專利名稱：用于神經(jīng)元特異性的體內(nèi)連續(xù)dopa合成的新型病毒載體構(gòu)建體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含編碼將在靶細(xì)胞中差異表達(dá)的兩種多肽的多核苷酸序列的病毒載體構(gòu)建體，尤其是單rAAV載體構(gòu)建體。本發(fā)明還涉及包含所述載體的藥物組合物，以及至人腦組織的遞送，并涉及所述載體用于治療與兒茶酚胺功能失調(diào)相關(guān)的疾病的醫(yī)療用途。具體地，本發(fā)明涉及對(duì)多巴胺缺乏相關(guān)的疾病，諸如帕金森氏病和相關(guān)功能障礙的治療。
背景技術(shù)：
帕金森氏病侵害30歲以上年齡的人。平均發(fā)病年齡為約60歲。主要的臨床癥狀是強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩和靜止性震顫。另外，該疾病可以表現(xiàn)出一系列其他癥狀諸如低血壓、認(rèn)知損害、姿勢(shì)不穩(wěn)定和許多其他癥狀。該疾病主要是由大腦中黑質(zhì)紋狀體多巴胺能系統(tǒng)(使用多巴胺(DA)作為其信號(hào)傳導(dǎo)物質(zhì)的神經(jīng)細(xì)胞，位于腦干的黑質(zhì)中，投射到殼核和尾狀核)的變性引起的基底神經(jīng)節(jié)功能障礙。該功能障礙在多年的時(shí)間內(nèi)是進(jìn)行性的。目前的治療標(biāo)準(zhǔn)基于通過添加L-多巴(其在腦中轉(zhuǎn)化為多巴胺)，或其他多巴胺受體刺激劑替代多巴胺。盡管目前針對(duì)多巴胺缺乏的替代的治療策略在疾病的早期階段經(jīng)常非常有效(至多達(dá)7-10年)，但最終大多數(shù)患者開始經(jīng)歷逐減的治療反應(yīng)和漸增的不良事件。這些中問題最大的是L-多巴誘發(fā)的運(yùn)動(dòng)障礙，該運(yùn)動(dòng)障礙似乎是采用目前的首選藥,L-多巴,或多巴胺激動(dòng)劑治療所導(dǎo)致的。由于歸因于近年來治療的改進(jìn),患有帕金森氏病的患者往往帶病存活越來越長的時(shí)間，L-多巴誘發(fā)的運(yùn)動(dòng)障礙尤其是對(duì)于疾病早發(fā)的患者帶來了越來越多的問題。目前對(duì)于運(yùn)動(dòng)障礙的治療選擇很少，并且這些治療經(jīng)常很復(fù)雜，并且其使用有限制。已經(jīng)在帕金森氏病的臨床前動(dòng)物模型中進(jìn)行測(cè)試的ー種方式是通過使用基因治療方式在多巴胺缺乏最多的殼核和尾狀核中獲得局部多巴胺替代來改進(jìn)經(jīng)典的藥理學(xué)多巴胺替代策略。該方式稱為“酶替代策略”。此治療的基本原理來源于對(duì)帕金森氏病(PD)患者的臨床觀察，所述臨床觀察提示由ロ服L-DOPA藥物治療誘發(fā)的嚴(yán)重異常不主運(yùn)動(dòng)(即，運(yùn)動(dòng)障礙)可以通過經(jīng)由靜脈內(nèi)或十二指腸途徑輸注L-DOPA或DA激動(dòng)劑來緩解。因此，目前的假說是運(yùn)動(dòng)障礙的發(fā)展至少部分歸因于ロ服L-DOPA遞送模式所產(chǎn)生的DA的間斷性脈沖式供應(yīng)。這些患者還通過大幅度減少在“關(guān)閉”狀態(tài)所花費(fèi)的總時(shí)間而從連續(xù)DA刺激受益。對(duì)于多巴胺的產(chǎn)生三種不同的酶是必不可少的，S卩，酪氨酸羥化酶(TH)，GTP-環(huán)化水解酶I(GCHl)和芳香族氨基酸脫羧酶(AADC)。前兩種調(diào)控由酪氨酸(ー種膳食氨基酸)產(chǎn)生L-DOPA，而AADC將L-DOPA轉(zhuǎn)化為多巴胺。這些酶中沒有一種對(duì)于多巴胺能神經(jīng)元是獨(dú)特的，而是也可以存在于非-多巴胺能細(xì)胞中。將這些酶添加至去神經(jīng)支配的靶區(qū)域可以導(dǎo)致局部產(chǎn)生L-DOPA或多巴胺。相對(duì)于常規(guī)的ロ服治療(其中L-DOPA血漿水平(以及腦水平)是波動(dòng)的)，這種策略的優(yōu)勢(shì)可以是其提供L-DOPA的持續(xù)產(chǎn)生。其還將治療局部化在需要替代的腦區(qū)域，而身體的其他部分不“被治療”，產(chǎn)生有利的效應(yīng)與副作用比。下面的評(píng)論提供了已發(fā)表的使用這種方式的臨床前數(shù)據(jù)I.通過使用多rAAV載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)可以在殼核和尾狀核中獲得所有三種基因的表達(dá)[Kaplitt MG，et al Long-term gene expression ana pnenotypiccorrection using adeno—associated virus vectors in the mammalian brain ；Nat Genet 1994 8 148-54 ； Man del RJ, et al Characterizat ion of intrastriatalrecombinant adeno—associated virus-mediated gene transfer of human tyrosinehydroxylase and human GTP—cyclohydrolase I in a rat model of Parkinson ! sdisease J Neurosci 1998 18 4271-84 ；Shen Y，et al Triple transduction with adeno—associated virus vectors expressing tyrosine hydroxylase,aromatic-L-amino~acid decarboxylase, and GTP cyclohydrolase I for gene therapyof Parkinsonr s disease ；Hum Gene Ther 2000111509-19].2. TH的效カ取決于GCHl (其產(chǎn)生輔因子四氫生物蝶呤，BH4)。Mandel及其同事已經(jīng)通過使用微量透析測(cè)量L-多巴的水平證明了此機(jī)制[Mandel RJ，et al Characterization οι intrastriatal recombinant adeno-associatedvirus-mediatedgene transfer of human tyrosine hydroxylase ana human GTP-cyclohydroIase I ina rat model of Parkinson' s disease ；.T Neurosci 1998 184271-84].3.在帕金森氏病的猴模型(MPTP-模型)中，AADC的表達(dá)可以導(dǎo)致ロ服L-多巴更有效的轉(zhuǎn)化，并且通過此機(jī)制改善了猴UPDRS運(yùn)動(dòng)評(píng)分(UPDRS是帕金森癥狀的標(biāo)準(zhǔn)臨床評(píng) 1介量表)中的功能[Bankiewicz KS, et al Long-term clinical improvementin MPTP-Iesioned primates after gene therapy with AAV-hAADC ；Mol Ther 2006 14564-70].4.所有三種基因的表達(dá)可以導(dǎo)致帕金森氏病的大鼠模型[Shen Y，et al iriple transduction with adeno—associated virus vectors expressing tyrosinehydroxylase, aromatic—L-amino—acid decarboxylase, and GTP eyelohydroIaseI forgene therapy of Parkinson' s disease ；Hum Gene Ther 2000 11 1509-19]和猴模型[Muramatsu S，et al !Behavioral recovery in a primate model of Parkinson' sdisease by triple trahsduction of striatal cells with adeno—associated viralvectors expressing dopamine-synthesizing enzymes. Hum Gene Ther 2002 13345-54]兩種模型中改善的功能。5. TH和GCHl的表達(dá)足以獲得可以導(dǎo)致帕金森氏病的大鼠模型中功能改善的紋狀體し-多巴水平并且還可以顯著地減少し-多巴誘發(fā)的運(yùn)動(dòng)障礙[Kirik D，et al:Reversal of motor impairments in parkinsonian rats by continuous intrastriataldelivery of L-dopa using rAAV-mediated gene transfer ；Proc Natl Acad Sci 200299 4708—13 ；Carlsson et al !Reversal of dyskinesias in an animal model ofParkinson' s disease by continuous L-DOPA delivery using rAAV vectors ；Brain2005128559-69]。然而，這些研究的進(jìn)行使用了兩個(gè)單獨(dú)的AAV血清型2載體，每個(gè)載體包含GCHl基因或TH基因，均在大的合成啟動(dòng)子(包含兔Y-球蛋白內(nèi)含子的雞b-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，其前面是來自巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子的增強(qiáng)子元件，稱為雞b-肌動(dòng)蛋白，CBA，啟動(dòng)子)的控制下。像這樣，就沒有辦法在細(xì)胞水平上控制兩種基因的表達(dá)比率；啟動(dòng)子也不可能使表達(dá)限于神經(jīng)元。關(guān)于本發(fā)明領(lǐng)域內(nèi)的現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)，Sun等人(2004)，記述了ー種非-AAV病毒表達(dá)載體，其具有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單元，每個(gè)都受神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子調(diào)控。其沒有描述兩個(gè)単元的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。在體外當(dāng)用3-基因和4-基因載體兩者轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)表達(dá)TH和GCH-I的細(xì)胞的量相當(dāng)。在兩種情況下，TH和GCH-I均在不同的轉(zhuǎn)錄物上。在4-基因載體中，GCH-I從IRES位點(diǎn)(在VMAT-20RF之后)翻譯。
Shen 等人 2000 記述了用 AAV-ΤΗ、AAV-AADC 和 AAV-GCH-I 共轉(zhuǎn)導(dǎo) HEK-293 細(xì)胞。在滴定研究中，293細(xì)胞用AAV-TH和AAV-AADC以及不同量的AAV-GCH-I轉(zhuǎn)導(dǎo)。結(jié)果顯示隨著AAV-GCH-I的滴度增加L-多巴和多巴胺兩者均增加。AAVGCH-I以最多與AAV-TH相同的滴度測(cè)試。所記載的比率為I : 10、I 2和I : UAAV-GCH-I AAV-ΤΗ)。以I : I比率的兩種載體(具有和不具有AAV-AADC)進(jìn)行體內(nèi)基因治療。Kirik 等人，2002 和 Carlsson 等人 2005 記述了 AAV-TH 和 AAVGCH1 的 I : I 混合物的共同給藥，其中AAV-TH的滴度為AAV-GCH-I的約3. 5倍(I 3.5的比率)。這些文獻(xiàn)中沒有一篇說明為什么使用這種比率。US 7，419，829 (Oxford Biomedica)記述了一種突變的WPRE元件及其在三基因載體(EIAV)中的用途，在該載體中TH、AADC和GCH-I被IRES序列分開。該WPRE元件可以將三種基因的表達(dá)提高到相同的程度。WO 96/05319 (Arch Development)記述了雙順反子載體,其在5’逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR中具有IRES位點(diǎn)或啟動(dòng)子，其控制上游和下游順反子兩者的表達(dá)。在采用成纖維細(xì)胞的雙重轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，他們公開了 TH活性為242. 6pmol/mg/min以及GCHl活性為35. 8pmol/mg/min?；诨钚?，這轉(zhuǎn)換為兩種酶之間I : 6. 8的比率。另外，該文獻(xiàn)記述了為實(shí)現(xiàn)最大TH活性的最適BH4濃度(500QM)。TH轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中超過50QM BH4時(shí)L-DOPA的濃度最大，并且使用更高濃度的BH4不會(huì)進(jìn)ー步增加。上面提及的參考文獻(xiàn)中沒有一篇記述了具有編碼TH和GCH-I兩者的構(gòu)建體的AAV載體。現(xiàn)有技術(shù)中所有的編碼TH和GCH-I兩者的單載體系統(tǒng)均在包含大得多的核酸片段的病毒載體中制備?，F(xiàn)有技術(shù)的單載體系統(tǒng)大多數(shù)另外包含編碼AADC的表達(dá)構(gòu)建體。對(duì)于臨床目的來說，AAV載體相對(duì)于基于HSV、EIAV和逆轉(zhuǎn)錄病毒的單載體系統(tǒng)存在許多優(yōu)勢(shì)。另外，缺少AADC也是相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的ー個(gè)優(yōu)勢(shì)，因?yàn)檫@導(dǎo)致轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中生成L-DOPA而不是生成DA。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是開發(fā)用于治療現(xiàn)有治療策略不足或現(xiàn)有治療與嚴(yán)重的副作用有關(guān)和/或被治療的個(gè)體發(fā)生針對(duì)所述治療的耐受性的功能障礙的新型分子工具。更具體地，本發(fā)明涉及ー種新型表達(dá)構(gòu)建體，其調(diào)控參與兒茶酚胺生物合成的酶的水平，因此在用于在需要的受試者中恢復(fù)正常兒茶酚胺平衡的方法中是有用的。具體地，本發(fā)明涉及所述表達(dá)構(gòu)建體在神經(jīng)功能障礙的治療方法中的用途，所述神經(jīng)功能障礙優(yōu)選不可治愈的退行性神經(jīng)功能障礙，其中大多數(shù)患者在延長的治療期間經(jīng)歷逐減的治療反應(yīng)和漸增的不良事件。本發(fā)明主要涉及帕金森氏病的治療，其中現(xiàn)有治療策略涉及L-DOPA或其他多巴胺受體刺激劑的給藥?，F(xiàn)有治療尤其在該疾病的早期階段有效，但在延長的治療期間大多數(shù)患者發(fā)生L-多巴誘發(fā)的運(yùn)動(dòng)障礙。運(yùn)動(dòng)障礙的發(fā)展據(jù)認(rèn)為與L-DOPA或其他多巴胺受體刺激劑的非連續(xù)遞送有關(guān)。本發(fā)明的主要目的是通過以減少任何不良反應(yīng)的連續(xù)速率向需要的部位局部供應(yīng)對(duì)于特別是帕金森氏病的治療所必需的化合物來改進(jìn)現(xiàn)有治療。
本發(fā)明涉及一種將被局部施用至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的單載體表達(dá)系統(tǒng)，其包含編碼兩種多肽的兩種多核苷酸，其中所述載體表達(dá)系統(tǒng)能夠差異性地表達(dá)兩種編碼的多肽，從而 獲得對(duì)于給定神經(jīng)功能障礙的最佳治療必需的被表達(dá)多肽的準(zhǔn)確比例。在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種單載體表達(dá)系統(tǒng)，其包含a)第一和第二表達(dá)盒,所述第一表達(dá)盒包含核苷酸序列,所述核苷酸序列包含與第一核苷酸序列可操作地連接的第一啟動(dòng)子序列，所述第一核苷酸序列編碼GTP-環(huán)化水解酶I(GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，并且其中所述第二表達(dá)盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含與第二核苷酸序列可操作地連接的第二啟動(dòng)子序列，所述第二核苷酸序列編碼酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，以所述載體不包含編碼芳香族氨基酸脫羧酶(AADC)多肽的核苷酸序列為條件，或b)第一和第二表達(dá)盒，所述第一表達(dá)盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含與第一核苷酸序列可操作地連接的第一啟動(dòng)子序列，所述第一核苷酸序列編碼GTP-環(huán)化水解酶I(GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，并且其中所述第二表達(dá)盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含與第二核苷酸序列可操作地連接的第二啟動(dòng)子序列，所述第二核苷酸序列編碼酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，其中所述載體是腺相關(guān)病毒載體(AAV)，或c)表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含啟動(dòng)子、第一核苷酸序列、翻譯起始核苷酸序列諸如內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)和第二核苷酸序列，其中所述啟動(dòng)子與所述第一核苷酸序列可操作地連接，并且其中所述翻譯起始核苷酸序列連接所述第一和所述第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列編碼GTP-環(huán)化水解酶I (GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，并且其中所述第二核苷酸序列編碼酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，或d)表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含第一核苷酸序列、翻譯起始核苷酸序列諸如內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)和第二核苷酸序列，其中所述翻譯起始核苷酸序列連接所述第一和所述第二核苷酸序列，并且其中包含所述第一核苷酸序列——所述第一核苷酸序列連接至所述翻譯起始核苷酸序列，所述翻譯起始核苷酸序列連接至所述第二核苷酸序列——的序列的側(cè)翼是5’和3’末端重復(fù)序列，并且其中所述第一核苷酸序列編碼GTP-環(huán)化水解酶I (GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，并且其中所述第二核苷酸序列編碼酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，其中所述末端重復(fù)序列包含能夠指導(dǎo)可操作地連接的多肽表達(dá)的序列。
在另ー個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種單載體表達(dá)系統(tǒng)，包含a)第一和第二表達(dá)盒,所述第一表達(dá)盒包含核苷酸序列,所述核苷酸序列包含與第一核苷酸序列可操作地連接的第一啟動(dòng)子序列，所述第一核苷酸序列編碼GTP-環(huán)化水解酶I(GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，其中所述多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由 SEQ ID NO. I、SEQID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 和 SEQID NO. 6組成的群組的多肽至少70%相同，并且其中所述第二表達(dá)盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含與第二核苷酸序列可操作地連接的第二啟動(dòng)子序列，所述第二核苷酸序列編碼酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，其中所述多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由 SEQID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10、SEQ IDNO. IUSEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 14組成的群組的多肽至少70%相同，條件是所述載體不包含編碼芳香族氨基酸脫羧酶(AADC)多肽的核苷酸序列，或b)第一和第二表達(dá)盒，所述第一表達(dá)盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含與第一核苷酸序列可操作地連接的第一啟動(dòng)子序列，所述第一核苷酸序列編碼GTP-環(huán)化水解酶I(GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，其中所述多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由 SEQ ID NO. I、SEQID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 和 SEQID NO. 6組成的群組的多肽至少70%相同，并且其中所述第二表達(dá)盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含與第二核苷酸序列可操作地連接的第二啟動(dòng)子序列，所述第二核苷酸序列編碼酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，其中所述多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由 SEQID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10、SEQ IDNO. IUSEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 14組成的群組的多肽至少70%相同，其中所述載體是腺相關(guān)病毒載體(AAV)，或c)表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含啟動(dòng)子、第一核苷酸序列、翻譯起始核苷酸序列諸如內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)和第二核苷酸序列，其中所述啟動(dòng)子與所述第一核苷酸序列可操作地連接，并且其中所述翻譯起始核苷酸序列連接所述第一和所述第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列編碼GTP-環(huán)化水解酶I (GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，其中所述多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2、SEQ IDNO. 3,SEQ ID NO. 4,SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6組成的群組的多肽至少70%相同，并且其中所述第二核苷酸序列編碼酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，其中所述多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14 組成的群組的多肽至少70%相同，或d)表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含第一核苷酸序列、翻譯起始核苷酸序列諸如內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)和第二核苷酸序列，其中所述翻譯起始核苷酸序列連接所述第一和所述第二核苷酸序列，并且其中包含所述第一核苷酸序列——所述第一核苷酸序列連接至所述翻譯起始核苷酸序列，所述翻譯起始核苷酸序列連接至所述第二核苷酸序列——的序列的側(cè)翼是5’和3’末端重復(fù)序列，并且其中所述第一核苷酸序列編碼GTP-環(huán)化水解酶I(GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，其中所述多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由 SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6組成的群組的多肽至少70%相同，并且其中所述第二核苷酸序列編碼酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，其中所述多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由 SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ IDNO. 12、SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 14組成的群組的多肽至少70%相同，其中所述末端重復(fù)序列包含能夠指導(dǎo)可操作地連接的多肽表達(dá)的序列。在某些實(shí)施方案中，載體可以是腺相關(guān)病毒載體(AAV)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中,本發(fā)明包括載體構(gòu)建體內(nèi)的調(diào)控元件，諸如土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)，以便調(diào)控編碼多肽的差異性表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，多肽的差異性表達(dá)對(duì)于DOPA的連續(xù)流動(dòng)以用于帕金森氏病的預(yù)期治療是有利的。所述載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，優(yōu)選在神經(jīng)元細(xì)胞中起作用也是有利的。其中有可能差異性地表達(dá)編碼兩種或更多種多肽的多核苷酸的單載體構(gòu)建體還可以用于其他應(yīng)用諸如治療其他功能障礙，其中需要兩種或更多種多肽之間的特異性化學(xué)計(jì)量。
在另ー個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種用于分別確定GTP環(huán)化水解酶I多肽(SEQ IDNOs. 1、2、3、4、5 和 6)與酪氨酸羥化酶多肽(SEQ ID NOs. 7、8、9、10、11、12、13 和 14)，或它們的變異體的表達(dá)比率的方法，所述多肽由如本文所定義的載體編碼，所述方法包括測(cè)量a.所述多肽的酶活性，或b.產(chǎn)生的BH4的量，或c.所述多肽的表達(dá)量，或d.分別與GTP環(huán)化水解酶I和酪氨酸羥化酶的多肽相對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄mRNA的水平。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所述比率優(yōu)選地通過確定表達(dá)的mRNA的量來測(cè)量，更優(yōu)選通過確定表達(dá)的蛋白的量或通過確定表達(dá)的TH(酪氨酸羥化酶)和GCHl (GTP環(huán)化水解酶I多肽)酶的活性來測(cè)量。表達(dá)的TH和GCHl酶的比率在15 : I至I : I之間，優(yōu)選在10 : I至3 : I之間，更優(yōu)選在8 : I至3 : I之間，更優(yōu)選在7 : I至4 : I之間，諸如在7 : I至5 : I之間，例如6 I。(詳見圖3)。在另ー個(gè)方面，本發(fā)明涉及分離的宿主細(xì)胞，其包含如本文以上定義的載體。在其他方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的載體表達(dá)系統(tǒng)、載體的多核苷酸和編碼的多肽的醫(yī)療用途。優(yōu)選地，所述醫(yī)療用途用于治療神經(jīng)系統(tǒng)的疾病、功能障礙或損害，更優(yōu)選治療退行性神經(jīng)功能障礙諸如帕金森氏病。在其他方面，本發(fā)明涉及用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的分離的宿主細(xì)胞，且涉及能夠產(chǎn)生本發(fā)明的感染性病毒顆粒的包裝細(xì)胞系。在ー個(gè)方面，本發(fā)明的載體用作藥劑。此外，本發(fā)明涉及ー種藥物組合物，其包含如本文以上定義的載體和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。在ー個(gè)方面，所述藥物組合物用于帕金森氏病的治療方法中，所述組合物包含單載體表達(dá)系統(tǒng)和用于將所述載體遞送至基底神經(jīng)節(jié)的制劑，其中所述單載體表達(dá)系統(tǒng)包含a)第一和第二表達(dá)盒，所述第一表達(dá)盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含與第一核苷酸序列可操作地連接的第一啟動(dòng)子序列，所述第一核苷酸序列編碼GTP-環(huán)化水解酶I(GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，并且其中所述第二表達(dá)盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含與第二核苷酸序列可操作地連接的第二啟動(dòng)子序列，所述第二核苷酸序列編碼酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，條件是所述載體不包含編碼芳香族氨基酸脫羧酶(AADC)多肽的核苷酸序列，或b)第一和第二表達(dá)盒，所述第一表達(dá)盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含與第一核苷酸序列可操作地連接的第一啟動(dòng)子序列，所述第一核苷酸序列編碼GTP-環(huán)化水解酶I(GCHl)多肽或其生物學(xué) 活性片段或變異體，并且其中所述第二表達(dá)盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含與第二核苷酸序列可操作地連接的第二啟動(dòng)子序列，所述第二核苷酸序列編碼酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，其中所述載體是腺相關(guān)病毒載體(AAV)，或c)表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含啟動(dòng)子、第一核苷酸序列、翻譯起始核苷酸序列諸如內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)和第二核苷酸序列，其中所述啟動(dòng)子與所述第一核苷酸序列可操作地連接，并且其中所述翻譯起始核苷酸序列連接所述第一和所述第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列編碼GTP-環(huán)化水解酶I (GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，并且其中所述第二核苷酸序列編碼酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，或d)表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含第一核苷酸序列、翻譯起始核苷酸序列諸如內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)和第二核苷酸序列，其中所述翻譯起始核苷酸序列連接所述第一和所述第二核苷酸序列，并且其中包含所述第一核苷酸序列——所述第一核苷酸序列連接至所述翻譯起始核苷酸序列，所述翻譯起始核苷酸序列連接至所述第二核苷酸序列——的序列的側(cè)翼是5’和3’末端重復(fù)序列，并且其中所述第一核苷酸序列編碼GTP-環(huán)化水解酶I (GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，并且其中所述第二核苷酸序列編碼酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，其中所述末端重復(fù)序列包含能夠指導(dǎo)可操作地連接的多肽表達(dá)的序列。在另ー個(gè)方面，本發(fā)明涉及施用本發(fā)明的藥物組合物的方法，其中所述藥物組合物通過注射、通過例如片劑ロ服、通過噴霧劑、經(jīng)皮膚或通過吸入給藥。所述注射優(yōu)選地是盧頁內(nèi)、腦內(nèi)、玻璃體內(nèi)、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、脊柱內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下或推注(bolus injection)或連續(xù)注射。還提供了ー種試劑盒，其包括本發(fā)明的藥物組合物，所述試劑盒還包括施用本發(fā)明的藥物組合物的說明書。


(A)本發(fā)明的連續(xù)DOPA-遞送策略的概況。⑶使用傳統(tǒng)雙_載體系統(tǒng)的比較實(shí)施例，所述雙-載體系統(tǒng)缺少控制GCH和TH的相對(duì)表達(dá)水平的可能性。Ml :載體構(gòu)建體。生成基因構(gòu)建體以從單載體基因組表達(dá)酪氨酸羥化酶(TH)和GTP環(huán)化水解酶I (GCH-I)兩者。為了實(shí)現(xiàn)超過GCHl基因的増加的TH表達(dá)，添加土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)。兩種基因受人突觸蛋白I啟動(dòng)子(SYN-I)驅(qū)動(dòng)，并且使用SV40多聚腺苷酸序列(pA)增強(qiáng)運(yùn)輸。完整的基因序列插入在來自AAV-血清型2的反向末端重復(fù)序列(ITR)之間。:對(duì)TH功能的BH4和GCHl依賴性的建模。在rAAV5_TH和rAAV5_GCHl載體以不同的比率混合的6組中，體內(nèi)和體外TG酶活性測(cè)量與TH蛋白測(cè)量的半定量Western印跡一起的數(shù)據(jù)值通過將數(shù)量歸ー化成Z-分值而統(tǒng)一成為單ー讀數(shù)變量。這產(chǎn)生可以直接進(jìn)行比較和建模的無因次量。(a)體內(nèi)和體外TH酶活性的以及TH蛋白水平的單個(gè)Z-分值，其作為rAAV5-TH和rAAV5_GCHl轉(zhuǎn)導(dǎo)后在DA耗竭的紋狀體中BH4合成的函數(shù)作圖。此運(yùn)算掲示當(dāng)作為紋狀體BH4水平的函數(shù)作圖時(shí)，來自三個(gè)測(cè)定的結(jié)果實(shí)際上匯集成ー個(gè)通用模式。(b)作為注射的gc rAAV5-GCHl的函數(shù)作圖的紋狀體BH4水平。紋狀體中的BH4水平不隨著rAAV5-GCHl的滴度增加而線性增加，而是顯示在3. 6E9gc以上明顯飽和。(c)將TH酶功能的三種實(shí)驗(yàn)的Z-分值聚合成單個(gè)模型，作為紋狀體BH4水平的函數(shù)作圖。(d)三次TH功能實(shí)驗(yàn)的平均Z-分值，其作為注射的rAAV5-GCHl的基因組拷貝數(shù)的函數(shù)作圖。B-D中的實(shí)線表示使用改良的列文伯格-馬夸爾特(Levenberg-Marquardt)算法,在應(yīng)用飽和模型I = Ax/ (B+x) +C之后實(shí)現(xiàn)的非線性擬合。
Mi :運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。在一系列行為實(shí)驗(yàn)中測(cè)試完全的單側(cè)DA去神經(jīng)支配的動(dòng)物。基于它們?cè)趫A筒實(shí)驗(yàn)(a)和藥物誘發(fā)的旋轉(zhuǎn)(d，e)中的能力，它們進(jìn)行假手術(shù)(shamsurgery) (Les-Sham組)或接受治療性單rAAV載體(TH-GCH1)。在圓筒實(shí)驗(yàn)(a)和踏步實(shí)驗(yàn)(b)中在5周內(nèi)發(fā)現(xiàn)TH-GCHl組中完全恢復(fù)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間保持了這種恢復(fù)。在走廊實(shí)驗(yàn)(C)中也發(fā)現(xiàn)這種恢復(fù)，而在安非他明(d)和阿樸嗎啡(e)誘發(fā)的旋轉(zhuǎn)中恢復(fù)是部分的。復(fù)雜運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)諸如在爬梯實(shí)驗(yàn)中也是顯著的(f)。* =與Les-Sham組顯著不同。圖5 :轉(zhuǎn)基因表汰和DA合成的事后分析(Post mortem analysis)。rAAV注射至6-0HDA引起損害的動(dòng)物中后6個(gè)月，使用免疫組織化學(xué)在生物化學(xué)上評(píng)價(jià)單rAAV TH-GCHl載體的功能。免疫組織化學(xué)掲示了 TH (a)和GCHl (b)轉(zhuǎn)基因兩者的穩(wěn)定表達(dá)。這種表達(dá)與DOPA (c中的實(shí)心條)和BH4(d中的實(shí)心條)兩者非常有效的生成相偶聯(lián)，達(dá)到比在未處理紋狀體中(d中的空心條)高得多的程度。多巴胺水平也顯著復(fù)原(e)并且中間代謝物DOPAC的水平恢復(fù)至正常的50% (f)，并且終末代謝物HVA (g)升高至正常水平的兩倍。Se :具有本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的構(gòu)建體的載體圖譜。Ml:關(guān)于運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的劑量響應(yīng)關(guān)系。在AAV注射前，完全的單側(cè)DA去神經(jīng)支配的動(dòng)物在走廊實(shí)驗(yàn)中測(cè)試(稱為損害基線)。此后，基于它們的能力，將它們平均分至4組中。所有發(fā)生損害的動(dòng)物接受等體積但濃度不斷増加的rAAV5-TH:GCHl載體[5 μ I]的立體定向注射。這形成下面的4個(gè)劑量組；O. 7% [9. lE8gc],3. 4% [4. 6E9gc],9. 8%[I. 3E10gc],100% [I. 3Ellgc]。包括相同大小的、未處理的、年齡匹配的對(duì)照組作為所有時(shí)間點(diǎn)處的參照。然后在AAV注射后12周時(shí)對(duì)動(dòng)物在走廊測(cè)試中再測(cè)試。在接受較高載體濃度的兩個(gè)治療組中觀察到完全恢復(fù)，即，低至I. 3E10gcrAAV5-TH:GCHl. 4. 6E9gc載體的劑量導(dǎo)致50%恢復(fù)，而源于9. IESgc劑量的恢復(fù)顯著較小。* =在兩維析因方差分析，然后Tukeyj s HSD事后檢驗(yàn)中顯著不同。M8 :細(xì)胞外多巴胺水平的微量透析定量。完全的單側(cè)DA去神經(jīng)支配的動(dòng)物分成兩組(TH-GCH1組和僅6-0HDA損害)。然后TH-GCHl組中的動(dòng)物接受全滴度rAAV5_TH: GCHl載體的立體定向注射。無損害的、未處理的年齡匹配的動(dòng)物也包括在該研究(未處理的對(duì)照(Intact Ctrl))中。至少6個(gè)月后，使用在線微量透析定量細(xì)胞外多巴胺水平。在損害對(duì)照組中細(xì)胞外多巴胺水平降低接近90%。另ー方面注射rAAV5-TH:GCHl后，細(xì)胞外多巴胺水平恢復(fù)至未處理動(dòng)物的兩倍以上。*=在單因素方差分析，然后Tukey’ s HSD事后檢驗(yàn)中，與損害對(duì)照顯著不同。定義激動(dòng)劑本文中使用的術(shù)語‘激動(dòng)劑’是指結(jié)合細(xì)胞的受體并引起細(xì)胞應(yīng)答的藥物。生物學(xué)活性:術(shù)語‘生物學(xué)活性’當(dāng)在本文中與由本發(fā)明的載體構(gòu)建體編碼的酶結(jié)合使用時(shí)，是指所述酶的酶活性，意指催化特定酶促反應(yīng)的能力。具體地，生物學(xué)活性是指酪氨酸羥化酶(TH)和GTP-環(huán)化水解酶(GCH-I)的酶活性。生物學(xué)活性片段:術(shù)語“生物學(xué)活性片段’當(dāng)在本文中使用時(shí)，是指包括酶的多肽的一部分，其分享全長多肽的生物學(xué)活性。片段的生物學(xué)活性可以比天然全長多肽的酶活性小、大或與其相同。生物學(xué)活性變異體:術(shù)語“生物學(xué)活性變異體’當(dāng)在本文中使用時(shí)，是指蛋白質(zhì)諸 如酶的多肽部分，其具有與天然全長蛋白相同的生物學(xué)活性。片段的生物學(xué)活性可以比天然全長多肽的酶活性小、大或與其相同。兒茶酚胺功能失調(diào):術(shù)語兒茶酚胺功能失調(diào)當(dāng)在本文中使用時(shí)是指與健康個(gè)體中的相同參數(shù)相比，兒茶酚胺合成、調(diào)節(jié)、儲(chǔ)存、釋放、攝取或代謝的異常。具體地，兒茶酚胺邊能失調(diào)是多巴胺功能失調(diào)，諸如多巴胺缺乏。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠診斷兒茶酚胺功能失調(diào)。認(rèn)知損害:本文中使用的術(shù)語‘認(rèn)知損害’是指具有不佳精神功能的狀況，與意識(shí)模糊、健忘和難以集中注意力有夫。保守置換本文定義的術(shù)語‘保守氨基酸置換’是指這樣的置換，通過所述置換，一個(gè)氨基酸置換另ー個(gè)具有ー種或多種共同的化學(xué)和/或物理特性的氨基酸。氨基酸可以根據(jù)共同的特性進(jìn)行分組。保守氨基酸置換是用預(yù)定的氨基酸組內(nèi)的一種氨基酸替換同一組內(nèi)另ー種氨基酸，其中預(yù)定組內(nèi)的氨基酸顯示出相似或基本相似的特性。功能障礙(disorder):本文使用的術(shù)語‘功能障礙’是指疾病或醫(yī)學(xué)問題，并且是損害身體功能的生物體的異常狀況，與特定的癥狀和體征有夫。其可以由外界因素諸如侵入的生物體導(dǎo)致，或其可以由內(nèi)部功能失調(diào)導(dǎo)致，諸如受損的兒茶酚胺產(chǎn)生或運(yùn)輸。具體地，功能障礙當(dāng)在本文中使用時(shí)是多巴胺產(chǎn)生的功能失調(diào)或多巴胺的異常生理濃度。表達(dá):編碼多肽的核酸序列的術(shù)語‘表達(dá)’意指該核酸序列轉(zhuǎn)錄為mRNA和/或該核酸序列的導(dǎo)致產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和翻譯。表達(dá)盒術(shù)語’表達(dá)盒‘當(dāng)在本文中使用時(shí)是指提供蛋白質(zhì)體內(nèi)合成所需的所有元件的基因組序列。這可以包括，但不一定限于，驅(qū)動(dòng)DNA轉(zhuǎn)錄為mRNA的序列，S卩，啟動(dòng)子序列，包括用于興趣蛋白的基因組序列的開放閱讀框和能夠使mRNA多聚腺苷酸化的3’非翻譯區(qū)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中起作用術(shù)語‘哺乳動(dòng)物細(xì)胞中起作用’當(dāng)在本文中使用時(shí)，意指當(dāng)被引入至哺乳動(dòng)物細(xì)胞中時(shí)導(dǎo)致翻譯成生物學(xué)活性多肽的序列，例如核苷酸序列諸如載體。基因治療本文使用的術(shù)語‘基因治療’是指將基因插入至個(gè)體的細(xì)胞和組織中以治療疾病。核酸序列:術(shù)語核酸序列當(dāng)在本文中使用時(shí)是指具有兩個(gè)或更多個(gè)的核苷酸堿基的單鏈或雙鏈，包括，不限干，脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、DNA或RNA的類似物、mRNA 和 cDNA。可操作地連接:術(shù)語‘可操作地連接’當(dāng)在本文中使用時(shí)表示編碼ー個(gè)或多個(gè)興趣多肽的核酸序列和轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列以下面的方式連接使得核酸序列當(dāng)被引入至細(xì)胞中時(shí)能夠表達(dá)。帕金森氏病:在本文中使用的術(shù)語‘帕金森氏病’(也稱為帕金森病或PD)是指中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性功能障礙，其經(jīng)常損害患者的運(yùn)動(dòng)技能、語言和其他功能。帕金森氏病屬于ー類稱為運(yùn)動(dòng)功能障礙的病癥。其特征為肌肉強(qiáng)直、震顫、身體運(yùn)動(dòng)遲緩，以及在極端的病例中，身體不能運(yùn)動(dòng)。ro是慢性的和進(jìn)行性二者的。藥用劑:術(shù)語’藥用劑‘或’藥物‘或’藥劑‘是指可以在患者的疾患(malady)、痛苦(afflication)、病癥(condition)、疾病(disease)或損傷(injury)的治療(包括預(yù)防、診斷、緩解或治愈)中使用的任何治療性或預(yù)防性試劑。治療上有用的遺傳決定子、肽、多肽和多核苷酸可以包含在術(shù)語藥品或藥物的含義范圍內(nèi)。當(dāng)在本文中使用吋，"治療剤”，"藥用劑"或"藥物"或“藥劑”是ー種生物活性剤。藥物組合物:或藥物、藥劑或試劑是指當(dāng)適宜地施用于患者時(shí)能夠引起期望的治療效應(yīng)的任何化學(xué)或生物學(xué)物質(zhì)、化合物或組合物。ー些藥物以無活性形式銷售，其在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為具有藥物活性的代謝物。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語"藥物組合物"和"藥劑"涵蓋無活性藥物和活性代謝物。Mk :術(shù)語’多肽‘當(dāng)在本文中使用時(shí)是指包含至少兩個(gè)氨基酸的分子。氨基酸可以是天然的或合成的?！央摹诒疚闹斜欢x為長度不大于100個(gè)氨基酸的多肽。術(shù)語“多肽”還意指包括蛋白質(zhì)，即，包含至少ー個(gè)多肽的功能性生物分子；當(dāng)包含至少兩個(gè)多肽時(shí)，這些可以形成復(fù)合體，共價(jià)連接或可以非共價(jià)連接。蛋白中的多肽可以被糖基化和/或被脂質(zhì)化和/或包含輔基。多核苷酸:本文使用的術(shù)語‘多核苷酸’是指這樣的分子，其是由在鏈中共價(jià)連接的核苷酸單體構(gòu)成的有機(jī)聚合物分子。“多核苷酸”當(dāng)在本文中使用時(shí)是指包含至少兩個(gè)核酸的分子。核酸可以是天然發(fā)生的或修飾的，諸如鎖核酸(LNA)，或肽核酸(PNA)。多核苷酸當(dāng)在本文中使用時(shí)通常屬于i)包含預(yù)定的編碼序列的多核苷酸，或ii)編碼預(yù)定的氨基酸序列的多核苷酸，或iii)編碼由多核苷酸⑴或(ii)編碼的多肽的片段的多核苷酸，其中所述片段具有如本文所規(guī)定的至少ー種預(yù)定的活性；和iv)其互補(bǔ)鏈在嚴(yán)格條件下與如(i)、(ii)和(iii)中任ー項(xiàng)所定義的多核苷酸雜交并編碼多肽或其片段的多核苷酸，所述多肽或其片段具有如本文所規(guī)定的至少ー種預(yù)定的活性；和V)包含與多核苷酸(iii)或(iv)的核苷酸序列簡(jiǎn)并的核苷酸序列的多核苷酸；或此類多核苷酸的互補(bǔ)鏈。啟動(dòng)子:本文使用的術(shù)語‘啟動(dòng)子’是指促進(jìn)特定基因轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)。啟動(dòng)子典型地位于它們調(diào)控的基因附近，在同一條鏈的上游。蛋白質(zhì):本文使用的術(shù)語‘蛋白質(zhì)’是指有機(jī)化合物，也稱作多肽，其是具有至少，和優(yōu)選地多于兩個(gè)氨基酸的肽。通用術(shù)語氨基酸包含天然氨基酸和非天然氨基酸兩者，它們中的任ー個(gè)可以是‘D’或‘L’異構(gòu)體形式。序列同一性在一個(gè)實(shí)施方案中序列同一性是通過利用神經(jīng)營養(yǎng)因子前體(proneurotrophin)活性調(diào)節(jié)肽的片段確定的,所述神經(jīng)營養(yǎng)因子前體活性調(diào)節(jié)肽包含至少25個(gè)連續(xù)氨基酸并且具有與本發(fā)明的任一 SEQ ID NO的氨基酸序列至少80%，諸如85%，例如90%，諸如95%，例如99%相同的氨基酸序列，其中同一性百分比用WisconsinGenetics Software Package Release 7. 0 中的算法 GAP、BESTFIT 或 FASTA 使用缺省空位權(quán)重(default gap weights)來確定。下面的術(shù)語用來描述兩個(gè)以上的多肽之間的序列關(guān)系"預(yù)定序列"、"比較窗"、"序列同一性"、"序列同一性百分比"和"實(shí)質(zhì)上的同一性"。"預(yù)定序列"是用作序列比較基礎(chǔ)的定義序列；預(yù)定序列可以是較大序列的子集，例如，作為在序列表中給出的全長DNA或基因序列的片段，所述全長DNA或基因序列諸如選自由 SEQ ID NO 15,SEQ ID NO 16, SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO :21和SEQ ID NO :22組成的群組的多核苷酸序列，或可以包含完整DNA或基因序列。通常，預(yù)定序列的長度為至少個(gè)20核苷酸，經(jīng)常為至少個(gè)25個(gè)核苷酸長度，并且常常為至少50個(gè)核苷酸長度。由于兩個(gè)多核苷酸可以每個(gè)⑴包含兩個(gè)多核苷酸之間相似的序列(即，完整多核苷酸序列的一部分)，和(2)可以進(jìn)一歩包含兩個(gè)多核苷酸之間不同的序列，兩個(gè)(或多個(gè))多核苷酸之間的序列比較典型地通過在“比較窗”內(nèi)比較兩個(gè)多核苷酸的序列來進(jìn)行，以鑒定和比較具有序列相似性的局部區(qū)域?！氨容^窗”當(dāng)在本文中使用時(shí)，是指至少20個(gè)連續(xù)核苷酸位置的概念片段，其中多核苷酸序列可以與至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的預(yù)定序列進(jìn)行比較，并且其中比較窗內(nèi)的多核苷酸序列部分可以包含與預(yù)定序列(不包含添加或缺失)相比20%以下的添加或缺失(即，空位)，用于兩個(gè)序列的最佳比對(duì)。用于比對(duì)比較窗的序列的最佳比對(duì)可以通過Smith和Waterman(1981)Adv. AppI.Math. 2 482 的局部同源性算法，通過 Needleman 和 Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48 443 的同源性比對(duì)算法，通過 Pearson 和 Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.) 85 :2444 的相似性搜索方法，通過這些算法的計(jì)算機(jī)化執(zhí)行(Wisconsin Genetics Software PackageRelease 7. 0 中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA，Genetics Computer Group,575ScienceDr. , Madison, Wis.),或通過仔細(xì)檢查進(jìn)行,并且選擇由各種方法生成的最佳比對(duì)(即，在比較窗內(nèi)產(chǎn)生最高的同源性百分比)。術(shù)語"序列同一性"是指在比較窗內(nèi)兩個(gè)多核苷酸序列是相同的(即，基于核苷酸-対-核苷酸比較)。術(shù)語"序列同一性百分比"通過如下計(jì)算在比較窗內(nèi)比較兩個(gè)最佳比對(duì)的序列，確定在兩個(gè)序列中出現(xiàn)相同核酸堿基(例如，A、T、C、G、U或I)的位置數(shù)目以產(chǎn)生匹配位置的數(shù)目，匹配位置的數(shù)目除以比較窗中的總位置數(shù)(即，窗ロ大小)，并將結(jié)果乘以100以產(chǎn)生序列同一性百分比。術(shù)語"實(shí)質(zhì)上的同一性"當(dāng)在本文中使用時(shí)表示多核苷酸序列的特性，其中所述多核苷酸包含這樣的序列，該序列與預(yù)定序列相比，在至少20個(gè)核苷酸位置的比較窗內(nèi)、經(jīng)常在至少25-50個(gè)核苷酸的比較窗內(nèi)具有至少85%序列同一性、優(yōu)選至少90至95%序列同一性、更普遍地至少99%序列同一性的序列，其中序列同一性百分比通過在比較窗內(nèi)將預(yù)定序列與多核苷酸序列比較來計(jì)算，所述多核苷酸序列可以包含預(yù)定序列的總計(jì)20%以下的缺失或添加。預(yù)定序列可以是較大序列的子集，例如，作為本文舉例說明的全長 SEQ ID NO 15,SEQ IDNO : 16、SEQ ID NO 17,SEQ ID NO 18,SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO :21 或 SEQ ID NO :22 多核苷酸序列的片段。當(dāng)應(yīng)用于多肽時(shí)，氨基酸序列的同一性程度是由氨基酸序列共享的位置處的相同氨基酸數(shù)目的函數(shù)。氨基酸序列的同源性或相似性程度是由氨基酸序列共享的位置處(即，結(jié)構(gòu)相關(guān)的)氨基酸數(shù)目的函數(shù)。術(shù)語“不相關(guān)的”或“非同源的”序列意指與另ー序列享有小于40%同一性的序列，盡管與本發(fā)明的多肽相比優(yōu)選小于25%。術(shù)語"實(shí)質(zhì)上的同一性"意指兩個(gè)肽序列，當(dāng)最佳比對(duì)時(shí)，諸如通過程序GAP或BESTFIT使用缺省空位權(quán)重比對(duì)，享有至少80%序列同一性，優(yōu)選至少90%序列同一性，更優(yōu)選至少95%序列同一性或更高的序列同一性(例如，99 %序列同一性)。優(yōu)選，不相同的殘基位置由于保守氨基酸置換而不同。
保守氨基酸置換是指具有相似側(cè)鏈的殘基的可交換性。例如，ー組具有脂族側(cè)鏈的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；ー組具有脂族-羥基側(cè)鏈的氨基酸是絲氨酸和蘇氨酸，ー組具有含酰胺側(cè)鏈的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；ー組具有芳族側(cè)鏈的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、和色氨酸；ー組具有堿性側(cè)鏈的氨基酸是賴氨酸、精氨酸和組氨酸；且ー組具有含硫側(cè)鏈的氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸置換組是纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。另外，基于如本文下面所定義的預(yù)定數(shù)目的保守氨基酸置換還確定了變異體。保守氨基酸置換當(dāng)在本文中使用時(shí)涉及一個(gè)氨基酸(預(yù)定的氨基酸組內(nèi))替換另一氨基酸(同一組內(nèi))，其中所述氨基酸顯示出相似或?qū)嵸|(zhì)上相似的特性。在如本文應(yīng)用的術(shù)語“保守氨基酸置換”的含義內(nèi)，在本文下面指出的氨基酸組內(nèi)，一種氨基酸可以替換另ー種氨基酸i)具有極性側(cè)鏈的氨基酸(Asp、Glu、Lys> Arg、His、Asn、Gin、Ser、Thr、Tyr 和Cys,)ii)具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe、Trp、Pro 和 Met)iii)具有脂族側(cè)鏈的氨基酸(Gly、Ala、Val、Leu、lie)iv)具有環(huán)狀側(cè)鏈的氨基酸(Phe、Tyr、Trp、His、Pro)V)具有芳族側(cè)鏈的氨基酸(Phe、Tyr、Trp)vi)具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(A sp, Glu)vii)具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(Lys、Arg、His)viii)具有酰胺側(cè)鏈的氨基酸(AsruGln)ix)具有輕基側(cè)鏈的氨基酸(Ser、Thr)X)具有含硫側(cè)鏈的氨基酸(Cys、Met),xi)中性、弱疏水性氨基酸(Pro、Ala、Gly、Ser、Thr)xii)親水性酸性氨基酸(Gin、Asn、Glu、Asp),和xiii)疏水性氨基酸(Leu、Ile、Val)因此，根據(jù)本發(fā)明，其變異體或片段可以在其序列或片段的相同變異體內(nèi)，或在其序列或片段的不同變異體之間，包含至少ー個(gè)置換，諸如彼此相獨(dú)立地引入的多個(gè)置換。從上面的概述中很明顯，相同變異體或其片段可以包含來自如本文上面所定義的ー個(gè)以上保守氨基酸組的ー個(gè)以上保守氨基酸置換。至少ー個(gè)氨基酸的添加或缺失可以是優(yōu)選2至250個(gè)氨基酸，諸如10至20個(gè)氨基酸，例如20至30個(gè)氨基酸，諸如40至50個(gè)氨基酸的添加或缺失。然而，50個(gè)氨基酸以上的添加或缺失，諸如50至100個(gè)氨基酸的添加，100至150個(gè)氨基酸的添加，150-250個(gè)氨基酸的添加，也包含在本發(fā)明內(nèi)。缺失和/或添加可以彼此相獨(dú)立地是序列內(nèi)和/或序列末端處的缺失和/或添加。根據(jù)本發(fā)明的多 肽片段，包括其任何功能性等效物，在一個(gè)實(shí)施方案中可以包含少于250個(gè)氨基酸殘基，諸如少于240個(gè)氨基酸殘基，例如少于225個(gè)氨基酸殘基，諸如少于200個(gè)氨基酸殘基，例如少于180個(gè)氨基酸殘基，諸如少于160個(gè)氨基酸殘基，例如少于150個(gè)氨基酸殘基，諸如少于140個(gè)氨基酸殘基，例如少于130個(gè)氨基酸殘基，諸如少于120個(gè)氨基酸殘基，例如少于110個(gè)氨基酸殘基，諸如少于100個(gè)氨基酸殘基，例如少于90個(gè)氨基酸殘基，諸如少于85個(gè)氨基酸殘基，例如少于80個(gè)氨基酸殘基，諸如少于75個(gè)氨基酸殘基，例如少于70個(gè)氨基酸殘基，諸如少于65個(gè)氨基酸殘基，例如少于60個(gè)氨基酸殘基，諸如少于55個(gè)氨基酸殘基，例如少于50個(gè)氨基酸殘基?！肮δ艿刃А碑?dāng)在本發(fā)明中使用時(shí)，根據(jù)ー個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，通過參照預(yù)定的序列片段的相應(yīng)功能性來確定。TH或GCH-I的功能等效物或變異體將被理解為，因?yàn)殡S著插入、缺失和包括保守置換的置換的數(shù)目和范圍增加而表現(xiàn)出與優(yōu)選的預(yù)定的TH或GCH-I序列逐漸不同的氨基酸序列。這種差異被測(cè)量為優(yōu)選的預(yù)定序列與片段或功能等效物之間的同源性下降。SEQ ID NO SEQ ID NO :1、SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO:5,SEQ ID NO 6,SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 10,SEQ ID NO :11、SEQ ID NO 12, SEQ ID NO :13和SEQ ID NO : 14的所有片段或功能等效物包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，無論它們顯示的與本文公開的各個(gè)預(yù)定的TH和GCH-I序列的同源性程度。其原因是TH和GCH-I的ー些區(qū)域可容易發(fā)生突變，或能夠完全缺失，而對(duì)得到的片段的結(jié)合活性沒有任何顯著的影響。通過置換獲得的功能性變異體可以很好地顯示出一定形式或程度的天然TH和GCH-I活性，盡管如果含有功能上相似的氨基酸側(cè)鏈的殘基被置換，則可能具有較小的同源性。就此而言，功能相似是指?jìng)?cè)鏈的主導(dǎo)特征諸如疏水性、堿性、中性或酸性，或是否存在立體位阻效應(yīng)。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，同一性程度并不是片段作為根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的預(yù)定片段的變異體或功能等效物的主要量度。氨基酸序列之間的同源性可以使用熟知的計(jì)分矩陣來計(jì)算，所述計(jì)分矩陣諸如BLOSUM 30、BLOSUM 40、BLOSUM 45、BLOSUM 50、BL0SUM55、BLOSUM 60、BLOSUM 62、BLOSUM65、BLOSUM 70、BLOSUM 75、BLOSUM 80、BLOSUM 85 和 BLOSUM 90 中的任ー個(gè)。與SEQ ID NO USEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ IDN0:5、SEQ IDNO 6,SEQ ID N0:7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQID NO 10,SEQ ID NO :11、SEQ ID NO:12,SEQ ID NO :13和SEQ ID NO : 14的片段分別具有同源性的片段，當(dāng)它們與所述預(yù)定片段序列分別優(yōu)選至少約90%同源，例如至少92%同源，諸如至少94%同源，例如至少95%同源，諸如至少96%同源，例如至少97%同源，諸如至少98%同源，例如至少99%同源時(shí)，被認(rèn)為落入了本發(fā)明的范圍內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，同源性百分比是指同一性百分比。當(dāng)根據(jù)本文使用的含義確定功能等效時(shí)可能考慮的其他因素是i)抗血清檢測(cè)根據(jù)本發(fā)明的TH或GCH-I片段的能力，或ii)在檢測(cè)中功能上等效的TG或GCH-I片段與相應(yīng)的TH或GCH-I片段競(jìng)爭(zhēng)的能力。一種確定已知氨基酸序列內(nèi)的免疫原性活性氨基酸序列的方法已經(jīng)由Geysen在US 5, 595, 915中描述,該文獻(xiàn)通過引用加入本文中。另外ー種可適用的用于確定肽片段的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的適宜方法由US6，013，478描述，其通過引用加入至本文中。此外，檢測(cè)氨基酸序列與受體部分結(jié)合的方法是技術(shù)人員已知的。除了引入至優(yōu)選的預(yù)定的TH或GCH多肽或其片段的任意位置中的保守置換以外，還可能需要在此類多肽的任何ー個(gè)或多個(gè)位置中引入非保守置換。導(dǎo)致形成TH或GCH-I的功能等效片段的非保守置換將例如i)在極性方面基本上不同，例如用具有非極性側(cè)鏈的殘基(Ala、Leu、Pro、Trp、Val、lie、Leu、Phe或Met)置換具有極性側(cè)鏈的殘基諸如Gly、Ser、Thr> Cys> Tyr、Asn或Gln或帶電荷的氨基酸諸如Asp、Glu、Arg或Lys，或用帶電荷的或極性的殘基置換非極性的殘基；和/或ii)在對(duì)多肽主鏈取向的作用方面基本上不同，諸如Pro或Gly被另ー個(gè)氨基酸置換或另一個(gè)氨基酸置換Pro或Gly ;和/或iii)在電荷方面基本上不同，例如用帶負(fù)電荷殘基諸如Glu或Asp置換帶正電荷的殘基諸如Lys、His或Arg(且反之亦然)；和/或iv)在空間位阻方面基本上不同，例如用體積大的殘基諸如His、Trp、Phe或Tyr置換具有較小側(cè)鏈的殘基例如，Ala、Gly或Ser (且反之亦然)。通過置換氨基酸獲得的變異體在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中可以基于氨基酸側(cè)鏈取代基的疏水性和親水性值以及相對(duì)相似性，包括電荷、尺寸等來獲得?？紤]了多種前述特性的示例性的氨基酸置換是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且包括精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。除了本文所述的變異體以外，可以構(gòu)想立體化學(xué)上類似的變異體以模擬變異體結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵部分并且此類化合物也可以以與本發(fā)明的變異體相同的方式使用。這可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的建模和化學(xué)設(shè)計(jì)技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。要理解的是所有這些立體化學(xué)類似的構(gòu)建體都落入了本發(fā)明的范圍內(nèi)。在進(jìn)ー步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及功能性變異體，所述功能性變異體包含具有下述親水性值或親水指數(shù)(hydrophilic index)的置換氨基酸,所述親水性值或親水指數(shù)在其置換的氨基酸的值的+/-4. 9內(nèi)，例如+/-4. 7內(nèi)，諸如+/-4. 5內(nèi)，例如+/-4. 3內(nèi)，諸如+/-4. I內(nèi)，例如+/-3. 9內(nèi)，諸如+/-3. 7內(nèi)，例如+/-3. 5內(nèi)，諸如+/-3. 3內(nèi)，例如+/-3. I內(nèi)，諸如+/-2. 9內(nèi)，例如+/-2. 7內(nèi)，諸如+/-2. 5內(nèi)，例如+/-2. 3內(nèi)，諸如+/-2. I內(nèi)，例如+/-2. O內(nèi)，諸如+/-I. 8內(nèi)，例如+/-I. 6內(nèi)，諸如+/-I. 5內(nèi)，例如+/-I. 4內(nèi)，諸如+/-I. 3內(nèi)，例如+/_1. 2內(nèi)，諸如+/-I. I內(nèi)，例如+/-I. O內(nèi)，諸如+/-0. 9內(nèi)，例如+/-0. 8內(nèi)，諸如+/-0. 7內(nèi)，例如+/-0. 6內(nèi)，諸如+/-0. 5內(nèi)，例如+/-0. 4內(nèi)，諸如+/-0. 3內(nèi)，例如+/-0. 25內(nèi)，諸如+/-0. 2內(nèi)。
親水性和親疏水性(hydrophilic and hydropathic)氨基酸指數(shù)在賦予蛋白質(zhì)交互生物學(xué)功能方面的重要性在本領(lǐng)域中是公知的(Kyte & Doolittle, 1982和Hopp,美國專利號(hào)4，554，101，每篇均通過引用加入至本文中)。
在本文中使用的氨基酸親疏水性指數(shù)值為異亮氨酸(+4. 5);纈氨酸(+4. 2)；亮氨酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氨酸/胱氨酸(+2.5);甲硫氨酸(+1.9);丙氨酸(+1. 8);甘氨酸(-0. 4);蘇氨酸(-0. 7);絲氨酸(-0. 8);色氨酸(-0. 9);酪氨酸(-1. 3);脯氨酸(-1. 6);組氨酸(-3. 2);谷氨酸(-3. 5);谷氨酰胺(-3. 5);天冬氨酸(-3. 5);天冬酰胺(-3. 5);賴氨酸(-3. 9);和精氨酸(-4. 5) (Kyte& Doolittle, 1982)。氨基酸親水性值為精氨酸(+3. O);賴氨酸(+3. O);天冬氨酸(+3. O. +-. I);谷氨酸(+3. O. +-. I);絲氨酸(+0. 3);天冬酰胺(+0. 2);谷氨酰胺(+0. 2);甘氨酸(O);蘇氨酸(-0. 4);脯氨酸(-0. 5. +' I);丙氨酸(-0. 5);組氨酸(-0. 5);半胱氨酸(-1. O)；甲硫氨酸(-1.3);纈氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);異亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2. 5);色氨酸(-3. 4) (U. S. 4，554，101)。除了本文所述的肽基化合物以外，可以構(gòu)想立體化學(xué)上類似的化合物以模擬肽結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵部分并且此類化合物也可以以與本發(fā)明的肽相同的方式使用。這可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的建模和化學(xué)設(shè)計(jì)技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。例如，可以采用酯化和其他烷基化作用來修 飾氨基末端，例如，ニ -精氨酸肽主鏈的氨基末端，以模擬四肽結(jié)構(gòu)。要理解的是所有這些立體化學(xué)上類似的構(gòu)建體都落入了本發(fā)明的范圍內(nèi)。具有N-末端烷基化和C-末端酷化的肽也涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。功能等效物也包括糖基化的和與相同或其他的TH或GCH-I片段和/或TH或GCH-I分子形成的共價(jià)或聚集結(jié)合物(covalent or aggregative conjugates),包括ニ聚體或不相關(guān)的化學(xué)部分。這種功能等效物通過將官能團(tuán)與在片段中包括在N-和C-末端中任一端或兩端發(fā)現(xiàn)的基團(tuán)以本領(lǐng)域已知的方式連接來制備。功能等效物因此可以包含與羧基末端的脂族酯或?；セ蝓０?，烷基胺或包含羧基側(cè)鏈的殘基結(jié)合的片段，例如，與天冬氨酸殘基處的烷基胺的結(jié)合物；含羥基殘基的O-酰基衍生物和氨基末端氨基酸或含氨基殘基的N-?；苌?，例如，與fMet-Leu-Phe或免疫原性蛋白的結(jié)合物。?；难苌镞x自烷基-部分的基團(tuán)(包括C3至ClO正烷基)，由此形成烷?；N類，以及選自碳環(huán)或雜環(huán)化合物，由此形成芳?；N類。反應(yīng)性基團(tuán)優(yōu)選是本身已知用于通過反應(yīng)性側(cè)基將蛋白交聯(lián)成不溶性基質(zhì)的雙官能化合物。共價(jià)或集合性功能等效物及其衍生物可用作免疫檢測(cè)中的試劑或用于親和性純化程序。例如，根據(jù)本發(fā)明的TH或GCH-I的片段可以通過本身已知的方法與溴化氰活化的瓊脂糖共價(jià)連接而使其不可溶，或者吸附至聚烯烴表面，進(jìn)行或不進(jìn)行戊ニ醛交聯(lián)，以在抗TH或抗GCH-I抗體或細(xì)胞表面受體的檢測(cè)或純化中使用。片段還可以用可檢測(cè)到的基團(tuán)標(biāo)記，例如，通過氯胺T程序放射性碘化，共價(jià)連接至稀土螯合物或偶合至另ー熒光部分以用于，例如，診斷性檢測(cè)中。TH或GCH-I的優(yōu)選的預(yù)定片段的誘變可以通過進(jìn)行氨基酸插入來進(jìn)行，通常以約I至10個(gè)氨基酸殘基的數(shù)量級(jí)，優(yōu)選約I至5氨基酸殘基來進(jìn)行，或進(jìn)行約I至10個(gè)殘基，諸如約2至5個(gè)殘基的缺失。在一個(gè)實(shí)施方案中，TH或GCH-I的片段通過自動(dòng)化合成來合成。可以采用任ー種商業(yè)可得的固相技術(shù),諸如Merrifield固相合成法，其中氨基酸相繼地添加到正在生長的氨基酸鏈。(參見 Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 =2149-2146,1963)。用于自動(dòng)化合成多肽的設(shè)備商購自供應(yīng)商諸如加利福尼亞州福斯特市的AppliedBiosystems公司，并且通常可以根據(jù)制造商的說明書來操作。固相合成將能夠?qū)⑺璧陌被嶂脫Q摻入至根據(jù)本發(fā)明的TH或GCH-I的任一片段中。要理解的是置換、缺失、插入或其任意亞組合可以組合以獲得最終的功能等效物序列。插入應(yīng)當(dāng)理解為包括氨基-末端和/或羧基-末端融合，例如與疏水或免疫原性蛋白或載體諸如能夠充當(dāng)載體的任何多肽或骨架結(jié)構(gòu)融合。還提供了寡聚體，所述寡聚體包括ニ聚體，所述ニ聚體包括根據(jù)本發(fā)明的TH和/或GCH-I的片段的同型ニ聚體和異ニ聚體，并且這些均落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。TH或GCH-I功能等效物和變異體可以作為與其他氨基酸序列或與天然TH或GCH-I序列的同型ニ聚體或異ニ聚體制備。異ニ聚體包括包含免疫反應(yīng)性TH片段以及不需要具有或發(fā)揮任何生物學(xué)活性的GCH-I片段的ニ聚體。假手術(shù)(Sham surgery):也被稱為安慰劑手術(shù),是ー種省略了被認(rèn)為是治療上必需的步驟的手術(shù)干預(yù)。在有対照的研究中，在對(duì)照群體中進(jìn)行假手術(shù)以通過中和安慰劑效應(yīng)和減少偏差來評(píng)估正在研究的干預(yù)的效果。然而與安慰劑(其典型的例子是惰性的“糖丸”)相反，假手術(shù)涉及真實(shí)的手術(shù)干預(yù)以抵消麻酔、切ロ創(chuàng)傷以及術(shù)前和術(shù)后護(hù)理的影響 并保持常規(guī)手術(shù)的假象。在本申請(qǐng)中，在稱作“Les Sham組”的對(duì)照組動(dòng)物中已經(jīng)進(jìn)行了假手術(shù)。
具體實(shí)施例方式對(duì)于最適DOPA遞送，TH和GCHl表達(dá)水平之間的化學(xué)計(jì)量關(guān)系在腦中還沒有被充分研究。到目前為止利用TH和GCHl遞送的大多數(shù)研究已經(jīng)采用了不關(guān)心控制它們的相對(duì)表達(dá)水平的設(shè)計(jì)。TH酶需要輔因子BH4用于DOPA合成。BH4由GTP在三步酶促反應(yīng)中合成，其中GCHl是第一個(gè)限速酶。后面的兩種酶是廣泛表達(dá)的。存在許多原因來仔細(xì)地看待此過程。首先，TH酶活性是被復(fù)雜調(diào)控的，并且TH蛋白的穩(wěn)定性也被調(diào)控。影響活性的一個(gè)因素是BH4的圍繞量。BH4太少，酶不能有效地工作，而BH4太多可抑制功能。其次，盡管每次酪氨酸轉(zhuǎn)化為DOPA消耗ー個(gè)BH4分子，而GCHl酶從不被消耗。由于底物GTP在細(xì)胞中很豐富，對(duì)于GCHl表達(dá)的需求可以大大小于TH表達(dá)。連續(xù)DOPA遞送取決于數(shù)種因素，這些因素促成建立用于最適TH酶功能性的環(huán)境。本發(fā)明人獲得的結(jié)果提示TH酶的激活與GCHl的表達(dá)量遵循三相動(dòng)力學(xué)關(guān)系。在GCHl TH比率達(dá)到I : 7的初始相中，TH功能和BH4合成兩者均隨著GCHl的增加而線性地增加。在當(dāng)GCHl進(jìn)ー步增加，達(dá)到5. 5E9GCH1基因組拷貝數(shù)(對(duì)應(yīng)于I : 3GCH1 TH比率的水平)的第二相中，BH4水平繼續(xù)線性増加，而TH功能開始顯示飽和的跡象。在第三相中，當(dāng)增加rAAV5-GCHl滴度超過5. 5E9基因組拷貝數(shù)時(shí)，在TH功能和BH4合成兩方面均明顯地出現(xiàn)飽和。綜合來說，這些數(shù)據(jù)顯示I : 3至I : 7GCH1 TH比率的工作范圍可以導(dǎo)致有效的DOPA合成，在此范圍內(nèi)TH功能得到優(yōu)化。因此，在某些實(shí)施方案中，TH基因的表達(dá)水平比GCHl表達(dá)水平高約3-7倍。此夕卜，使用本文所述的載體和方法和載體，穩(wěn)定的良好限定的比率的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平可得以維持，以提供可預(yù)測(cè)的和優(yōu)化的體內(nèi)表達(dá)水平。較早的策略已經(jīng)利用了雙-載體設(shè)計(jì)或單載體多-順反子載體。使用各自編碼ー種基因的単獨(dú)的病毒載體具有許多限制。首先，“產(chǎn)品”實(shí)際上變成兩種藥物，每種具有其自身的產(chǎn)量變化。由于這難以在體外評(píng)估，因此臨床級(jí)別的生產(chǎn)可能是非常成問題的。其次，盡管在整體范圍上，兩個(gè)基因的表達(dá)譜可能看上去相似，但兩個(gè)載體的拷貝數(shù)在個(gè)體細(xì)胞中可能變化極大，因此導(dǎo)致不同水平的DOPA合成。另外，影響可能會(huì)因?yàn)樵S多細(xì)胞接受不到或僅接受ー種基因而加重，因此即使有的話，也顯示非常有限的DOPA合成。一種更具吸引力的方法是將基因合并到單個(gè)載體中，因?yàn)閮蓚€(gè)基因?qū)⒖偸窃谙嗤募?xì)胞中表達(dá)，將僅有一個(gè)“產(chǎn)品”。然而，基因序列太大不能裝入特定的載體構(gòu)建體例如重組AAV載體中阻礙了這種方法。AAV的包裝容量被優(yōu)化到野生型AAV基因組的大小左右(4. 7kb)。如果重組基因組顯著地超過這個(gè)大小，則產(chǎn)量滴度和體內(nèi)功效都嚴(yán)重地受損。在基因治療中，優(yōu)選類型的病毒載體是AAV。AAV由于許多特性而有利于基因治療。特別重要的是野生型病毒缺少病原性。其還可以感染未分裂細(xì)胞，并且可以提供長期 、穩(wěn)定的基因表達(dá)。所需的基因以及驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子一起可以插入到反向末端重復(fù)序列(ITR)之間，該反向末端重復(fù)序列在單鏈載體DNA被宿主細(xì)胞DNA聚合酶復(fù)合體轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA后協(xié)助細(xì)胞核中多串聯(lián)體的形成?；贏AV的基因治療載體在宿主細(xì)胞核中形成游離型多串聯(lián)體。AAV還表現(xiàn)出非常低的免疫原性，似乎限于生成中和抗體，而它們不誘導(dǎo)明確定義的細(xì)胞毒性反應(yīng)。這些特性使得AAV成為基因治療的有吸引力的候選物，尤其是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的基因治療中。盡管多巴胺合成途徑通常被認(rèn)為包括兩個(gè)主要的酶，TH和AADC，本發(fā)明人在本文中已經(jīng)顯示使用表達(dá)TH和GCHl而不表達(dá)AADC的一種或多種載體的基因治療，可以提供癥狀的和/或治療性緩解。這是最重要的，因?yàn)槟承┎《据d體諸如AAV載體的有限包裝容量阻止或限制包含所有三種基因，TH、GCH1和AADC。此外，采用傳統(tǒng)的雙-順反子載體基因組構(gòu)建體，兩種基因TH和GCHl的組合是不可能的。盡管有可能在N-末端截短TH酶以減小基因的大小，但這樣帶來的代價(jià)是去除了反饋抑制和磷酸化的固有安全性機(jī)制。這種截短的酶在甚至當(dāng)胞漿DA濃度達(dá)到毒性水平吋，將繼續(xù)有效。這并不是如本發(fā)明中所利用的全長TH cDNA的那種情況。本文所述的某些實(shí)施方案包括截然不同的質(zhì)粒設(shè)計(jì)。例如，某些實(shí)施方案利用具有兩個(gè)啟動(dòng)子的雙表達(dá)盒，而不是通過使用內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)雙重基因表達(dá)。采用基因治療中傳統(tǒng)使用的合成的融合啟動(dòng)子諸如合成的含有兔Y-球蛋白內(nèi)含子的雞b_肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，其前面是來自巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子的增強(qiáng)子元件(稱為雞b-肌動(dòng)蛋白，CBA，啟動(dòng)子)，這種質(zhì)粒設(shè)計(jì)將是不可能。小的內(nèi)源性強(qiáng)啟動(dòng)子的使用已經(jīng)允許這種不同的質(zhì)粒設(shè)計(jì)方式。單載體表汰系統(tǒng).在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種單載體表達(dá)系統(tǒng)，其包含編碼被設(shè)計(jì)進(jìn)行差異性表達(dá)的兩種多肽的兩種多核苷酸(圖2中所述)。這兩種編碼的多肽，酪氨酸羥化酶(TH)和GTP-環(huán)化水解酶I (GCHl)，可以以3 : I至7 : I的比率優(yōu)先表達(dá)。與其他多肽一起，TH和GCHl是產(chǎn)生多巴胺中的重要酶，因?yàn)樗鼈冋{(diào)節(jié)來自酪氨酸的L-多巴產(chǎn)生。其他因子參與多巴胺合成，但TH和GCHl之間的化學(xué)計(jì)量關(guān)系可以是此過程中的限制性因素。因此本發(fā)明的主要目的是提供ー種載體構(gòu)建體，其遞送優(yōu)化比例的TH和GCH1。此夕卜，本發(fā)明提供了ー種局部遞送該載體構(gòu)建體的方法以便將増加的多巴胺的產(chǎn)生限制于需要其的細(xì)胞。病毒載體從廣義上說，基因治療尋求將新的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移至患者的細(xì)胞，為患者帶來治療性益處。這種益處包括治療或預(yù)防廣范圍的疾病、功能障礙和其他病癥?；蛑委熆梢苑譃閮煞N不同的類型生殖系基因治療，其中遺傳物質(zhì)被轉(zhuǎn)移至生殖細(xì)胞中，并且因此將是可遺傳的；和體細(xì)胞基因治療，其中遺傳物質(zhì)被轉(zhuǎn)移至體細(xì)胞并且因此將是不可遺傳的。離體基因治療方法涉及修飾分離的細(xì)胞諸如干細(xì)胞，其可以被輸注、移植或以其他的方式移植到患者中。參見，例如，專利號(hào)為4，868，116,5, 399，346和5，460，959的美國 專利。相反，體內(nèi)基因治療尋求在體內(nèi)直接靶向宿主患者組織。病毒載體是將遺傳物質(zhì)遞送至宿主生物體中的有用工具?？捎米骰蜣D(zhuǎn)移載體的病毒包括乳多空病毒、腺病毒、痘苗病毒、腺相關(guān)病毒(AAV)、皰疹病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒，諸如HIV, SIV, FIV, EIAV、MoMLV。用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的優(yōu)選病毒是慢病毒和腺相關(guān)病毒。兩種類型病毒均可以整合入基因組而不需要細(xì)胞分裂，并且兩種類型已經(jīng)在臨床前動(dòng)物研究中針對(duì)在神經(jīng)系統(tǒng)、尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的適應(yīng)征進(jìn)行了測(cè)試。優(yōu)選類型的病毒載體是AAV15AAV由于許多特性而在基因治療中受到關(guān)注。其中主要的特性是野生型病毒明顯缺少病原性，并且其還可以感染非分裂的細(xì)胞。野生型AAV基因組最經(jīng)常整合至人第9號(hào)染色體的特定位點(diǎn)(指定的AAVS1)中，而以可以忽略不計(jì)的頻率發(fā)生在基因組中的隨機(jī)整合。該特性使其與逆轉(zhuǎn)錄病毒相比是稍微更加可預(yù)測(cè)的，逆轉(zhuǎn)錄病毒存在隨機(jī)插入和誘變的危險(xiǎn)。然而，采用AAV作為基因治療載體，這種整合能力可以通過從載體的DNA去除rep和cap而消除。由于rep和cap基因在復(fù)制缺陷型病毒載體中沒有功能上的價(jià)值，因此它們可以從載體基因組中去除。在這些野生型AAV基因的位置，期望的ー個(gè)或多個(gè)基因與驅(qū)動(dòng)該基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子一起可以插入在反向末端重復(fù)序列(ITR)之間。ITR對(duì)于載體DNA的病毒載體包裝來說是重要的，其在單鏈載體DNA被宿主細(xì)胞DNA聚合酶復(fù)合體轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA之后，協(xié)助細(xì)胞核中多串聯(lián)體的形成。基于AAV的基因治療載體可以在宿主細(xì)胞核中形成游離型多串聯(lián)體。在非分裂細(xì)胞中，這些串聯(lián)體可以在宿主細(xì)胞的生命中保持完整。在分裂細(xì)胞中，AAV DNA可以通過細(xì)胞分裂丟失，因?yàn)橛坞x型DNA不與宿主細(xì)胞DNA—起復(fù)制。AAV DNA至宿主基因組中的隨機(jī)整合很少但可以被檢測(cè)到。AAV表現(xiàn)出低的免疫原性，似乎限于生成中和抗體，而它們不誘導(dǎo)明確定義的細(xì)胞毒性反應(yīng)。這些特性，連同感染休眠細(xì)胞的能力一起，使得作為人類基因治療的載體它們的一些優(yōu)勢(shì)超過了腺病毒。這些特性使得AAV成為有吸引力的候選物，用于建立用于在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的基因治療的病毒載體。病毒載體，包括AAV載體，具有某些克隆能力，S卩，它們能夠攜帶一定量的多核苷酸。因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包裝容量在I至40kb，諸如I至30kb，例如I至20kb,諸如I至15kb,例如I至IOkb,諸如I至8kb,例如2至7kb,諸如3至6kb,例如4至5kb范圍內(nèi)的病毒載體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中的，本發(fā)明涉及包裝容量為4. 8kb的AAV載體。目前存在至少11種血清型的AAV。血清型2已經(jīng)被最廣泛地研究，并且AAV2針對(duì)例如，骨骼肌、血管平滑肌細(xì)胞、肝細(xì)胞和特別是神經(jīng)元表現(xiàn)出天然向性。然而，其他血清型已經(jīng)證明作為基因治療的工具是有效的；例如AAV6似乎特別地可用于感染氣道上皮細(xì)胞，AAV7表現(xiàn)出對(duì)鼠骨骼肌細(xì)胞的高轉(zhuǎn)導(dǎo)率(類似于AAVl和AAV5)，AAV8特別地可用于轉(zhuǎn)導(dǎo)肝細(xì)胞，以及AAVl和5在至血管內(nèi)皮細(xì)胞的基因遞送中是高效的。通過用野生型AAV感染激發(fā)的體液免疫被認(rèn)為是非常普遍的事件。相關(guān)的中和活性限制了最普遍使用的血清型AAV2在某些應(yīng)用中的有效性。因此，目前正在進(jìn)行的至腦的大多數(shù)臨床試驗(yàn)涉及遞送AAV2，腦是ー個(gè)相對(duì)免疫豁免的器官。除了使用不同血清型的AAV以外，有可能將不同的血清型組合在一起，諸如使用ー種血清型的質(zhì)粒，其包裝在另ー種血清型的衣殼中。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的腺相關(guān)病毒(AAV)載體是AAV2載體。在進(jìn)ー步的實(shí)施方案中，AAV2載體包裝在包裝在不同于AAV2衣殼的AAV衣殼中。還在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，AAV2載體包裝在AAV5衣殼中。AAV載體可以使用兩種主要的原理制備，轉(zhuǎn)染人細(xì)胞系單層培養(yǎng)物或自由漂浮的昆蟲細(xì)胞。單層細(xì)胞培養(yǎng)物通過磷酸鈣沉淀、脂轉(zhuǎn)染或其他方式，采用兩種或三種質(zhì)粒制劑的混合物轉(zhuǎn)染，所述混合物含有具有載體基因組的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和ー種或兩種包含載體衣殼合成所必需的基因的輔助質(zhì)粒。對(duì)于昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物，此過程一般代替為使用包含相同功能的桿狀病毒構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。然后收集細(xì)胞、上清液或兩者用于載體的純化和濃縮。這可以通過氯化銫或碘克沙醇梯度純化、離子交換色譜、凝膠過濾和親和色譜和超離心的任意組合來實(shí)現(xiàn)。在本領(lǐng)域中記載了制備AAV的方法，例如，US 5,677, 158,US 6，309，634和US6，451，306記述了 AAV遞送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的實(shí)施例。因此，在主要的方面，本發(fā)明涉及一種單載體表達(dá)系統(tǒng)，其包含a)第一和第二表達(dá)盒,所述第一表達(dá)盒包含核苷酸序列,所述核苷酸序列包含與第一核苷酸序列可操作地連接的第一啟動(dòng)子序列，所述第一核苷酸序列編碼GTP-環(huán)化水解酶I(GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，并且其中所述第二表達(dá)盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含與第二核苷酸序列可操作地連接的第二啟動(dòng)子序列，所述第二核苷酸序列編碼酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，條件是所述載體不包含編碼芳香族氨基酸脫羧酶(AADC)多肽的核苷酸序列，或b)第一和第二表達(dá)盒，所述第一表達(dá)盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含與第一核苷酸序列可操作地連接的第一啟動(dòng)子序列，所述第一核苷酸序列編碼GTP-環(huán)化水解酶I(GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，并且其中所述第二表達(dá)盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含與第二核苷酸序列可操作地連接的第二啟動(dòng)子序列，所述第二核苷酸序列編碼酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，其中所述載體是腺相關(guān)病毒載體(AAV)，或c)表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含啟動(dòng)子、第一核苷酸序列、翻譯起始核苷酸序列諸如內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)和第二核苷酸序列，其中所述啟動(dòng)子與所述第一核苷酸序列可操作地連接，并且其中所述翻譯起始核苷酸序列連接所述第一和所述第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列編碼GTP-環(huán)化水解酶I(GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，并且其中所述第二核苷酸序列編碼酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，或d)表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含第一核苷酸序列、翻譯起始核苷酸序列諸如內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)和第二核苷酸序列，其中所述翻譯起始核苷酸序列連接所述第一和所述第二核苷酸序列，并且包含所述第一核苷酸序列——所述第一核苷酸序列連接至所述翻譯起始核苷酸序列，所述翻譯起始核苷酸序列連接至所述第二核苷酸序列——的序列的側(cè)翼是5’和3’末端重復(fù)序列，并且其中所述第一核苷酸序列編碼GTP-環(huán)化水解酶I (GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，并且其中所述第二核苷酸序列編碼酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，其中所述末端重復(fù)序列包含能夠指導(dǎo)可操作地連接的多肽表達(dá)的序列。在前文所述的載體的一個(gè)實(shí)施方案中，由所述第一表達(dá)盒表達(dá)的所述GTP-環(huán)化水解酶I (GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異 體與選自由SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3,SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 和 SEQ IDN0. 6 組成的群組的多肽至少 70%相同，并且其中由所述第二表達(dá)盒表達(dá)的所述酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由 SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. IUSEQIDN0. 12、SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 14組成的群組的多肽至少70%相同。在前文所定義的載體的另ー個(gè)實(shí)施方案中，被表達(dá)的所述GTP-環(huán)化水解酶I (GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，其中所述多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由 SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ IDN0. 4、SEQ ID NO. 5 和 SEQ IDNO. 6組成的群組的多肽至少70%相同，并且其中由所述第二表達(dá)盒表達(dá)的所述酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8、SEQ IDNO. 9,SEQ ID NO. 10,SEQ ID NO. IUSEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14 組成的群組的多肽至少70%相同。在前文所定義的載體的另ー個(gè)實(shí)施方案中，被編碼的GTP-環(huán)化水解酶I (GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ IDNO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6組成的群組的多肽至少70%相同，并且其中被編碼的酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9,SEQ IDN0. 10,SEQ ID NO. IUSEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14組成的群組的多肽至少70%相同。在前文所定義的載體的另ー個(gè)實(shí)施方案中，所述GTP-環(huán)化水解酶I(GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ IDNO. 4,SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6組成的群組的多肽至少70%相同，并且其中被編碼的酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9,SEQ IDN0. 10,SEQ ID NO. IUSEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14組成的群組的多肽至少70%相同。在某些實(shí)施方案中，AADC基因包含在載體中可以由于許多原因中的任ー種原因是不利的。首先，其生成新的系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以不受調(diào)節(jié)地將酪氨酸轉(zhuǎn)化為多巴胺。由于紋狀體中的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞缺少將多巴胺隔離至囊泡中的機(jī)制，因此多巴胺可以迅速地在胞漿中積累。如果TH酶留有N-末端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，則產(chǎn)生的多巴胺可以通過負(fù)反饋直接抑制DOPA合成，所述負(fù)反饋會(huì)嚴(yán)重地限制治療的功效。另ー方面，如果TH酶被截短，則胞漿多巴胺水平會(huì)迅速増加，因?yàn)檗D(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞也缺少釋放多巴胺的機(jī)制。胞漿多巴胺的這種增加已經(jīng)顯示導(dǎo)致紋狀體神經(jīng)元的變性，這不僅消除了癥狀緩解，而且可能將帕金森氏病轉(zhuǎn)變成多系統(tǒng)萎縮(MSA)，ー種對(duì)L-DOPA無反應(yīng)的功能障礙，其幾乎沒有治療方案。其次，包含AADC基因也可以影響患者對(duì)ロ服L-DOPA藥物治療的反應(yīng)。已知L-DOPA藥物治療的主要不良事件之一是運(yùn)動(dòng)障礙。其被認(rèn)為至少部分由于脈動(dòng)式給藥途徑所引起的紋狀體中多巴胺水平的波動(dòng)導(dǎo)致的。如果在紋狀體中在病癥處從L-DOPA至多巴胺的轉(zhuǎn)化率被提高，則這會(huì)加重該波動(dòng)，并且也加重運(yùn)動(dòng)障礙。這實(shí)際上已在用AADC基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的動(dòng)物模型中觀察到。另ー方面，缺少AADC基因可以提供DOPA通過可利用的大氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白至紋狀體神經(jīng)元外的穿梭運(yùn)動(dòng)，并且由此提供安全性機(jī)制，因?yàn)榭衫玫腁ADC酶可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化速度。具有內(nèi)源性AADC酶活性的神經(jīng)元還可以具有儲(chǔ)存和釋放多巴胺的能力，因此降低多巴胺毒性的危險(xiǎn)。因此，在某些實(shí)施方案中，該載體不包含編碼芳香族氨基酸脫羧酶(AADC)多肽的核苷酸序列。因此，在另ー個(gè)主要的方面，本發(fā)明提供了一種單載體表達(dá)系統(tǒng)，其包含a)第一和第二表達(dá)盒，所述第一表達(dá)盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含與第一核苷酸序列可操作地連接的第一啟動(dòng)子序列，所述第一核苷酸序列編碼GTP-環(huán)化水解酶I (GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，其中所述多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由 SEQ ID NO. I、SEQID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6組成的組的多肽至少70%相同，并且其中所述第二表達(dá)盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含與第二核苷酸序列可操作地連接的第二啟動(dòng)子序列，所述第二核苷酸序列編碼酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，其中所述多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由 SEQID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 14組成的群組的多肽至少70%相同，條件是所述載體不包含編碼芳香族氨基酸脫羧酶(AADC)多肽的核苷酸序列，或b)第一和第二表達(dá)盒，所述第一表達(dá)盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含與第一核苷酸序列可操作地連接的第一啟動(dòng)子序列，所述第一核苷酸序列編碼GTP-環(huán)化水解酶I(GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，其中所述多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由 SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 和 SEQIDN0. 6組成的群組的多肽至少70%相同，并且其中所述第二表達(dá)盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含與第二核苷酸序列可操作地連接的第二啟動(dòng)子序列，所述第二核苷酸序列編碼酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，其中所述多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由 SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10、SEQIDNO. IUSEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 14組成的群組的多肽至少70%相同，其中所述載體是腺相關(guān)病毒載體(AAV)，或c)表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含啟動(dòng)子、第一核苷酸序列、翻譯起始核苷酸序列諸如內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)和第二核苷酸序列，其中所述啟動(dòng)子與所述第一核苷酸序列可操作地連接，并且其中所述翻譯起始核苷酸序列連接所述第一和所述第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列編碼GTP-環(huán)化水解酶I (GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，其中所述多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2、SEQ IDNO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6組成的群組的多肽至少70%相同，并且其中所述第二核苷酸序列編碼酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，其中所述多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14 組成的群組的多肽至少70%相同，或d)表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含第一核苷酸序列、翻譯起始核苷酸序列諸如內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)和第二核苷酸序列，其中所述翻譯起始核苷酸序列連接所述第一和所述第二核苷酸序列，并且其中包含所述第一核苷酸序列——所述第一核苷酸序列連接至所述翻譯起始核苷酸序列，所述翻譯起始核苷酸序列連接至所述第二核苷酸序列——的序列的側(cè)翼是5’和3’末端重復(fù)序列，并且其中所述第一核苷酸序列編碼GTP-環(huán)化水解酶I(GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，其中所述多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由 SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 和 SEQID NO. 6組成的群組的多肽至少70%相同，并且其中所述第二核苷酸序列編碼酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，其中所述多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由 SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ IDNO. 12、SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 14組成的群組的多肽至少70%相同，其中所述末端重復(fù)序列包含能夠指導(dǎo)可操作地連接的多肽表達(dá)的序列。
在另ー個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種單載體表達(dá)系統(tǒng)，其包含a)第一和第二表達(dá)盒,所述第一表達(dá)盒包含核苷酸序列,所述核苷酸序列包含與第一核苷酸序列可操作地連接的第一啟動(dòng)子序列，所述第一核苷酸序列編碼GTP-環(huán)化水解酶I(GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，其中所述多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由 SEQ ID NO. I、SEQID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 和 SEQID NO. 6組成的群組的多肽至少75%相同，諸如至少80%相同，例如至少90%相同，諸如至少92%相同，例如至少95%相同，諸如至少97%相同，例如至少98%相同，諸如至少99%相同，例如至少99. 5%相同，并且其中所述第二表達(dá)盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含與第二核苷酸序列可操作地連接的第二啟動(dòng)子序列，所述第二核苷酸序列編碼酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，其中所述多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由 SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ IDNO. 12,SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 14組成的群組的多肽至少75%相同，諸如至少80%相同，例如至少90%相同，諸如至少92%相同，例如至少95%相同，諸如至少97%相同，例如至少98%相同，諸如至少99%相同，例如至少99. 5%相同，條件是所述載體不包含編碼芳香族氨基酸脫羧酶(AADC)多肽的核苷酸序列，或b)第一和第二表達(dá)盒，所述第一表達(dá)盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含與第一核苷酸序列可操作地連接的第一啟動(dòng)子序列，所述第一核苷酸序列編碼GTP-環(huán)化水解酶I(GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，其中所述多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由 SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 和 SEQIDN0. 6組成的群組的多肽至少70%相同，并且其中所述第二表達(dá)盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含與第二核苷酸序列可操作地連接的第二啟動(dòng)子序列，所述第二核苷酸序列編碼酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，其中所述多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由 SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10、SEQIDNO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14 組成的群組的多肽至少 75%相同，諸如至少80%相同，例如至少90%相同，諸如至少92%相同，例如至少95%相同，諸如至少97%相同，例如至少98%相同，諸如至少99%相同，例如至少99. 5%相同，其中所述載體是腺相關(guān)病毒載體(AAV)，或c)表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含啟動(dòng)子、第一核苷酸序列、翻譯起始核苷酸序列諸如內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)和第二核苷酸序列，其中所述啟動(dòng)子與所述第一核苷酸序列可操作地連接，并且其中所述翻譯起始核苷酸序列連接所述第一和所述第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列編碼GTP-環(huán)化水解酶I (GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，其中所述多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2、SEQ IDNO. 3,SEQ ID NO. 4,SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6組成的群組的多肽至少75%相同，諸如至少80%相同，例如至少90%相同，諸如至少92%相同，例如至少95%相同，諸如至少97%相同，例如至少98%相同，諸如至少99%相同，例如至少99. 5%相同，并且其中所述第二核苷酸序列編碼酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，其中所述多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由SEQ ID NO. 7、SEQ IDN0. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. IUSEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14 組成的群組的多肽至少 70%相同，或d)表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含第一核苷酸序列、翻譯起始核苷酸序列諸如內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)和第二核苷酸序列，其中所述翻譯起始核苷酸序列連接所述第一和所述第二核苷酸序列，并且其中包含所述第一核苷酸序列——所述第一核苷酸序列連接至所述翻譯起始核苷酸序列，所述翻譯起始核苷酸序列連接至所述第二核苷酸序列——的序列的側(cè)翼是5’和3’末端重復(fù)序列，并且其中所述第一核苷酸序列編碼GTP-環(huán)化水解酶I(GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，其中所述多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由 SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 和 SEQ IDNO. 6組成的群組的多肽至少75 %相同，諸如至少80 %相同，例如至少90 %相同，諸如至少92%相同，例如至少95%相同，諸如至少97%相同，例如至少98%相同，諸如至少99%相同，例如至少99. 5%相同，并且其中所述第二核苷酸序列編碼酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，其中所述多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由SEQID NO. 7,SEQ ID NO. 8,SEQ ID NO. 9,SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQIDNO. 13和SEQ ID NO. 14組成的群組的多肽至少70%相同，其中所述末端重復(fù)序列包含能夠指導(dǎo)可操作地連接的多肽表達(dá)的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體是最小整合型載體(minimally integrating vectorノ。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體是圖6中所不的載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，如前文所定義的載體I至40kb，例如I至30kb，諸如I至20kb，例如I至15kb,諸如I至10,例如I至8kb,諸如2至7kb,例如3至6kb,諸如4至5kb的包
裝容量。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，如前文所定義的載體具有4. 5至4. 8kb的包裝容量。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體是病毒載體，其中所述載體選自由下列各項(xiàng)組成的組腺相關(guān)病毒載體(AAV)、慢病毒載體、腺病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，載體是腺相關(guān)病毒載體(AAV)。即使優(yōu)選AAV載體，其他載體也可以用于本發(fā)明。因此，在另ー個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體是質(zhì)粒載體。還在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體是合成的載體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中起作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，該載體僅在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中起作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種基于在人、非人靈長類動(dòng)物、其他哺乳動(dòng)物物種或其嵌合體形式中鑒定的任何AAV血清型的載體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種基于被修飾以表達(dá)改變的或新型衣殼蛋白的任何血清型的AAV載體的載體。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及AAV載體，更優(yōu)選血清型2AAV載體，更優(yōu)選包裝在血清型5AAV衣殼中的血清型2AAV載體。對(duì)于衣殼選擇，兩個(gè)因素可以有助于選擇優(yōu)選的血清型。第一個(gè)是存在野生型等效物的中和抗體。已經(jīng)顯示在各個(gè)人群中最普遍的血清型是血清型2。因此，使用與血清型2和其他血清型具有最小的衣殼同源性的血清型是有價(jià)值的。血清型5引人注目，因?yàn)槠渑c其他AAV血清型I至9僅具有 53-57% 的衣殼序列同源性(Daya 和 Berns. Gene therapy using adeno-associatedvirus vectors. ClinMicrobiol Rev(2008) vol. 21 (4)pp. 583-93)?？赡苡兄谵D(zhuǎn)導(dǎo)在人腦中傳播的第二個(gè)因素是載體衣殼對(duì)其展示親和性的細(xì)胞表面殘基。AAV血清型2與硫酸肝 素蛋白聚糖(HSPG)具有強(qiáng)的親和性，而AAV5血清型則無。由于HSPG在腦中十分豐富，因此這可能有助于傳播?；虻谋磉_(dá)在轉(zhuǎn)錄、翻譯或翻譯后水平受到控制。轉(zhuǎn)錄起始是基因表達(dá)中早期和關(guān)鍵性的事件。這取決于啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列并且受到與這些序列相互作用的特定細(xì)胞因子的影響。AAV可以被設(shè)計(jì)成包含不同來源的ー個(gè)或多個(gè)多核苷酸。載體構(gòu)建體可以包含一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述ー個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞特異，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自但不限于由下列各項(xiàng)組成的組人神經(jīng)細(xì)胞包括人神經(jīng)元、中國倉鼠卵巢細(xì)胞、CH0-K1、幼倉鼠腎細(xì)胞、小鼠成纖維細(xì)胞-3T3細(xì)胞、非洲綠猴細(xì)胞系、大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞、AT3細(xì)胞、大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、大鼠神經(jīng)元細(xì)胞和大鼠海馬細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含基因組序列的載體，其中酶的表達(dá)受到一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子的控制，所述啟動(dòng)子允許在神經(jīng)元，諸如例如紋狀體神經(jīng)元中的高表達(dá)。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述ー個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子是神經(jīng)元特異性的。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述ー個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子是人突觸蛋白啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體的第一和/或第二啟動(dòng)子，如前文所定義的，是對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞特異的啟動(dòng)子。在進(jìn)ー步的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是神經(jīng)細(xì)胞。還在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述神經(jīng)細(xì)胞是神經(jīng)元。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一和所述第二啟動(dòng)子兩者都是突觸蛋白I啟動(dòng)子。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，所述第一或所述第二啟動(dòng)子中的任一個(gè)是突觸蛋白I啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明中使用的啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子，其中所述組成性活性啟動(dòng)子選自由下列各項(xiàng)組成的組CAG、CMV、AUbiC、RSV、EF-la、SV40、Mtl。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，其中所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子選自由下列各項(xiàng)組成的組Tet-0n、Tet-Off, Mo-MLV-LTR, Mxl、孕酮、RU486和雷帕霉素-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
本發(fā)明的啟動(dòng)子可以是組成型啟動(dòng)子，包括但不限于由下列各項(xiàng)組成的組CAG啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子、人UbiC啟動(dòng)子、RSV啟動(dòng)子、EF-I α啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子和Mtl啟動(dòng)子。除了啟動(dòng)子以外，表達(dá)載體還可以包含ー個(gè)或多個(gè)多聚腺苷酸化序列。多聚腺苷酸化序列是產(chǎn)生成熟mRNA以將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物翻譯成多肽所必需的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，多聚腺苷酸化序列與本發(fā)明的編碼TH或GCH-I的序列可操作地連接。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，多聚腺苷酸化序列的5’端與本發(fā)明的編碼TH或GCH-I的序列的3’端可操作地連 接。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多聚腺苷酸化序列是SV40多聚腺苷酸化序列。 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一表達(dá)盒或所述第二表達(dá)盒包含多聚腺苷酸化序列。在本發(fā)明的另ー個(gè)實(shí)施方案中，所述第一表達(dá)盒和所述第二表達(dá)盒兩者均包含多聚腺苷酸化序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多聚腺苷酸化序列是SV40多聚腺苷酸化序列其中所述多聚腺苷酸化序列的5’端與前文所定義的所述第一和/或所述第二核苷酸序列的3’可操作地連接。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述編碼GTP-環(huán)化水解酶I (GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體的第一核苷酸序列包含SEQ ID NO. 18的序列。在本發(fā)明的另ー個(gè)實(shí)施方案中，所述編碼酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體的第二核苷酸序列包含SEQ ID NO. 21的序列。IRES是內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的縮寫并且是允許在mRNA序列中間的翻譯起始作為更大的蛋白合成過程的一部分的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)也可以包含在本發(fā)明的表達(dá)載體構(gòu)建體中。為了將遺傳序列插入至宿主DNA中，病毒經(jīng)常使用重復(fù)達(dá)上千次的DNA序列，稱為重復(fù)序列，或末端重復(fù)序列包括長末端重復(fù)序列(LTR)和反向末端重復(fù)序列(ITR)，其中所述重復(fù)序列可以是5’和3’末端重復(fù)序列兩者。ITR在單鏈載體DNA被宿主細(xì)胞DNA聚合酶復(fù)合體轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA之后，協(xié)助細(xì)胞核中多串聯(lián)體的形成。ITR序列可以來源于病毒載體，優(yōu)選AAV，更優(yōu)選AAV2。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的載體的表達(dá)盒包含5’末端重復(fù)序列和3’末端
重復(fù)序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述5’和3’末端重復(fù)序列選自反向末端重復(fù)序列[ITR]和長末端重復(fù)序列[LTR]。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述5’和3’末端重復(fù)序列是AAV反向末端重復(fù)序列[ITR]。在一個(gè)進(jìn)ー步的實(shí)施方案中，所述反向末端重復(fù)序列包含SEQ ID NO. 15和SEQ IDNO. 16的序列。表達(dá)載體還可以包含一個(gè)或多個(gè)增強(qiáng)子或調(diào)控元件，諸如轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件，以增加或調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)的水平。這意味著包含在病毒載體中的ー種或多種多核苷酸序列的表達(dá)與沒有增強(qiáng)子和/或調(diào)節(jié)子的載體中的表達(dá)效率相比可以增加或降低。通過使用所述增強(qiáng)子和/或調(diào)節(jié)子，還有可能差異性地表達(dá)包含在載體中的兩種以上的基因。因此有可能將增強(qiáng)子或調(diào)控子指引至具有兩種以上的多核苷酸序列的載體內(nèi)的獨(dú)特多核苷酸序列。增強(qiáng)子和調(diào)節(jié)子包括，但不限干，SP163、大鼠胰島素II-內(nèi)含子或其他內(nèi)含子、CMV增強(qiáng)子和雞[β]_球蛋白隔離子或其他隔離子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸序列受嵌入在載體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件的調(diào)控。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述調(diào)控元件是土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件。在更優(yōu)選的實(shí)施方案(WPRE)中，所述WPRE調(diào)控本發(fā)明的兩種多核苷酸之間的表達(dá)比率，優(yōu)選通過增加TH的表達(dá)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二核苷酸序列與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件可操作地連接，其中所述轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件可以是土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)，其中所述土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件可以包含SEQ ID NO. 22的序列。在ー個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的兩種多肽的表達(dá)以一定的比率發(fā)生，其中TH表達(dá)高于GCH I表達(dá)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，TH GCH I比率在I : I至50 I之間，諸如I : I至45 I之間，例如I : I至40 I之間，諸如I : I至35 I之間，例如I : I至30 : I之間，諸如I : I至29 I之間，例如I : I至28 I之間，諸如I : I至27 I之間，例如I : I至26 I之間，諸如I : I至25 I之間，例如I : I至24 : I之間，諸如I : I至23 I之間，例如I : I至22 I之間，諸如I : I至21 I之間，例如I : I至20 I之間，諸如I : I至19 : I之間，例如I : I至18 : I之間，諸如I : I至17 : I之間，例如I : I至16 I之間，諸如I : I至15 : I之間，例如I : I至14 I之間，諸如I : I至13 I之間，例如I : I至12 I之間，諸如I : I至11 : I之間，例如I : I至10 : I之間，諸如I : I至9 : I之間，諸如I : I至8 : I之間，例如I : I至7 I之間，諸如7 1，例如6 I之間，諸如5 1，例如4 1，諸如3 1，例如2 : I至8 : I之間，諸如3 : I至7 : I。為了將表達(dá)比率控制在所需的范圍，存在幾種可能性。樣品中存在的mRNA的水平可以通過RT PCR測(cè)量。RT-PCR利用ー對(duì)引物，所述引物與cDNA的兩條鏈中每一條上的定義序列互補(bǔ)。然后這些引物由DNA聚合酶延伸，并且在每個(gè)循環(huán)后形成鏈的ー個(gè)拷貝，導(dǎo)致對(duì)數(shù)擴(kuò)増。RT-PCR包括三個(gè)主要步驟。第一個(gè)步驟是逆轉(zhuǎn)錄，其中使用逆轉(zhuǎn)錄酶和引物將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。下一步驟涉及dsDNA的變性，以使兩條鏈分開，并且引物可以在較低的溫度下再次結(jié)合并且開始新的鏈反應(yīng)。PCR擴(kuò)增的最后步驟是從引物的DNA延伸，其由熱穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶來完成。當(dāng)擴(kuò)增進(jìn)行時(shí)使用熒光報(bào)告分子可以將擴(kuò)增子可視化。蛋白的量可以以幾種方式測(cè)量。多核苷酸水平可以通過放射免疫測(cè)定(RIA)來檢測(cè)。RIA是ー種用來測(cè)量抗原濃度的非常敏感的技術(shù)，其不需要使用生物測(cè)定。為了進(jìn)行放射免疫測(cè)定，經(jīng)常通過用與酪氨酸連接的碘的Y-放射性同位素標(biāo)記抗原從而將已知量的抗原制成為有放射性的。此放射性標(biāo)記的抗原然后與已知量的針對(duì)該抗原的抗體混合，結(jié)果，兩者彼此化學(xué)結(jié)合。然后，カロ入來自患者的含有未知量的該相同抗原的血清樣品。這導(dǎo)致來自血清的未標(biāo)記(或“冷”)抗原與放射性標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)抗體結(jié)合位點(diǎn)。隨著“冷”抗原的濃度增加，越來越多的抗原與抗體結(jié)合，替代了放射性標(biāo)記變異體，并且減小了抗體結(jié)合的放射性標(biāo)記抗原與游離的放射性標(biāo)記抗原的比率。然后結(jié)合的抗原與未結(jié)合的抗原分開，并測(cè)量上清液中剰余的游離抗原的放射性。使用已知的標(biāo)準(zhǔn)品，然后可以生成結(jié)合曲線，該結(jié)合曲線能夠得出患者血清中抗原的量。也可以采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)。ELISA是ー種用來檢測(cè)樣品中存在蛋白或任何其他抗原的定量技木。在ELISA中，未知量的抗原固定至表面，然后在該表面上沖洗特異性抗體，使得其可以與抗原結(jié)合。此抗體與酶連接，并且在最終步驟中，加入ー種物質(zhì)，所述酶可以將該物質(zhì)轉(zhuǎn)化成一些可檢測(cè)到的信號(hào)。存在幾種類型的ELISA，包括間接ELISA、夾心ELISA、競(jìng)爭(zhēng)ELISA和反向ELISA。也可以使用其他基于免疫的測(cè)定，諸如化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定和解離增強(qiáng)鑭系元素免疫測(cè)定(Dissociation-Enhanced Lanthinide Immunoassays)。散射測(cè)池法和比池法也適用于蛋 白測(cè)定。確定蛋白含量的另一方式是通過基于色譜法的方法，更具體地是液相色譜法。親和色譜法基于分析物和特定分子之間的選擇性非共價(jià)相互作用。離子交換色譜法使用離子交換機(jī)制來分離分析物。離子交換色譜法使用帶電荷的固定相來分離帶電荷的化合物。在常規(guī)方法中，固定相是離子交換樹脂，其攜帯帶電荷的官能團(tuán)，所述官能團(tuán)與要保留的化合物的帶相反電荷的基團(tuán)相互作用。尺寸排阻色譜法(SEC)也被稱為凝膠滲透色譜(GPC)或凝膠過濾色譜。SEC用來根據(jù)其尺寸分離分子(或更準(zhǔn)確地根據(jù)其流體力學(xué)直徑或流體力學(xué)體積)。較小的分子能夠進(jìn)入介質(zhì)的孔隙，因此，需要更長的時(shí)間洗脫，而較大的分子從孔隙中被排出，且洗脫速度更快。反相色譜法是一種洗脫程序，其中流動(dòng)相的極性大大超過固定相。因此，極性化合物先被洗脫而非極性化合物被保留。備選方法包括電泳。電泳利用在電場(chǎng)的影響下分散的粒子相對(duì)于流體的運(yùn)動(dòng)。粒子然后以依照它們的相對(duì)電荷的速度移動(dòng)。更具體地說，以下的電泳方法可用于檢測(cè)CD163 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、火箭免疫電泳、親和免疫電泳和等電聚焦。流式細(xì)胞儀也可用于確定蛋白含量。在流式細(xì)胞儀中，單一波長的光束定向到流體力學(xué)聚焦的流體流。許多探測(cè)器(一些為熒光探測(cè)器)瞄準(zhǔn)流體流通過光束的點(diǎn)ー個(gè)與在光束一致，幾個(gè)探測(cè)器與其垂直。通過光束的每個(gè)O. 2至150微米的懸浮粒子以某種方式散射光，粒子中存在的或附著于粒子的熒光化學(xué)物質(zhì)可被激發(fā)從而以比光源更長的波長發(fā)光。這種散射光和熒光的組合被探測(cè)器接收到，通過分析每個(gè)探測(cè)器處亮度的波動(dòng)，有可能得出關(guān)于各個(gè)單個(gè)粒子的物理和化學(xué)結(jié)構(gòu)的多種信息。Luminex技木，是基于用特異性地俘獲來自樣品的特異性抗原的試劑包被微球的技術(shù)。MS是ー種用于測(cè)定樣品或分子的元素組成的分析技術(shù)。它也用于闡明分子諸如蛋白質(zhì)和其他化學(xué)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。MS的原理包括將化學(xué)化合物電離以產(chǎn)生帶電荷的分子或分子片段，并測(cè)量其質(zhì)量電荷比。酶活性可通過多種方法測(cè)量。所有酶測(cè)定測(cè)量隨著時(shí)間推移底物的消耗或產(chǎn)物的產(chǎn)生。通常，主要使用四種類型的實(shí)驗(yàn)初始速率實(shí)驗(yàn)，進(jìn)展曲線實(shí)驗(yàn)，瞬變動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)或松弛實(shí)驗(yàn)(relaxation experiments)。這些測(cè)定包括分光光度測(cè)定、突光測(cè)定、量熱法測(cè)定、化學(xué)發(fā)光測(cè)定、光散射測(cè)定、放射測(cè)定、色譜和比色測(cè)定，諸如MTT測(cè)定。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)比率通過測(cè)量存在的編碼TH的多核苷酸的量相對(duì)于編碼GCH I的多核苷酸的量，更優(yōu)選TH mRNA的量相對(duì)于GCH ImRNA的量來確定。在另一個(gè)實(shí)施方案中，TH和GCH I多肽的表達(dá)通過表達(dá)的蛋白質(zhì)的量來測(cè)量。還在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)比率通過測(cè)量TH和CGH I多肽的酶活性來確定。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，TH GCHl比率為至少3 1，諸如至少4 1，例如至少5 1，諸如至少 6 1，例如至少7 1，諸如至少10 1，例如15 1，諸如20 1，例如25 1，諸如30 1，例如35 1，諸如40 1，例如45 1，諸如50 I。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，TH GCHl比率為7 I。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的TH和GCHl的表達(dá)水平之間的比率通過測(cè)量表達(dá)的TH和GCHl酶的活性來確定。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的TH和GCHl的表達(dá)水平之間的比率通過測(cè)量四氫生物蝶呤(BH4)的量來確定，四氫生物蝶呤是兒茶酚胺/多巴胺生物合成中的ー種中間產(chǎn)物。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的TH和GCHl的表達(dá)水平之間的比率通過測(cè)量轉(zhuǎn)錄的mRNA的量來確定。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的TH和GCHl的表達(dá)水平之間的比率通過測(cè)量表達(dá)的蛋白質(zhì)的量來確定。酪氨酸羥化酶酪氨酸羥化酶，縮寫TH，是ー種催化酪氨酸轉(zhuǎn)化為3，4- ニ羥基苯丙氨酸(DOPA)(一種多巴胺的前體)的單加氧酶。TH活性受響應(yīng)于環(huán)境變化以及神經(jīng)元和激素刺激的轉(zhuǎn)錄和翻譯后機(jī)制的調(diào)控。對(duì)TH活性的最快速調(diào)節(jié)通過經(jīng)由磷酸化的蛋白翻譯后修飾而發(fā)生。如前所述，酪氨酸羥化酶的主要功能是將酪氨酸轉(zhuǎn)化為多巴胺。TH主要見于多巴胺能神經(jīng)元中，但不僅限于這些。TH基因是在胚胎發(fā)育是必不可少的，因?yàn)門H敲除基因型在小鼠胚胎期14天內(nèi)是致命的，而TH突變的雜合子小鼠正常發(fā)育，只有兒茶酚胺水平的略微下降。TH酶是高度特異的，不接受吲哚衍生物，這與參與兒茶酚胺產(chǎn)生的許多其他酶的行為不同。作為合成兒茶酚胺的限速酶，TH在腎上腺素能神經(jīng)元的生理學(xué)中起關(guān)鍵作用。兒茶酚胺，諸如多巴胺，在所述腎上腺素能神經(jīng)元的信號(hào)傳導(dǎo)中是主要參與者。腎上腺素能神經(jīng)元的功能障礙通常導(dǎo)致幾種神經(jīng)退行性疾病，諸如周圍神經(jīng)病變、肌萎縮側(cè)索硬化癥、阿爾茨海默病、帕金森氏病、亨廷頓病、缺血性中風(fēng)、急性腦損傷、急性脊髄損傷、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、多發(fā)性硬化、周圍神經(jīng)創(chuàng)傷或損傷、暴露于神經(jīng)毒素、代謝性疾病諸如糖尿病或腎功能不全和由傳染原引起的損害，或引起情緒障礙諸如抑郁癥。在治療帕金森氏病中可以使用采用本發(fā)明的構(gòu)建體和方法施用的TH。在本發(fā)明中編碼TH的多核苷酸序列列于SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及 SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10、SEQ IDNO. 11和SEQ ID NO. 12以及編碼TH多肽的多核苷酸的序列變異體，所述序列變異體包含與所述SEQ ID NO.至少70%的序列同一性，更優(yōu)選與SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ IDNO. 9,SEQID NO. 10,SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID NO. 1275%的序列同一性，例如至少 80%的序列同一性，諸如至少85%的序列同一性，例如至少90%的序列同一性，諸如至少95%的序列同一性,例如至少96%的序列同一性，諸如至少97%的序列同一性，例如至少98%的序列同一性，諸如至少99%的序列同一性。包含在本發(fā)明的載體構(gòu)建體中的編碼TH的多核苷酸還可以編碼TH多肽的生物學(xué)活性片段或變異體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，由本發(fā)明編碼的TH多核苷酸的這些片段或變異體包含至少50個(gè)連續(xù)氨基酸，諸如75個(gè)連續(xù)氨基酸，例如100個(gè)連續(xù)氨基酸，諸如150個(gè)連續(xù)氨基酸，例如200個(gè)連續(xù)氨基酸，諸如250個(gè)連續(xù)氨基酸，例如300個(gè)連續(xù)氨基酸，諸如350個(gè)連續(xù)氨基酸，例如400個(gè)連續(xù)氨基酸，諸如450個(gè)連續(xù)氨基酸，其中所討論的序列中指定的任何氨基酸被改變成不同的氨基酸，以所述片段或變異體中不超過15個(gè)氨基酸被如此改變?yōu)闂l件。
還包括SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQID NO. 11、SEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 14以及本發(fā)明的編碼的TH多肽的突變和置換形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，氨基酸序列中的置換是保守的，其中氨基酸被具有相似的化學(xué)和/或物理特性的另ー氨基酸置換。突變可以在SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14 和或在編碼的TH多肽內(nèi)的ー個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)中發(fā)生。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及賦予TH生物學(xué)活性的任何突變，諸如例如中性突變或沉默突變。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及突變，其中絲氨酸殘基S8、S19、S3US40或S404的ー個(gè)或多個(gè)被改變。在一個(gè)實(shí)施方案中，由根據(jù)本發(fā)明的載體構(gòu)建體表達(dá)的生物學(xué)活性片段包含至少50個(gè)連續(xù)氨基酸，其中在所選擇的序列中指定的任何氨基酸被改變?yōu)椴煌陌被?，以序列中不多?5個(gè)氨基酸殘基被如此改變?yōu)闂l件。在一個(gè)實(shí)施方案中，由根據(jù)本發(fā)明的載體構(gòu)建體表達(dá)的酪氨酸羥化酶(TH)多肽與選自由 SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ IDNO. 12、SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 14組成的群組的多肽至少70%相同，更優(yōu)選與選自由SEQ ID NO. 7,SEQ ID NO. 8,SEQ ID NO. 9,SEQ ID NO. 10,SEQ ID NO. IUSEQ ID NO. 12,SEQID NO. 13和SEQ IDN0. 14組成的群組的多肽至少75%相同，更優(yōu)選與選自由SEQ ID NO. 7、SEQID NO. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 14組成的群組的多肽至少80%相同，更優(yōu)選與選自由SEQ ID NO. 7、SEQ IDNO. 8,SEQ ID NO. 9,SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. IUSEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13 和 SEQ IDNO. 14組成的群組的多肽至少85%相同，更優(yōu)選與選自由SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14 組成的群組的多肽至少90%相同，更優(yōu)選與選自由SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ IDN0. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13 和 SEQID NO. 14 組成的群組的多肽至少95%相同，更優(yōu)選與選自由SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ IDNO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14 組成的群組的多肽至少 96%相同，更優(yōu)選與選自由 SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. IUSEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14 組成的群組的多肽至少 97%相同，更優(yōu)選與選自由 SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ IDNO. IUSEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 14組成的群組的多肽至少98%相同，更優(yōu)選與選自由 SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ IDN0.9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQID NO. 12、SEQ ID NO. 13和SEQID NO. 14組成的群組的多肽至少99%相同，更優(yōu)選與選自由 SEQ ID NO. 7,SEQ ID NO. 8,SEQ ID NO. 9,SEQ ID NO. 10,SEQ ID NO. IUSEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 14組成的群組的多肽100%相同。在一個(gè)實(shí)施方案中，由根據(jù)本發(fā)明的載體構(gòu)建體表達(dá)的生物學(xué)活性片段是酪氨酸羥化酶的催化結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，由根據(jù)本發(fā)明的載體構(gòu)建體表達(dá)的生物學(xué)活性片段是突變的 酪氨酸羥化酶多肽，其中殘基S19、S31、S40或S404中的ー個(gè)或多個(gè)殘基已經(jīng)改變?yōu)榱愆`個(gè)
氨基酸殘基。GTP-環(huán)化水解酶IGTP-環(huán)化水解酶I (GCH I)是酶的GTP環(huán)化水解酶家族成員。GCH I是葉酸和生物蝶呤生物合成途徑的一部分。GCH I是四氫生物蝶呤(BH4)生物合成中的第一個(gè)和限速酶，催化GTP轉(zhuǎn)化成7，8-DHNP-3' -TP0 BH4是在單胺神經(jīng)遞質(zhì)血清素(5-羥色胺(5-HT)、褪黑激素、多巴胺、去甲腎上腺素和腎上腺素的生物合成中芳族氨基酸羥化酶(AAAH)所需要的重要輔因子。此基因的突變與惡性苯丙酮尿癥和高苯丙氨酸血癥，以及L-DOPA-反應(yīng)性肌張カ障礙有夫。已經(jīng)記載了編碼不同同エ型的數(shù)種可變剪接的轉(zhuǎn)錄變異體；然而，不是所有變異體都產(chǎn)生功能酶。GCH I具有許多臨床意義，涉及幾種功能障礙。GCHl缺陷是GTP環(huán)化水解酶I缺乏(GCH1D;也稱為由于GTP環(huán)化水解酶I缺乏引起的非典型性嚴(yán)重苯丙酮尿癥)的原因。GCHlD是由于四氫生物蝶呤缺乏引起的惡性高苯丙氨酸血癥的原因之一。其也是由于神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺和血清素耗竭引起的缺陷性神經(jīng)傳遞的原因，導(dǎo)致諸如帕金森氏病的疾病。主要癥狀包括精神運(yùn)動(dòng)性阻滯、緊張性障礙(tonicity disorders)、驚厥、嗜睡、易怒、異常活動(dòng)、體溫過高、多涎和吞咽困難。ー些患者可能表現(xiàn)嚴(yán)重高苯丙氨酸血癥和輕度5型肌張力障礙之間的中間嚴(yán)重性表現(xiàn)型(伴有晝間波動(dòng)的肌張カ障礙-帕金森綜合征)。在此中間表現(xiàn)型中，存在明顯的運(yùn)動(dòng)遲緩，但沒有智力障礙和，如果有的話，僅最輕的高苯丙氨酸血癥。GCHl缺陷是5型肌張カ障礙(DYT5)的原因；還稱為伴有晝間波動(dòng)的進(jìn)行性肌張カ障礙、常染色體顯性Segawa綜合征或伴有晝間波動(dòng)的肌張カ障礙-帕金森綜合征。DYT5是ー種DOPA-反應(yīng)性肌張カ障礙。肌張カ障礙是根據(jù)存在持續(xù)的不隨意肌收縮而定義的，經(jīng)常導(dǎo)致異常姿勢(shì)。DYT5典型地出現(xiàn)在童年期，其中由于下肢肌張カ障礙而具有行走困難，并且晚間肌張カ障礙加重。其特征是姿勢(shì)和運(yùn)動(dòng)障礙，顯示明顯的晝間波動(dòng)。軀干轉(zhuǎn)動(dòng)罕見。睡眠后癥狀緩解，疲勞和運(yùn)動(dòng)則加重。對(duì)L-DOPA有良好的反應(yīng)而沒有副作用。采用本發(fā)明的構(gòu)建體和方法施用的GCH I可以用于治療帕金森氏病。本發(fā)明中的編碼GCH I的多核苷酸序列列于SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2、SEQ IDNO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及SEQID NO. I、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4以及編碼GCH I多肽的多核苷酸的序列變異體，所述序列變異體包含與SEQ ID NO. K SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3和SEQ IDNO. 4 至少 70% 的序列同一性，更優(yōu)選與 SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3 和 SEQID NO. 475%的序列同一性，例如至少80%的序列同一性，諸如至少85%的序列同一性，例如至少90%的序列同一性，諸如至少95%的序列同一性，例如至少96%的序列同一性，諸如至少97%的序列同一性，例如至少98%的序列同一性，諸如至少99%的序列同一性。包含在本發(fā)明的載體構(gòu)建體中的編碼GCH I的多核苷酸還可以編碼GCH I多肽的生物學(xué)活性片段或變異體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，由本發(fā)明編碼的GCH I多核苷酸的這些片段或變異體包含至少50個(gè)連續(xù)氨基酸，諸如75個(gè)連續(xù)氨基酸，例如100個(gè)連續(xù)氨基酸，諸如150個(gè)連續(xù)氨基酸，例如200個(gè)連續(xù)氨基酸，諸如250個(gè)連續(xù)氨基酸，其中所討論的序列中指定的任何氨基酸被改變?yōu)椴煌陌被幔运銎位蜃儺愺w中不多于15個(gè)氨基酸被如此改變?yōu)闂l件。還包括SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 和SEQ ID NO. 6以及本發(fā)明的編碼的GCH I多肽的突變和置換形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，氨基 酸序列中的置換是保守的，其中氨基酸被具有相似的化學(xué)和/或物理特性的另ー氨基酸置換。突變可以在 SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 和SEQ ID NO. 6和或在編碼的GCH I多肽內(nèi)的ー個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)中發(fā)生。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及賦予TH生物學(xué)活性的任何突變，諸如例如中性突變或沉默突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，由根據(jù)本發(fā)明的載體構(gòu)建體表達(dá)的生物學(xué)活性片段包含至少50個(gè)連續(xù)氨基酸，其中所選擇的序列中指定的任何氨基酸被改變?yōu)椴煌陌被?，以序列中不多?5個(gè)氨基酸殘基被如此改變?yōu)闂l件。在一個(gè)實(shí)施方案中，由根據(jù)本發(fā)明的載體構(gòu)建體表達(dá)的GTP-環(huán)化水解酶I (GCHl)多肽與選自由 SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 和 SEQID NO. 6組成的群組的多肽至少70%相同，更優(yōu)選與選自由SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2、SEQID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6組成的群組的多肽至少75%相同，更優(yōu)選與選自由 SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 和 SEQID NO. 6組成的群組的多肽至少80%相同，更優(yōu)選與選自由SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2、SEQID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6組成的群組的多肽至少85%相同，更優(yōu)選與選自由 SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 和 SEQID NO. 6組成的群組的多肽至少90%相同，更優(yōu)選與選自由SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2、SEQID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6組成的群組的多肽至少95%相同，更優(yōu)選與選自由 SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 和 SEQID NO. 6組成的群組的多肽至少96%相同，更優(yōu)選與選自由SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2、SEQID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6組成的群組的多肽至少97%相同，更優(yōu)選與選自由 SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 和 SEQID NO. 6組成的群組的多肽至少98%相同，更優(yōu)選與選自由SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2、SEQID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6組成的群組的多肽至少99%相同，更優(yōu)選與選自由 SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 和 SEQID NO. 6組成的群組的多肽100%相同。治療神經(jīng)退行件疾病的靶組織治療神經(jīng)退行性疾病的ー個(gè)挑戰(zhàn)是局部施用藥劑以避免過多的副作用。目前治療大腦功能障礙的大多數(shù)藥物以使得它們到達(dá)整個(gè)大腦的方式給藥，最常通過ロ服給藥。而且，當(dāng)ロ服遞送時(shí)，藥物會(huì)以脈沖的方式到達(dá)靶區(qū)域，在這種脈沖的方式中波動(dòng)的水平可給患者帶來問題。體內(nèi)基因治療的ー個(gè)重要參數(shù)是選擇合適的靶組織。對(duì)于治療帕金森氏病，殼核和尾狀核是特別令人感興趣的。更具體地，治療應(yīng)當(dāng)集中在黑質(zhì)中致密區(qū)的多巴胺能神經(jīng)元。在帕金森氏病中，據(jù)信經(jīng)常伴隨采用目前選用藥L-多巴長期治療的運(yùn)動(dòng)障礙是藥物在腦中的波動(dòng)水平的結(jié)果。已經(jīng)在帕金森氏病的臨床前動(dòng)物模型中進(jìn)行測(cè)試的ー種方式是通過使用基因治療方式來改進(jìn)多巴胺替代策略，在該方式中在多巴胺缺乏最多的殼核和尾狀核中可以進(jìn)行局部多巴胺替代。該方式稱為“酶替代策略”。此治療的基本原理來源于對(duì)H)患者的臨床觀察，其提示由ロ服L-DOPA用藥治療誘發(fā)的嚴(yán)重運(yùn)動(dòng)障礙可以通過經(jīng)由靜脈內(nèi)或十二指腸途徑輸注的L-DOPA來緩解。因此，目前的假說是運(yùn)動(dòng)障礙的發(fā)展至少部分由于ロ服L-DOPA遞送模式所產(chǎn)生的DA的間斷性脈沖式供應(yīng)。 基因治療能夠調(diào)節(jié)產(chǎn)生多巴胺的酶，而不是供應(yīng)多巴胺或L-多巴。因此，在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，編碼TH和GCH I酶的多核苷酸被遞送至要治療帕金森氏病的個(gè)體的大腦中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多核苷酸在單AAV載體中遞送。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含所述多核苷酸的所述載體被遞送至所述個(gè)體的大腦中，優(yōu)選在尾狀核和/或殼核中。還在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，遞送所述載體使得其在黑質(zhì)致密區(qū)的多巴胺能神經(jīng)元中起效。給藥和遞送方案ー個(gè)重要的參數(shù)是要被遞送到靶組織中的TH和GCHl的劑量。就此而言，"単位劑量"通常是指每ml TH和GCH I組合物的TH和HCHl的濃度。對(duì)于病毒載體，TH和GCHI的濃度可以由每ml神經(jīng)營養(yǎng)組合物的病毒粒子數(shù)定義。最適地，對(duì)于使用病毒表達(dá)載體遞送TH和GCH I，TH和GCH I的每個(gè)單位劑量將包含2. 5至25 μ L的TH和GCH I組合物，其中所述組合物包括藥學(xué)上可接受流體中的病毒表達(dá)載體，并且提供每ml TH和GCH I組合物從101°直至IO15個(gè)表達(dá)TH和GCH I的病毒粒子(圖7中例證)。這樣高的滴度可特別用于腺相關(guān)病毒，諸如本發(fā)明中所述的AAV載體。實(shí)施例2描述了本發(fā)明的載體的劑量方案。在一個(gè)實(shí)施方案中，施用于有需要的患者的載體的劑量為I. 5E+10至2. 2E+12之間個(gè)載體基因組拷貝數(shù)每毫升殼核灰質(zhì)。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，用于制備治療兒茶酚胺失調(diào)的藥劑的載體的劑量為I. 5E+10至2. 2E+12個(gè)載體基因組拷貝數(shù)每毫升所述載體意欲給藥的個(gè)體的殼核灰質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，給藥部位是大腦的紋狀體，尤其是尾狀核和/或殼核。注射至殼核中可以標(biāo)記位于大腦的各個(gè)遠(yuǎn)端區(qū)域中的靶部位，例如，蒼白球、杏仁核、丘腦底核或黑質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶部位(或之一)是黑質(zhì)，更優(yōu)選黑質(zhì)中的致密區(qū)。注射還可以進(jìn)入紋狀體和黑質(zhì)兩者中。在給定的靶部位內(nèi)，載體系統(tǒng)可以轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞。靶細(xì)胞可以是存在于神經(jīng)組織中的細(xì)胞，諸如神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細(xì)胞，少突膠質(zhì)細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞或室管膜細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶細(xì)胞是神經(jīng)元，尤其是黑質(zhì)中致密區(qū)的多巴胺能神經(jīng)元。
載體系統(tǒng)優(yōu)選通過直接注射給藥。注射至大腦(尤其是紋狀體)中的方法是本領(lǐng)域中公知的(Bilang-Bleuel 等人(1997) Proc. Acad. Nati. Sci. USA94 :8818-8823 ；Choi-Lundberg等人(1998) Exp. Neurol. 154 :261-275 ;Choi_Lundberg等人(1997) Science275 :838-841 ;和 Mandel 等人(1997) Proc. Acad. Natl. Sci. USA 94 14083-14088)?？梢越o
予立體定向注射。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解本發(fā)明采用的直接遞送法避免了與體內(nèi)基因治療相關(guān)的限制性危險(xiǎn)因素。在本發(fā)明中，遞送是直接的，并且選擇遞送部位使得分泌的Th和GCHl的擴(kuò)散在大腦的受控和預(yù)定區(qū)域內(nèi)發(fā)生，從而優(yōu)化了與靶向神經(jīng)元的接觸，同時(shí)盡量減少了與非靶向細(xì)胞的接觸。
載體衣殼性質(zhì)的改良能夠使得在鞘內(nèi)(IT)注射或注射至腦室(ICV)之后，載體靶向至紋狀體區(qū)域。這可以通過改良衣殼的特定結(jié)構(gòu)域來實(shí)現(xiàn)。例如，位置587處的氨基酸突變可以去除AAV血清型2的HSPG結(jié)合親和性，并且開放與可能是細(xì)胞類型特異性的其他細(xì)胞表面殘基的結(jié)合。另ー種備選方式是生成嵌合的AAV血清型，其遺傳來自混合的兩種血清型的不同結(jié)合性質(zhì)。藥物制劑為了形成用于本發(fā)明中的TH和GCH I組合物，可以將編碼TH和GCH I的表達(dá)病毒載體置于藥學(xué)上可接受的懸浮液、溶液或乳液中。合適的介質(zhì)包括鹽水和脂質(zhì)體制劑。更具體地，藥學(xué)上可接受的載體可以包括非水性溶液、混懸液和乳液的無菌水溶液。非水性溶劑的例子是丙ニ醇、聚こニ醇、植物油諸如橄欖油，和可注射的有機(jī)酯諸如油酸こ酷。水性載體包括水、醇/水溶液、乳液或混懸液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。胃腸外載體包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖，右旋糖和氯化鈉、乳酸林格氏液或固定油。靜脈內(nèi)載體包括流體和營養(yǎng)物補(bǔ)充劑、電解質(zhì)補(bǔ)充劑(諸如基于林格氏右旋糖的那些)，等等。還可以存在防腐劑和其他添加剤，諸如，例如，抗菌劑，抗氧化劑，螯合剤，和惰性氣體等等。此外，TH和GCH I轉(zhuǎn)基因的組合物可以使用本領(lǐng)域公知的手段凍干，用于后續(xù)的重構(gòu)和根據(jù)本發(fā)明的用途。膠體分散體系還可以用于靶向基因遞送。膠體分散體系包括高分子復(fù)合體、微球、珠子，和基于脂質(zhì)的體系包括水包油型乳液、膠束、混合膠束和脂質(zhì)體。脂質(zhì)體是人工膜囊泡，其可用作體外和體內(nèi)的遞送載體。已經(jīng)顯示，尺寸范圍為O. 2-4.0μπι的大單層囊泡(LUV)可以封裝相當(dāng)大百分比的包含大的高分子的緩沖水溶液。RNA、DNA和完整的病毒粒子可以封裝在水性內(nèi)部并且以生物學(xué)活性形式遞送至細(xì)胞(Fraley,等人,Trends Biochem. Sci. ,6 :77,1981)。除了哺乳動(dòng)物細(xì)胞以外，脂質(zhì)體已被用于在植物、酵母和細(xì)菌細(xì)胞中遞送可操作編碼的轉(zhuǎn)基因。為了使脂質(zhì)體成為高效的基因轉(zhuǎn)移載體，應(yīng)該具有以下特性(I)以高效率封裝編碼TH和GCHl的基因，同時(shí)不影響其生物學(xué)活性；(2)與非靶細(xì)胞相比，優(yōu)先和實(shí)質(zhì)上與靶細(xì)胞結(jié)合；(3)以高效率將囊泡的水性內(nèi)容物遞送至靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)；和(4)遺傳信息的準(zhǔn)確和有效的表達(dá)(Mannino，等人，Biotechniques, 6 :682,1988)?？捎糜谥|(zhì)體生產(chǎn)的脂質(zhì)的例子包括磷脂?；衔?，諸如磷脂酰甘油、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰こ醇胺、鞘磷脂、腦苷脂和神經(jīng)節(jié)苷脂。特別有用的是ニ?；字８视停渲兄|(zhì)部分包含14-18個(gè)碳原子，特別是16-18個(gè)碳原子，并且是飽和的。示例性的磷脂包括蛋磷脂酰膽堿、ニ棕櫚酰磷脂酰膽堿和ニ硬脂酰磷脂酰膽堿?？苫诮馄蕦W(xué)和機(jī)械因素對(duì)脂質(zhì)體的靶向進(jìn)行分類。解剖分類基于選擇性的水平，例如，器官特異性、細(xì)胞特異性和細(xì)胞器特異性?；谄涫潜粍?dòng)或主動(dòng)可以區(qū)分機(jī)械性靶向。被動(dòng)靶向利用脂質(zhì)體分布至細(xì)胞的天然傾向，所述細(xì)胞屬于含有竇狀毛細(xì)血管的器官中的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)。另ー方面，主動(dòng)靶向涉及脂質(zhì)體的改變，所述改變通過將脂質(zhì)體偶聯(lián)到特異性配體諸如單克隆抗體、糖、糖脂或蛋白質(zhì)，或通過改變脂質(zhì)體的組成或大小，以實(shí)現(xiàn)至除了天然發(fā)生的定位部位之外的器官和細(xì)胞類型的靶向。靶向基因遞送系統(tǒng)的表面可以以多種方式改性。在脂質(zhì)體靶向遞送系統(tǒng)的情況 下，可以將脂質(zhì)基團(tuán)結(jié)合至脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙分子層中，以保持靶向配體與脂質(zhì)體雙分子層的穩(wěn)定締合。可以使用多種連接基團(tuán)來連接脂質(zhì)鏈與靶向配體。因此，在ー個(gè)方面，本發(fā)明涉及在治療帕金森氏病的方法中使用的藥物組合物，所述組合物包含單載體表達(dá)系統(tǒng)和用于將所述載體遞送到基底神經(jīng)節(jié)的制劑，其中所述單載體表達(dá)系統(tǒng)包含a)第一和第二表達(dá)盒，所述第一表達(dá)盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含與第一核苷酸序列可操作地連接的第一啟動(dòng)子序列，所述第一核苷酸序列編碼GTP-環(huán)化水解酶I(GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變體，并且其中所述第二表達(dá)盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含與第二核苷酸序列可操作地連接的第二啟動(dòng)子序列，所述第二核苷酸序列編碼酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變體，條件是所述載體不包含編碼芳香族氨基酸脫羧酶(AADC)多肽的核苷酸序列，或b)第一和第二表達(dá)盒，所述第一表達(dá)盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含與第一核苷酸序列可操作地連接的第一啟動(dòng)子序列，所述第一核苷酸序列編碼GTP-環(huán)化水解酶I(GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變體，并且其中所述第二表達(dá)盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含與第二核苷酸序列可操作地連接的第二啟動(dòng)子序列，所述第二核苷酸序列編碼酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變體，其中所述載體是腺相關(guān)病毒載體(AAV),或c)表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含啟動(dòng)子、第一核苷酸序列、翻譯起始核苷酸序列諸如內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)和第二核苷酸序列，其中所述啟動(dòng)子與所述第一核苷酸序列可操作地連接，并且其中所述翻譯起始核苷酸序列連接所述第一和所述第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列編碼GTP-環(huán)化水解酶I (GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變體，并且其中所述第二核苷酸序列編碼酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變體，或d)表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含第一核苷酸序列、翻譯起始核苷酸序列諸如內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)和第二核苷酸序列，其中所述翻譯起始核苷酸序列連接所述第一和所述第二核苷酸序列，并且其中包含所述第一核苷酸序列——所述第一核苷酸序列連接至所述翻譯起始核苷酸序列，所述翻譯起始核苷酸序列連接至所述第二核苷酸序列——的序列的側(cè)翼是5’和3’末端重復(fù)序列，并且其中所述第一核苷酸序列編碼GTP-環(huán)化水解酶I (GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變體，并且其中所述第二核苷酸序列編碼酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變體，其中所述末端重復(fù)序列包含能夠指導(dǎo)可操作地連接的多肽表達(dá)的序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，由所述第一表達(dá)盒表達(dá)的GTP-環(huán)化水解酶I (GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQID NO. 4、SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6組成的群組的多肽至少70%相同，并且其中由所述第二表達(dá)盒表達(dá)的酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由SEQ IDNO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ IDNO. 13和SEQ ID NO. 14組成的群組的多肽至少70%相同。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，被表達(dá)的GTP-環(huán)化水解酶I (GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，其中所述多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6 組成的群組的多肽至少70%相同，并且其中由所述第二表達(dá)盒表達(dá)的所述酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. IUSEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14 組成的群組的多肽至少 70%相同。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，GTP-環(huán)化水解酶I (GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由 SEQ ID NO. 1，SEQ ID NO. 2，SEQ ID NO. 3，SEQ ID NO. 4，SEQ ID NO. 5，SEQ ID NO. 6組成的群組的多肽至少70%相同，并且其中被編碼的酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ IDNO. 10,SEQ ID NO. IUSEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14 組成的群組的多肽至少70%相同。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，GTP-環(huán)化水解酶I (GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由 SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 和SEQ ID NO. 6組成的群組的多肽至少70%相同，并且其中被編碼的酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ IDNO. 10,SEQ ID NO. IUSEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14 組成的群組的多肽至少70%相同。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，如前文所定義的藥物組合物包含甘露醇、肝素或基于 し的 MRI 對(duì)比劑(contrast agents)。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，如前文所定義的藥物組合物包含營養(yǎng)因子或可逆蛋白酶體抑制劑。醫(yī)療用涂和治療方法
在ー個(gè)方面，本發(fā)明的載體用作藥劑。在ー個(gè)方面，本發(fā)明涉及如前文所定義的載體用于制備治療與兒茶酚胺功能失調(diào)相關(guān)的疾病的藥劑的用途。在ー個(gè)方面，本發(fā)明涉及如前文所定義的載體，用于治療與兒茶酚胺功能失調(diào)相關(guān)的疾病的方法中。在ー個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種在有需要的患者中，治療與兒茶酚胺功能失調(diào)相關(guān)的疾病的方法，所述方法包括向所述個(gè)體施用如前文所定義的載體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，兒茶酚胺功能失調(diào)是兒茶酚胺缺乏。
在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案中，兒茶酚胺功能失調(diào)是兒茶酚胺過多。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，兒茶酚胺缺乏是多巴胺缺乏。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，兒茶酚胺過多是多巴胺過多。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述與兒茶酚胺功能失調(diào)相關(guān)的疾病是中樞和/或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的疾病、功能障礙或損害·。在進(jìn)ー步的實(shí)施方案中，所述中樞和/或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的疾病、功能障礙或損害是神經(jīng)退行性疾病。

在另ー個(gè)實(shí)施方案中，所述與兒茶酚胺功能失調(diào)相關(guān)的疾病是基底神經(jīng)節(jié)的疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過使用本發(fā)明的載體可治療的疾病選自由下列各項(xiàng)組成的組帕金森氏病(PD) ,DOPA反應(yīng)性肌張カ障礙、ADHD、精神分裂癥、抑郁癥，血管性帕金森綜合征、特發(fā)性震顫、慢性應(yīng)激、遺傳性多巴胺受體異常、阿片、可卡因、酒精或大麻的長期使用、腎上腺功能不全、高血壓、去甲腎上腺素缺乏癥、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙、病態(tài)性賭博癥、癡呆、路易體癡呆。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過使用本發(fā)明的載體可治療的神經(jīng)退行性疾病是帕金森氏病(PD)ο在ー個(gè)方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的載體用于制備治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥劑的用途。所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病可以是周圍神經(jīng)系統(tǒng)或中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病。治療不僅是預(yù)期的治愈性治療，而且是預(yù)防性(preventive)(非絕對(duì)的預(yù)防)或預(yù)防(prophylactic)治療。治療還可以是改善性(非絕對(duì)的改善)或?qū)ΠY性的。優(yōu)選CNS功能障礙是神經(jīng)退行性疾病或神經(jīng)疾病，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述神經(jīng)退行性疾病是帕金森氏病。神經(jīng)系統(tǒng)疾病可以通過向有需要的個(gè)體施用治療有效量的本發(fā)明的病毒載體；或治療有效量的本發(fā)明的藥物組合物來治療。藥物組合物因此，在ー個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含如前文所定義的載體和藥學(xué)上可接受載體或稀釋劑的藥物組合物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，如前文所定義的藥物組合物的pH為pH 4至pH 9之間。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物的注射是顱內(nèi)、腦內(nèi)、靜脈內(nèi)、玻璃體內(nèi)、鼻內(nèi)、肌內(nèi)、脊柱內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、推注或連續(xù)給藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物被配制用于通過注射給藥、舌下片劑或噴霧齊U、皮膚給藥或吸入。在一個(gè)實(shí)施方案中，如前文所定義的藥物組合物被配制用于通過注射給藥、栓劑、ロ服給藥、舌下片劑或噴霧劑、皮膚給藥、吸入或用于使用可植入的生物相容性膠囊局部給藥。在進(jìn)ー步的實(shí)施方案中，所述注射是靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、脊柱內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、推注或連續(xù)給藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物以30分鐘至24小時(shí)的間隔進(jìn)行給藥。
在另ー個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物以I至6小時(shí)的間隔進(jìn)行給藥。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述治療的持續(xù)時(shí)間為6至72小吋。在本發(fā)明的ー個(gè)重要方面，所述治療的持續(xù)時(shí)間為終生。在進(jìn)ー步的實(shí)施方案中，如前文所定義的藥物組合物被配制用于通過注射給藥、栓劑、ロ服給藥、舌下片劑或噴霧劑、皮膚給藥、吸入或用于使用可植入的生物相容性膠囊局部給藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物中的活 性成分，即載體的劑量為每kg體重10 μ g至500mg之間，諸如20 μ g至400mg之間，例如30 μ g至300mg之間，諸如40 μ g至200mg之間,例如50 μ g至IOOmg之間，諸如60 μ g至90 μ g之間，例如70 μ g至80 μ go在進(jìn)ー步的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物以72小時(shí)至至少7天的間隔給藥，諸如80小時(shí),例如96h,諸如5天,例如6天,諸如一周一次。在進(jìn)ー步的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物以7天至I個(gè)月的間隔給藥，諸如每兩周一次,例如每三周一次?？芍踩氲乃拗骷?xì)胞在ー個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含如前文所定義的載體的分離的宿主細(xì)胞。在ー個(gè)方面，本發(fā)明涉及用根據(jù)本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的分離的宿主細(xì)胞。這些細(xì)胞優(yōu)選是哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞因?yàn)檫@些細(xì)胞能夠分泌和正確地加工編碼的TH和GCHl。優(yōu)選的物種包括由哨齒類動(dòng)物(小鼠、大鼠)、兔、犬、貓、豬、猴、人組成的組。對(duì)于由本發(fā)明載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的良好候選物的原代培養(yǎng)物和細(xì)胞系的例子包括由下列各項(xiàng)組成的組CH0、HEK293、COS、PCI2、HiB5、RN33b、神經(jīng)元細(xì)胞、胚胎細(xì)胞、ARPE-19、MDX12、C2C12、HeLa, H印G2、紋狀體細(xì)胞、神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、中間神經(jīng)元。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的宿主細(xì)胞選自由下列各項(xiàng)組成的組真核細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞，更優(yōu)選靈長類動(dòng)物細(xì)胞，更優(yōu)選人細(xì)胞。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的宿主細(xì)胞選自由下列各項(xiàng)組成的組中國倉鼠卵巢細(xì)胞、CH0-K1、幼倉鼠腎細(xì)胞、小鼠成纖維細(xì)胞-3T3細(xì)胞、非洲綠猴細(xì)胞系、大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞、AT3細(xì)胞、大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、大鼠神經(jīng)元細(xì)胞和大鼠海馬細(xì)胞。實(shí)施例實(shí)施例I :單rAAV載體在帕金森氏病的動(dòng)物模型中對(duì)于連續(xù)DOPA遞送的效果材料和方法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在下面實(shí)驗(yàn)中的所有大鼠(除了未處理對(duì)照組中的動(dòng)物以外)接受單側(cè)6-0HDA注射，6-0HDA注射至內(nèi)側(cè)前腦束(MFB)以達(dá)到黑質(zhì)紋狀體途徑的全部損害。在損害后4至5小時(shí)，所有發(fā)生損害的動(dòng)物在安非他明誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)后在旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行篩選[Ungerstedt和Arbuthnott Quantitative recording of rotational behavior in ratsafter 6-hydroxy-dopamine lesions of the nigrostriatal dopamine system ；BrainRes 1970 24 485-93]。僅將表現(xiàn)出朝向DA耗竭側(cè)> 6. 0次轉(zhuǎn)體/min的動(dòng)物納入研究中(η = 54) ο20只確認(rèn)有6-0HDA損害的大鼠基于它們?cè)趫A筒實(shí)驗(yàn)和在安非他明_和阿樸嗎啡-誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)中的表現(xiàn)平均分配至兩組中(Les-Sham和TH-GCH1)(圖3)。損害后6周吋，TH-GCHl組中的動(dòng)物接受立體定向注射3. 5E10 gcrAAV5-TH:GCHl載體，對(duì)照組接受假手木，手術(shù)包括打開頭皮，在正確的部位鉆孔，但不穿透硬腦膜。在rAAV注射后第5周和第10周，使用相同的藥物誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行再次測(cè)試。在rAAV后第5、第9和第13周，在相同的旋轉(zhuǎn)流量計(jì)設(shè)備中在不存在先前藥理學(xué)激發(fā)的情況下對(duì)動(dòng)物評(píng)分(自主旋轉(zhuǎn))。在注射后第5、第12和第14周還重復(fù)了圓筒實(shí)驗(yàn)。為了研究對(duì)運(yùn)動(dòng)學(xué)習(xí)、感覺運(yùn)動(dòng)整合以及運(yùn)動(dòng)功能的治療效果，一旦充分表現(xiàn)出治療的療效就開始進(jìn)行踏步、爬梯和走廊實(shí)驗(yàn)的訓(xùn)練。在rAAV注射后第5、第10和第12周時(shí)進(jìn)行踏步實(shí)驗(yàn)。在轉(zhuǎn)導(dǎo)后第22-24周之間，在21天內(nèi)以單實(shí)驗(yàn)階段進(jìn)行爬梯實(shí)驗(yàn)。然后將動(dòng)物進(jìn)行走廊實(shí)驗(yàn)并在第28周時(shí)處死。40只確認(rèn)有6-0HDA損害的大鼠基于它們?cè)趫A筒實(shí)驗(yàn)、踏步實(shí)驗(yàn)和走廊實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)平均分配至4組中。在損害后第6周，動(dòng)物立體定向注射以等體積的rAAV5-TH:GCHl載體[5μ1]。接受遞增濃度的載體制劑的四組形成下面的四個(gè)劑量組0. 7% [9. IESgc]GCHl-TH(η = 10) ,3. 4% [4. 6E9gc]GCHl-TH(η = 10) ,9. 8% [I. 3E10gc]GCHl-TH(η = 10)， 100% [I. 3Ellgc]GCHl-TH(η = 10)。包括相同大小的、未處理的、年齡匹配的對(duì)照組作為參照(η = 10)。在6-0HDA損害后第5周(在AAV注射前)和AAV后第12周在走廊實(shí)驗(yàn)中對(duì)動(dòng)物進(jìn)行評(píng)分。8只確認(rèn)有6-0HDA損害的動(dòng)物基于它們?cè)谧呃葘?shí)驗(yàn)和在安非他明-誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)中的表現(xiàn)平均分配至2組中(Les-Sham和TH-GCH1)。TH-GCHl組中的動(dòng)物接受如下所述的全滴度AAV5-TH:GCH1載體的立體定向注射，并且在AAV注射后最少第6個(gè)月時(shí)使用在線微量透析進(jìn)行評(píng)估。將所有動(dòng)物斷頭并迅速地去除大腦，切除紋狀體組織并快速冷凍用于生物化學(xué)分析。中腦被后固定在4%多聚甲醛(PFA)中用于確認(rèn)6-0HDA損害。載體構(gòu)建本研究中利用的病毒載體是假型rAAV2/5載體，其中目的轉(zhuǎn)基因的側(cè)翼為包裝在AAV5衣殼中的AAV2(本文稱為簡(jiǎn)單rAAV)的反向末端重復(fù)序列。在本發(fā)明中，構(gòu)建了表達(dá)轉(zhuǎn)基因TH和GCHl兩者的新型質(zhì)粒。在此，兩個(gè)表達(dá)盒融合至單個(gè)AAV2質(zhì)粒中。TH和GCHl在人突觸蛋白I(Syn-I)啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。GCHl基因之后緊接著晩期SV40poly-A序列，所述序列在控制TH基因表達(dá)的第二 Syn-I啟動(dòng)子之前。為了獲得超過GCHl的TH基因表達(dá)，通過添加土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)來改善TH mRNA的運(yùn)輸。完整的序列的末端是早期SV40poly-A序列(圖I)。rAAV載體使用雙轉(zhuǎn)染法采用適宜的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和含有必要的腺病毒包裝基因的輔助質(zhì)粒來制備，如以前所述[Grimm等人Novel toolsior production and purification of recombinant adenoassociated virus vectors ；Hum Gene Ther 1998182745-60 ；Hauswirth 等人Production and purification ofrecombinant adeno-associated virus ；Meth Enzymol 2000 316743-61]。之后通過碘克沙醇不連續(xù)梯度和瓊脂糖Q柱色譜將它們純化，如在別處所詳述的那樣[Ulusoy等人=DoseOptimization for Long-term rAAV—mediated RNA Interference in the Nigrostriata丄Projection Neurons ；Mol Ther 2009171574-84]。純化的病韋載體懸浮液使用 TaqMan 定量PCR進(jìn)行滴定，如在別處所述的那樣[Ulusoy等人Dose Optimization for Long-termrAAV—mediated RNA Interference in the Nigrostriatal Projection Neurons ；MoiTher 2009171574-84])，但采用靶向WPRE序列的引物和探針。注射的載體懸浮液的最終效價(jià)為 I. 0E13gc/m。手術(shù)操作在以約6ml/kg的總體積經(jīng)腹膜內(nèi)注射的芬太尼和Dormitor (美托咪定)(Apoteksbolaget, Sweden)的20 : I混合物誘導(dǎo)的麻醉下進(jìn)行所有手術(shù)操作。使用10 μ I漢密爾頓氏注射器(Hamilton syringe)對(duì)裝在立體定向框架(Stoelting,Wood Dale, IL)中的動(dòng)物進(jìn)行注射。從前囟計(jì)算前后位(AP)和中間外側(cè)(ML)坐標(biāo)，以及從硬腦膜表面計(jì)算背腹(DV)坐標(biāo)[Watson 和 Paxinos The rat brain in stereotaxic coordinates ；Academic Press San Diego 1986]06-0HDA 損害。動(dòng)物接受 6-0HDA (Sigma-Aldrich AB, Sweden)注射，6-0HDA 注射至右側(cè)MFB (以3. 5 μ g/μ I的濃度注射的14 μ g在抗壞血酸鹽-鹽水中的游離堿(O. 02% ))以便達(dá)到黑質(zhì)紋狀體的完全損害[Ungerstedt和Arbuthnott !Quantitative recordingof rotational behavior in rats after 6-hydroxy-dopamme lesions oi thenigrostriatal dopamine system Brain Res 1970 24 485-93]。在下面的坐標(biāo)處進(jìn)行注射AP :-4. 4mm ;ML :-1. 2mm 和 DV :-7. 8mm，門牙固定桿(tooth bar)設(shè)為 _2· 4mm[Carlsson等人 serotonin neuron transplants exacerbate L-DOPA-induced dyskinesias in arat model of Parkinsonr s disease .I Neurosci 200727 8011-22]。使用與漢密爾頓氏注射器連接的26號(hào)針頭以I μ 1/min的注射速度進(jìn)行注射，并使針頭保持在合適的位置額外3min之后將其緩慢撤出。rAAV載體注射。載體治療組中的動(dòng)物接受在林格氏乳酸鹽懸浮液中的5 μ lrAAV5載體的立體定向注射。在下列的坐標(biāo)處以ー個(gè)I. 5μ I和ー個(gè)1μ I沉淀物沿兩個(gè)針道中的甸ー個(gè)進(jìn)行注射(1)AP:+1. Omm ；ML :-2. 6mm 和 DV :-4. 5，-3. 5mm 以及(2) AP :0mm ；ML -3. 2mm和DV :-5. 0，-4. Omm，門牙固定桿設(shè)為_2. 4mm。使用安裝在與漢密爾頓氏注射器連接的22s號(hào)針頭上的拉長玻璃毛細(xì)管(外徑60-80 μ m直徑)進(jìn)行注射。注射速率為
O.4 μ 1/min,并且在遞送第一沉淀物后使針頭保持在合適的位置lmin，以及在遞送第二沉淀物后保持3min，然后在從腦實(shí)質(zhì)緩慢撤出針頭。行為測(cè)試藥物誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)通過使用自動(dòng)旋轉(zhuǎn)流量計(jì)碗(rotometer bowl) (AccuScanInstruments Inc.，Columbus，Ohio)在注射硫酸 D-安非他明(2. 5mg/kg，ip ；Apoteksbolaget, Sweden)或阿樸嗎卩非-HCl (0. 05mg/kg，sc ;Sigma_Aldrich AB，Sweden)后測(cè)量左側(cè)和右側(cè)轉(zhuǎn)體，井分別監(jiān)測(cè)90和40min來評(píng)估。旋轉(zhuǎn)不對(duì)稱評(píng)分表示為完全360°轉(zhuǎn)體次數(shù)/min，同側(cè)轉(zhuǎn)動(dòng)(即，朝向注射側(cè))被賦為正值。圓筒實(shí)驗(yàn)評(píng)估前肢利用不對(duì)稱性，其基本上如[Kirik 等Growth and functional efficacy of intrastriatal nigraltransplants depend on the extent of nigrostriatal degeneration ；.T Neurosci2001212889-96]所述的那樣進(jìn)行，根據(jù)[Schallert 和 Tillerson !Innovative models ofcns disease irom molecule to therapy. Intervention strategies for degenerationof dopamine neurons in parkinsonism-optimising behavioral assessment ofoutcome ；1999 131-51]進(jìn)行微小的改動(dòng)。大鼠個(gè)別地放置在20cm玻璃杯中并允許其自由移動(dòng)，同時(shí)用數(shù)碼視頻照相機(jī)記錄。兩個(gè)垂直的鏡子置于玻璃杯后，使杯子的全部表面均可以清晰地在屏幕上看到。將動(dòng)物留置在杯中直至觀察到觸碰杯壁至少20次。然后由對(duì)動(dòng)物的分組身份不了解的觀察者使用逐幀分析離線對(duì)在此探查階段期間在杯壁上前肢的放置和使用進(jìn)行評(píng)分。對(duì)在飼養(yǎng)期間在與杯壁20次接觸期間使用的爪進(jìn)行評(píng)分，并且當(dāng)左前爪觸碰時(shí)表示為總觸碰次數(shù)的百分比。在此實(shí)驗(yàn)中，正常動(dòng)物按平均50%記分。踏步(前肢運(yùn)動(dòng)不能)實(shí)驗(yàn)。前肢運(yùn)動(dòng)不能由對(duì)個(gè)體大鼠的分組身份不了解的研究者使用踏步實(shí)驗(yàn)來評(píng)估，所述踏步實(shí)驗(yàn)最初由[Schallert等人Excessive bracing reactions and theircontrol by atropine and L-DOPA in an animal analog of Parkinsonism ；Exp Neurol19796433-43]描述，改良為根據(jù)[Olsson等人Forelimb akinesia in the rat Parkinsonmodel !differential effects of dopamine agonists and nigral transnlants asassessed by a new stepping test .T Neurosci 1995 15 3863-75]的側(cè)-踏步實(shí)驗(yàn)，并且如以前所述[Winkler 等人L-DOPA-induced dyskinesia in the intrastriatal6-hydroxydopamine model of parkinson' s disease relation to motor and cellularparameters of nigrostriatal function Neurobiol Dis 2002 10 165-86]被米納。簡(jiǎn)
言之，研究者使用兩手僅僅抓住大鼠舉起大鼠的后爪和一只前爪離開桌子但使未受限制的爪子接觸桌子表面。然后動(dòng)物在規(guī)定的90cm距離內(nèi)跨越桌子表面以緩慢恒定的步幅在5s的時(shí)間內(nèi)移動(dòng)。研究者對(duì)正手和反手兩個(gè)方向上調(diào)整側(cè)步的次數(shù)評(píng)分兩次，并計(jì)算平均值。在6-0HDA-損害后第三周內(nèi)對(duì)動(dòng)物訓(xùn)練4天。當(dāng)動(dòng)物已經(jīng)達(dá)到穩(wěn)定的基線能力的第5-7天的平均評(píng)分形成最終的因變量。來自此時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)構(gòu)成治療前基線評(píng)分。因此，最后三天的平均值用作治療前的能力評(píng)分。在隨后的三個(gè)實(shí)驗(yàn)階段，rAAV注射后第6-、9_和12-周，首先馴化動(dòng)物熟悉實(shí)驗(yàn)I天或兩天，然后連續(xù)評(píng)估三天。爬梯實(shí)驗(yàn)用來評(píng)估熟練的前肢伸出和抓握能力，所述實(shí)驗(yàn)采用對(duì)由[Montoya等人The 〃 staircase test " a measure of independent forelimb reaching andgrasping abilities in rats .T Neurosci Methods 1991 36 219-28]所述的最初實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的改良形式來進(jìn)行，其如以前記載為[Winkler等人Intranigral transplants ofGABA-rich striatal tissue induce behavioral recovery in the rat Parkinson moaeland promote the effects obtained by intrastriatal dopaminergic transrlants ；Exp Neurol 1999 155165-86]。糖丸(TestDiet，Richmond，VA)放置在由一個(gè)寬的中央平臺(tái)(35mm)隔開的雙層樓梯的臺(tái)階上,所有都包封在ー個(gè)小的樹脂玻璃盒子(285x60x90mm)中。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)日前動(dòng)物禁食48小時(shí)，并在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期期間保持受限的食物攝入出-Sg/天)，僅在每天實(shí)驗(yàn)階段后給予食物。以rAAV注射后21周為單個(gè)階段進(jìn)行爬梯實(shí)驗(yàn)。在爬梯實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物訓(xùn)練連續(xù)21天(15min/天)，在兩側(cè)臺(tái)階2-5的每個(gè)上面放置10個(gè)糖丸(總計(jì)40個(gè)糖丸/側(cè))，其中第I天規(guī)定為大鼠開始查找糖丸的第一日。來自第11-15天的數(shù)據(jù)用作穩(wěn)定能力的評(píng)分。在第16-18天和第19-21天時(shí)，糖丸僅分別放置在左側(cè)和右側(cè)擱板上，給予大鼠強(qiáng)迫選擇的挑戰(zhàn)。熟練的前肢能力表示為帕金森(左)側(cè)上的食入的糖丸數(shù)目(獲取的-掉落的)。失誤率定義為掉落的百分比((獲取的-食入的/獲取的)X 100)。走廊實(shí)驗(yàn)在6-0HDA MFB損害后第5周、AAV注射前(規(guī)定的損害基線)第12周或AAV注射后第25周時(shí)進(jìn)行，如以前所述[Dowd等人The Corridor Task a simpletest of lateralised response selection sensitive to unilateral dopaminedeafferentation and graft-derived dopamine replacement in the striatum ；BrainRes Bull 20056824-30]，以研究單側(cè)感覺運(yùn)動(dòng)反應(yīng)選擇。簡(jiǎn)言之，將大鼠放置在走廊的ー端(150cmX7cmX 23cm)，走廊有10對(duì)相鄰的蓋子，均勻地沿地板分布。每個(gè)蓋子裝有5_10個(gè)糖丸。查找(Retrieval)定義為毎次大鼠將其鼻子伸到唯一的杯子中，無論是否它吃到任何糖丸。不與其他查找交叉的再訪不計(jì)分。測(cè)試每只大鼠直至做出20次查找或經(jīng)過了5分鐘的最大時(shí)間。在測(cè)試前和整個(gè)測(cè)試期間限制大鼠食物，如以上在爬梯實(shí)驗(yàn)中所述，并且在糖丸沿地板散落的走廊中馴化10分鐘，持續(xù)兩天。為了減少探查行為，在評(píng)分之前將大鼠放置在空走廊中。然后將大鼠評(píng)分4天，結(jié)果表示為最后兩天的平均值。數(shù)據(jù)表示為作為總查找次數(shù)的百分比的對(duì)側(cè)查找的次數(shù)。生化分析12只大鼠通過斷頭處死，之后取出大腦并使用大腦模具沿冠狀軸切成兩部分。然 后將來自前部的每個(gè)半球的紋狀體組織迅速切下并分別在干冰上冷凍，并保存在_80°C直至進(jìn)ー步分析。包含中腦-后腦區(qū)的尾部在4%多聚甲醛(PFA)中在4°C后固定24小時(shí)，然后在25%蔗糖中保持至少24小吋。使用前述實(shí)驗(yàn)方案的改良形式將切開的腦組織勻漿和制備，所述改良實(shí)驗(yàn)方案使得能夠從同一樣品通過高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)單胺和BH4，以及體外 TH 活性和 western 印跡分析[Romero-Ramos 等人Low selenium diet inducestyrosine hyaroxylase enzyme in nigrostriatal system of the rat :Brain Res Mo_lBrain Res 2000847-16]。簡(jiǎn)言之，使用超聲波粉碎器在在冰上在Tris-こ酸鹽緩沖液(5 μ 1/mg, 20mM, pH 6. I)中勻漿。然后將100 μ I勻漿液吸入至等體積的冰冷的O. 8mM高氯酸中用于HPLC測(cè)量。剩余的勻漿液以17，000\8在4で離心101^11。40 μ I上清液進(jìn)ー步在10 μ I包含O. 6% Triton X-100的Tris-こ酸鹽緩沖液(20mM，pH 6. I)中進(jìn)ー步稀釋并在_20°C保存用于體外TH活性測(cè)定。微量透析在異氟醚麻醉下進(jìn)行微量透析實(shí)驗(yàn)(圖8)。具有3mm長半透膜(35kD截止PES膜，Microbiotech AB)的微量透析探針在下述的坐標(biāo)處插入至右側(cè)(損害和切開的(transdiced))紋狀體中AP :+0. 5mm ;ML :-2. 9mm 和 DV :-4. 25, -3. 5mm 和(2) AP Omm ；ML :-3. 2mm 和 DV :-5. 5，門牙固定桿設(shè)為 _2. 4mm。使用 CSF 以 O. 67 μ 1/min 的流速?zèng)_洗探針，填充直連式HPLC-EC設(shè)備的注射環(huán)使得能夠用15分鐘的時(shí)間分辨率進(jìn)行分析。如以前所述檢測(cè)和定量DA和代謝物(Ulusoy等人· Presynaptic dopaminergiccompartment determines the susceptibility to L-DOPA—inducea dysKinesia in rats.ProcNatlAcadSci USA (2010) vol. 107 (29) pp. 13159-64)。數(shù)據(jù)表示為在探針植入后平衡最少I小時(shí)后采集的三次連續(xù)測(cè)量的平均值。 單胺和BH4的HPLC分析高氯酸中的組織勻漿液在離心(15min，9, 000Xg,4°C )前在冰上孵育至少20min。通過Whatman濾板式過濾器以9，OOOXg過濾上清液另外2min。之后，樣品在Mili-Q過濾的去離子水中以I : 4稀釋，并在-80°C中保存直至進(jìn)行分析。組織提取物然后在三個(gè)獨(dú)立的測(cè)量中通過HPLC-EC分析(I)DA和血清素(5_HT) ； (2)DOPA ；^P (3)BH4。對(duì)于每次測(cè)量,25 μ I姆種樣品通過冷卻的自動(dòng)進(jìn)樣器(Spark Holland Midas)注射至與防護(hù)池(guard cell) (ESA 5020)和玻璃-碳電極分析池(ESA 5011)連接的電化學(xué)檢測(cè)器(ESACoulochem III)。對(duì)于 DA/5-HT 和 DOPA 檢測(cè)，反相 C18 柱(3 μ m ReproSi 1-pur, 4. 6mm 0,150mm長，Chrompack)用于化合物分離，而對(duì)于BH4檢測(cè),其更換為另一反相C18柱(5 μ mReproSi 1-pur, 4. 6mm 0，250mm 長，Chrompack)，其前面是 C8 柱(5μηι ReproSil 80,4. 6mm 0. 33mm 長，Chrompack)。用于DA/5-HT檢測(cè)的流動(dòng)相包含60mM醋酸鈉、90 μ M Na2-EDTA、9 %甲醇中的460 μ M I-辛烷磺酸，其中pH調(diào)整為4. 2。對(duì)于DOPA檢測(cè)，其包含用H3PO4調(diào)整至pH 3.0的IOOmM NaH2P04、90yM Na2_EDTA、10%甲醇中的ImM辛基硫酸鈉。另ー方面，用于BH4檢測(cè)的流動(dòng)相由以前描述的EC BH4檢測(cè)方案進(jìn)行改良[HowelIs和Hyland Direct analysisof tetrahydrobiopterm in cerebrospinal iluid by high-periormance liquidchromatography with redox electrochemistry prevention of autoxidation duringstorage and analysis Clin Chim Acta 1987 167 23-30]并由 50mM醋酸鈉、5mM朽1 樣酸、48 μ M EDTA、5%甲醇中的160μΜ DTE組成，pH 5.2。對(duì)于兒茶酚胺，流動(dòng)相以500 μ 1/min的流速遞送，對(duì)于BH4以lml/min的流速遞送。使用清晰色譜軟件包(DataApex, Prague,Czech Republic)進(jìn)行峰鑒定和定量。組織學(xué)分析8只動(dòng)物通過過量使用戍巴比妥鈉(Apoteksbolaget, Sweden)進(jìn)行深麻醉，并用50ml生理鹽水溶液，然后用250ml新鮮制備的冰冷的在調(diào)整至pH = 7. 4的0. IM磷酸鹽緩沖液中的4% PFA心臟灌流。取出大腦并在相同的溶液中后固定2小時(shí)，然后在25%蔗糖中低溫保護(hù)24-48小時(shí)，然后切片。固定的大腦和后固定的中腦區(qū)在半自動(dòng)冷凍切片機(jī)(MiciOm HM 450)上切成40 μ m冠狀切片，并收集成6個(gè)系列并在-20°C保存在抗凍液(0. 5M磷酸鈉緩沖液，30%甘油和30%こニ醇)中直至進(jìn)ー步處理。使用針對(duì)TH的抗體(兔IgG I 10，000 61ザ代62，1 (^6”410，和針對(duì)6011的抗體(定制的兔186，1 5，000)進(jìn)行免疫組織化學(xué)。使用生物素化ニ抗(羊抗兔BA1000,Vector Laboratories,Burlingame,CA),然后與抗生物素蛋白-生物素過氧化物酶溶液(ABC Elite, Vector Laboratories)孵育I小時(shí)，通過3，3’ - ニ氨基聯(lián)苯胺在0. 01% H202中的顯色反應(yīng)顯色而將染色可視化。實(shí)施例2 :劑量計(jì)算在完全多巴胺去神經(jīng)的大鼠模型中利用單載體AAV介導(dǎo)的DOPA遞送在嚙齒動(dòng)物研究中的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)使我們能夠精確地確定功能恢復(fù)所需要的劑量范圍。通過仔細(xì)的評(píng)價(jià)，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)9. lE8gc GCHl-TH(確定為0.7%，表1A)的劑量在走廊實(shí)驗(yàn)中導(dǎo)致10只動(dòng)物中的2只出現(xiàn)明顯的康復(fù)。下一個(gè)劑量4. 6E9gc GCHl-TH(3. 4% )導(dǎo)致10只動(dòng)物中8只康復(fù)，而測(cè)試的兩個(gè)最高劑量 I. 3E10gc GCHl-TH(9. 8% )和 I. 3Ellgc GCHl-TH(100% )在此實(shí)驗(yàn)中能夠使10只動(dòng)物中的10只全部康復(fù)。然而100%的劑量導(dǎo)致更快速的康復(fù)，在手術(shù)后第3周時(shí)就已經(jīng)完全康復(fù)。為了計(jì)算在非人靈長類動(dòng)物和人中的等效劑量，基于關(guān)于MR和組織學(xué)評(píng)價(jià)的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)計(jì)算殼核區(qū)的換算系數(shù)(表1B)。這些數(shù)據(jù)提供了嚙齒動(dòng)物和人之間的換算系數(shù)為I 60。這些數(shù)字使得能夠計(jì)算物種之間的等效總劑量(表1C)，并且還確認(rèn)基于目前可達(dá)到的病毒生產(chǎn)滴度，這樣的劑量是可行的?；诩僭O(shè)生產(chǎn)滴度3E13gc/ml，注射劑量/人殼核將落在I. 82 μ I至260 μ I之間(表1D)。對(duì)于適應(yīng)在殼核體積和體重方面的個(gè)體患者差異的精確度，劑量被重新定義為 gc/cm3殼核灰質(zhì)或kg體重(表1E)。另外,基于載體基因組的分子量(1.4g/ymol)生成了對(duì)于載體制劑的Ug單鏈DNA(ssDNA)的等效量。表1，治療性劑量范圍的定義表1A，劑量定義
權(quán)利要求
1.一種單載體表達(dá)系統(tǒng)，包含 a)第一和第二表達(dá)盒，所述第一表達(dá)盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含與第一核苷酸序列可操作地連接的第一啟動(dòng)子序列，所述第一核苷酸序列編碼GTP-環(huán)化水解酶I(GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，并且其中所述第二表達(dá)盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含與第二核苷酸序列可操作地連接的第二啟動(dòng)子序列，所述第二核苷酸序列編碼酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，條件是所述載體不包含編碼芳香族氨基酸脫羧酶(AADC)多肽的核苷酸序列，或 b)第一和第二表達(dá)盒，所述第一表達(dá)盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含與第一核苷酸序列可操作地連接的第一啟動(dòng)子序列，所述第一核苷酸序列編碼GTP-環(huán)化水解酶I(GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，并且其中所述第二表達(dá)盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含與第二核苷酸序列可操作地連接的第二啟動(dòng)子序列，所述第二核苷酸序列編碼酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，其中所述載體是腺相關(guān)病毒載體(AAV)，或 c)表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含啟動(dòng)子、第一核苷酸序列、翻譯起始核苷酸序列諸如內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)和第二核苷酸序列，其中所述啟動(dòng)子與所述第一核苷酸序列可操作地連接，并且其中所述翻譯起始核苷酸序列連接所述第一和所述第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列編碼GTP-環(huán)化水解酶I (GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，并且其中所述第二核苷酸序列編碼酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，或 d)表達(dá)盒,所述表達(dá)盒包含第一核苷酸序列、翻譯起始核苷酸序列諸如內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)和第二核苷酸序列，其中所述翻譯起始核苷酸序列連接所述第一和所述第二核苷酸序列，并且其中包含所述第一核苷酸序列——所述第一核苷酸序列連接至所述翻譯起始核苷酸序列，所述翻譯起始核苷酸序列連接至所述第二核苷酸序列——的序列的側(cè)翼是5’和3’末端重復(fù)序列，并且其中所述第一核苷酸序列編碼GTP-環(huán)化水解酶I (GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，并且其中所述第二核苷酸序列編碼酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，其中所述末端重復(fù)序列中的至少ー個(gè)包含能夠指導(dǎo)可操作地連接的多肽表達(dá)的序列。
2.權(quán)利要求Ia)所述的載體，其中由所述第一表達(dá)盒表達(dá)的所述GTP-環(huán)化水解酶I (GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由下列各項(xiàng)組成的群組的多肽至少70%相同SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQID NO. 4、SEQ ID NO. 5 和 SEQID NO. 6，并且其中由所述第二表達(dá)盒表達(dá)的所述酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由下列各項(xiàng)組成的群組的多肽至少70%相同SEQ ID NO. 7、SEQ IDNO. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO.13 和 SEQIDNO. 14。
3.權(quán)利要求Ib)所述的載體，其中被表達(dá)的所述GTP-環(huán)化水解酶I(GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，其中所述多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由下列各項(xiàng)組成的群組的多肽至少 70%相同SEQ ID NO. I、SEQ IDNO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6，并且其中由所述第二表達(dá)盒表達(dá)的所述酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由下列各項(xiàng)組成的群組的多肽至少70%相同SEQID NO. 7, SEQ ID NO. 8,SEQ ID NO. 9,SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ IDNO. 12、SEQ IDNO. 13 和 SEQ ID NO. 14。
4.權(quán)利要求lc)所述的載體，其中被編碼的GTP-環(huán)化水解酶I(GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由下列各項(xiàng)組成的群組的多肽至少70%相同SEQ ID NO. I、SEQID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6，并且其中被編碼的酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由下列各項(xiàng)組成的群組的多肽至少 70%相同SEQ ID NO. 7,SEQ ID NO. 8,SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. IUSEQID NO. 12、SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14。
5.權(quán)利要求Id)所述的載體，其中被編碼的GTP-環(huán)化水解酶I(GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由下列各項(xiàng)組成的群組的多肽至少70%相同SEQ ID NO. I、SEQID NO. 2,SEQ ID NO. 3,SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5和 SEQ ID NO. 6，并且其中被編碼的酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由下列各項(xiàng)組成的群組的多肽至少 70%相同SEQ IDNO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQIDNO. 12、SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14。
6.權(quán)利要求I至5中任一項(xiàng)所述的載體，其中所述載體不包含編碼芳香族氨基酸脫羧酶(AADC)多肽的核苷酸序列。
7.權(quán)利要求I所述的載體，其中所述載體具有I至40kb,例如I至30kb,諸如I至20kb,例如I至15kb,諸如I至10,例如I至8kb,諸如2至7kb,例如3至6kb,諸如4至5kb的包裝容量。
8.權(quán)利要求I所述的載體，其中所述載體具有4.5至4. Skb的包裝容量。
9.權(quán)利要求I至8中任一項(xiàng)所述的載體，其中所述載體是病毒載體。
10.權(quán)利要求I至8中任一項(xiàng)所述的載體，其中所述載體是質(zhì)粒載體。
11.權(quán)利要求I至8中任一項(xiàng)所述的載體，其中所述載體是合成載體。
12.權(quán)利要求9所述的載體，其中所述病毒載體選自由下列各項(xiàng)組成的群組腺相關(guān)病毒載體(AAV)、慢病毒載體、腺病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
13.權(quán)利要求9所述的載體，其中所述病毒載體是腺相關(guān)病毒載體(AAV)。
14.權(quán)利要求12所述的載體，其中所述腺相關(guān)病毒載體(AAV)是AAV2載體。
15.權(quán)利要求14所述的載體，其中所述AAV2載體的衣殼包裝在不同于AAV2衣殼的AAV衣殼中。
16.權(quán)利要求15所述的載體，其中所述AAV2載體包裝在AAV5衣殼中。
17.權(quán)利要求I至16中任一項(xiàng)所述的載體，其中所述載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中起作用。
18.權(quán)利要求I至5中任一項(xiàng)所述的載體，其中所述生物學(xué)活性片段包含至少50個(gè)連續(xù)氨基酸，其中所選擇序列中指定的任一個(gè)氨基酸被改變?yōu)椴煌陌被幔运鲂蛄兄胁欢嘤?5個(gè)氨基酸殘基被這樣改變?yōu)闂l件。
19.權(quán)利要求18所述的載體，其中所述生物學(xué)活性片段是酪氨酸羥化酶的催化結(jié)構(gòu)域。
20.權(quán)利要求I所述的載體，其中所述生物學(xué)活性變異體是突變的酪氨酸羥化酶多肽，其中殘基S19、S31、S40或S404中的一個(gè)或多個(gè)已經(jīng)被改變?yōu)榱硪粋€(gè)氨基酸殘基。
21.權(quán)利要求I至20中任一項(xiàng)所述的載體，其中所述GTP-環(huán)化水解酶I(GCHl)多肽與選自由 SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ IDNO. 4、SEQ ID NO. 5 和 SEQ IDNO. 6組成的群組的多肽至少70%相同，更優(yōu)選與選自由SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2、SEQID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6組成的群組的多肽至少75%相同，更優(yōu)選與選自由 SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ IDNO. 5 和 SEQID NO. 6組成的群組的多肽至少80%相同，更優(yōu)選與選自由SEQID NO. USEQ ID NO. 2、SEQID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6組成的群組的多肽至少85%相同，更優(yōu)選與選自由 SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 和 SEQIDNO. 6組成的群組的多肽至少9 0%相同，更優(yōu)選與選自由SEQ ID NO. I、SEQID NO. 2、SEQID NO. 3,SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6組成的群組的多肽至少95%相同，更優(yōu)選與選自由肽 SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2,SEQ ID NO. 3,SEQ ID NO. 4,SEQ ID NO. 5 和 SEQID NO. 6組成的群組的多肽至少96%相同，更優(yōu)選與選自由SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2、SEQIDNO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6組成的群組的多肽至少97%相同，更優(yōu)選與選自由 SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 和 SEQID NO. 6組成的群組的多肽至少98%相同，更優(yōu)選與選自由SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2、SEQID NO. 3,SEQ IDNO. 4、SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6組成的群組的多肽至少99%相同，更優(yōu)選與選自由 SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 和 SEQID NO. 6組成的群組的多肽I O O %相同。
22.權(quán)利要求I至20中任一項(xiàng)所述的載體，其中所述酪氨酸羥化酶(TH)多肽與選自由 SEQ ID NO. 7,SEQ ID NO. 8,SEQ ID NO. 9,SEQ ID NO. 10,SEQ ID NO. IUSEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 14組成的群組的多肽至少70%相同，更優(yōu)選與選自由SEQ IDNO. 7,SEQ ID NO. 8,SEQ IDNO. 9、SEQ ID NO. 10,SEQ ID NO. IUSEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13和SEQID NO. 14組成的群組的多肽至少75%相同，更優(yōu)選與選自由SEQ ID NO. 7、SEQ IDNO. 8,SEQ ID NO. 9,SEQ ID NO. 10,SEQ ID NO. IUSEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13 和 SEQ IDNO. 14組成的群組的多肽至少80%相同，更優(yōu)選與選自由SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQID NO. 9,SEQ ID NO. 10,SEQ IDNO. IUSEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14 組成的群組的多肽至少85%相同，更優(yōu)選與選自由SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14 組成的群組的多肽至少90%相同，更優(yōu)選與選自由SEQ ID NO. 7、SEQ IDNO. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ IDNO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14 組成的群組的多肽至少95%相同，更優(yōu)選與選自由 SEQ ID NO. 7,SEQ ID NO. 8,SEQ ID NO. 9,SEQ ID NO. 10,SEQID NO. IUSEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13和 SEQ ID NO. 14組成的群組的多肽至少96%相同，更優(yōu)選與選自由 SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ IDNO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 14組成的群組的多肽至少97%相同，更優(yōu)選與選自由 SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. IUSEQ IDNO. 12、SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 14組成的群組的多肽至少98%相同，更優(yōu)選與選自由SEQ IDN0.7、SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. IUSEQ IDNO. 12、SEQID NO. 13和SEQ ID NO. 14組成的群組的多肽至少99%相同，更優(yōu)選與選自由SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8,SEQ ID NO. 9,SEQ ID NO. 10,SEQ ID NO. IUSEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13 和SEQ ID NO. 14組成的群組的多肽100%相同。
23.權(quán)利要求I所述的載體，其中所述第一和/或所述第二啟動(dòng)子是對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞特異的啟動(dòng)子。
24.權(quán)利要求23所述的載體，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是神經(jīng)細(xì)胞。
25.權(quán)利要求34所述的載體，其中所述神經(jīng)細(xì)胞是神經(jīng)元。
26.權(quán)利要求I所述的載體，其中所述第一啟動(dòng)子和所述第二啟動(dòng)子是突觸蛋白I啟動(dòng)子。
27.權(quán)利要求I所述的載體，其中所述第一啟動(dòng)子或所述第二啟動(dòng)子是突觸蛋白I啟動(dòng)子。
28.權(quán)利要求I所述的載體，其中所述啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子。
29.權(quán)利要求28所述的載體，其中所述組成型活性啟動(dòng)子選自由下列各項(xiàng)組成的群組CAG、CMV、AUbiC、RSV、EF-la、SV40、Mtl。
30.權(quán)利要求I所述的載體，其中所述啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
31.權(quán)利要求30所述的載體，其中所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子選自由下列各項(xiàng)組成的群組Tet-On, Tet-Off、Mo-MLV-LTR、Mxl、孕酮、RU486和雷帕霉素-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
32.權(quán)利要求I所述的載體，其中所述第一表達(dá)盒或所述第二表達(dá)盒還包含多聚腺苷酸化序列。
33.權(quán)利要求I所述的載體，其中所述第一表達(dá)盒和所述第二表達(dá)盒還包含多聚腺苷酸化序列。
34.權(quán)利要求32或33任ー項(xiàng)所述的載體，其中所述多聚腺苷酸化序列是SV40多聚腺苷酸化序列。
35.權(quán)利要求32至34中任ー項(xiàng)所述的載體，其中所述多聚腺苷酸化序列的5’與所述第一核苷酸序列和/或所述第二核苷酸序列的3’可操作地連接。
36.權(quán)利要求I所述的載體，其中編碼GTP-環(huán)化水解酶I(GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體的所述第一核苷酸序列包含SEQ ID NO. 18的序列。
37.權(quán)利要求I所述的載體，其中編碼酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體的所述第二核苷酸序列包含SEQ ID NO. 21的序列。
38.權(quán)利要求I至37中任ー項(xiàng)所述的載體，其中所述第二核苷酸序列與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件可操作地連接。
39.權(quán)利要求38所述的載體，其中所述轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件是土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)。
40.權(quán)利要求39所述的載體，其中所述土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件包含SEQIDNO. 22的序列ο
41.權(quán)利要求I至40中任ー項(xiàng)所述的載體，其中所述載體的所述表達(dá)盒包含5’末端重復(fù)序列和3’末端重復(fù)序列。
42.權(quán)利要求41所述的載體，其中所述5’和3’末端重復(fù)序列選自反向末端重復(fù)序列[ITR]和長末端重復(fù)序列[LTR]。
43.權(quán)利要求41所述的載體，其中所述5’和3’末端重復(fù)序列是AAV反向末端重復(fù)序列[ITR]。
44.權(quán)利要求43所述的載體，其中所述反向末端重復(fù)序列包含SEQIDN0. 15和SEQ IDNO. 16的序列。
45.權(quán)利要求I至44中任ー項(xiàng)所述的載體，其中TH GCHl的比率為至少3 : 1，諸如至少4 1，例如至少5 1，諸如至少6 1，例如至少7 1，諸如至少10 1，例如·15 1，諸如20 1，例如25 1，諸如30 1，例如35 1，諸如40 1，例如45 1，諸如 50 I。
46.權(quán)利要求I至44中任ー項(xiàng)所述的載體，其中所述TH GCHl的比率為7:1。
47.權(quán)利要求45至46中任ー項(xiàng)所述的載體，其中所述比率通過測(cè)量表達(dá)的TH和GCHl酶的活性來確定。
48.權(quán)利要求45至46中任ー項(xiàng)所述的載體，其中所述比率通過測(cè)量四氫生物蝶呤(BH4)的量來確定。
49.權(quán)利要求45至46中任ー項(xiàng)所述的載體，其中所述比率通過轉(zhuǎn)錄的mRNA的量來確定。
50.權(quán)利要求45至46中任ー項(xiàng)所述的載體，其中所述比率通過表達(dá)的蛋白質(zhì)的量來確定。
51.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的載體，其中所述載體是圖6中所限定的載體。
52.權(quán)利要求I至51中任ー項(xiàng)所述的載體，其中所述載體是最小整合型載體。
53.權(quán)利要求I至52中任ー項(xiàng)所述的載體，用作藥劑。
54.—種分離的宿主細(xì)胞，包含權(quán)利要求I至53中任ー項(xiàng)所述的載體。
55.權(quán)利要求54所述的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞選自由真核細(xì)胞組成的群組，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞，更優(yōu)選靈長類動(dòng)物細(xì)胞，更優(yōu)選人細(xì)胞。
56.權(quán)利要求55所述的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞選自由下列各項(xiàng)組成的群組中國倉鼠卵巢細(xì)胞、CHO-K1、幼倉鼠腎細(xì)胞、小鼠成纖維細(xì)胞-3T3細(xì)胞、非洲綠猴細(xì)胞系、大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞、AT3細(xì)胞、大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、大鼠神經(jīng)元細(xì)胞和大鼠海馬細(xì)胞。
57.權(quán)利要求I至56中任一項(xiàng)所述的載體在制備用于治療與兒茶酚胺功能失調(diào)相關(guān)的疾病的藥劑中的用途。
58.權(quán)利要求57所述的用途，其中所述兒茶酚胺功能失調(diào)是兒茶酚胺缺乏。
59.權(quán)利要求57所述的用途，其中所述兒茶酚胺功能失調(diào)是兒茶酚胺過多。
60.權(quán)利要求58所述的用途，其中所述兒茶酚胺缺乏是多巴胺缺乏。
61.權(quán)利要求59所述的用途，其中所述兒茶酚胺過多是多巴胺過多。
62.權(quán)利要求57至61中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述與兒茶酚胺功能失調(diào)相關(guān)的疾病是中樞和/或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的疾病、功能障礙或損害。
63.權(quán)利要求62所述的用途，其中所述中樞和/或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的疾病、功能障礙或損害是神經(jīng)退行性疾病。
64.權(quán)利要求57至63中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述與兒茶酚胺功能失調(diào)相關(guān)的疾病是基底神經(jīng)節(jié)的疾病。
65.權(quán)利要求64所述的用途，其中所述疾病選自由下列各項(xiàng)組成的群組帕金森氏病(PD)、DOPA反應(yīng)性肌張カ障礙、ADHD、精神分裂癥、抑郁癥、血管性帕金森綜合征、特發(fā)性震顫、慢性應(yīng)激、遺傳性多巴胺受體異常、阿片、可卡因、酒精或大麻的長期使用、腎上腺功能不全、高血壓、去甲腎上腺素缺乏癥、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙、病態(tài)性賭博、癡呆、路易體癡呆。
66.權(quán)利要求65所述的用途，其中所述神經(jīng)退行性疾病是帕金森氏病(PD)。
67.權(quán)利要求I至53中任ー項(xiàng)所述的載體，用于治療與兒茶酚胺功能失調(diào)相關(guān)的疾病的方法中。
68.權(quán)利要求67所述的載體，其中所述兒茶酚胺功能失調(diào)是兒茶酚胺缺乏。
69.權(quán)利要求67所述的載體，其中所述兒茶酚胺功能失調(diào)是兒茶酚胺過多。
70.權(quán)利要求68所述的載體，其中所述兒茶酚胺缺乏是多巴胺缺乏。
71.權(quán)利要求69所述的載體，其中所述兒茶酚胺過多是多巴胺過多。
72.權(quán)利要求67至71中任ー項(xiàng)所述的載體，其中所述與兒茶酚胺功能失調(diào)相關(guān)的疾病是中樞和/或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的疾病、功能障礙或損害。
73.權(quán)利要求72所述的載體，其中所述中樞和/或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的疾病、功能障礙或損害是神經(jīng)退行性疾病。
74.權(quán)利要求67至73中任ー項(xiàng)所述的載體，其中所述與兒茶酚胺功能失調(diào)相關(guān)的疾病是基底神經(jīng)節(jié)的疾病。
75.權(quán)利要求74所述的載體，其中所述疾病選自由下列各項(xiàng)組成的群組帕金森氏病(PD)、DOPA反應(yīng)性肌張カ障礙、ADHD、精神分裂癥、抑郁癥、血管性帕金森綜合征、特發(fā)性震顫、慢性應(yīng)激、遺傳性多巴胺受體異常、阿片、可卡因、酒精或大麻的長期使用、腎上腺功能不全、高血壓、去甲腎上腺素缺乏癥、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙、病態(tài)性賭博、癡呆、路易體癡呆。
76.權(quán)利要求75所述的載體，其中所述神經(jīng)退行性疾病是帕金森氏病(PD)。
77.一種治療需要所述治療的患者中的與兒茶酚胺功能失調(diào)相關(guān)的疾病的方法，所述方法包括向個(gè)體施用權(quán)利要求I至53中任ー項(xiàng)所述的載體。
78.權(quán)利要求77所述的方法，其中所述兒茶酚胺功能失調(diào)是兒茶酚胺缺乏。
79.權(quán)利要求77所述的方法，其中所述兒茶酚胺功能失調(diào)是兒茶酚胺過多。
80.權(quán)利要求78所述的方法，其中所述兒茶酚胺缺乏是多巴胺缺乏。
81.權(quán)利要求79所述的方法，其中所述兒茶酚胺過多是多巴胺過多。
82.權(quán)利要求77至81中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述與兒茶酚胺功能失調(diào)相關(guān)的疾病是中樞和/或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的疾病、功能障礙或損害。
83.權(quán)利要求82所述的方法，其中所述中樞和/或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的疾病、功能障礙或損害是神經(jīng)退行性疾病。
84.權(quán)利要求77至83中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述與兒茶酚胺功能失調(diào)相關(guān)的疾病是基底神經(jīng)節(jié)的疾病。
85.權(quán)利要求84所述的方法，其中所述疾病選自由下列各項(xiàng)組成的群組帕金森氏病(PD)、DOPA反應(yīng)性肌張カ障礙、ADHD、精神分裂癥、抑郁癥、血管性帕金森綜合征、特發(fā)性震顫、慢性應(yīng)激、遺傳性多巴胺受體異常、阿片、可卡因、酒精或大麻的長期使用、腎上腺功能不全、高血壓、去甲腎上腺素缺乏癥、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙、病態(tài)性賭博、癡呆、路易體癡呆。
86.權(quán)利要求84所述的方法，其中所述神經(jīng)退行性疾病是帕金森氏病(PD)。
87.一種用于治療帕金森氏病的方法中的藥物組合物，所述組合物包含單載體表達(dá)系統(tǒng)和用于將所述載體遞送至基底神經(jīng)節(jié)的制劑，其中所述單載體表達(dá)系統(tǒng)包含 a)第一和第二表達(dá)盒，所述第一表達(dá)盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含與第一核苷酸序列可操作地連接的第一啟動(dòng)子序列，所述第一核苷酸序列編碼GTP-環(huán)化水解酶I(GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，并且其中所述第二表達(dá)盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含與第二核苷酸序列可操作地連接的第二啟動(dòng)子序列，所述第二核苷酸序列編碼酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，條件是所述載體不包含編碼芳香族氨基酸脫羧酶(AADC)多肽的核苷酸序列，或 b)第一和第二表達(dá)盒，所述第一表達(dá)盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含與第一核苷酸序列可操作地連接的第一啟動(dòng)子序列，所述第一核苷酸序列編碼GTP-環(huán)化水解酶I(GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，并且其中所述第二表達(dá)盒包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含與第二核苷酸序列可操作地連接的第二啟動(dòng)子序列，所述第二核苷酸序列編碼酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，其中所述載體是腺相關(guān)病毒載體(AAV)，或 c)表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含啟動(dòng)子、第一核苷酸序列、翻譯起始核苷酸序列諸如內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)和第二核苷酸序列，其中所述啟動(dòng)子與所述第一核苷酸序列可操作地連接，并且其中所述翻譯起始核苷酸序列連接所述第一和所述第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列編碼GTP-環(huán)化水解酶I (GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，并且其中所述第二核苷酸序列編碼酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，或 d)表達(dá)盒,所述表達(dá)盒包含第一核苷酸序列、翻譯起始核苷酸序列諸如內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)和第二核苷酸序列，其中所述翻譯起始核苷酸序列連接所述第一和所述第二核苷酸序列，并且其中包含所述第一核苷酸序列——所述第一核苷酸序列連接至所述翻譯起始核苷酸序列，所述翻譯起始核苷酸序列連接至所述第二核苷酸序列——的序列的側(cè)翼是5’和3’末端重復(fù)序列，并且其中所述第一核苷酸序列編碼GTP-環(huán)化水解酶I (GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，并且其中所述第二核苷酸序列編碼酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，其中所述末端重復(fù)序列包含能夠指導(dǎo)可操作地連接的多肽表達(dá)的序列。
88.權(quán)利要求87a)所述的組合物，其中由所述第一表達(dá)盒表達(dá)的所述GTP-環(huán)化水解酶I(GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由下列各項(xiàng)組成的群組的多肽至少 70%相同SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2、SEQ IDNO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 和 SEQID NO. 6，并且其中由所述第二表達(dá)盒表達(dá)的所述酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由下列各項(xiàng)組成的群組的多肽至少70%相同SEQ ID NO. 7、SEQ IDNO. 8,SEQ ID NO. 9,SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. IUSEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13 和 SEQ IDNO. 14。
89.權(quán)利要求87b)所述的組合物，其中被表達(dá)的所述GTP-環(huán)化水解酶I(GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體，其中所述多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由下列各項(xiàng)組成的群組的多肽至少70%相同SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ IDNO. 4、SEQ ID NO. 5和SEQ IDNO. 6，并且其中由所述第二表達(dá)盒表達(dá)的所述酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由下列各項(xiàng)組成的群組的多肽至少70%相同SEQ ID NO. 7,SEQ ID NO. 8,SEQ ID NO. 9,SEQ ID NO. 10,SEQ ID NO. IUSEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14。
90.權(quán)利要求87c)所述的組合物，其中被編碼的GTP-環(huán)化水解酶I(GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由下列各項(xiàng)組成的群組的多肽至少70%相同SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6，并且其中所述被編碼的酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由下列各項(xiàng)組成的群組的多肽至少 70%相同SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ IDNO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14。
91.權(quán)利要求87d)所述的組合物，其中被編碼的GTP-環(huán)化水解酶I(GCHl)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由下列各項(xiàng)組成的群組的多肽至少70%相同SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2,SEQ ID NO. 3,SEQ ID NO. 4,SEQ ID NO. 5和 SEQ ID NO. 6，并且其中被編碼的酪氨酸羥化酶(TH)多肽或其生物學(xué)活性片段或變異體與選自由下列各項(xiàng)組成的群組的多肽至少70%相同SEQ ID NO. 7,SEQ ID NO. 8,SEQ ID NO. 9,SEQ ID NO. 10,SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14。
92.權(quán)利要求91所述的藥物組合物，其中所述制劑包含甘露醇、肝素或基于釓的MRI對(duì)比劑。
93.權(quán)利要求91至92中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，進(jìn)ー步包含營養(yǎng)因子或可逆蛋白酶體抑制劑。
94.ー種藥物組合物，包含權(quán)利要求I至53中任ー項(xiàng)所述的載體，和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
95.權(quán)利要求94所述的藥物組合物，被配制用于注射給藥、舌下含片或噴霧劑、皮膚給藥或吸入。
96.權(quán)利要求95所述的藥物組合物，其中所述注射是顱內(nèi)、腦內(nèi)、靜脈內(nèi)、玻璃體內(nèi)、鼻內(nèi)、肌內(nèi)、脊柱內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、推注或連續(xù)給藥。
97.根據(jù)權(quán)利要求91至96中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述組合物的pH在pH4至pH 10之間。
98.根據(jù)權(quán)利要求91至97中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述載體的劑量為每毫升殼核灰質(zhì)I. 5E+10至2. 2E+12之間個(gè)載體基因組拷貝。
99.根據(jù)權(quán)利要求91至98中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中以30分鐘至24小時(shí)的間隔進(jìn)行給藥。
100.根據(jù)權(quán)利要求91至98中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中以I至6小時(shí)的間隔進(jìn)行給藥。
101.根據(jù)權(quán)利要求91至98中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述治療的持續(xù)時(shí)間為6至72小時(shí)。
102.根據(jù)權(quán)利要求91至98中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述治療的持續(xù)時(shí)間為終生。
103.一種用于分別確定GTP環(huán)化水解酶I多肽(SEQ ID NO. 1、2、3、4、5和6)與酪氨酸羥化酶多肽(SEQ ID NO. 7、8、9、10、11、12、13和14)，或它們的變異體的表達(dá)比率的方法，所述多肽由權(quán)利要求I至53中任ー項(xiàng)所定義的載體編碼，所述方法包括測(cè)量 a.所述多肽的酶活性，或 b.產(chǎn)生的BH4的量，或 c.所述多肽的表達(dá)量，或 d.分別與GTP環(huán)化水解酶I多肽和酪氨酸羥化酶的多肽相對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄mRNA的水平。
104.權(quán)利要求103所述的方法，其中所述比率通過所述多肽的活性和所述多肽的存在量的組合來確定。
105.—種組件試劑盒,所述試劑盒包含權(quán)利要求91至102中任一項(xiàng)所述的藥物組合物和用藥說明書。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含編碼兩種多肽的序列的單載體表達(dá)系統(tǒng)，所述兩種多肽諸如酪氨酸羥化酶(TH)和GTP-環(huán)化水解酶1(GCH1)。這兩種多肽可應(yīng)當(dāng)優(yōu)選地以3∶1至15∶1之間，諸如3∶1至7∶1之間的比率表達(dá)。本發(fā)明可用于治療兒茶酚胺缺乏癥，諸如多巴胺缺乏癥包括但不限于帕金森氏病。此外，本發(fā)明提供了遞送載體構(gòu)建體的方法，以便將兒茶酚胺產(chǎn)生增加限制在有需要的細(xì)胞中。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102695526SQ201080061015
公開日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2010年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月9日
發(fā)明者安德斯·比約克倫德, 德尼茲·基里克, 托馬斯·比約克倫德 申請(qǐng)人:吉恩波多治療股份公司