檢測物質(zhì)，則可通過放射自顯影照相術(shù)對多肽甲狀腺癌標(biāo)志物進(jìn)行定位。可用各種光學(xué)方法通過測定放射自顯影照片中粒子的密度，或通過統(tǒng)計(jì)晶粒，對放射自顯影照相術(shù)的結(jié)果進(jìn)行量化。時(shí)間分辨熒光測定法可用來檢測熒光信號、標(biāo)記或可檢測物質(zhì)。例如，Christopoulos TK 和 Diamandis EP Anal. Chem.，1992 64 :342-346 中描述的方法可與常用的時(shí)間分辨熒光計(jì)一起使用。按照本發(fā)明的一個實(shí)施方案，用于檢測生物樣品中多肽甲狀腺癌標(biāo)志物的免疫測定法包括在允許形成包含結(jié)合劑和多肽甲狀腺癌標(biāo)志物的一種或多種復(fù)合物的條件下，使一定量的與多肽甲狀腺癌標(biāo)志物特異性結(jié)合的結(jié)合劑與樣品接觸，并測定一種或多種復(fù)合物的存在情況或量作為樣品中所包含的多肽甲狀腺癌標(biāo)志物的量的衡量。按照本發(fā)明的一個實(shí)施方案，提供一種方法，其中多肽甲狀腺癌標(biāo)志物抗體用酶直接或間接標(biāo)記，加入酶底物，其中選擇底物使得底物或酶與底物的反應(yīng)產(chǎn)物與鑭系元素金屬(優(yōu)選銪和鋱)形成熒光復(fù)合物。加入一種或多種鑭系元素金屬，通過測量熒光復(fù)合物的熒光，定量測定樣品的多肽甲狀腺癌標(biāo)志物。根據(jù)酶底物或酶與底物的反應(yīng)產(chǎn)物與鑭系兀素金屬復(fù)合的能力來選擇酶。提供這類熒光復(fù)合物的酶和酶底物的實(shí)例描述于Diamandis的美國專利號5，312，922。舉例來說，當(dāng)抗體用堿性磷酸酶直接或間接標(biāo)記時(shí)，用于本方法的底物可以是4-甲基傘形酮磷酸酯、5-氟水楊酸磷酸酯或二氟尼柳磷酸酯。通常使用時(shí)間分辨熒光計(jì)測量復(fù)合物的熒光強(qiáng)度。對多肽甲狀腺癌標(biāo)志物有特異性的抗體也可用酶間接標(biāo)記。例如，抗體可與配體結(jié)合對的一個配偶體綴合，而酶可與配體結(jié)合對的另一個配偶體偶聯(lián)。代表性實(shí)例包括抗生物素蛋白-生物素和核黃素-核黃素結(jié)合蛋白。在實(shí)施方案中，對多肽甲狀腺癌標(biāo)志物有特異性的抗體用酶標(biāo)記。本發(fā)明方法的多方面包括(a)使受試者的生物樣品與對多肽甲狀腺癌標(biāo)志物有 特異性的抗體反應(yīng)，其中抗體用酶直接或間接標(biāo)記；(b)加入酶底物，其中選擇底物使得底物或酶與底物的反應(yīng)產(chǎn)物形成熒光復(fù)合物；(C)通過測定熒光復(fù)合物的熒光，來定量測定樣品中的多肽甲狀腺癌標(biāo)志物；和(d)將定量測定的水平與從受試患者或?qū)φ帐茉囌叩钠渌鼧悠返玫降乃竭M(jìn)行比較。在一個實(shí)施方案中，多肽甲狀腺癌標(biāo)志物是Ep-ICD和β-聯(lián)蛋白，將定量測定的水平與對正常受試者、患早期疾病的受試者或同一受試者不同時(shí)間點(diǎn)的定量測定水平進(jìn)行比較，其中與對照受試者相比，標(biāo)志物水平的提高表明ATC和/或預(yù)后或生存率不佳。本發(fā)明的一個具體實(shí)施方案包括下列步驟(a)使生物樣品與用可檢測物質(zhì)直接或間接標(biāo)記的對多肽甲狀腺癌標(biāo)志物有特異性的第一抗體和被固定的對多肽甲狀腺癌標(biāo)志物有特異性的第二抗體一起溫育；(b)將第一抗體與第二抗體相分離，得到第一抗體相和第二抗體相；(C)檢測第一或第二抗體相中的可檢測物質(zhì)，從而定量測定生物樣品中的多肽甲狀腺癌標(biāo)志物；和(d)將定量測定的多肽甲狀腺癌標(biāo)志物與預(yù)先確定的標(biāo)準(zhǔn)的水平進(jìn)行比較。標(biāo)準(zhǔn)可相當(dāng)于對未患疾病或患早期疾病的對照受試者的樣品或得自受試者的其它樣品的樣品定量測定的水平。與標(biāo)準(zhǔn)相比，Ep-ICD和/或β_聯(lián)蛋白的水平升高可表明退行發(fā)育性甲狀腺癌。按照一個實(shí)施方案，本發(fā)明提供通過用免疫測定法測定多肽甲狀腺癌標(biāo)志物而用于測定樣品中的多肽甲狀腺癌標(biāo)志物的方法。對技術(shù)人員而言顯而易見的是，多種競爭或非競爭免疫測定方法可用來測定血清中的多肽甲狀腺癌標(biāo)志物。競爭方法通常采用固定化或可固定的抗多肽甲狀腺癌標(biāo)志物的抗體和多肽甲狀腺癌標(biāo)志物的標(biāo)記形式。樣品多肽甲狀腺癌標(biāo)志物和標(biāo)記的多肽甲狀腺癌標(biāo)志物競爭結(jié)合對多肽甲狀腺癌標(biāo)志物有特異性的抗體。在將所得的已與抗體結(jié)合的標(biāo)記多肽甲狀腺癌標(biāo)志物(結(jié)合的部分)與其余的未結(jié)合的標(biāo)記多肽甲狀腺癌標(biāo)志物(未結(jié)合的部分)分離后，測定結(jié)合或未結(jié)合的部分中的標(biāo)記的量，并可按任何常規(guī)方式例如通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線作比較將其與試驗(yàn)樣品中多肽甲狀腺癌標(biāo)志物的量相關(guān)聯(lián)。另一方面，非競爭方法被用于測定多肽甲狀腺癌標(biāo)志物，其最常見的方法為“夾心”方法。在該測定中，采用對多肽甲狀腺癌標(biāo)志物有特異性的兩種抗體。一種抗體被直接或間接標(biāo)記(“檢測抗體”)，另一個是固定化或可固定的(“俘獲抗體”)?？蓪⒎@抗體和檢測抗體與試驗(yàn)樣品同時(shí)或序貫接觸?？赏ㄟ^將俘獲抗體與樣品一起溫育，之后在預(yù)先確定的時(shí)間加入檢測抗體來完成序貫方法，或者可將檢測抗體先與樣品一起溫育，然后加入俘獲抗體。在進(jìn)行完成測定所必須的溫育后，可將俘獲抗體與液體試驗(yàn)混合物相分離，并且可在分離的俘獲抗體相的至少一部分中或液體試驗(yàn)混合物的其余部分中測定標(biāo)記。一般在俘獲抗體相中測定標(biāo)記，因?yàn)榉@抗體相包含在俘獲抗體和檢測抗體之間“夾心的”多肽甲狀腺癌標(biāo)志物。在另一個實(shí)施方案中，可在不分離俘獲抗體和液體試驗(yàn)混合物的情況下測定標(biāo)記。在本發(fā)明的具體夾心免疫測定法中，使用對多肽甲狀腺癌標(biāo)志物有特異性的小鼠多克隆/單克隆抗體和對多肽甲狀腺癌標(biāo)志物有特異性的兔多克隆/單克隆抗體。在一個典型的多肽甲狀腺癌標(biāo)志物的雙位點(diǎn)免疫測定法(two-siteimmunometric assay)中,俘獲抗體和檢測抗體之一或兩者是多克隆抗體,或者俘獲抗體和檢測抗體的之一或兩者是單克隆抗體(即多克隆/多克隆、單克隆/單克隆或單克隆/多 克隆)。用于檢測抗體的標(biāo)記可選自本領(lǐng)域常規(guī)已知的任何標(biāo)記。標(biāo)記可以是酶或化學(xué)發(fā)光部分，但它也可以是放射性同位素、熒光團(tuán)、可檢測的配體(例如可通過經(jīng)由配體的標(biāo)記結(jié)合配偶體的二次結(jié)合而檢測)等。一方面，抗體用酶標(biāo)記，酶通過加入經(jīng)選擇使得酶與底物的反應(yīng)產(chǎn)物形成熒光復(fù)合物的底物而檢出。可選擇俘獲抗體，使得它提供將其從試驗(yàn)混合物的其余部分中分離出來的方法。因此，俘獲抗體可以已固定化形式或不溶形式引入測定，或者可呈可固定形式，即能夠繼將俘獲抗體引入測定之后實(shí)現(xiàn)固定。固定化俘獲抗體可包含與固相共價(jià)或非共價(jià)連接的抗體，所述固定相為例如磁性粒子、乳膠粒子、微量滴定板孔、珠粒、比色皿或其它反應(yīng)容器?？晒潭ɑ@抗體的實(shí)例是這樣的抗體，其已用配體部分(例如半抗原、生物素等)化學(xué)修飾，并且隨后可通過與配體的結(jié)合配偶體(例如抗體、抗生物素蛋白等)的固定化形式接觸而固定化。在一個實(shí)施方案中，俘獲抗體可使用對與固相結(jié)合的俘獲抗體有物種特異性的抗體固定化。篩選方法本發(fā)明還考慮用于針對其在治療甲狀腺癌、特別是侵襲性甲狀腺癌、更特別是ATC中的潛在功效評價(jià)試驗(yàn)物質(zhì)或化合物的方法。試驗(yàn)物質(zhì)和化合物包括但不限于肽，例如可溶性肽包括具Ig尾的融合肽、隨機(jī)肽文庫和由D-和/或L-構(gòu)型氨基酸構(gòu)成的組合化學(xué)法衍生的分子文庫的成員、磷酸肽(包括隨機(jī)或部分簡并、定向磷酸肽文庫的成員)、抗體[例如多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體、抗獨(dú)特型抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、片段(例如Fab, F(ab)2和Fab表達(dá)文庫片段和其表位結(jié)合片段)]、多核苷酸(例如反義物、siRNA)及有機(jī)或無機(jī)小分子。所述物質(zhì)或化合物可以是內(nèi)源性生理化合物或者天然或合成化合物。本發(fā)明提供用于評價(jià)試驗(yàn)物質(zhì)在治療甲狀腺癌、特別是侵襲性甲狀腺癌、更特別是ATC中的潛在功效的方法，所述方法包括比較(a)獲自患者并暴露于試驗(yàn)物質(zhì)的第一樣品中的一種或多種甲狀腺癌標(biāo)志物和任選其它標(biāo)志物的水平；和(b)獲自患者的第二樣品中的一種或多種甲狀腺癌標(biāo)志物和任選其它標(biāo)志物的水平，其中所述樣品未暴露于試驗(yàn)物質(zhì)，其中第一樣品相對于第二樣品在一種或多種甲狀腺癌標(biāo)志物和任選其它標(biāo)志物的表達(dá)水平方面的顯著差異，表明試驗(yàn)物質(zhì)潛在對治療患者的甲狀腺癌有效。第一樣品和第二樣品可以是獲自患者的單一樣品的部分或獲自患者的合并樣品的部分。一方面，本發(fā)明提供選擇用于治療患者的甲狀腺癌、特別是侵襲性甲狀腺癌、更特別是ATC的物質(zhì)的方法，所述方法包括(a)從患者中獲得樣品；(b)分別在多種試驗(yàn)物質(zhì)存在下維持樣品的等分部分；(c)對各等分部分中的一種或多種甲狀腺癌標(biāo)志物和任選其它標(biāo)志物進(jìn)行比較；和
(d)選出一種試驗(yàn)物質(zhì)，其相對于其它試驗(yàn)物質(zhì)在含有該試驗(yàn)物質(zhì)的等分部分中改變一種或多種甲狀腺癌標(biāo)志物和任選其它標(biāo)志物的水平。一方面，本發(fā)明提供選擇用于抑制受試者的甲狀腺癌的物質(zhì)的方法，所述方法包括(a)從受試者中獲得包含癌細(xì)胞的樣品；(b)分別在多種試驗(yàn)物質(zhì)存在下暴露樣品的等分部分；(C)將各等分部分中的一種或多種甲狀腺癌標(biāo)志物的水平進(jìn)行比較；和(d)選出一種試驗(yàn)物質(zhì)，其相對于其它試驗(yàn)物質(zhì)改變含有該試驗(yàn)物質(zhì)的等分部分中的甲狀腺癌標(biāo)志物水平，其中甲狀腺癌標(biāo)志物是Ep-ICD和/或β-聯(lián)蛋白。該方法還可包括給予受試者至少一種試驗(yàn)物質(zhì)，其相對于其它試驗(yàn)物質(zhì)改變含有該試驗(yàn)物質(zhì)的等分部分中的甲狀腺癌標(biāo)志物水平。一方面，本發(fā)明提供評價(jià)試驗(yàn)化合物的甲狀腺癌細(xì)胞致癌潛力的方法，所述方法包括(a)在試驗(yàn)化合物存在和不存在的情況下維持單獨(dú)的甲狀腺癌細(xì)胞等分部分；和(b)將各等分部分中的一種或多種甲狀腺癌標(biāo)志物的表達(dá)進(jìn)行比較，其中在試驗(yàn)化合物存在下維持的等分部分相對于在不存在試驗(yàn)化合物的情況下維持的等分部分在甲狀腺癌標(biāo)志物水平方面的顯著差異，表明試驗(yàn)化合物具有甲狀腺癌細(xì)胞致癌潛力，其中甲狀腺癌標(biāo)志物是Ep-I⑶和/或β -聯(lián)蛋白。試劑盒本發(fā)明考慮用于實(shí)施本發(fā)明的方法以診斷甲狀腺癌、特別是檢測甲狀腺癌的侵襲性或轉(zhuǎn)移潛力、更特別是ATC的試劑盒。這類試劑盒通常包括對進(jìn)行診斷測定所必需的兩種或更多種組分。組分包括但不限于化合物、試劑、容器和/或裝置。因此，本文所述方法可通過利用預(yù)先包裝的診斷試劑盒進(jìn)行，所述試劑盒至少包括本文所述的物質(zhì)(例如抗體、探針、引物等)，其可適宜例如在臨床背景下用于診斷患有甲狀腺癌或具有形成甲狀腺癌的誘因的患者、特別是用于測定甲狀腺癌的侵襲性或轉(zhuǎn)移潛力更特別是ATC。本發(fā)明考慮裝試劑盒的容器，所述試劑盒包括本文所述用于診斷甲狀腺癌、特別是測定甲狀腺癌的侵襲性或轉(zhuǎn)移潛力、更特別是ATC的一種或多種結(jié)合劑。舉例來說，試劑盒可包括對多肽甲狀腺癌標(biāo)志物有特異性的抗體、針對用一種或多種酶標(biāo)記的抗體的抗體和一種或多種酶的底物。試劑盒還可包括微量滴定板孔、標(biāo)準(zhǔn)品、測定稀釋劑、洗滌緩沖液、粘性板蓋和/或使用試劑盒實(shí)施本發(fā)明方法的說明書?！矫?，本發(fā)明提供用于診斷受試者的甲狀腺癌、特別是甲狀腺癌的侵襲性或轉(zhuǎn)移潛力、更特別是ATC的試驗(yàn)試劑盒，其包括與多肽甲狀腺癌標(biāo)志物結(jié)合的抗體和/或與多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物雜交或擴(kuò)增多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物的多核苷酸。在另一方面，本發(fā)明涉及與多肽甲狀腺癌標(biāo)志物結(jié)合的抗體和/或與多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物雜交或擴(kuò)增多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物的多核苷酸在制備用于診斷或檢測甲狀腺癌、特別是診斷或檢測甲狀腺癌的侵襲性或轉(zhuǎn)移潛力的組合物中的用途。在本發(fā)明的又一個方面，試劑盒包括與多肽甲狀腺癌標(biāo)志物的表位特異性結(jié)合的抗體或抗體片段，以及用于檢測抗體與其甲狀腺癌細(xì)胞相關(guān)表位結(jié)合的工具，作為可在測試前進(jìn)一步稀釋的濃縮物(包括凍干組合物)。具體地講，本發(fā)明提供用于診斷甲狀腺癌的侵襲性或轉(zhuǎn)移潛力、特別是ATC的試劑盒，其包括已知量的與多肽甲狀腺癌標(biāo)志物特異性結(jié)合的第一結(jié)合劑，其中第一結(jié)合劑包含可檢測物質(zhì)，或者它與可檢測物質(zhì)直接或間接結(jié)
口 ο可設(shè)計(jì)試劑盒以檢測樣品中多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物的水平。這類試劑盒一般包括本文所述的與多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物雜交或擴(kuò)增多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物的寡核苷酸探針或引物。寡核苷酸可用于例如PCR或雜交步驟中。還提供可用于檢測靶多核苷酸甲·狀腺癌標(biāo)志物的試驗(yàn)試劑盒，其包括包含多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物及其片段或互補(bǔ)序列的容器。試劑盒可包括引物SEQ ID NO. 3-6中的一種或多種。本發(fā)明的試劑盒還可包括內(nèi)有可用于收集試驗(yàn)樣品(例如血清)的工具(包括用于收集和穩(wěn)定血液的柳葉刀和吸水紙或吸水布)的容器。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)本文考慮的分析方法可通過應(yīng)用下面描述的和本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)和方法執(zhí)行。因此，本發(fā)明提供包含一種或多種甲狀腺癌標(biāo)志物的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)?！坝?jì)算機(jī)可讀介質(zhì)”是指可直接通過計(jì)算機(jī)讀取和訪問的任何介質(zhì)，包括但不限于磁性存儲介質(zhì)，例如軟盤、硬盤存儲介質(zhì)和磁帶；光學(xué)存儲介質(zhì)，例如CD-ROM ；電存儲介質(zhì)，例如RAM和ROM ;及這些類別的混合，例如磁/光學(xué)存儲介質(zhì)。因此，本發(fā)明考慮在其上記錄了針對患者和對照鑒定的標(biāo)志物的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)?！坝涗洝笔侵冈谟?jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上存儲信息的過程。技術(shù)人員可容易地采取目前已知的在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上記錄信息的任何方法，以產(chǎn)生包含有關(guān)本文公開的一種或多種標(biāo)志物的信息的制品。多個數(shù)據(jù)處理機(jī)程序和格式可用來存儲有關(guān)一種或多種甲狀腺癌標(biāo)志物的信息。例如，信息可在市售軟件(例如WordPerfect和MicroSoft Word)中經(jīng)格式化的字處理文本文件中再提出，或者以ASCII文件形式再提出，ASCII文件存儲在數(shù)據(jù)庫應(yīng)用中，例如DB2、Sybase、0racle等中。可對許多數(shù)字處理機(jī)結(jié)構(gòu)化格式(例如文本文件或數(shù)據(jù)庫)作改動以獲得已將標(biāo)志物信息記錄在其上的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)。通過提供計(jì)算機(jī)可讀形式的標(biāo)志物信息，可按常規(guī)訪問信息用于多種目的。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用呈計(jì)算機(jī)可讀形式的信息，將在治療期間或之后獲得的標(biāo)志物信息與數(shù)據(jù)存儲手段內(nèi)存儲的信息進(jìn)行比較。本發(fā)明提供用于保持關(guān)于進(jìn)行確定患者是否患有甲狀腺癌、特別是侵襲性甲狀腺癌、更特別是ATC或者是否易患有這類病況的方法的指令的介質(zhì)，所述方法包括測定一種或多種甲狀腺癌標(biāo)志物存在與否，并根據(jù)標(biāo)志物的存在與否，確定病況或該病況的傾向，任選推薦措施或治療。本發(fā)明還提供在電子系統(tǒng)中和/或在網(wǎng)絡(luò)中的用于確定受試者是否患有本文公開的病況或是否易患本文公開的病況的方法，所述方法包括測定一種或多種標(biāo)志物存在與否，并根據(jù)標(biāo)志物的存在與否，確定受試者是否患有該病況或是否易患該病況，并任選推薦措施或治療。本發(fā)明還提供在網(wǎng)絡(luò)中的用于確定受試者是否患有本文公開的病況或是否易患本文公開的病況的方法，所述方法包括(a)接收有關(guān)受試者的表型信息和有關(guān)與受試者樣品有關(guān)的本文公開的一種或多種標(biāo)志物的信息；(b)從網(wǎng)絡(luò)獲取與標(biāo)志物相應(yīng)的信息；和(C)根據(jù)表型信息和有關(guān)標(biāo)志物的信息，確定受試者是否患有該病況或是否易患該病況，和(d)任選推薦措施或治療。本發(fā)明另還提供用于鑒定所選記錄的系統(tǒng)，所述所選記錄鑒定患病細(xì)胞或組織。本發(fā)明的系統(tǒng)一般包括數(shù)字計(jì)算機(jī)；與計(jì)算機(jī)連接的數(shù)據(jù)庫服務(wù)器；與有數(shù)據(jù)存儲在其中的數(shù)據(jù)庫服務(wù)器連接的數(shù)據(jù)庫，包括數(shù)據(jù)記錄(其包括本文公開的一種或多種標(biāo)志物)的數(shù)據(jù)，以及根據(jù)所需選擇標(biāo)準(zhǔn)向數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)文件執(zhí)行查詢，以提供與所需選擇標(biāo)準(zhǔn)匹配的記錄報(bào)告的編碼機(jī)制。
本發(fā)明考慮用于確定受試者是否患有本文公開的病況或是否易患本文公開的病況、特別是ATC的商業(yè)方法，所述方法包括(a)接受有關(guān)受試者的表型信息和關(guān)于與受試者樣品有關(guān)的本文公開的一種或多種標(biāo)志物的信息；(b)從網(wǎng)絡(luò)獲取與標(biāo)志物相應(yīng)的信息；和(C)根據(jù)表型信息、有關(guān)標(biāo)志物的信息和獲取的信息，確定受試者是否患有該病況或是否易患該病況，并任選推薦措施或治療。在本發(fā)明的一個方面，本文所述計(jì)算機(jī)系統(tǒng)、組分和方法用來監(jiān)測病況或確定病況的病期。治療應(yīng)用本發(fā)明考慮與本文公開的甲狀腺癌標(biāo)志物包括甲狀腺癌、特別是侵襲性甲狀腺癌、更特別是ATC有關(guān)的治療應(yīng)用。甲狀腺癌標(biāo)志物可以是治療的靶標(biāo)。例如，核Ep-ICD可以是治療侵襲性甲狀腺癌和ATC的祀標(biāo)。治療方法包括免疫治療方法，其包括抗體療法的應(yīng)用。一方面，本發(fā)明提供可用來預(yù)防甲狀腺癌、特別是侵襲性甲狀腺癌、更特別是ATC的一種或多種抗體。另一方面，本發(fā)明提供預(yù)防、抑制或減輕甲狀腺癌、特別是侵襲性甲狀腺癌、更特別是ATC的方法，所述方法包括以有效預(yù)防、抑制或減輕病況或減少病況發(fā)生的量將與甲狀腺癌標(biāo)志物(例如Ερ-ICD)結(jié)合的抗體給予患者。與甲狀腺癌標(biāo)志物、特別是Ep-ICD結(jié)合的抗體可與標(biāo)記、藥物或細(xì)胞毒性劑、受體的靶標(biāo)結(jié)合區(qū)、黏著分子、配體、酶、細(xì)胞因子或趨化因子組合。在本發(fā)明的多方面，甲狀腺癌標(biāo)志物，特別是Ep-ICD，可與細(xì)胞毒性劑(例如化療劑)或毒素或其活性片段綴合。毒素和其相應(yīng)片段的實(shí)例包括白喉A鏈、外毒素A鏈、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、麻風(fēng)樹毒蛋白、巴豆毒素、酚霉素、伊諾霉素等。細(xì)胞毒性劑可以是通過將放射性同位素與抗體綴合，或?qū)⒎派湫院怂嘏c已與抗體共價(jià)連接的螯合劑結(jié)合而制備的放射化學(xué)物質(zhì)?？贵w還可與一種或多種小分子毒素綴合，例如加卡奇霉素、美登素、單端孢霉烯(trichothene)和CC1065 (參見美國專利號5, 208, 020)。本發(fā)明的方法考慮給予單一抗體以及不同的各種抗體(例如識別其它標(biāo)志物的不同表位的抗體)的組合或“混合物”。這類混合物可具有某些優(yōu)勢，因?yàn)樗鼈兒信c甲狀腺癌標(biāo)志物的不同表位結(jié)合和/或利用不同的效應(yīng)子機(jī)制的抗體。這類組合的抗體可具有協(xié)同治療作用。另外，給予一種或多種標(biāo)志物特異性抗體可與其它治療劑組合。特異性抗體可以其“裸露的”或未綴合形式給予，或者可具有與其綴合的治療劑。本發(fā)明還考慮治療受試者的甲狀腺癌的方法，所述方法包括將對Ep-CAM、特別是對EpEx或Ep-ICD有特異性的抗體遞送給有需要的受試者。在本發(fā)明的一個方面，抗體與細(xì)胞毒性劑或毒素綴合(見上文)。抗體可以是例如公開于美國專利號7557190和US7459538、美國公布申請?zhí)?20050163785,20070122406 和 20070196366 及 McDonald 等(Drug Design, Development and Therapy 2008 ；2 :105-114)的治療性抗體。在一個具體的實(shí)施方案中，抗體是與毒素、更特別是與VB4-845免疫毒素綴合的抗體(ViventiaBiotechnologies Inc. , Ontario, Canada)。更具體地講，按照本發(fā)明的一個方面，提供治療患有甲狀腺癌的受試者的方法，其中以治療有效量給予對Ep-CAM、特別是對EpEx或Ep-ICD有特異性的抗體。在又一個方面，以藥學(xué)上可接受的形式提供抗體。 一方面，本發(fā)明提供用于治療甲狀腺癌的藥物組合物，其特征在于所述組合物包含對Ep-CAM、特別是對EpEx或Ep-ICD有特異性的抗體以及藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或溶媒。用于本發(fā)明方法的抗體可配制成包含適于所需遞送方法的載體的藥物組合物。合適的載體包括當(dāng)與抗體混合時(shí)保持抗體的功能并且與受試者的免疫系統(tǒng)無反應(yīng)性的任何材料。實(shí)例包括許多標(biāo)準(zhǔn)藥用載體的任一種，例如無菌磷酸緩沖鹽溶液、抑菌水等(一般參見 Remington' s Pharmaceutical Sciences 第 16 版，A. Osal.,主編,1980)。可通過能夠?qū)⒖贵w遞送到損傷部位的任何途徑，給予一種或多種標(biāo)志物特異性抗體制劑。給藥途徑包括但不限于靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、真皮內(nèi)等。抗體制劑可被凍干，并作為無菌粉劑優(yōu)選在真空下保存，然后在注射前在含有例如苯甲醇防腐劑的抑菌水中或在無菌水中復(fù)溶。治療一般可包括以有效劑量經(jīng)可接受的給藥途徑重復(fù)給予抗體制劑。劑量將取決于本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍了解的各種因素，包括病況的病因?qū)W、病況的病期、所用抗體的結(jié)合親和力和半壽期、患者中標(biāo)志物表達(dá)的程度、所需要的穩(wěn)態(tài)抗體濃度水平、治療頻率和與本發(fā)明的治療方法聯(lián)用的任何治療劑的影響。限定適當(dāng)劑量的決定因素是在具體情況下治療有效所必須的具體抗體的量?？赡苄枰貜?fù)給予以達(dá)到所需效果。直接給予一種或多種標(biāo)志物抗體也是可行的，并且在某些情況下可具有優(yōu)勢。可針對甲狀腺癌標(biāo)志物對患者進(jìn)行評價(jià)，以便輔助確定最有效的給藥方案和相關(guān)因素。本文所述測定方法或類似測定法，可用于在治療前定量測定患者中的標(biāo)志物水平。這類測定法還可用于整個治療的監(jiān)測，并且可用于結(jié)合評價(jià)其它參數(shù)(例如標(biāo)志物水平)來衡量治療的成功。可通過用表達(dá)高水平多核苷酸的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞或組織，來關(guān)閉本文公開的多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物。這類構(gòu)建體可使細(xì)胞充滿不可翻譯的有義或反義序列。甚至在缺乏整合到DNA時(shí)，這類載體可繼續(xù)轉(zhuǎn)錄RNA分子直到所有拷貝被內(nèi)源核酸酶破壞。來源于反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、皰疹病毒或痘苗病毒或者來源于各種細(xì)菌質(zhì)粒的載體可用來將多核苷酸遞送至靶定器官、組織或細(xì)胞群。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法可用來構(gòu)建表達(dá)多核苷酸(例如反義物)的重組載體。(參見例如Sambrook等人(同上)和Ausubel等人(同上)描述的技術(shù))。用于將載體導(dǎo)入適于體內(nèi)、體外和離體治療的細(xì)胞或組織的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。例如通過轉(zhuǎn)染或通過脂質(zhì)體的遞送是本領(lǐng)域眾所周知的?？赏ㄟ^針對多核苷酸甲狀腺癌標(biāo)志物的調(diào)節(jié)區(qū)(即啟動子、增強(qiáng)子和內(nèi)含子)設(shè)計(jì)反義分子、DNA、RNA或PNA，來獲得基因表達(dá)的修飾。優(yōu)選寡核苷酸來源于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，例如介于前導(dǎo)序列-10和+10區(qū)域。還可設(shè)計(jì)反義分子，使得通過防止轉(zhuǎn)錄物與核糖體結(jié)合而阻斷mRNA的翻譯。還可采用“三股螺旋”堿基配對方法實(shí)現(xiàn)抑制。三股螺旋配對損害雙螺旋充分打開以結(jié)合聚合酶、轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)節(jié)分子的能力。有關(guān)使用三鏈體DNA的治療進(jìn)展的綜述參見 Gee J E 等(載于Huber B E and B I Carr (1994)Molecular andImmunologic Approaches, Futura Publishing Co, Mt Kisco N. Y.)。核酶是催化RNA的特異性切割的酶RNA分子。核酶通過核酶分子與互補(bǔ)靶RNA的序列特異性雜交，接著內(nèi)核分離而起作用。因此，本發(fā)明考慮可特異性和有效催化多核苷酸·標(biāo)志物的內(nèi)核分離的工程改造的錘頭基序核酶分子。任何可能的RNA靶標(biāo)內(nèi)的特異性核酶切割位點(diǎn)最初可通過掃描包括下列序列的核酶切割位點(diǎn)的靶分子來鑒定GUA、GUU和⑶C。一旦鑒定出位點(diǎn)，便可針對可使寡核苷酸無法操作的二級結(jié)構(gòu)特征，對相當(dāng)于含有切割位點(diǎn)的靶基因區(qū)域的15-20個核糖核苷酸的短RNA序列進(jìn)行評價(jià)。還可采用核糖核酸酶保護(hù)測定，通過測試與互補(bǔ)寡核苷酸雜交的可及性，來確定候選靶標(biāo)的適宜性。本發(fā)明提供預(yù)防、抑制或減輕患者的甲狀腺癌、特別是侵襲性甲狀腺癌、更特別是ATC的方法，所述方法包括(a)從患者中獲取腫瘤樣品；(b)分別在多種試驗(yàn)物質(zhì)存在下維持樣品的等分部分；(c)對各等分部分中的本文公開的甲狀腺癌標(biāo)志物和任選一種或多種其它標(biāo)志物的水平進(jìn)行比較；(d)將至少一種試驗(yàn)物質(zhì)給予患者，該試驗(yàn)物質(zhì)相對于其它試驗(yàn)物質(zhì)改變含有該試驗(yàn)物質(zhì)的等分部分中的甲狀腺癌標(biāo)志物和任選其它標(biāo)志物的水平。本文所述活性治療物質(zhì)可以合適的方式給予，例如通過注射(皮下、靜脈內(nèi)等)、口服給予、吸入、經(jīng)皮施用或直腸給予。根據(jù)給藥途徑，活性物質(zhì)可用保護(hù)物質(zhì)不受酶、酸和可鈍化物質(zhì)的其它自然條件的作用的材料包衣。可在合適的溶劑中用合適的表面活性劑制備活性化合物作為游離堿或藥學(xué)上可接受的鹽的溶液劑?？稍诟视?、液體聚乙二醇及其混合物中，或者在油中制備分散體?？赏ㄟ^本身已知的用于制備可給予受試者的藥學(xué)上可接受的組合物的方法來制備本文所述組合物，使得將有效量的活性物質(zhì)在具有藥學(xué)上可接受的溶媒的混合物中混合。合適的溶媒描述于例如 Remington :The Science and Practice of Pharmacy (第21 版· 2005, University of the Sciences in Philadelphia(編輯)，Mack PublishingCompany)和 1999 年出版的 The United States Pharmacopeia The NationalFormulary (USP 24NF 19)。在此基礎(chǔ)上，組合物包含(雖然并非唯一)活性物質(zhì)的溶液，所述活性物質(zhì)與一種或多種藥學(xué)上可接受的溶媒或稀釋劑聯(lián)合，并包含在具有合適PH并與生理流體等滲的緩沖溶液中。
組合物被標(biāo)示為單獨(dú)或與其它治療劑或其它治療形成聯(lián)合的治療劑。本發(fā)明的組合物可與其它治療劑或療法同時(shí)、分別或序貫給予。可使用合適的動物模型體內(nèi)評價(jià)采用本發(fā)明方法鑒定的組合物和物質(zhì)/化合物的治療活性。下面的非限制性實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了說明實(shí)施例I使用針對EpCAM的Ep-Ex和Ep-I⑶結(jié)構(gòu)域的抗體，通過免疫組織化學(xué)(IHC)對在原發(fā)性人甲狀腺癌以及在一組侵襲性和非侵襲性甲狀腺癌細(xì)胞系中的EpEx和Ep-ICD蛋白表達(dá)進(jìn)行了研究，研究結(jié)果得到蛋白質(zhì)印跡法的證實(shí)。為了確定EpCAM過表達(dá)是否歸因于轉(zhuǎn)錄增加，采用定量實(shí)時(shí)PCR(Q-PCR)對這些腫瘤中的EpCAM轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行分析。此外，進(jìn)行 了核Ep-I⑶和β -聯(lián)蛋白的同時(shí)染色以確立甲狀腺癌中致癌Ep-I⑶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的預(yù)后值。在該實(shí)施例中描述的研究中采用下列材料與方法。材料與方法患者和組織樣品研究獲安大略倫理委員會和加拿大多倫多辛乃山醫(yī)院(Ontario EthicsCommittee and Mount Sinai Hospital,Toronto,Canada)批準(zhǔn)。告知所有患者實(shí)情，并取得簽名同意書。從加拿大多倫多辛乃山醫(yī)院病理學(xué)部門檔案館取出30個甲狀腺癌石蠟塊。由15個甲狀腺腫瘤和15個鄰近正常組織組成的30個新鮮冷凍樣品也包括在研究中，用于定量實(shí)時(shí) PCR 分析。將組織在 RNAlater TissueProtect 溶液(Qiagen, Mississauga, ON)中速凍，并保存在_80°C下備用。在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)前由病理學(xué)家檢查每個病例。從數(shù)據(jù)庫調(diào)取患者隨訪數(shù)據(jù)，以將腫瘤中的蛋白質(zhì)表達(dá)與臨床結(jié)局相關(guān)聯(lián)，從而評價(jià)這些蛋白質(zhì)的預(yù)后關(guān)聯(lián)性?；颊唠S訪最短15個月的時(shí)間，最長199個月的時(shí)間?？贵w抗EpCAM 單克隆抗體 M0C-31 (AbD Serotec, Oxford, UK)識別 EpCAM 氨基端區(qū)的胞外組分(EGF1 結(jié)構(gòu)域-aa 27-59) [Chaudry Ma 等，2007]。EpCAM 的胞內(nèi)域，a-EpICD 抗體1144(Epitomics)識別EpCAM的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。針對β-聯(lián)蛋白的aa 571-781產(chǎn)生的β-聯(lián)蛋白抗體(目錄號 610154,B D Sciences, San Jose, CA)和 cnyc 抗體(C19, sc-788,親和純化的兔多克隆抗體，Santa Cruz Biotechnology Inc.)。細(xì)胞系使得自Μ· Ringel, The Ohio State University, OH 的結(jié)腸癌細(xì)胞系 WRO(之前認(rèn)為是甲狀腺癌細(xì)胞系)和ARO-結(jié)腸癌細(xì)胞系(之前認(rèn)為是ATC細(xì)胞系)生長在補(bǔ)充了10%胎牛血清(FBS)、2mmol/L L-谷氨酰胺、lmmol/L丙酮酸鈉和Ix非必需氨基酸的RPMI1640中。將高度分化的甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系TPC-I維持在補(bǔ)充了 5% FBS和2mmol/LL-谷氨酰胺的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中。使甲狀腺髓樣癌細(xì)胞系TT(得自 J. Fagin,University of Cincinnati, Cincinnati, OH)生長在補(bǔ)充了 10% FBS 的 F-12K培養(yǎng)基(Invitrogen Life Technologies, Grand Island, NY)。使退行發(fā)育性甲狀腺癌細(xì)胞系CAL62 (來自J. Fagin)生長在補(bǔ)充了 10% FBS的DMEM中。將所有細(xì)胞系培養(yǎng)在潮濕、5% C02、37°C培養(yǎng)箱中；70-80%匯合細(xì)胞用于下述實(shí)驗(yàn)。甲狀腺癌中EpEx和Ep-ICD表達(dá)的免疫組織化學(xué)
從石蠟塊上切取4μπι厚的連續(xù)切片，固定在載玻片上。切片用二甲苯和逐級酒精系列脫蠟并水化。載玻片在室溫下用O. 3%Η202處理30分鐘以阻斷內(nèi)源過氧化物酶活性。在阻斷與正常馬或山羊血清的非特異性結(jié)合后，將切片與抗EpEx小鼠單克隆抗體M0C-31(稀釋度I : 200)、或a-EpI⑶抗體1144(稀釋度I : 200)、或小鼠單克隆β -聯(lián)蛋白抗體(稀釋度I : 200) —起溫育30分鐘后，與生物素化第二抗體(馬抗小鼠或山羊抗兔)一起溫育 30 分鐘。切片最后與 VECTASTAIN Elite ABC 試劑(Vector labs,Burlingame, CA)一起溫育，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzedine)用作色原。免疫組織化學(xué)染色的評價(jià)按照文獻(xiàn)所述，在組織切片的5個區(qū)域?qū)γ庖哧栃匀旧M(jìn)行了評價(jià)[Ralhan等，2008]。在由2名不知臨床結(jié)局的評估人員觀察時(shí)，如果上皮細(xì)胞在胞質(zhì)、質(zhì)膜和/或核中顯示免疫陽性，則切片記為陽性。對這些切片如下進(jìn)行評分0，< 10%細(xì)胞；1，10-30%細(xì)胞；2，30-50%細(xì)胞；3，50-70%細(xì)胞；4，> 70%細(xì)胞顯示免疫反應(yīng)性。還根據(jù)強(qiáng)度如下對切片進(jìn)行半定量評分0，無山輕微；2，中等；3，強(qiáng)。最后，對各個甲狀腺癌和正常甲狀腺組織 切片，通過將百分比陽性的和強(qiáng)度的分值相加，得到總分(范圍為0-7)。如前所述對免疫組織化學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[Ralhan等，2008]。米用 Visiopharm Integrator System(Visiopharm, Horsholm, Denmark),驗(yàn)證了免疫組織化學(xué)得分?jǐn)?shù)據(jù)。僅定量測定核染色，因?yàn)檐浖辉试S根據(jù)陽性褐色染色強(qiáng)度的差異同時(shí)定量測定膜、胞質(zhì)和核染色。統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS 10. O軟件(Chicago)，對免疫組織化學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。箱形圖用來確定正常甲狀腺組織和甲狀腺癌中膜EpEx、核Ep-ICD和核或胞質(zhì)β -聯(lián)蛋白表達(dá)的總分的分布。截?cái)嘀?gt;2定義為統(tǒng)計(jì)檢查的核β_聯(lián)蛋白免疫陽性的陽性標(biāo)準(zhǔn)。對于膜β_聯(lián)蛋白，6的分值定義為表達(dá)喪失。利用由生存數(shù)據(jù)用Kaplan-Meier曲線建立的生命表，對表達(dá)的EpEx、Ep_ICD和/或β_聯(lián)蛋白染色與患者總體生存率之間的相關(guān)性進(jìn)行了評價(jià)。自細(xì)胞系、冷凍樣品、石蠟切片進(jìn)行的RNA分離和第一鏈cDNA合成所有RNA分離均按照生產(chǎn)商的說明書進(jìn)行。使用RNeasy Mini Kit (Qiagen,Maryland,MA),從細(xì)胞系中提取總 RNA。使用 High Pure RNA Tissue Kit 和 High Pure RNAParaffin Kit (Roche,Mannheim, Germany)分別從新鮮冷凍甲狀腺組織樣品和FFPE樣品分離 RNA。米用 ND-1000 分光光度計(jì)(Nanodrop Technologies,Wilmington,DE)測定 RNA 的量° 使用 Transciptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche,Mannheim, Germany)進(jìn)行第一鏈cDNA合成。5 μ I的反應(yīng)產(chǎn)物用作實(shí)時(shí)PCR的模板。定量實(shí)時(shí)RT-PCR按照生產(chǎn)商的說明書，利用LightCycler480 (Roche, Mannheim, Germany)與 SYBRGreen I Master 試劑盒(Roche, Mannheim, Germany),進(jìn)行定量實(shí)時(shí) RT-PCR(Q-PCR)分析。實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)始于在95°C下溫育5分鐘，接著在95°C下變性10秒鐘、在65°C下退火15秒鐘，并在72°C下延伸15秒鐘的45個循環(huán)。完成PCR后立即進(jìn)行解鏈曲線分析。所有反應(yīng)以一式三份進(jìn)行，并重復(fù)實(shí)驗(yàn)至少兩次。應(yīng)用LightCycler480軟件I. 5分析數(shù)據(jù)。EpCAM和GAPDH的引物應(yīng)用ProbeFinder測定設(shè)計(jì)軟件(Roche，Mannheim, Germany)設(shè)計(jì)，由Sigma合成并進(jìn)行HPLC純化。引物序列如下EpCAM,5’ -CCATGTGCTGGTGTGTGAA-3’ [SEQ ID NO. 3](正向)和 5’ -TGTGTTTTAGTTCAATGGATGATCCA-3，[SEQ ID NO. 4](反向);GAPDH，5，-AGCCACATCGCTCAGACAC-3，[SEQ ID NO. 5](正向)和 5’ -GCCCAATACGACCAAATCC-3’ [SEQ ID NO. 6](反向)。免疫細(xì)胞化學(xué)將侵襲性和非侵襲性甲狀腺癌細(xì)胞(WR0、CAL_62、TT和TPC-1)和對照細(xì)胞(ARO)(1x103)鋪在蓋玻片上，生長過夜。之后，細(xì)胞用PBS洗滌三次，使用4%低聚甲醛固定。對于通過免疫細(xì)胞化學(xué)檢測Ep-Ex、Ep-ICD和β-聯(lián)蛋白，固定細(xì)胞分別用M0C-31、1144(稀釋度I : 200)或小鼠單克隆β_聯(lián)蛋白抗體染色30分鐘，用生物素化第二抗體染色30分鐘。切片最后與 VECTASTAIN Elite ABC 試劑(Vector labs, Burlingame, CA) 一起溫育，二氨基聯(lián)苯胺用作色原。對于免疫熒光檢測，山羊抗小鼠IgG-FITC(Sigma，St Louis, MO)或IgG-Alexa用 作第二抗體。核用DAPI染色。免疫熒光使用熒光顯微鏡(Leica DM IRBE,Houston,TX)檢測。蛋白質(zhì)印跡法在裂解緩沖液(O.15mM NaCl、5mM EDTA (pH 8. O) U % TritonUOmM Tris-Cl (pH7.4))和蛋白酶抑制劑混合物(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)中制備細(xì)胞裂解物。細(xì)胞裂解物(30微克蛋白質(zhì))通過SDS-PAGE分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Millipore，Billerica, MA)。膜用抗 EpCAM 小鼠單克隆抗體 B302 (Santa Cruz Biotechnology, SantaCruz, CA)(稀釋度I : 500)探測，接著按照生產(chǎn)商的說明書通過辣根過氧化物酶綴合的第二山羊抗小鼠抗體和化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)(PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA)探測。作為蛋白質(zhì)加樣的對照，使用小鼠單克隆抗體C_4(Santa Cruz Biotechnology, SantaCruz, CA)(稀釋度I : 1000),針對β-肌動蛋白探測印跡。應(yīng)用ImageGauge軟件(AlturaSoftware Inc.),通過光密度測定分析進(jìn)行定量。結(jié)果甲狀腺癌中EpEx和Ep-ICD表達(dá)的免疫組織化學(xué)分析為了確定甲狀腺癌中Ep-Ex和Ep-ICD的臨床重要性，分別使用結(jié)構(gòu)域特異性抗體M0C-31和1144，在存檔組織中通過免疫組織化學(xué)法對其表達(dá)進(jìn)行分析。在ATC中未觀察到質(zhì)膜EpEx免疫反應(yīng)性(圖1，組圖IA)。為了確定膜EpEx的喪失是否導(dǎo)致其胞質(zhì)/核蓄積，使用1144抗體進(jìn)行Ep-ICD免疫染色-在ATC中觀察到強(qiáng)的核和胞質(zhì)Ep-ICD免疫染色(圖1，組圖IIA)。已經(jīng)表明活化Ep-I⑶與β-聯(lián)蛋白結(jié)合，并體外激活癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖[Maetzel等，2009]。在連續(xù)切片中進(jìn)行β _聯(lián)蛋白免疫染色以確定在胞質(zhì)/核Ep-I⑶和核/胞質(zhì)聯(lián)蛋白之間是否有任何相關(guān)性。研究表明ATC中同時(shí)存在胞質(zhì)和核β-聯(lián)蛋白免疫染色(圖1，組圖ΙΙΙΑ)。相比之下，分化差的甲狀腺濾泡癌(TOFTC)亞類顯示，定位于細(xì)胞-細(xì)胞接觸的區(qū)域有強(qiáng)的局灶性EpEx膜染色(圖1，組圖IB);在這些腫瘤中觀察到中等核染色和胞質(zhì)Ep-I⑶免疫染色(圖1，組圖IIB);對于β-聯(lián)蛋白，觀察到輕微的胞質(zhì)染色和顯著的膜染色(圖1，組圖ΙΙΙΒ)。分化差的甲狀腺乳頭狀癌(TOPTC)顯示EpEx膜染色(圖1，組圖IC)；在這些腫瘤中未觀察到核染色和觀察到微弱的胞質(zhì)Ep-I⑶免疫染色(圖1，組圖IIC);對β-聯(lián)蛋白觀察到膜染色和輕微胞質(zhì)染色(圖1，組圖IIIC)。高度分化的甲狀腺乳頭狀癌(WDPTC)顯示強(qiáng)的EpEx膜染色(圖1，組圖ID);在這些腫瘤中未觀察到核染色，但有輕微胞質(zhì)Ep-I⑶免疫染色(圖1，組圖IID);并對β-聯(lián)蛋白觀察到強(qiáng)膜染色(圖1，組圖II ID)。相比之下，正常(非惡性)甲狀腺組織顯示基礎(chǔ)EpEx膜免疫反應(yīng)性(圖1，組圖IE)和微弱或無胞質(zhì)或核Ep-ICD染色(圖1，組圖IIE)及針對β-聯(lián)蛋白的基礎(chǔ)膜免疫反應(yīng)性(圖1，組圖ΙΙΙΕ)。鱗狀細(xì)胞癌變體顯示微弱的EpEx膜免疫反應(yīng)性(圖1，組圖IF);強(qiáng)的胞質(zhì)和核Ep-I⑶染色(圖1，組圖IIF);及針對β-聯(lián)蛋白的膜和胞質(zhì)免疫反應(yīng)性(圖1，組圖IIIF)。利用visioform定量測定核Ep-I⑶染色；圖IG中給出顯示不同的甲狀腺癌亞型中百分比核Ep-I⑶陽性的直方圖。所有的5個ATC均顯示核陽性；核Ep-I⑶總陽性面積范圍為12-40%。值得注意的是，I個PDPTC和I個PDFTC也顯示核Ep-I⑶陽性?？偟膩碚f，甲狀腺腫瘤不同亞型中聯(lián)蛋白表達(dá)分析表明ATC中的胞質(zhì)和核表達(dá)，而在TOFTC和PDPTC及在WDPTC以及在非惡性甲狀腺組織中觀察到膜定位。 具有不同病理的同一患者的不同組織塊的組織切片分析表明這些蛋白質(zhì)表達(dá)模式中的差異，正如在各個甲狀腺腫瘤中觀察到的一樣。圖2組圖Al描繪沒有EpEx膜染色的ATC切片，而組圖AII表示在連續(xù)ATC切片中強(qiáng)的Ep-I⑶核和胞質(zhì)定位，組圖AIII顯示核和胞質(zhì)聯(lián)蛋白表達(dá)。得自同一患者的另一個組織塊表明SCC，組圖BI表示局灶性微弱的膜EpCAM表達(dá)，而組圖BII表示強(qiáng)的核和胞質(zhì)Ep-I⑶表達(dá)，組圖BIII表示核和膜β -聯(lián)蛋白表達(dá)。相比之下，顯示TOFTC的來自同一患者的另一個組織塊僅顯示膜EpEx (組圖Cl)，同時(shí)只觀察到胞質(zhì)Ep-I⑶(組圖CII)，并觀察到無核免疫染色的膜β-聯(lián)蛋白(組圖CIII)。得自同一患者的正常甲狀腺組織顯示強(qiáng)的EpCAM膜染色(組圖DI) ,XEp-KD的核染色和強(qiáng)染色(組圖DII)及β-聯(lián)蛋白的膜染色(組圖DIII)。在同一患者中觀察到的這些不同的染色模式支持甲狀腺癌的不同亞類中這些蛋白質(zhì)差異表達(dá)的觀察結(jié)果。箱形圖分析在正常甲狀腺組織和不同甲狀腺癌亞型的石蠟包埋切片中測定的EpEx、Ep-I⑶和β_聯(lián)蛋白的免疫染色總評分的分布見圖3。組圖A表示EpEx染色的箱形圖-Al描繪在正常組織和PTC中的膜EpEx定位、在ATC中無可檢測的表達(dá)、在FTC和SCC中表達(dá)的不同降低(評分中值為3，黑體水平線)。組圖AII描繪在正常組織、PTC、PDPTC, PDFTC和FTC中的胞質(zhì)EpEx定位、在ATC中無可檢測的表達(dá)和在SCC中表達(dá)的不同降低。組圖AIII描繪在正常組織或任一種甲狀腺癌中無可檢測的核EpEx染色。組圖B表示Ep-ICD染色的箱形圖-I描繪在一些PTC、PDFTC和TOPTC中的膜Ep-ICD定位，但在ATC、FTC和SCC中無膜染色。組圖BII描繪在正常組織、PTC、ATC、FTC和SCC、PDPTC和I3DFTC中的胞質(zhì)Ep-ICD定位。組圖BIII描繪與評分中值為O的PTC、FTC、roPTC、PDFTC和正常甲狀腺組織相比，在ATC中的核Ep-I⑶定位和在SCC中的不同表達(dá)(評分中值為3，黑體水平線，范圍0-4，用垂直條形柱表示)。組圖C表示聯(lián)蛋白染色的箱形圖-I描繪僅ATC中的核染色。組圖CII表示在所分析的所有甲狀腺癌亞型中的胞質(zhì)β-聯(lián)蛋白。組圖CIII表示在正常組織和除大多數(shù)的ATC以外的所分析的所有甲狀腺癌亞型中的膜β-聯(lián)蛋白。利用Visiopharm Integrator System進(jìn)一步驗(yàn)證了免疫組織化學(xué)得分?jǐn)?shù)據(jù)。圖3D表示甲狀腺癌不同亞型中的Ep-I⑶核染色。所分析的所有ATC及I個PDPTC和I個TOFTC顯示核Ep-I⑶表達(dá)。甲狀腺癌中EpCAM表達(dá)的定量實(shí)時(shí)RT-PCR分析在轉(zhuǎn)錄物水平上通過Q-PCR測定了侵襲性和非侵襲性甲狀腺癌中EpCAM的差異表達(dá)。圖4表示甲狀腺腫瘤和非惡性(組織學(xué)上正常的)甲狀腺組織中EpCAM轉(zhuǎn)錄物的水平。與FTC和PTC相比，ATC顯示非常低的EpCAM轉(zhuǎn)錄物水平。在EpCAM轉(zhuǎn)錄物和甲狀腺癌侵襲性之間未觀察到相關(guān)性。EpEx、Ep-I⑶和β -聯(lián)蛋白表達(dá)與疾病結(jié)局的關(guān)聯(lián)Kaplan-Meier生存分析揭示具有核Ep-I⑶表達(dá)的甲狀腺癌患者的總體生存期縮短(P < O. 0001,圖5Α)。與不顯示核Ep-I⑶的患者的185個月總體生存期中值相比，顯示核Ep-I⑶的患者的總體生存期中值為5個月。顯示喪失膜EpEx的患者的總體生存期(中 位值=5個月)比具有膜表達(dá)的患者(中位值=185個月，P < O. 0001,圖5Β)短。顯示核β_聯(lián)蛋白的患者的總體生存期(中位值=5個月)比不顯示核β_聯(lián)蛋白的患者(中位值=185個月，P = O. 0014，圖5C)短。具有Ep-I⑶和β -聯(lián)蛋白兩者核表達(dá)的甲狀腺癌患者的總體生存期(中位值=5個月)比不具有Ep-I⑶和β_聯(lián)蛋白兩者核表達(dá)的患者(中位值=185個月，P = O. 0014，圖5D)短。EpEx在侵襲性人甲狀腺癌細(xì)胞系中的亞細(xì)胞定位在侵襲性和非侵襲性人甲狀腺癌中觀察到的Ep-Ex和Ep-I⑶的差異亞細(xì)胞定位在體外繁殖的甲狀腺癌細(xì)胞系中模擬，并通過免疫細(xì)胞化學(xué)進(jìn)行測定。通過免疫細(xì)胞化學(xué)法在WRO細(xì)胞、甲狀腺髓樣癌細(xì)胞-TT和陽性對照結(jié)腸癌細(xì)胞-ARO (之前認(rèn)為是ATC細(xì)胞)中觀察到定位于質(zhì)膜的強(qiáng)的EpEx免疫染色，而在退行發(fā)育性甲狀腺癌細(xì)胞(CAL-62)和低級別甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞(TPC-I)中未檢測到膜EpCAM染色(圖6Α組圖I)。這些研究結(jié)果得到免疫熒光的證實(shí)(圖6Α組圖III)。在CAL-62細(xì)胞中觀察到胞質(zhì)和核Ep-I⑶染色，相比之下，WRO細(xì)胞顯示胞質(zhì)Ep-ICD和微弱的核染色(圖6Β組圖II和IV)。圖6Β中給出EpEx和Ep-ICD染色的合并圖像，組圖IV描繪WRO細(xì)胞中強(qiáng)的膜染色和微弱的胞質(zhì)染色。在TT細(xì)胞中，EpEx在膜中細(xì)胞-細(xì)胞接觸處顯示強(qiáng)的局灶性染色和微弱的胞質(zhì)Ep-ICD染色。相比之下，退行發(fā)育性CAL-62細(xì)胞顯示核和胞質(zhì)Ep-I⑶染色和無或微弱的EpEx染色。相比之下，非侵襲性甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系TPC-I不具有可檢測的EpEx或Ep-I⑶染色。蛋白質(zhì)印跡分析證實(shí)了 EpEx在ARO、WRO和TT細(xì)胞中顯著過表達(dá)；相比之下，在CAL-62細(xì)胞中觀察到EpEx水平降低，而在TPC-I細(xì)胞中未檢出EpEx (圖6C)。Q-PCR分析顯示同組癌細(xì)胞系中EpCAM轉(zhuǎn)錄物的水平無顯著差異。圖6D表示在ARO,WR0,TT和CAL-62細(xì)胞中的EpCAM/GAPDH比率；在TPC-I細(xì)胞中無法定量測定轉(zhuǎn)錄物。作為致癌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的EpCAM研究提出EpCAM的致癌潛力因其胞內(nèi)域的釋放而被激活，這可通過激活Wnt途徑組分向細(xì)胞核發(fā)出信號。為了確定在EpEx自質(zhì)膜的表達(dá)喪失、胞質(zhì)蓄積和易位至核與Wnt途徑組分聯(lián)蛋白的亞細(xì)胞定位和靶基因例如c-myc的表達(dá)之間是否有任何相關(guān)性，在上述甲狀腺癌細(xì)胞系組中對這些蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行了分析。圖6E和6F顯示在WRO和ARO細(xì)胞中在細(xì)胞-細(xì)胞間接觸處有強(qiáng)的EpEx表達(dá)以及β聯(lián)蛋白和c-myc的胞質(zhì)和核定位，但在CAL-62、TT和TPC-I細(xì)胞中卻無。討論關(guān)鍵的研究結(jié)果是(i)退行發(fā)育性甲狀腺腫瘤顯示膜EpEx喪失，但在腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)和核中Ep-I⑶蓄積增加，這與并發(fā)的β -聯(lián)蛋白表達(dá)并行，表明了 Ep-I⑶可在這些腫瘤中起致癌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的作用，fct途徑組分(包括β-聯(lián)蛋白)的隨之激活可能是這些腫瘤快速生長及其預(yù)后差的原因；(ii)在高度分化的甲狀腺濾泡癌和甲狀腺乳頭狀癌中觀察到EpEx膜過表達(dá)，而在分化差的甲狀腺濾泡癌和甲狀腺乳頭狀癌的亞類中顯示核Ep-I⑶；(iii)EpEx在培養(yǎng)中的癌細(xì)胞WRO和TT的表面中過表達(dá)，但在退行發(fā)育性甲狀腺癌細(xì)胞(CAL62)和較少侵襲性細(xì)胞TPC-I中的膜上未檢測出，而在CAL62細(xì)胞中檢出核Ερ-ICD,這就支持臨床研究結(jié)果。本項(xiàng)研究是使用對Ep-ICD的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域有特異性的抗體的首次報(bào)道，證實(shí)了在ATC中Ep-ICD的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的胞質(zhì)和核蓄積。最近有研究提出，EpCAM的調(diào)節(jié)性膜內(nèi)蛋白·酶解(RIP)產(chǎn)生Ep-I⑶，已經(jīng)表明Ep-I⑶在癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)EpCAM信號并激活Wnt蛋白——導(dǎo)致β -聯(lián)蛋白及革巴基因c-myc和細(xì)胞周期蛋白Dl的核蓄積增加(Munz等,2009)。證實(shí)了在ATC中胞質(zhì)和核Ep-I⑶與β -聯(lián)蛋白伴隨表達(dá)，這就表明Ep-I⑶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的活化和隨之fct途徑組分的活化可能是ATC快速生長的原因。β-聯(lián)蛋白作為參與典型Wnt途徑的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子起重要作用[Li H等，2002]。β-聯(lián)蛋白的核定位參與口腔白斑的癌前期變化[Ishida K等，2007]，并且已知與包括結(jié)腸直腸腫瘤、胃腫瘤和食管腫瘤等人類癌癥的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)[Morin PJ 1997,Ogasawara N2006，Takayama T，1996，Zhou XB 2002]。典型Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化導(dǎo)致β-聯(lián)蛋白的核易位[Lustig B 2003]，因此，核β-聯(lián)蛋白是活性細(xì)胞增殖的標(biāo)志物。與膜和胞質(zhì)表達(dá)不同，β_聯(lián)蛋白的核定位影響腫瘤進(jìn)展。核β_聯(lián)蛋白在ATC中的表達(dá)反應(yīng)了這些腫瘤的侵襲性質(zhì)。此外，在侵襲性甲狀腺癌細(xì)胞系CAL62中的體外研究結(jié)果表明，Ep-I⑶、β -聯(lián)蛋白和c-myc共定位支持可能造成ATC及SCC、PDPTC和PDFTC亞類侵襲行為的致癌Ep-I⑶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活化、Wnt途徑組分活化和其靶蛋白cmyc的過表達(dá)。生存分析數(shù)據(jù)還表明膜EpEx喪失與甲狀腺癌患者總體生存期縮短關(guān)聯(lián)(P < O. 0001)。此外，還發(fā)現(xiàn)與不顯示這些蛋白質(zhì)核蓄積的甲狀腺癌患者(中位值=185個月)相比，核Ep-I⑶蓄積(P < O. 0001)和核β-聯(lián)蛋白表達(dá)(P = O. 0014)單獨(dú)或伴以Ep-I⑶(P = O. 0014)與總體生存期縮短相關(guān)(中位值=5個月)。這是強(qiáng)調(diào)單獨(dú)或與核β-聯(lián)蛋白相關(guān)聯(lián)的核Ep-ICD作為侵襲性甲狀腺癌不良預(yù)測物的臨床重要性的首次報(bào)告。甲狀腺癌細(xì)胞系和原發(fā)性甲狀腺腫瘤的體外研究結(jié)果表明EpEx在高度分化和分化差的甲狀腺癌的質(zhì)膜中過表達(dá)，并強(qiáng)調(diào)其作為免疫治療靶標(biāo)的潛力。值得注意的是，在早期免疫組織化學(xué)研究中，Ensinger等(2006)報(bào)道了 EpEx在高度分化和分化差的甲狀腺癌中過表達(dá)，但在所分析的22個ATC中未觀察到表達(dá)。結(jié)果還證實(shí)在ATC中使用識別Ep-CAM胞外域的抗體M0C-31，細(xì)胞表面的EpEx表達(dá)喪失。極高度分化和分化差的甲狀腺濾泡性腫瘤細(xì)胞和甲狀腺乳頭狀腫瘤細(xì)胞的質(zhì)膜上的EpEx過表達(dá)，使之成為癌癥標(biāo)志物以及免疫治療靶標(biāo)的理想候選物。在ATC中膜EpEx的喪失及其核定位表明，在這些腫瘤中需要靶向Ep-I⑶的新的治療方法。
結(jié)論綜上所述，證實(shí)了侵襲性甲狀腺癌(退行發(fā)育性甲狀腺癌和一些分化差的甲狀腺乳頭狀癌)中膜EpEx的喪失和Ep-I⑶的核蓄積。在這些腫瘤中核聯(lián)蛋白的同時(shí)增加表明這些腫瘤中Wnt途徑信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的活化。此外，膜EpEx的喪失，或者單獨(dú)或連同β-聯(lián)蛋白的Ep-I⑶的核蓄積，與甲狀腺癌患者總體生存率差相關(guān)。Ep-I⑶可用作侵襲性甲狀腺癌的標(biāo)志物，并且是新療法的潛在靶標(biāo)。實(shí)施例2 EpCAM-潛在治療靶標(biāo)用VB4-845/VB6-845治療后EpCAM陽性甲狀腺癌細(xì)胞增殖的抑制在甲狀腺癌細(xì)胞系組以及在具有不同EpCAM表達(dá)水平的陽性對照結(jié)腸癌細(xì)胞系中，檢查了 EpCAM特異性免疫毒素VB4-845/VB6-845對細(xì)胞增殖的作用。如圖7所示，基于MTT的細(xì)胞存活率測定表明，VB4-845抑制WRO和ARO細(xì)胞的增殖，其IC5tl分別為IpM和 0.7ρΜ。相比之下，甲狀腺髓樣癌細(xì)胞系TT邊緣地對免疫毒素治療起反應(yīng)，而無可檢測的膜EpCAM表達(dá)的乳頭狀細(xì)胞系TPC-I和退行發(fā)育性細(xì)胞系CAL-62對VB4-845無反應(yīng)。用VB6-845治療的相同細(xì)胞系中觀察到類似結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。甲狀腺癌細(xì)胞系中VB4-845對細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)VB4-845治療的甲狀腺癌細(xì)胞通過FACS進(jìn)行的細(xì)胞周期分析顯示時(shí)間依賴性地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，反映在與TT和TPC-I細(xì)胞相比，WRO和陽性對照ARO細(xì)胞中的subGO部分顯著增加。還在用不同濃度的VB4-845治療前后，通過蛋白質(zhì)印跡法測定了細(xì)胞系中VB4-845對EpCAM表達(dá)的作用。圖8表示用免疫毒素治療的WRO細(xì)胞中EpCAM表達(dá)的劑量依賴性降低；未治療或VB4-845治療的TPC-I細(xì)胞中未檢測到EpCAM表達(dá)。由免疫毒素和EpCAM結(jié)合引起的VB4-845細(xì)胞毒性免疫毒素VB4-845是將抗EpCAM單鏈可變片段與假單胞菌屬(Pseuodomonas)外毒素A的毒性結(jié)合的重組融合蛋白。蛋白質(zhì)的側(cè)翼是2個六聚組氨酸(hexahistinide)標(biāo)簽。正如在流式細(xì)胞術(shù)測定中測定的一樣，在與VB4-845溫育2小時(shí)后，在具有EpCAM表達(dá)的細(xì)胞中檢出抗His抗體。將TPC-I細(xì)胞(106)注射給6周齡SCID小鼠。4周后，每2天給每個腫瘤的腫瘤周注射含7. 5ug VB4的IOOul PBS。約2周后，小鼠主要因腫瘤過大而處死。測量腫瘤的大小，并在VB4治療和PBS治療之間進(jìn)行比較。還在體內(nèi)和體外兩種情況下篩選TPC-I的EpCAM表達(dá)。因腫大小各異，因此將腫瘤體積轉(zhuǎn)化成百分比。至于VB4治療，10個之中有4個腫瘤縮小(圖9 (A))，而在PBS組中8個之中僅I個腫瘤縮小(圖9 (B))。實(shí)施例3 在本實(shí)施例描述的研究中采用下列材料與方法?；颊吆徒M織樣品研究獲加拿大多倫多辛乃山醫(yī)院研究倫理理事會批準(zhǔn)。對于IHC分析，從腫瘤庫提取正常甲狀腺組織(N = 9)、非腫瘤性-增生性/膠質(zhì)結(jié)節(jié)(N= I)、甲狀腺乳頭狀癌(PTC, N = 86)、甲狀腺濾泡癌(FTC，N = 2)、分化差的PTC (N = I)、分化差的FTC (N = I),甲狀腺髓樣癌(N = 3)、島狀癌(N = 6)、SCC(N = 4)、退行發(fā)育性甲狀腺癌(N = 11)的存檔組織塊，由病理學(xué)家檢查，并用于切取組織切片，用下文所述Ep-I⑶和EpEx(Moc31)抗體進(jìn)行免疫染色。
以下是對研究結(jié)果的論述。散點(diǎn)圖分析圖10-14中的散點(diǎn)圖表示在正常甲狀腺組織和所分析的9個甲狀腺腫瘤組織亞型中Ep-I⑶和EpEx膜/胞質(zhì)/核免疫組織化學(xué)染色評分的分布。ATC和SCC組顯示膜EpEx染色顯著減少，平均評分小于4，島狀癌顯示膜EpEx中等減少。值得注意的是，ATC顯示EpEx喪失，膜IHC評分小于I (圖10)。與正常甲狀腺組織組類似，其它較少侵襲性甲狀腺腫瘤亞型顯示強(qiáng)的EpEx膜染色，平均IHC評分大于6 (圖10)。在對EpEx胞質(zhì)染色的觀察中(圖11)，與正常甲狀腺組類似，比起較大侵襲性甲狀腺癌亞型(包括ATC、SCC和島狀癌亞型)，一些較少侵襲性甲狀腺癌亞型(例如PTC、FTC)顯示較強(qiáng)的EpEx染色。ATC組顯示無可檢測的低EpEx染色或微弱的免疫反應(yīng)性。重要的是，使用對EpCAM的胞內(nèi)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(Ερ-ICD)有特異性的抗體，圖12和圖13所示的膜染色，表示在所有甲狀腺腫瘤亞型和另在正常甲狀腺組中觀察到的IHC評分為 4-5的平均表達(dá)水平。所檢查的11個ATC組織塊中有10個觀察到核Ep-I⑶染色增加(大于截?cái)嘀滇?)(圖14)，平均染色評分為4. 7。在較少侵襲性亞型SCC組中，4例中有2例顯示達(dá)到截?cái)嘀?的核Ep-I⑶染色。在所有86個PTC組織塊中，大部分腫瘤顯示非常低的EpICD核染色，平均評分為O. 6 (表2)，與正常組相似。其它亞型例如HP、FTC、PDPTC、PDFTC、MTC、島狀癌，全都顯示低水平的EpI⑶核染色，Ep-I⑶核表達(dá)評分介于0-2之間(圖14)。甲狀腺腫瘤中Ep-I⑶和EpEx表達(dá)的免疫組織化學(xué)分析在所比較的2個腫瘤甲狀腺癌亞型(甲狀腺乳頭狀癌和退行發(fā)育性甲狀腺癌)中(表2)，ATC組表明當(dāng)選擇截?cái)嘀滇?以確定陽性時(shí)，11個組織塊中10個(90. 9% )為核Ep-I⑶陽性，而所有11個組織在截?cái)嘀?lt; 4時(shí)顯示EpEx膜表達(dá)喪失。86個PTC組織中僅I個(I. 2% )顯示核Ep-I⑶陽性。在PTC中4. 5的核EpI⑶高評分與臨床史的相關(guān)性顯示患者為35歲男性，并具有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的證據(jù)。核Ep-I⑶評分為3的另一名PTC患者患有轉(zhuǎn)移性胰腺癌伴發(fā)膿毒癥。Ep-I⑶和EpEx IHC染色評分在PTC和ATC組間顯著不同，將侵襲性與非侵襲性甲狀腺癌(TC)相區(qū)別。ROC曲線分析繪制膜EpEx和核Ep-I⑶的ROC曲線以將最大侵襲性甲狀腺癌亞型ATC與最常觀察到的但非侵襲性甲狀腺癌亞型PTC區(qū)別開來(圖15和16)。ROC分析的結(jié)果概括于表4。在彡4的截?cái)嘀迪?，核Ep-I⑶蓄積將ATC與PTC相區(qū)別，靈敏度為90. 9%，特異性為98. 8%,AUC為O. 9931 (圖15和表4)。這就表明高水平的核EpI⑶蓄積具有用作區(qū)分侵襲性與其它非侵襲性甲狀腺癌亞型的良好生物標(biāo)記的潛力。如圖15和表5中所示，當(dāng)選擇核EpI⑶IHC染色評分的截?cái)嘀到橛?. 5-4之間時(shí)，該生物標(biāo)記(核EpI⑶)可以90-100%的高靈敏度和95-98%的高特異性將ATC與PTC區(qū)別開來。在< 4的截?cái)嘀迪拢pEx表達(dá)喪失還可以100%的高靈敏度、98. 8%的高特異性和O. 914的AUC值將所有ATC病例與PTC區(qū)別開來(圖16和表6)。陽性預(yù)測值為91. 67%，陰性預(yù)測值為100% (圖16和表6)。如圖16和表7所示，選擇EpEx膜IHC染色評分的截?cái)嘀到橛?. 5_5之間，該生物標(biāo)記(膜EpEx)可以90-100%的高靈敏度和95-100%的高特異性將ATC與PTC區(qū)別開來。實(shí)施例4菲律賓人甲狀腺癌研究觀察到菲律賓人群具有較高的甲狀腺癌發(fā)病率，并且腫瘤比非菲律賓患者的腫瘤更具侵襲性。在菲律賓患者的侵襲性和非侵襲性甲狀腺癌中對EpEx和Ep-ICD的表達(dá)進(jìn)行了分析。給出結(jié)果如下。菲律賓人甲狀腺腫瘤中Ep-I⑶表達(dá)的免疫組織化學(xué)分析在IHC評分截?cái)嘀禐?時(shí)，在所比較的3個腫瘤組中(表3)，侵襲性惡性腫瘤組在10個組織中有7個顯示核Ep-I⑶陽性，10個組織中有6個顯示EpEx膜表達(dá)喪失。在所分析的9個良性腫瘤病例和11個非侵襲性惡性病例的任一個中未觀察到EpEx膜表達(dá)喪失。非侵襲性甲狀腺癌不顯示核Ep-I⑶陽性，且所分析的9個良性腫瘤中僅I個顯示核Ep-I⑶陽性。圖17所示顯微照片表示良性甲狀腺腫瘤(A)和非侵襲性惡性腫瘤(C)中的膜EpEx表達(dá)，在所有10個甲狀腺侵襲性惡性腫瘤病例的某些區(qū)域(E、G)中觀察到EpEx膜表達(dá)喪失。在甲狀腺侵襲性惡性腫瘤(F、H)中觀察到Ep-I⑶核表達(dá)，但在良性腫瘤組和非侵襲性惡性腫瘤組(B、D)中未觀察到。箱形圖分析
·
圖18和19的散點(diǎn)圖以及圖21A和21B及圖22A和22B的箱形圖顯示所分析的3組(共30病例)菲律賓人甲狀腺腫瘤病例中膜EpEx和核Ep-ICD染色評分的分布。在所檢查的10例侵襲性惡性腫瘤中有7例發(fā)現(xiàn)核Ep-I⑶染色增加(超過截?cái)嘀?gt; 4)(圖22B)，平均染色評分為4. 3。在9例良性腫瘤中僅觀察到I例達(dá)到截?cái)嘀?gt; 4的核Ep-ICD染色，11個非侵襲性惡性腫瘤組織中無一觀察到達(dá)到截?cái)嘀?gt; 4的核Ep-ICD染色。所檢查的全部9個良性甲狀腺腫瘤組織和全部11例非侵襲性惡性腫瘤顯示高水平膜EpEx染色，平均分值約為7分(圖21 (A))。在2/3侵襲性惡性病例中觀察到膜EpEx表達(dá)喪失(圖22A.)。ROC曲線分析繪制膜EpEx和核Ep-I⑶的ROC曲線以將惡性甲狀腺腫瘤與良性腫瘤區(qū)別開來(圖20A、B)，并且還將侵襲性惡性腫瘤與非侵襲性腫瘤區(qū)別開來(圖20C，D)。包括相關(guān)ROC分析的結(jié)果概括于表8。核Ep-ICD蓄積以33. 33%靈敏度、88. 89%的特異性和O. 703的AUC值將甲狀腺惡性腫瘤與良性腫瘤區(qū)別開來。核Ep-I⑶蓄積以80%靈敏度、100%的特異性和I. O的AUC將侵襲性甲狀腺惡性腫瘤與非侵襲性癌區(qū)別開來(表8)。膜EpEx表達(dá)喪失以28. 57%靈敏度、100%的特異性和O. 857的AUC值將甲狀腺惡性腫瘤與良性腫瘤區(qū)別開來。核Ep-I⑶蓄積以60 %靈敏度、100 %的特異性和O. 914的AUC將侵襲性甲狀腺惡性腫瘤與非侵襲性癌區(qū)別開來(表8)。表I已知的針對EpCAM的抗體
權(quán)利要求
1.一種用于檢測受試者的與甲狀腺癌有關(guān)的甲狀腺癌標(biāo)志物的方法，所述方法包括或基本由以下步驟組成 (a)從患者中獲得樣品； (b)檢測或鑒定樣品中的ー種或多種甲狀腺癌標(biāo)志物；和 (C)將檢測到的量與對標(biāo)準(zhǔn)物檢測到的量進(jìn)行比較，其中所述甲狀腺癌標(biāo)志物是Ep-ICD和/或β-聯(lián)蛋白。
2.ー種用于診斷甲狀腺癌的方法，所述方法包括比較 (a)從受試者的樣品中提取的甲狀腺癌標(biāo)志物的水平；和 (b)對照樣品中甲狀腺癌標(biāo)志物的水平，其中甲狀腺癌標(biāo)志物的水平相對于對照的相應(yīng)水平的顯著差異表明甲狀腺癌，其中所述甲狀腺癌標(biāo)志物是Ep-ICD、β_聯(lián)蛋白和任選EpEx0
3.權(quán)利要求I或2的方法，其中所述受試者有患甲狀腺癌的風(fēng)險(xiǎn)或需要篩查。
4.ー種用于對甲狀腺樣品進(jìn)行表征或分類的方法，所述方法包括檢測甲狀腺癌標(biāo)志物的表達(dá)相對于對照的差異，其中所述甲狀腺癌標(biāo)志物是Ep-I⑶、β -聯(lián)蛋白和任選ΕρΕχ。
5.一種診斷受試者的甲狀腺癌的特定疾病期的方法，所述方法包括測定獲自受試者的樣品中甲狀腺癌標(biāo)志物的狀態(tài)，其中所述標(biāo)志物的異常狀態(tài)表明存在特定疾病期，并且其中所述甲狀腺癌標(biāo)志物是Ep-I⑶或β-聯(lián)蛋白。
6.ー種用于鑒定作為甲狀腺癌治療的候選者的受試者的診斷方法，所述方法包括測定獲自受試者的樣品中甲狀腺癌標(biāo)志物的狀態(tài)，其中樣品中甲狀腺癌標(biāo)志物的異常狀態(tài)表明治療是需要的或必需的，且其中所述甲狀腺癌標(biāo)志物是Ep-I⑶、β -聯(lián)蛋白和任選ΕρΕχ。
7.權(quán)利要求5或6的方法，其中所述異常狀態(tài)可以是高狀態(tài)、低狀態(tài)或負(fù)狀態(tài)。
8.一種用于診斷受試者的甲狀腺癌的侵襲性或轉(zhuǎn)移潛力的方法，所述方法包括 (a)從受試者中獲得樣品； (b)檢測樣品中的甲狀腺癌標(biāo)志物；和 (C)將檢測到的量與對標(biāo)準(zhǔn)物檢測到的量進(jìn)行比較，其中所述甲狀腺癌標(biāo)志物是Ep-ICD和/或β-聯(lián)蛋白。
9.權(quán)利要求I或8的方法，其中所述標(biāo)準(zhǔn)物或?qū)φ瞻ㄔ诨驾^低級別甲狀腺癌的受試者中檢測到的水平或量。
10.一種用于診斷受試者的退行發(fā)育性甲狀腺癌(ATC)的方法，所述方法包括 (a)使得自受試者的樣品與能夠測量目標(biāo)甲狀腺癌標(biāo)志物水平的試劑接觸，其中所述甲狀腺癌標(biāo)志物是Ep-I⑶、β -聯(lián)蛋白和任選EpEx ;和 (b)根據(jù)與得自取自未患ATC的受試者或在不同時(shí)間取自受試者的類似樣品的對照水平相比，受試者樣品中Ep-I⑶和β -聯(lián)蛋白中的至少ー種的水平升高和任選EpEx降低，提供在所述受試者中的ATC的診斷。
11.一種用于監(jiān)測受試者的甲狀腺癌進(jìn)展的方法，所述方法包括(a)檢測在第一時(shí)間點(diǎn)來自患者的樣品中的甲狀腺癌標(biāo)志物；(b)在隨后的時(shí)間點(diǎn)重復(fù)步驟(a);和(C)將步驟(a)和(b)中檢測到的水平進(jìn)行比較，從而監(jiān)測癌癥的進(jìn)展，其中所述甲狀腺癌標(biāo)志物是Ep-ICD或β-聯(lián)蛋白。
12.權(quán)利要求1-11中任ー項(xiàng)的方法，其中所述甲狀腺癌標(biāo)志物是通過下列步驟檢測的多肽 (a)使樣品與特異性結(jié)合多肽或其組成部分的結(jié)合劑接觸；和 (b)檢測樣品中相對于預(yù)先確定的標(biāo)準(zhǔn)的與結(jié)合劑結(jié)合的多肽量。
13.一種用于檢測或診斷受試者的侵襲性甲狀腺癌或具有轉(zhuǎn)移潛力的甲狀腺癌的存在情況的方法，所述方法包括以下步驟 (a)提供與甲狀腺癌標(biāo)志物特異性結(jié)合的結(jié)合劑； (b)在允許形成包含結(jié)合劑和甲狀腺癌標(biāo)志物的復(fù)合物的條件下使結(jié)合劑與受試者的樣品接觸； (C)測定復(fù)合物的存在情況或量；和 (d)將所述量與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較以確定受試者的侵襲性甲狀腺癌或具有轉(zhuǎn)移潛力的甲狀腺癌的存在情況，其中所述甲狀腺癌標(biāo)志物是Ep-ICD或β -聯(lián)蛋白。
14.權(quán)利要求12或13的方法，其中所述結(jié)合劑是抗體。
15.權(quán)利要求1-11中任ー項(xiàng)的方法，其中所述甲狀腺癌標(biāo)志物是多核苷酸。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述多核苷酸是mRNA或其片段。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述多核苷酸通過以下步驟檢測 (a)使樣品同與所述多核苷酸雜交的寡核苷酸接觸；和 (b)檢測樣品中相對于預(yù)先確定的標(biāo)準(zhǔn)或截?cái)嘀档呐c所述多核苷酸雜交的核酸水平，由此確定受試者的甲狀腺癌存在與否。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述mRNA采用擴(kuò)增反應(yīng)檢測。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述擴(kuò)增反應(yīng)是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其利用與所述多核苷酸或所述多核苷酸的互補(bǔ)序列雜交的寡核苷酸引物。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述多核苷酸采用RT-PCR檢測。
21.權(quán)利要求16的方法，其中所述mRNA采用雜交技術(shù)檢測，所述雜交技術(shù)利用與所述多核苷酸或所述多核苷酸的互補(bǔ)序列雜交的寡核苷酸探針。
22.一種用于評價(jià)試驗(yàn)物質(zhì)抑制受試者的甲狀腺癌的潛在功效的方法，所述方法包括比較(a)獲自受試者并暴露于試驗(yàn)物質(zhì)的第一樣品中ー種或多種甲狀腺癌標(biāo)志物的水平，其中所述甲狀腺癌標(biāo)志物是Ep-ICD和/或β-聯(lián)蛋白，和(b)獲自受試者的第二樣品中甲狀腺癌標(biāo)志物的水平，其中所述樣品不暴露于試驗(yàn)物質(zhì)，其中第一樣品相對于第二樣品在甲狀腺癌標(biāo)志物的表達(dá)水平方面的顯著差異，表明試驗(yàn)物質(zhì)潛在對抑制受試者的甲狀腺癌有效。
23.ー種選擇用于抑制受試者的甲狀腺癌的物質(zhì)的方法，所述方法包括(a)從受試者中獲得包含癌細(xì)胞的樣品；(b)分別在多種試驗(yàn)物質(zhì)存在下暴露樣品的等分部分；(C)將各等分部分中的ー種或多種甲狀腺癌標(biāo)志物的水平進(jìn)行比較；和(d)選出ー種試驗(yàn)物質(zhì)，其相對于其它試驗(yàn)物質(zhì)改變含有該試驗(yàn)物質(zhì)的等分部分中的甲狀腺癌標(biāo)志物水平，其中所述甲狀腺癌標(biāo)志物是Ep-I⑶和/或β -聯(lián)蛋白。
24.權(quán)利要求23的方法，其還包括將相對于其它試驗(yàn)物質(zhì)改變含有該試驗(yàn)物質(zhì)的等分部分中的甲狀腺癌標(biāo)志物水平的至少ー種試驗(yàn)物質(zhì)給予受試者。
25.ー種評價(jià)試驗(yàn)化合物的甲狀腺癌細(xì)胞致癌潛力的方法，所述方法包括(a)在試驗(yàn)化合物存在和不存在的情況下維持単獨(dú)的甲狀腺癌細(xì)胞等分部分；和(b)將各等分部分中的ー種或多種甲狀腺癌標(biāo)志物的表達(dá)進(jìn)行比較，其中在試驗(yàn)化合物存在下維持的等分部分相對于在不存在試驗(yàn)化合物的情況下維持的等分部分在甲狀腺癌標(biāo)志物水平方面的顯著差異，表明試驗(yàn)化合物具有甲狀腺癌細(xì)胞致癌潛力，其中所述甲狀腺癌標(biāo)志物是Ep-ICD和/或β_聯(lián)蛋白。
26.權(quán)利要求1-21中任ー項(xiàng)要求保護(hù)的方法，其中所述樣品獲自組織、提取物、細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)胞裂解物、灌洗液或生理流體。
27.權(quán)利要求26要求保護(hù)的方法，其中所述樣品獲自腫瘤組織。
28.一種用于檢測和/或診斷侵襲性甲狀腺癌或具有轉(zhuǎn)移潛力的甲狀腺癌的試劑盒，所述試劑盒包括與甲狀腺癌標(biāo)志物結(jié)合的結(jié)合劑或與編碼甲狀腺癌標(biāo)志物的多核苷酸雜交或擴(kuò)增所述多核苷酸的物質(zhì)，其中所述甲狀腺癌標(biāo)志物是Ep-ICD或β -聯(lián)蛋白。
29.抗體用于檢測和/或診斷甲狀腺癌的侵襲性或轉(zhuǎn)移潛力的用途，所述抗體與甲狀腺癌標(biāo)志物或以下多核苷酸結(jié)合，所述多核苷酸與編碼甲狀腺癌標(biāo)志物的多核苷酸雜交或擴(kuò)增編碼甲狀腺癌標(biāo)志物的多核苷酸，其中所述甲狀腺癌標(biāo)志物是Ep-ICD或β -聯(lián)蛋白。
30.ー種用于檢測和/或診斷甲狀腺癌的侵襲性或轉(zhuǎn)移潛力的組合物，其包含抗體，所述抗體與甲狀腺癌標(biāo)志物或以下多核苷酸結(jié)合，所述多核苷酸與編碼甲狀腺癌標(biāo)志物的多核苷酸雜交或擴(kuò)增編碼甲狀腺癌標(biāo)志物的多核苷酸，其中所述甲狀腺癌標(biāo)志物是Ep-ICD或聯(lián)蛋白。
31.一種治療受試者的甲狀腺癌的方法，所述方法包括將對Ep-CAM、Ep-I⑶或β-聯(lián)蛋白有特異性的抗體遞送給有需要的受試者。
全文摘要
本文描述了用于檢測、診斷和監(jiān)測受試者的甲狀腺癌的方法，其包括測定在受試者的樣品中的包括Ep-ICD和β-聯(lián)蛋白在內(nèi)的標(biāo)志物。本發(fā)明還提供用于實(shí)施本發(fā)明方法的試劑盒和組合物。
文檔編號A61P35/00GK102844443SQ201080053701
公開日2012年12月26日 申請日期2010年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月21日
發(fā)明者保羅·沃爾菲什, 蘭巨·拉爾漢 申請人:保羅·沃爾菲什, 蘭巨·拉爾漢