專利名稱：生物活性移植物和復(fù)合物的制作方法
生物活性移植物和復(fù)合物相關(guān)申請的引用本申請是2009年12月13日提交的名為“生物活性移植物和復(fù)合物”的美國專利申請系列號12/636，751的繼續(xù)申請，其全部內(nèi)容通過引用并入本文并要求2008年12月13日提交的名為“衍生自生理流體生長刺激劑和制備其的方法”的美國臨時系列號61/201,612的權(quán)益，其全部內(nèi)容通過引用并入本文，以及2009年9月7日提交的名為“生物活性同種異體移植物和復(fù)合物”的美國臨時申請系列號61/240，283的權(quán)益，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。
背景技術(shù)：
不論是同種異體移植、自身移植還是異種移植的骨移植物可應(yīng)用于患有與骨骼結(jié)構(gòu)中的不穩(wěn)定或異常相關(guān)的疼痛或者其他異常疾病的患者。作為非限制性實例，患有脊椎不穩(wěn)定或者一塊或多塊椎骨運動過量的患者可以用脊柱融合術(shù)方法治療，包括去除處于兩 塊椎骨之間的部分椎間盤。然后可以將骨移植物或脊骨植入物或兩者的組合插入或圍繞去除椎間盤的區(qū)域以促進(jìn)兩塊鄰近椎骨的融合。這樣的骨移植物或脊骨植入物可以包括由皮質(zhì)骨、松質(zhì)骨、皮質(zhì)松質(zhì)骨或以上提及三種類型的骨材料的組合制成的獲取的(harvested)骨片段。患者還可患有各種退化性疾病，其中可以選擇骨移植物的植入作為治療。


參考以下的附圖可以更好地理解本發(fā)明的許多方面。附圖中的組分不一定是按比例的，重點在于清楚地說明本發(fā)明的原理。此外，在附圖中，相似的標(biāo)號在多個視圖中指示相應(yīng)的部分。圖I是說明根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式的流程圖。圖2是說明根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式的流程圖。圖3是說明根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式的流程圖。圖4是說明根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式的流程圖。圖5是說明根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式的流程圖。圖6是說明根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式的流程圖。圖7是說明根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式的流程圖。圖8是說明根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式的流程圖。圖9是說明根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式的流程圖。圖10是說明根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式的流程圖。圖11是說明根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式的流程圖。圖12-13是說明產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的殼聚糖/礦物油灰的各種實施方式的方法的流程圖。圖14-17是說明產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的殼聚糖/骨油灰的各種實施方式的方法的流程圖。
圖18-20是說明產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的殼聚糖/礦物支架海綿的各種實施方式的方法的流程圖。圖21-26是說明產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的殼聚糖/骨支架海綿的各種實施方式的方法的流程圖。圖27是說明根據(jù)本發(fā)明的各種實施方式的物料性質(zhì)的實例的圖表。圖28-29是說明根據(jù)本發(fā)明的各種實施方式的支架膨脹的實例的圖。
具體實施方式

本發(fā)明的各種實施方式涉及刺激組織生長的生物活性因子和/或生物相容性材料。應(yīng)當(dāng)理解，這些生物活性因子可以從包含細(xì)胞的生理溶液中獲取。生理溶液可以作為在身體中的天然溶液存在，或在提取細(xì)胞時從組織中獲得。包含細(xì)胞的任何組織可以是生理流體的來源，如，例如，中胚層組織、內(nèi)胚層組織以及外胚層組織。這些組織的實例包括骨髓、血液、脂肪、皮膚、肌肉、脈管系統(tǒng)、軟骨、韌帶、腱、筋膜、心包、神經(jīng)和頭發(fā)。這些組織還可包括器官，如胰、心、腎、肝、腸、胃和骨。在按照本發(fā)明所描述的加工之前，可以將細(xì)胞濃縮。本發(fā)明的一個實施方式涉及由細(xì)胞骨組織制成骨誘導(dǎo)性植入物以及制作骨誘導(dǎo)性植入物的方法。由細(xì)胞骨組織制成的植入物可以包含骨誘導(dǎo)性和/或骨傳導(dǎo)性材料，以促進(jìn)處于植入物插入?yún)^(qū)域或在植入物插入?yún)^(qū)域周圍的融合和/或新骨增長。因此，根據(jù)一個實施方式，部分的松質(zhì)骨、皮質(zhì)松質(zhì)骨和/或骨皮質(zhì)或其任何組合可獲自捐獻(xiàn)者。在一個實施方式中，獲得的材料可以以盡可能多地保持捐獻(xiàn)樣品中的骨髓的方式富集。富集的樣品可以經(jīng)受裂解條件和/或裂解劑，以促進(jìn)細(xì)胞在其中的裂解以釋放包含在樣品中的生長因子和營養(yǎng)素。換句話說，富集的樣品可以經(jīng)受溶解在富集的樣品中的細(xì)胞的裂解劑。一旦細(xì)胞組分被裂解，它們釋放生長因子和/或生物活性物質(zhì)如細(xì)胞因子和營養(yǎng)素，以刺激生長、分化和修復(fù)。這些生長物質(zhì)可以是細(xì)胞因子如包含TGF-β家庭成員的蛋白類、激素類或糖蛋白類(包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白類)，白細(xì)胞介素類，干擾素類，淋巴因子，趨化因子，血小板衍生生長因子，VEGF以及促進(jìn)組織生長、修復(fù)或再生的其他刺激劑。在其他實施方式中，可以裂解來自其他組織的細(xì)胞以釋放可以結(jié)合到富集的樣品的生長物質(zhì)并進(jìn)一步加工為植入物。裂解條件性質(zhì)上可以是機械的，如熱解、微流體、超聲、電休克、磨、珠磨、均化、弗壓氏碎器(french press)、碰撞、過度剪切、壓力、真空力及其組合。過度剪切可以通過小孔有力吸取、在引起高引力的每分鐘過度轉(zhuǎn)數(shù)下的離心而引發(fā)。溫度、壓力或流動的急劇變化也可以用于裂解細(xì)胞組分。裂解條件可以包括熱解技術(shù)，這些技術(shù)可涉及冷凍、冷凍-融化循環(huán)、以及加熱以破裂細(xì)胞壁。裂解條件還可以包括可涉及細(xì)胞溶解或皺縮的滲透休克技術(shù)的微流體技術(shù)。裂解條件還可以包括施加超聲技術(shù)，包括但不限于，超聲處理、聲孔效應(yīng)、超聲化學(xué)、聲致發(fā)光和空穴現(xiàn)象。裂解條件還可以包括電休克技術(shù)，如電穿孔以及經(jīng)受高電壓和/或電流源。裂解條件進(jìn)一步可以包括物理碰撞或研磨細(xì)胞的研磨或打擊技術(shù)，以破碎細(xì)胞膜，釋放包含其中的刺激物質(zhì)。裂解還可以通過將富集的樣品的細(xì)胞經(jīng)受裂解劑來實現(xiàn)，裂解劑可以促進(jìn)由于pH不平衡而裂解的刺激生長物質(zhì)的釋放，包括經(jīng)受洗滌劑、酶、病毒、溶劑、表面活性劑、溶血素以及其組合。由PH不平衡化學(xué)誘導(dǎo)的細(xì)胞裂解可涉及將富集的樣品的細(xì)胞經(jīng)受裂解劑，以破碎細(xì)胞壁并釋放可溶的生長物質(zhì)。在一些實施方式中，裂解劑可以包含一種或多種酸和/或堿。在經(jīng)受裂解劑之后，富集的樣品可以經(jīng)受緩沖液或其他溶液，以基本中和生長因子與裂解劑的混合物的pH值。在一些實施方式中，可能期望pH是酸性的(例如pH低于7)或者堿性的(例如pH高于7)以保持特定生長因子或生物活性物質(zhì)的溶解度。例如，與中性或堿性PH值相比，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(尤其是BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-9、BMP-14以及其他骨形態(tài)發(fā)生蛋白1-30)在處于7以下的酸性pH值時是更可溶的。在其他實施方式中，裂解劑可以包含揮發(fā)性酸或堿如醋酸或氨，且細(xì)胞物質(zhì)在經(jīng)受裂解劑后可以利用干燥技術(shù)如蒸發(fā)、真空干燥、凍干、冷凍干燥、升華、沉淀以及可以接受的類似方法而被中和或者部分中和。在其他實施方式中，裂解劑可以包含可以破裂細(xì)胞壁并將可能圍繞細(xì)胞的任何脂質(zhì)屏障去除的洗滌劑。酶類、病毒類、溶劑類、表面活性劑類以及溶血素類還可以幫助分解或者去除外面的細(xì)胞膜，釋放包含其中的生物活性生長物質(zhì)。
在這些裂解劑的使用和/或富集的樣品經(jīng)受裂解條件之后，接著可以按照以上所提到的進(jìn)行中和，和/或另外的次級過程以去除任何不期望的殘余?？梢詫⒂闪呀膺^程所釋放的生長劑、營養(yǎng)素等加入至載體如合成支架、生物支架，以及自體組織、同種異體組織和異種移植組織。還在其他實施方式中，用作載體的富集的樣品可以經(jīng)受裂解條件和/或裂解劑，且由裂解過程所釋放的生長因子可以結(jié)合到該樣品的至少一部分。換句話說，由裂解細(xì)胞物質(zhì)所釋放的生長物質(zhì)可以立即用于自體使用。在其他實施方式中，可將釋放的生長物質(zhì)儲存而用于同種異體使用。儲存技術(shù)可以包括冷凍或凍干以保持生物活性。生長因子和營養(yǎng)素也可以在所選的載體上被冷凍或凍干，以允許刺激物質(zhì)至載體的完全結(jié)合，以及以允許外科醫(yī)師的直接使用。冷凍干燥還允許更長的室溫有效期以及濃縮至更小體積的機會。本發(fā)明另外的實施方式涉及從包含細(xì)胞的生理溶液獲得一組特定的生長因子和營養(yǎng)素。在該實施方式中，細(xì)胞按照以上所描述的被裂解，然后將裂解溶液經(jīng)受具有帶電表面的物質(zhì)，包括但不限于，層析樹脂、陶瓷，礦化組織、去礦化組織、軟組織以及具有電荷的其他材料。帶電表面吸引某些刺激生長物質(zhì)和分子，將它們從裂解溶液中去除。剩余的生長物質(zhì)然后可以用于再生或修復(fù)期望的組織類型。類似于前一個實施方式，生長物質(zhì)溶液可以進(jìn)一步濃縮和冷凍或者凍干，以延長有效期。本發(fā)明另外的實施方式包括選擇性清洗、裂解、或去除某些細(xì)胞組分而保持其他細(xì)胞組分。選擇性裂解或去除可以通過上面提到的方法來物理(physically)實現(xiàn)。作為可以理解的，某些細(xì)胞可以對各種裂解機制有抵抗作用。作為非限制性實例，間充質(zhì)干細(xì)胞由于它們有抵抗作用的細(xì)胞壁和無效的細(xì)胞體積而對細(xì)胞溶解和滲透裂解是有抵抗作用的。因此，為了實現(xiàn)選擇性裂解，滲透裂解可以用于從血液或骨髓中裂解紅細(xì)胞和白細(xì)胞。一旦非抗性細(xì)胞被裂解，獲得的溶液為富集的MSC群。然后溶液可以經(jīng)由離心作用、熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)、過濾、磁珠分選(magnetic bead selection and depletion)、和/或重力沉降而進(jìn)一步濃縮。對于同種異體移植，F(xiàn)ACS和磁珠分選可用于去除會引起植入患者免疫應(yīng)答的任何剩余細(xì)胞。一旦植入，細(xì)胞可以以同源的方式運行并分化成期望的表型。本發(fā)明另外的實施方式包括前面兩個實施方式的組合。生理溶液可以通過選擇性裂解而富集，并通過離心、FACS、磁珠分選、和/或重力沉降而進(jìn)一步濃縮。將富集的生理溶液加入到按照前面所描述的方法裂解的生理溶液中，以幫助細(xì)胞誘導(dǎo)分化成期望的表型。然后這些細(xì)胞可以以期望的方式運行以再生和修復(fù)組織。在另外的實施方式中，松質(zhì)骨可以經(jīng)受只部分裂解存在的細(xì)胞群的弱裂解劑(如少于IM的醋酸)。在該實施方式中，部分裂解釋放生長因子并且將它們與骨結(jié)合，而其他細(xì)胞(如間葉干細(xì)胞和祖細(xì)胞)可仍然保持有活力并附在骨上。在另外的實施方式中，松質(zhì)骨可經(jīng)受弱裂解劑(如水)，然后經(jīng)受前面說明的機械裂解條件(如熱解、高/低壓、超聲處理、離心等。)。一旦細(xì)胞裂解，將骨、細(xì)胞片斷、以及碎片從包含生長因子的溶液中去除。然后可通過加入酸或另外的質(zhì)子給體溶液而使該溶液帶正電荷。然后可將在該溶液中的生長因子利用所描述的技術(shù)濃縮、冷凍或凍干成可溶粉末?？扇芊勰┛稍谑中g(shù)期間在將其加入至植入物之前用液體重溶或者在植入之前以粉末形式 加入至植入物。在另外的實施方式中，骨誘導(dǎo)性生長因子可以從包含細(xì)胞的生理流體中形成。按照前面所描述的裂解這些細(xì)胞，并可將其加載到來自與細(xì)胞相同的組織捐贈者的同種異體移植骨上。可將刺激生長物質(zhì)在凍干或冷凍之前加載到該骨上?？梢栽诩虞d刺激生長物質(zhì)之前將骨礦化或去礦化以允許刺激生長物質(zhì)更完全的結(jié)合。也可以在加載刺激生長物質(zhì)之前或之后將骨顆?；?morselized),允許其用于流動的復(fù)合物。在另外的實施方式中，包含細(xì)胞的生理流體(如滑液)可以從活供者、尸體供者或自身獲得。這些液體可經(jīng)受所描述的機械或化學(xué)裂解條件以溶液化生長因子。一旦生長因子從這些細(xì)胞釋放，可通過所描述的方法(如過濾、離心或重力沉降)來去除固體物質(zhì)(如細(xì)胞片斷、碎片或血小板)。一旦將固體物質(zhì)去除，然后可通過加入酸或另外的質(zhì)子給體液而使該溶液帶正電荷。然后可將在該溶液中的生長因子利用所描述的技術(shù)濃縮、冷凍或凍干成可溶粉末?？扇芊勰┛稍谑中g(shù)期間在將其加入至植入物之前用液體重溶或者在植入之前以粉末形式加入至植入物。選擇性地，可以以類似的方式制備具有或沒有滑液的軟骨，用于修復(fù)或再生軟骨或脊骨盤。此外，其他組織如肌肉、脂肪、神經(jīng)、真皮、心臟的組織、血管組織、髓核組織、纖維環(huán)組織或其他的固體組織可以按照該方式制備以用于幫助修復(fù)或再生組織。刺激生長物質(zhì)可以來自各種細(xì)胞溶液。這些溶液可包含培養(yǎng)和/或未培養(yǎng)的細(xì)胞，并且可以是自體、同種異體或異種來源。如果細(xì)胞同種異體或異種來源，至少可以進(jìn)行利用前面所描述的方法的部分裂解或免疫細(xì)胞消耗，以使刺激生長物質(zhì)不引起患者的免疫應(yīng)答。選擇性地，免疫應(yīng)答物質(zhì)，例如CD45+細(xì)胞和其他白細(xì)胞，可以在使用之前去除以降低或消除免疫應(yīng)答。這些免疫應(yīng)答物質(zhì)可通過本發(fā)明前面所描述的選擇性裂解來去除。本發(fā)明的各種實施方式涉及用于提供抗菌多糖支架的復(fù)合物和/或方法，該支架可與骨激發(fā)性物質(zhì)如刺激組織生長、細(xì)胞粘著、細(xì)胞增殖以及增強傷口愈合的生物活性生長因子以及不同類型的細(xì)胞相結(jié)合。殼聚糖是在海洋甲殼類動物殼以及細(xì)菌和真菌的細(xì)胞壁中發(fā)現(xiàn)的多糖。殼聚糖是一種可以支持組織生長的無毒生物相容材料。因為生物相容性、抗菌活性、加工通用性以及將細(xì)胞與生長因子結(jié)合的能力的組合，殼聚糖是一種支持組織生長的卓越生物材料?？少徺I用于在這些應(yīng)用中使用的材料，這些應(yīng)用如，但不限于骨空隙填充物、肌骨骼缺損、非結(jié)構(gòu)性骨缺損、結(jié)構(gòu)性骨缺損、椎間隙、橫突間隙、植入物涂層、止血劑、傷口覆蓋、骨腫瘤以及感染部位的治療。該支架還可包含礦物質(zhì)。在一個實施方式中，一種生物相容的形狀記憶骨傳導(dǎo)性和/或骨誘導(dǎo)性抗菌可壓縮的植入物支架可用于組織工程。例如，本發(fā)明提供包括殼聚糖溶液和產(chǎn)生可壓縮的固體多孔基底的無毒礦物混合物的矯形結(jié)構(gòu)。該支架可包括具有范圍在約5%至約80%、范圍在約10%至約70%、和/或范圍在約15%至約60%的重量百分比的殼聚糖。在一些實施方式中，該殼聚糖濃度高于約5%、高于約30%、或更高。在其他實施方式中，該殼聚糖濃度低于約10%或低于約2. 5%。根據(jù)本發(fā)明的各種實施，殼聚糖的分子量可在約IkDa至約750kDal的范圍之間、在約IOkDal至約650kDa的范圍之間、和/或在約50kDa至約550kDa的范圍之間。所使用的殼聚糖可以是去乙?；瘹ぞ厶?。根據(jù)一個實施，脫乙?；某潭瓤稍?，但不限于，約50%至約99%脫乙?；姆秶鷥?nèi)。通常，脫乙?；陌俜直?程度越低，在植入時降解發(fā)生地越快。脫乙酰化百分比也可以特定于具體的張力和壓縮性質(zhì)。去乙?；降?， 支架的拉伸強度越低。根據(jù)各種實施，殼聚糖的脫乙?；俜直瓤梢栽趶募s50%至約66. 6%的范圍內(nèi)，以生產(chǎn)更快的降解曲線并依次具有影響孔隙率的更低密度。在其他實施中，殼聚糖的脫乙?；俜直瓤梢詾樵诩s66. 6%至約83. 2%的中間范圍內(nèi)，以生產(chǎn)中間降解曲線并依次具有影響孔隙率的中間密度。還根據(jù)其他的實施，殼聚糖的脫乙?；俜直瓤梢詾樵诩s83. 2%至約99%的中間范圍內(nèi)，以生產(chǎn)更長的降解曲線并依次具有影響孔隙率的更高密度。殼聚糖材料可以與另外的蛋白或氨基酸結(jié)合，以提高蛋白和細(xì)胞結(jié)合。蛋白、酶、結(jié)構(gòu)蛋白、細(xì)胞信號或配體結(jié)合蛋白、或者氨基酸類的實例包括但不限于，骨膠原、谷氨酸和賴氨酸。殼聚糖可以為醫(yī)學(xué)級或包含低水平的有毒污染物(如重金屬類、內(nèi)毒素類以及其他潛在有毒殘留物或污染物)的等價質(zhì)量。根據(jù)本發(fā)明的各種實施方式，殼聚糖溶液可以通過在低pH的液體(如酸)中溶解來制備。低PH液體包括但不限于，乙酸、鹽酸、磷酸、硫酸、硝酸、羥乙酸、羧酸、或氨基酸。使用的酸的量可在約0. 1%至約50%之間，和/或可在約0. 1%至約25%之間。在一些實施方式中，pH可以介于微酸性至中性或偏中性之間。中和可以通過使用堿性物質(zhì)來獲得，堿性物質(zhì)如，但不限于，氫氧化鈉、氫氧化氨(氨水)、氫氧化鉀、氫氧化鋇、氫氧化銫、氫氧化鍶、氫氧化鈣、氫氧化鋰、氫氧化銣、丁基鋰、二異丙基氨基鋰、鋰乙胺、氨基鈉、氫化鈉和雙(三甲基甲硅烷基)氨基鋰。中和也可以通過使用堿性氨基酸來獲得，其包括賴氨酸、組氨酸、甲基賴氨酸、精氨酸、精氨基琥珀酸、L-精氨酸、L-焦谷氨酸和鳥氨酸?？墒褂脤崿F(xiàn)中和的不同技術(shù)，如可以接受的蒸發(fā)、真空干燥、凍干、冷凍干燥、升華、沉淀以及類似方法。制得的溶液產(chǎn)生包含殼聚糖與至少部分由水組成的液體介質(zhì)的混懸液或凝膠。該混懸劑或凝膠含可以包含組織和/或礦物顆粒。組織可包括同種異體移植物、自體移植物或異種移植物。然后制得的殼聚糖/礦物混懸液可通過技術(shù)(如注射塑型、真空模塑法、注塑壓縮成型、旋轉(zhuǎn)塑型、靜電紡絲、3D印刷、鑄造和相位分離法)而成形至期望的形式(如多孔體(porous solids)或半固態(tài))。這些形狀可以是矯形形狀，如，例如釘、管、針、螺絲釘、片、楔形錨、條、帶、鉤、夾、墊圈、線、纖維、環(huán)、板、球和立方體。根據(jù)本發(fā)明另外的方面，殼聚糖支架可具有范圍從約I Pm至約5mm的基質(zhì)孔隙度。基質(zhì)支架還可具有與其內(nèi)部孔隙度相比，不同的表面孔隙度。表面孔隙度可具有從約Iiim至約Imm的范圍，而內(nèi)部孔隙度可具有從IOiim至約5mm的范圍?？傮w孔徑可以取決于殼聚糖的濃度，更低的濃度將產(chǎn)生更大的孔徑，而更高的濃度將產(chǎn)生更小的孔徑?？讖竭€可以被設(shè)計成豎直排列、縱向排列、水平排列，或其組合，這取決于在制備時所使用的方法或植入的預(yù)期部位?？缀屯ǖ赖拇笮『头较蚩梢酝ㄟ^控制凍結(jié)速率和定向凍結(jié)來控制。可以改變變量如凍結(jié)速度、凍結(jié)溫度和指定的凍結(jié)區(qū)域，以由于溫度梯度的功能而調(diào)整孔/通道大小和方向。植入物可以以每I分鐘至20分鐘-0.1° C至-15° C的變速下降速率凍結(jié)，產(chǎn)生均勻的結(jié)晶。在冷凍干燥之后，結(jié)晶蒸發(fā)，使孔留在植入物內(nèi)。例如，每10分鐘-10° C的慢下降速率將產(chǎn)生更大的孔徑，而I分鐘-10° C的快下降速率產(chǎn)生更小的孔徑。通道，而不是孔，可以通過降低變速下降速率甚至進(jìn)一步至每15分 鐘-5° C而形成。方向性孔和/或通道可以通過在冷凍干燥時施加冷凍源至植入物的指定區(qū)域。例如，如果冷凍源施加于植入物的指定區(qū)域(如指定的表面)，孔或通道方向?qū)⒋怪庇诶鋬鲈?。所施加的冷凍源的組合可以產(chǎn)生多向孔或通道結(jié)構(gòu)。如果冷凍源未置于任何的指定區(qū)域，那么孔或通道方向可以是各向異性的。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，植入物一旦與液體水化可具有形狀記憶。脫水或水化的海綿可被周向、單向或多向壓縮，直至原始大小的約十分之一，但在水化時，回到其原始形狀。支架可以壓縮成各種形狀，如，但不限于，管、針、立方體、條和片。壓縮可指向支架外部地發(fā)生，或從支架向外內(nèi)部地發(fā)生。在一些實施方式中，生物相容的植入物可包含礦物，如鈣鹽(例如磷酸鈣)、硅酸鹽、碳酸鹽、硫酸鹽、齒化物、氧化物硫化物磷酸鹽(oxide sulfide phosphate)、金屬或包含金銀銅的半金屬、合金、和/或其組合。根據(jù)目前的實施方式的一個方面，磷酸鈣可以選自羥磷灰石(HA)、硅酸鹽羥基磷灰石(HA)、磷酸三鈣(TCP)、純的/取代的P磷酸三鈣(3 -TCP )、a磷酸三鈣(a -TCP )、磷酸八鈣(OCP )、磷酸四鈣(TTCP )、無水磷酸二鈣(DCPD )、和/或其組合。礦物粒徑可在約Inm至Imm的粉末的范圍內(nèi)。礦物含量還可以以范圍從約50um直至約5毫米的粒度大小加入。植入物可包含大于100 u m的顆粒，以增加壓縮阻力以及細(xì)胞/蛋白結(jié)合。鈣鹽濃度可大于約10%、大于約30%或大于約40%。支架可包含范圍在約5%至約75%、范圍在約8%至約72%、和/或范圍在約10%至約70%的礦物。根據(jù)實施方式的另一方面，支架可以由范圍在約5%至約75%、范圍在約8%至約72%、和/或范圍在約10%至約70%的礦化、去礦化、或部分去礦化的骨構(gòu)成。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，植入物具有取決于在配方中使用的殼聚糖和pH水平的量的抗微生物性和/或抗菌性。殼聚糖濃度與PH—起可以提供針對但不限于下列的生物的抗菌活性金黃色葡萄球菌(MRSA)、糞腸球菌(VRE)、鮑氏不動桿菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、釀膿鏈球菌、表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌、糞腸球菌、粘質(zhì)沙雷菌、嗜麥芽窄食假單胞菌、變異鏈球菌、艱難梭菌、肺炎鏈球菌、索氏志賀菌(shigella species)、產(chǎn)氣腸桿菌、奇異變形桿菌、普通變形桿菌、弗氏檸檬酸桿菌屬、陰溝腸桿菌、粘膜炎莫拉菌、藤黃微球菌、和霍亂弧菌。在PH增加后，材料的剛性也增加。在一些實施方式中，殼聚糖溶液可以在從約5mg/mL至約200mg/mL的范圍內(nèi)。pH水平可低于8和/或低于7。根據(jù)各種實施方式，支架張力、剪切、和壓縮性質(zhì)可以利用如下方法通過交聯(lián)而加強干熱交聯(lián)、化學(xué)交聯(lián)、物理交聯(lián)、或光度交聯(lián))。干熱交聯(lián)可涉及用或不用負(fù)壓，使支架經(jīng)受高溫?；瘜W(xué)交聯(lián)可包括用亞硝酸、丙二醛、補骨脂素類、醛類、甲醛、戊二醛、乙醛、丙醛、丁醛、苯甲醛、肉桂醛、和/或甲苯甲醛的處理。光交聯(lián)可利用可包括紫處線、等離子體或其他能源的能源和/或光源。在一個實施方式中，一種生物相容的形狀記憶骨傳導(dǎo)性和/或骨誘導(dǎo)性抗菌可壓縮植入物支架可用于組織工程。包含殼聚糖溶液和骨混合物的矯形結(jié)構(gòu)產(chǎn)生可壓縮的固體多孔基底。骨可選自同種異體移植骨、異種移植骨、自體移植骨或其組合。骨可以是細(xì)或粗研磨的粉末或多孔顆粒。例如，顆?？纱笥诩s100 ym，以增加壓縮阻力或細(xì)胞/蛋白結(jié)合。粉劑可以取決于應(yīng)用均勻或不均勻地整合入整個支架。骨還可以礦化、去礦化、部分去礦化、溶液化、或膠化。在一個選擇性實施方式中，一種生物相容的形狀記憶骨傳導(dǎo)性和/或骨誘導(dǎo)性抗菌可壓縮植入物支架可用于組織工程。包含殼聚糖溶液和礦物/骨混合物的矯形結(jié)構(gòu)產(chǎn)生相當(dāng)有壓縮阻力的固體且多孔基底。支架可能包括更大粒徑的礦物和骨(例如大于約 IOOum)以有助于壓縮阻力。在其他實施方式中，一種生物相容的骨傳導(dǎo)性和/或骨誘導(dǎo)性抗菌植入物支架可用于組織工程。包含殼聚糖溶液和礦物/骨混合物的矯形結(jié)構(gòu)產(chǎn)生承重植入物。例如，承重或者壓縮阻力可通過交聯(lián)、增加密度，和/或更大的粒徑來增強。根據(jù)一種實施，支架可由去礦化或部分去礦化的骨和殼聚糖構(gòu)成。殼聚糖可在約0. 1%至約20%和/或約0. 5%至約15%的范圍內(nèi)。根據(jù)第二實施，支架可由鈣鹽和殼聚糖構(gòu)成。殼聚糖可在約0. 1%至約20%和/或約0. 5%至約15%的范圍內(nèi)。在各種實施方式中，一種生物相容的骨傳導(dǎo)性和/或骨誘導(dǎo)性抗菌植入物支架可用于組織工程。包含殼聚糖溶液的矯形結(jié)構(gòu)包括一種或多種物質(zhì)，包括生長因子、生長因子刺激物質(zhì)、維生素類、和/或生物活性分子。還可以包括鈣鹽(例如磷酸鈣)和/或組織(例如骨)作為骨激發(fā)物質(zhì)。生長因子可與支架結(jié)合。生長因子包括，但不限于，骨形態(tài)生成蛋白(BMP)、轉(zhuǎn)化生長因子P (TGF-0 )、生長分化因子(⑶F)、軟骨形態(tài)發(fā)生蛋白(CDMP)、介白素、干擾素、淋巴因子、趨化因子、血小板衍生生長因子(PDGF)、VEGF、￠-成纖維細(xì)胞生長因子(P-FGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，以及促進(jìn)生長、修復(fù)或再生組織的其他刺激物質(zhì)。骨形態(tài)生成蛋白可以選自 BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9、BMP-10, BMP-IUBMP-12, BMP-13, BMP-14、BMP-15和BMP-16。骨形態(tài)生成蛋白還可以是重組人骨形態(tài)生成蛋白。生長因子也可以是血管生長因子或促有絲分裂生長因子。在其他實施方式中，一種生物相容的骨傳導(dǎo)性和/或骨誘導(dǎo)性抗菌植入物支架可用于組織工程。包含殼聚糖溶液和礦物/骨混合物的矯形結(jié)構(gòu)包含種植的細(xì)胞。該細(xì)胞可以由間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、前成骨細(xì)胞、骨祖細(xì)胞、及其組合組成。在各種實施方式中，一種生物相容的骨傳導(dǎo)性和/或骨誘導(dǎo)性抗菌植入物支架可用于組織工程。包含殼聚糖溶液和礦物/骨混合物的矯形結(jié)構(gòu)具有類似于油灰的稠度。材料可以被塑型以滿足不同情形?？梢哉{(diào)節(jié)配方參數(shù)，以具有基于應(yīng)用的不同粘度和粘著性狀。在選擇性實施方式中，一種生物相容的骨傳導(dǎo)性和/或骨誘導(dǎo)性抗菌植入物支架可用于組織工程。包含殼聚糖溶液和礦物/骨混合物的矯形結(jié)構(gòu)具有可流動的稠度。材料可以被定制以滿足不同情形?？梢栽O(shè)定粘度參數(shù)以在應(yīng)用如糊劑、可注射膠和噴霧劑中具有較不粘稠的性質(zhì)。糊劑和膠可以以期望的外形被施加到組織，以有助于應(yīng)用的效能。可以將較不粘稠的制劑如油灰或非常粘稠的可注射/可流動的流體施加于如骨空隙(bonevoids),生物惰性植入物、空心螺釘、螺釘周圍、或其他矯形應(yīng)用的位置。在各種其他實施方式中，一種生物相容的骨傳導(dǎo)性和/或骨誘導(dǎo)性抗菌植入物支架可用于組織工程。包含殼聚糖溶液和礦物/骨混合物的矯形結(jié)構(gòu)具有用于涂覆目的的低粘度。涂層可以施加于生物惰性材料如，但不限于，聚醚醚酮、不銹鋼、鈦、聚亞苯基砜和硅樹脂結(jié)構(gòu)。例如，涂層可以施加于(例如噴射)生物惰性植入物如,但不限于,籠、螺絲釘、螺絲釘頭、針、桿、絲、兩尖釘、連接器、全髖假體、髖白杯、和片。涂層還可施加于(例如噴射)生物活性植入物如，但不限于，礦物、自身移植、同種移植、異種移植物、去礦化骨、部分去礦化骨、礦化骨、和膠原。本文中所描述的系統(tǒng)和方法可以在手術(shù)環(huán)境中采用，其中需要將刺激生長物質(zhì)植入患者中。雖然本發(fā)明描述用于產(chǎn)生刺激生長物質(zhì)，尤其是源于包含細(xì)胞或細(xì)胞組織的生理溶液的刺激生長物質(zhì)的方法和系統(tǒng)，應(yīng)理解，這些方法和系統(tǒng)可以應(yīng)用于各種的醫(yī)療應(yīng) 用，包括針對再生或修復(fù)骨、軟骨、肌肉、腱、韌帶、脈管系統(tǒng)、脂肪、纖維環(huán)、髓核、皮膚、頭發(fā)、血、淋巴結(jié)、筋膜、神經(jīng)、心臟、胰腺、肝、眼、牙、消化、呼吸、生殖，以及其他軟組織應(yīng)用(如在再生醫(yī)學(xué)和組織工程中)。現(xiàn)在參考圖1，其描繪根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式的方法。在圖I中說明的實施方式中，示出可以適于骨應(yīng)用的植入物。在圖I的實施方式中，在框102中，松質(zhì)骨從尸體、活供體回收，或從患者自體獲得?？梢阅セ蚯懈瞰@得的松質(zhì)骨至期望的可以接受的形狀和構(gòu)型。注意在獲取和切割操作期間保留骨內(nèi)的一些細(xì)胞材料、骨髓、和/或血。在現(xiàn)有技術(shù)植入物中，骨中的骨髓和/或血可以從獲取的骨樣品中系統(tǒng)地去除和/或清除。在本發(fā)明的實施方式中，松質(zhì)骨可能具有在如髂嵴、椎體、chondyles等中的骨皮質(zhì)部分。因此，在一些實施方式中，取決于具體應(yīng)用的需要，松質(zhì)骨可在進(jìn)一步處理之前將皮質(zhì)部分去除。然后在框104中，將松質(zhì)骨經(jīng)受用作如上描述的裂解劑的醋酸。在一個實施方式中，醋酸濃度可以大于1%，在0. 2M-17M的摩爾范圍內(nèi)。采用醋酸裂解劑以裂解保留在松質(zhì)骨的多孔骨結(jié)構(gòu)中和骨表面上的細(xì)胞。裂解的細(xì)胞釋放并溶液化(或溶解)包含在細(xì)胞材料中的生長因子和生物活性物質(zhì)。醋酸裂解劑還允許溶液化的生物活性物質(zhì)與骨結(jié)合。在框106中，骨可進(jìn)一步在經(jīng)受酸裂解劑之后并在生物活性物質(zhì)與骨結(jié)合后用清洗劑清洗。可以進(jìn)行漂洗，以去除過量的醋酸、細(xì)胞片段、脂、和/或碎片。另外，在框108中，獲取的骨的pH可基本被中和。在一些實施方式中，在框106中，獲取的骨的pH可以通過清洗劑和清洗步驟來中和。在其他實施方式中，可不需要pH中和。在框110中，獲取的骨的進(jìn)一步的pH中和可通過利用蒸發(fā)、真空干燥或冷凍干燥的脫水來實現(xiàn)，以將醋酸裂解劑減少至殘留物，并引起植入物更中性的pH。清洗溶液可以是水、鹽水(NaCI、PBS等)、過氧化物類、醇(異丙醇、乙醇等)、晶體、滅菌液體(抗生素如慶大霉素、萬古霉素、桿菌肽、多粘菌素、兩性霉素、氨芐青霉素(氨芐西林)、阿米卡星、替考拉寧等)、保存液(DMEM、DMS0、甘露醇、蔗糖、葡萄糖等)、保存劑、和/或在同種異體移植物過程中使用的其他液體。得到的產(chǎn)物產(chǎn)生具有增加的生物活性的松質(zhì)骨植入物。在一些實施方式中，可形成具有增加的生物活性的研磨的顆粒狀填充物植入物以及有結(jié)構(gòu)的松質(zhì)骨植入物?，F(xiàn)在參考圖2，其描繪本發(fā)明可替代的實施方式。所描繪的流程圖說明形成由獲取的具有生物活性的骨皮質(zhì)和來自獲取的松質(zhì)骨的結(jié)合至骨皮質(zhì)材料的生長因子所制成的植入物的方法。在所描繪的實施方式中，在框202中，骨皮質(zhì)從尸體、活供體回收，或從患者自體獲得。在框204中，松質(zhì)骨也從相同供體獲得。取決于具體的應(yīng)用要求，可將獲得的骨皮質(zhì)磨或切割至期望的形狀和構(gòu)型?？梢郧鍧嵅⑷サV化骨皮質(zhì)(例如用鹽酸洗滌和/或用檸檬酸酸處理)以去除其礦物含物。取決于期望的應(yīng)用，可將獲得的松質(zhì)骨磨或切割至特定的形狀和構(gòu)型。注意在獲取和切割操作期間盡可能多地保留松質(zhì)骨內(nèi)的骨髓、和血。在本發(fā)明的實施方式中，松質(zhì)骨可能具有如在髂嵴、椎體、chondyles等中的骨皮質(zhì)部分。因此，在一些實施方式中，取決于植入物的應(yīng)用，松質(zhì)骨在進(jìn)一步處理之前可部分去除皮質(zhì)部分。然后在框206中，將松質(zhì)骨經(jīng)受作為裂解劑的鹽酸(例如0. 1M-16M)，以裂解保留在多孔骨結(jié)構(gòu)中和骨表面上的細(xì)胞。裂解的細(xì)胞釋放并溶液化包含在細(xì)胞材料中的生長因子和生物活性物質(zhì)。對比圖I中在上面所公開的實施方式，可以采用鹽酸作為限制溶 液化的生長因子和生物活性物質(zhì)與松質(zhì)骨結(jié)合的裂解劑，但它們(溶液化的生長因子和生物活性物質(zhì))存在于鹽酸和裂解液混合物中。然后，在框208中，將在裂解液混合物中的溶液化的生長因子以及生物活性物質(zhì)加入到從相同供體獲得的骨皮質(zhì)中。在鹽酸混合物中的生長因子和生物活性物質(zhì)很容易與礦化和/或去礦化的骨皮質(zhì)結(jié)合(例如I分鐘-50個小時的結(jié)合時間)。在框210中，在結(jié)合之后將骨皮質(zhì)進(jìn)一步清洗和清潔，以去除過量的鹽酸、細(xì)胞片段、脂、和/或碎片。清洗溶液可以是水、鹽水、過氧化物類、醇、晶體、滅菌液體、保存液、保存劑、和/或在同種異體移植物過程中使用的其他液體。在框212中，骨皮質(zhì)然后可以經(jīng)受pH中和，其可以通過在框214中的在上面相同實施方式中提及的脫水來實現(xiàn)。PH中和還可以通過可以接受的其他化學(xué)物質(zhì)或物理方法來實現(xiàn)。在一些實施方式中，可以以該方式制作具有增加的生物活性的研磨的顆粒狀填充物植入物以及有結(jié)構(gòu)的骨皮質(zhì)植入物?，F(xiàn)在參考圖3，其描繪本發(fā)明選擇性(alternative，可替代)的實施方式。在框302中，骨皮質(zhì)和松質(zhì)骨從尸體、活供體獲取和/或回收，或從患者自體獲得。如果需要特定的植入物應(yīng)用，可將松質(zhì)骨和/或骨皮質(zhì)磨或切割至期望的形狀和構(gòu)型。注意在獲取和切割操作期間盡可能多地保留骨內(nèi)的細(xì)胞材料、骨髓、和/或血。在圖3的實施方式中，在框304中，將獲取的松質(zhì)骨和獲取的骨皮質(zhì)粉碎，然后混合，以產(chǎn)生基本同質(zhì)的混合物。如果需要，可在與松質(zhì)骨混合之前利用上面提及的鹽酸洗滌的技術(shù)將骨皮質(zhì)去礦化。可通過與另外的液體(如水)混合，來進(jìn)一步勻質(zhì)化松質(zhì)骨和骨皮質(zhì)混合物，以使生長因子可以在全部混合物中更加勻質(zhì)地分布。然后在框306中，將含骨溶液經(jīng)受作為裂解劑的醋酸(例如濃度0. 1M-17M)，以裂解保留在多孔骨結(jié)構(gòu)中和骨表面上的細(xì)胞。裂解的細(xì)胞釋放并溶液化包含在細(xì)胞材料中的生長因子和生物活性物質(zhì)。醋酸還允許溶液化的生物活性物質(zhì)與骨皮質(zhì)和松質(zhì)骨的混合物結(jié)合?？赡苄枰M(jìn)一步的酸洗滌以進(jìn)一步地將骨去礦化，減少其模量，和/或使其更呈海綿狀?？墒褂萌魏晤愋偷乃?包括乙酸、鹽酸、檸檬酸、磷酸等)以進(jìn)一步將骨去礦化。在框308中，在結(jié)合之后可將骨進(jìn)一步清洗并清潔，以去除過量的酸、細(xì)胞片段、月旨、和/或碎片。在一些實施方式中，可通過蒸發(fā)、真空干燥或凍干將骨脫水，以去除任何剩余的醋酸并中和的骨皮質(zhì)和松質(zhì)骨混合物的pH (框310和框312中)。清洗溶液可以包括水、鹽水、過氧化物類、醇、晶體、滅菌液體、保存液、保存劑、或在同種異體移植物過程中使用的其他液體。因此，可以以該方式制作具有增加的生物活性的研磨的顆粒狀填充物植入物以及有結(jié)構(gòu)的皮質(zhì)松質(zhì)骨植入物?，F(xiàn)在參考圖4，其描繪本發(fā)明選擇性的實施方式。在框402中，松質(zhì)骨從尸體、活供體回收，或從患者自體獲得。如果需要特定的植入物應(yīng)用，可將獲取的松質(zhì)骨磨或切割至期望的形狀和構(gòu)型。注意在獲取和切割操作期間盡可能多地保留骨內(nèi)的細(xì)胞材料、骨髓、和/或血。在本發(fā)明的實施方式中，松質(zhì)骨可能具有如在髂嵴、椎體、chondyles等中的骨皮質(zhì)部分。因此，可將松質(zhì)骨的骨皮質(zhì)部分從松質(zhì)骨中移除。然后在框404中，將松質(zhì)骨經(jīng)受作為裂解劑的醋酸(例如0. 1M-17M)，以裂解保留在多孔骨結(jié)構(gòu)中和骨表面上的細(xì)胞。裂解的細(xì)胞釋放并溶液化包含在細(xì)胞材料中的生長因子和生物活性物質(zhì)。醋酸還允許溶液化的生物活性物質(zhì)與骨結(jié)合。在框408中，可利用至少一種使用任何酸的去礦化洗滌將松質(zhì)骨進(jìn)一步地去礦化，酸包括但不限于，乙酸、鹽酸、檸檬酸、磷酸等，以改變骨的機械性質(zhì)并且去除礦物含物。 在框410中，在去礦化洗滌之間可進(jìn)行壓縮測試，以確定骨的柔性和壓縮性的水平是否適于給定應(yīng)用。如果骨對于期望的應(yīng)用太硬，可進(jìn)行進(jìn)一步的去礦化洗滌。在框411中，一旦達(dá)到期望的柔性，結(jié)合之后可將骨進(jìn)一步清洗并清潔，以去除過量的酸、細(xì)胞片段、月旨、或碎片。在一些實施方式中，可通過蒸發(fā)、真空干燥或凍干將骨脫水，以去除任何剩余的醋酸并引起植入物更加中性的pH (框412和框414中)。應(yīng)理解，pH中和可以通過除脫水之外的化學(xué)物質(zhì)或物理方法實現(xiàn)。清洗溶液可以是水、鹽水、過氧化物類、醇、晶體、滅菌液體、保存液、保存劑等，或在同種異體移植物過程中使用的其他液體。因此，可以以該方式制作具有增加的生物活性的研磨的顆粒狀填充物植入物以及有結(jié)構(gòu)但可變形/可壓縮的松質(zhì)骨植入物。現(xiàn)在參考圖5，其描繪本發(fā)明選擇性的實施方式。在框502中，骨皮質(zhì)從尸體、活供體回收，或從患者自體獲得。取決于植入物的應(yīng)用，可將骨皮質(zhì)磨或切割至期望的形狀和構(gòu)型。因此，在框504中，松質(zhì)骨也從與骨皮質(zhì)相同的供體獲得。取決于期望的應(yīng)用，可將松質(zhì)骨磨或切割至特定的形狀和構(gòu)型。注意在獲取和切割操作期間盡可能多地保留松質(zhì)骨內(nèi)的細(xì)胞材料、骨髓、和/或血。在本發(fā)明的實施方式中，松質(zhì)骨可能具有如在髂嵴、椎體、chondyles等中的骨皮質(zhì)部分。因此,松質(zhì)骨可在進(jìn)一步處理之前將皮質(zhì)部分去除。在框506中，將松質(zhì)骨經(jīng)受裂解劑，如但不限于鹽酸，以裂解保留在多孔骨結(jié)構(gòu)中和骨表面上的細(xì)胞。在框510和在框512中，可將獲取的骨皮質(zhì)清潔并去礦化以去除其礦物含物，其包括但不限于鈣鹽。該去礦化方法可能涉及在酸中的浸泡和/或?qū)⑺嵫h(huán)真空灌注到骨孔里。采用真空輔助的循環(huán)去礦化方法，作為非限制性實例，可能將所需要的去礦化時間減少一分鐘到五十九分鐘。真空輔助的循環(huán)去礦化循環(huán)可以有助于從整個植入物而不僅是在表面上相當(dāng)均勻地去除鈣礦物質(zhì)。如果去礦化步驟通過在酸中浸泡骨皮質(zhì)而實施，可能出現(xiàn)非均勻的鈣礦物質(zhì)去除。非均勻的鈣礦物去除可以導(dǎo)致變化在整個植入物的不同部分的鈣濃度梯度。
采用真空輔助的循環(huán)去礦化相對于將樣品在酸中浸泡而可以產(chǎn)生更均勻的鈣濃度，這帶來具有更好的韌性和彈性的更堅固的植入物。另外，該方法可以被用于減少骨的模量，以更好地匹配在患者的手術(shù)植入位置發(fā)現(xiàn)的自然機械性質(zhì)。這可以有利于骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)減少的患者，或患有低骨密度或骨礦物質(zhì)密度的患者。此外，這均勻的模量減少在植入部位去皮的手術(shù)位置是有利的。均勻的鈣礦物質(zhì)去除還可以減少脊柱融合中的沉降速率。利用真空輔助的循環(huán)去礦化還可更好地保持骨皮質(zhì)內(nèi)的生長因子。在框514中，如果確定骨皮質(zhì)的模量水平是可接受的，該模量減少的骨皮質(zhì)或皮質(zhì)松質(zhì)骨還可以用結(jié)合的生長因子和/或生物活性物質(zhì)制作。裂解獲取的松質(zhì)骨的細(xì)胞釋放并溶液化包含在細(xì)胞材料中的生長因子和生物活性物質(zhì)。鹽酸還限制溶解的生物活性物質(zhì)及生長因子與松質(zhì)骨的結(jié)合。在框515中，將在鹽酸中的溶解的生長因子以及生物活性物質(zhì)加入到從相同供體獲得的骨皮質(zhì)中。生長因子及生物活性物質(zhì)很容易地與礦化的或去礦化的骨皮質(zhì)結(jié)合。在框516中，在結(jié)合之后可將骨進(jìn)一步清洗并清潔，以去除過量的鹽酸、細(xì)胞片段、脂、和/或碎片等。清洗溶液可以是水、鹽水、過氧化物類、醇、類晶體、滅菌液體、保存 液、保存劑、和/或在同種異體移植物過程中使用的其他液體。另外，如果植入物進(jìn)一步地被去礦化，植入物可以在與生物活性物質(zhì)和/或生長因子結(jié)合之前或之后制成可變形的。因此，可以以該方式制作具有增加的生物活性的模量減少的有結(jié)構(gòu)的骨皮質(zhì)植入物?，F(xiàn)在參考圖6，其描繪本發(fā)明選擇性的實施方式。在框602中，骨髓從尸體、活供體獲取，或從患者自體獲得。如果使用尸體供體，通過獲取在進(jìn)行任何骨剖切之前的骨髓可獲得較大體積的骨髓。在一些實施方式中，利用連接真空管的管狀錐來富集骨髓，還增加從尸體供體獲得骨髓的收率。管狀錐的尖端在松質(zhì)骨內(nèi)分裂開，允許真空通過插管將骨髓牽引入采集室里。從活供體在供體在去除生命支持之前獲取骨髓還可以采用骨髓獲取技術(shù)，因為在移動髓時，由生理循環(huán)所引起的血流將額外的骨髓材料沖到用于進(jìn)一步抽吸的區(qū)域里。在框606中，在已富集骨髓之后，可以通過過濾、離心、磁珠綁定、熒光激活細(xì)胞分選(FACS)、和/或可想到的其他細(xì)胞分選或濃縮技術(shù)來集中特定的細(xì)胞類型(如間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、或其他祖細(xì)胞)以增加細(xì)胞濃度、分開細(xì)胞類型、或從溶液中除去特定的細(xì)胞類型。在框606中，一旦獲得期望的細(xì)胞群，可將其經(jīng)受前面所描述的裂解技術(shù)，如經(jīng)受醋酸。一旦將醋酸加入到細(xì)胞，它們在給定時間來裂解且將生長因子和其他生物活性物質(zhì)溶解?？梢詫⒃撊芤弘x心或過濾以去除任何的細(xì)胞片段或細(xì)胞碎片。溶液可能經(jīng)歷第二過濾步驟以去除其他固體沉淀物，如析出的血紅蛋白。溶液可能經(jīng)歷第三過濾步驟以濃縮溶液中的生長因子和其他生物活性物質(zhì)。然后，利用前面所描述方法(如冷干)將溶液脫水。在框610中，將溶液減少至水可溶的粉末并且在框612中，可在真空下密封以增加保存期限。還可以將溶液結(jié)冰以增加保存期限。該粉末可以富含數(shù)量或生物活性分子和/或生長因子，包括但不限于，BMP-2、VEGF, aFGF、FGF - 6、TGF-Bl、以及可想到的其他?，F(xiàn)在參考圖7，其描繪本發(fā)明選擇性的實施方式。在所描述的實施方式中，在框702中，松質(zhì)骨從尸體、活供體回收，或從患者自體獲得。如果需要特定的植入物應(yīng)用，可將獲取的松質(zhì)骨磨或切割至期望的形狀和構(gòu)型。注意在獲取和切割操作期間盡可能多地保留骨內(nèi)的骨髓和血。在本發(fā)明的實施方式中，松質(zhì)骨可能具有如在髂嵴、椎體、chondyles等中的骨皮質(zhì)部分。因此，松質(zhì)骨可在進(jìn)一步處理之前將皮質(zhì)部分去除。在框704中，然后將獲取的松質(zhì)骨經(jīng)受裂解劑(如水)，以溶解包含在松質(zhì)骨內(nèi)的細(xì)胞。如果使用特定的抗凝劑(如肝素)作為裂解劑，通過裂解細(xì)胞而釋放的生長因子會在溶液中溶解。如果沒有使用抗凝劑或如果使用不同的抗凝血劑，如枸櫞酸鈉，細(xì)胞將被溶解并且釋放生長因子，但是它們不會液體中充分地溶解。在該情況下，然后在框706中，將骨液體中移出，且在框708中，將增溶劑(如酸)力口入到液體以溶解生長因子和其他生物活性物質(zhì)。一旦生長因子和其他生物活性物質(zhì)已溶解，可將液體中和和/或凍干(在框710中)。如果使用醋酸作為增溶劑，中和可以是不一定的，因為大量醋酸在凍干期間將蒸發(fā)。選擇性地，可使用其他裂解劑和增溶劑用于裂解細(xì)胞并且溶解生長因子，防止生長因子和生物活性物質(zhì)與從中富集細(xì)胞的松質(zhì)骨結(jié)合。 現(xiàn)在參考圖8，其描繪本發(fā)明選擇性的實施方式。在所描繪的實施方式中，在框802中，松質(zhì)骨從尸體、活供體回收，或從患者自體獲得。如果需要特定的植入物應(yīng)用，可將松質(zhì)骨磨或切割至期望的形狀和構(gòu)型。注意在獲取和切割操作期間盡可能多地保留骨內(nèi)的骨髓和血。松質(zhì)骨可能具有如在髂嵴、椎體、chondyles等中的骨皮質(zhì)部分。因此，可將獲取的松質(zhì)骨的骨皮質(zhì)部分移除。在框804中，將獲取的松質(zhì)骨經(jīng)受水以選擇性地裂解不期望的細(xì)胞類型，如紅血細(xì)胞、白血細(xì)胞等。在一些實施方式中，骨對水的比率可以采用從I份骨對I份水到I份骨對200份水的范圍。未附在骨上的任何剩余活細(xì)胞可以以該方式清洗掉。另外，使用弱的裂解劑(如少于IM的醋酸)可能引起溶解的生長因子與骨結(jié)合，但仍然保留附在骨上的活祖先細(xì)胞。期望的細(xì)胞，如間質(zhì)干細(xì)胞、骨髓間質(zhì)細(xì)胞、祖先細(xì)胞等在多孔骨結(jié)構(gòu)中和在骨表面上保持活力。前面所描述的其他機械裂解技術(shù)如超聲處理、攪拌誘導(dǎo)修剪、熱解可能與水浴共同使用，以促進(jìn)細(xì)胞材料的裂解。在框806中，在裂解時間(例如I分鐘-50小時)已過去之后,加入鹽水以恢復(fù)溶液的滲透性至生理水平(例如大約0. 9%的鹽)。在框808中，在溶液恢復(fù)到等滲條件之后，將液體輕輕倒出，留下骨。有效的清洗還有助于去除不期望的未與松質(zhì)骨結(jié)合的細(xì)胞，并且在傾倒步驟中將它們棄除。在框810中，可將抗生素施加至骨以幫助降低生物負(fù)荷量水平。選擇性地，在一些實施方式中，可以在裂解步驟之前將抗生素給至獲取的松質(zhì)骨?？墒褂玫囊恍┛股匕☉c大霉素、萬古霉素、兩性霉素、前面提到的或可以想到的其他抗生素，或可以用于降低同種異體移植組織中的生物負(fù)荷量的各種抗生素。在降低生物負(fù)荷量之后，骨可經(jīng)受貯藏或保存液體，如DMEM、DMS0、蔗糖、甘露醇、葡萄糖等。然后將骨凍結(jié)，直到解凍用于以修復(fù)骨骼缺陷的手術(shù)操作。在一些實施方式中，骨可以被凍結(jié)至或低于_40°C的溫度?，F(xiàn)在參考圖9，其描繪本發(fā)明選擇性的實施方式。在所描繪的實施方式中，可將在上面參考圖6和/或7所描述的實施方式中所獲得的生長因子和生物活性物質(zhì)(作為非限制性實例)在脫水之前加入到可生物降解或可再吸收的聚合物。因此，在框902中所獲取的骨髓可經(jīng)受在框904中的至少一次如上面參考圖6所描述的過濾操作。在框906中，獲取的骨髓可以經(jīng)受也上面提到的裂解劑。在該實施方式中，生長因子以及生物活性物質(zhì)按照前面所描述的(方法)來獲取并加入到含普通溶劑(如一種酸)的聚合物中。可生物降解的聚合物可以為蛋白或多糖，如骨膠原、透明質(zhì)酸、殼聚糖、明膠等，以及兩種或更多種聚合物的組合。在框910中，在將生長因子和生物活性物質(zhì)加入到聚合物之后，混合以獲得基本勻質(zhì)的溶液。然后可將任何泡沫或雜質(zhì)從基本勻質(zhì)的溶液中去除。如果需要將其他材料(如，但不限于，磷酸鈣、去礦化骨、羥基磷灰石、肝素、硫酸軟骨素等)嵌入植入物中，用于生長因子附著、降解副產(chǎn)物、和/或機械強化，還可以將它們加到到混合物。在框912中，混合物在，在一些實施方式中，從_200°C到(TC的范圍內(nèi)冷凍，以將包含在混合物中的水成核到冰，并將聚合物/生物活性混合物凝結(jié)至多孔結(jié)構(gòu)里?；旌衔锟梢员粌鼋Y(jié)成任何幾何形狀，包括，球形、圓柱形、矩形、以片的形式、管形式等。植入物將傾向于以保持該形狀，以聚合物的形狀記憶性質(zhì)給予空間以在體內(nèi)擴大?？梢栽黾訙囟纫援a(chǎn)生更大的孔或減少減少溫度以產(chǎn)生小孔。通過與期望的孔方向垂直地放置低溫源而可以將孔做成定向的。在框914中，一旦混合物在期望的溫度和孔方向凍結(jié)，將植入物凍干和/或脫水以基本消除包含在其內(nèi)的水。如果使用醋酸或另外的揮發(fā)物質(zhì)作為溶劑，該溶劑也將通過凍干而消除。 在框915中，在完成凍干之后，支架可在乙醇、鹽水、堿或緩沖劑中基本被中和，這用作裂解劑的溶劑。在醋酸溶劑的情況下，凍干的植入物可以在乙醇中清洗，接著在鹽水或其他清洗劑中清洗。在鹽水清洗之后，植入物可以用不含鹽的水清洗并真空干燥或凍干以延長保存期限。在框918中，脫水的植入物可以在真空下包裝或在真空密封小瓶中密封。植入物還可以在凍結(jié)和凍干之前或者在中和和凍干之后被壓縮，以產(chǎn)生在經(jīng)受液體時膨脹的壓縮支架。在經(jīng)受液體后，這樣的植入物基本膨脹到近似最初的支架大小。通過壓縮中和的支架并在沒有凍結(jié)的情況下干燥可實現(xiàn)延時膨脹?，F(xiàn)在參考圖10，其描繪本發(fā)明選擇性的實施方式。在所描繪的實施方式中，可將在上面參考圖6和/或7所討論的實施方式中所獲得的生長因子和生物活性物質(zhì)(作為非限制性實例)加入到可生物降解或可再吸收的聚合物以產(chǎn)生可流動的液體和/或凝膠。在該實施方式中，生長因子以及生物活性物質(zhì)按照前面所描述的(方法)來獲取并加入到含普通溶劑(如一種酸)的聚合物中。因此,在框1002中所獲取的骨髓可經(jīng)受框1004中的至少一次如上面參考圖6所描述的過濾操作。在框1006中，獲取的骨髓可以經(jīng)受也上面提到的裂解劑?？缮锝到獾木酆衔锟梢詾榈鞍谆蚨嗵?，如骨膠原、透明質(zhì)酸、殼聚糖、明膠等，以及兩種或更多種聚合物的組合。在框1010中，在將生長因子和生物活性物質(zhì)加入到聚合物之后，混合以獲得基本勻質(zhì)的溶液?？扇コ魏闻菽螂s質(zhì)。如果需要將其他材料(如，但不限于，磷酸鈣、去礦化骨、羥基磷灰石、肝素、硫酸軟骨素等)嵌入植入物中，用于生長因子附著、降解副產(chǎn)物、和/或機械強化，還可以將它們加到到混合物?？梢赃x擇身體耐受的裂解劑。例如，可以將生長因子以及生物活性物質(zhì)加入到殼聚糖并在醋酸溶液(0.01M-17M)中。還可以將去礦化的骨加入到該溶液中?；旌洗巳芤?，且可以通過施加真空或離心來去除泡沫。在框1012中，可以將凝膠包裝在注射器中，并凍結(jié)和/或保持在環(huán)境溫度。一旦注射和/或植入體內(nèi)，凝膠與組織結(jié)合。生理流體體可緩沖凝膠以中和PH并且引起凝膠原位凝固。一旦凝膠凝固，期望的治療性植入物保留在預(yù)期的手術(shù)位置并且將遷移減至最小?，F(xiàn)在參考圖11，其描繪本發(fā)明選擇性的實施方式。按照在上面參考圖10所討論的實施方式中所描述的所獲得凝膠可利用技術(shù)如真空干燥、溶劑蒸發(fā)等來脫水，以將凝膠減至到半硬膜和/或小球。因此，在框1102中所獲取的骨髓可經(jīng)受框1104中的至少一次如上面參考圖6所描述的過濾操作。在框1106中，獲取的骨髓可以經(jīng)受也上面提到的裂解劑。在框1112中，按照上面所描述的將凝膠脫水。在框1114中，丸劑可進(jìn)一步地磨或切至期望的粒徑，這取決于期望的植入物應(yīng)用。一旦經(jīng)受液體并植入手術(shù)位置，由研磨小球所產(chǎn)生小球和/或粉末形成也可以與組織結(jié)合的粘性油灰。該結(jié)合性質(zhì)使油灰在植入時基本保持在手術(shù)位置。該油灰可以用作生物活性手術(shù)粘合劑。這 樣的油灰在與用于手術(shù)過程的自體材料(如用于脊柱融合操作的自體移植骨)一起使用時也是有用的，因為其可有利于幫助將自體移植物保持在粘性團(tuán)中并且將遷移減至最小。現(xiàn)在參考圖12，所顯示的是說明以生產(chǎn)實施方式的低pH殼聚糖/礦物油灰的方法的流程框圖。在框1202中，制作殼聚糖溶液。殼聚糖溶液可在約1%至約25%的范圍內(nèi)。在框1204中，然后加入酸(例如醋酸)以促使溶液成為懸浮液。酸可在約0. 1%至約25%的范圍內(nèi)。然后，在框1206中，加入以粉末或顆粒形式的礦物質(zhì)，并且在框1208中，攪成同質(zhì)混合物。在框1210中，接著將濕的或凍結(jié)的油灰包裝?，F(xiàn)在參考圖13，所顯示的是說明以生產(chǎn)實施方式的中性至偏中性的殼聚糖/礦物油灰的方法的流程框圖。在框1302中，制作殼聚糖溶液。殼聚糖溶液可在約1%至約25%的范圍內(nèi)。在框1304中，然后加入酸(例如醋酸)以促使溶液成為懸浮液。酸可在約0. 1%至約25%的范圍內(nèi)。在框1306中，接著通過加入堿性溶液(例如氫氧化鈉或氫氧化銨)并且攪拌以勻質(zhì)該堿性溶液而將懸浮液中和或部分中和。然后，在框1308中，加入以粉末或顆粒形式的礦物質(zhì)，并且在框1310中，攪成同質(zhì)混合物。在框1312中，接著將濕的或凍結(jié)的油灰包裝?，F(xiàn)在參考圖14，其描繪說明以生產(chǎn)實施方式的低pH殼聚糖/骨油灰的方法的流程框圖。在框1402中，制作殼聚糖溶液。殼聚糖溶液可在約1%至約25%的范圍內(nèi)。在框1404中，然后加入酸(例如醋酸)以促使溶液成為懸浮液。酸可在約0. 1%至約25%的范圍內(nèi)。然后，在框1406中，加入以粉末或顆粒形式的骨，并且在框1408中，攪成同質(zhì)混合物。在框1410中，接著將濕的或凍結(jié)的油灰包裝。現(xiàn)在參考圖15，所顯示的是說明以生產(chǎn)實施方式的中性至偏中性的殼聚糖/骨油灰的方法的流程框圖。在框1502中，制作殼聚糖溶液。殼聚糖溶液可在約1%至約25%的范圍內(nèi)。在框1504中，然后加入酸(例如醋酸)以促使溶液成為懸浮液。酸可在約0. 1%至約25%的范圍內(nèi)。在框1506中，接著通過加入堿性溶液(例如氫氧化鈉或氫氧化銨)并且攪拌以勻質(zhì)該堿性溶液而將懸浮液中和或部分中和。然后，在框1508中，加入以粉末或顆粒形式的骨(如同種異體移植骨)，并且在框1510中，攪成同質(zhì)混合物。在框1512中，接著將濕的或凍結(jié)的油灰包裝?，F(xiàn)在參考圖16，所顯示的是說明以生產(chǎn)實施方式的低pH殼聚糖/去礦化骨油灰的方法的流程框圖。在框1602中，制作殼聚糖溶液。殼聚糖溶液可在約1%至約25%的范圍內(nèi)。在框1604中，然后加入酸(例如醋酸)以促使溶液成為懸浮液。酸可在約0. 1%至約25%的范圍內(nèi)。然后，在框1606中，加入以粉末或顆粒形式的去礦化或部分去礦化骨，并且在框1608中，攪成同質(zhì)混合物。在框1610中，接著將濕的或凍結(jié)的油灰包裝。
現(xiàn)在參考圖17，其描繪說明以生產(chǎn)實施方式的中性至偏中性殼聚糖/去礦化骨油灰的方法的流程框圖。在框1702中，制作殼聚糖溶液。殼聚糖溶液可在約1%至約25%的范圍內(nèi)。在框1604中，然后加入酸(例如醋酸)以促使溶液成為懸浮液。酸可在約0. 1%至約25%的范圍內(nèi)。在框1606中，接著通過加入堿性溶液(例如氫氧化鈉或氫氧化銨)并且攪拌以勻質(zhì)該堿性溶液而將懸浮液中和或部分中和。然后，在框1708中，加入以粉末或顆粒形式的去礦化或部分去礦化骨(如同種異體移植骨)，并且在框1710中，攪拌成同質(zhì)混合物。在框1712中，接著將濕的或凍結(jié)的油灰包裝?，F(xiàn)在參考圖18，所顯示的是說明以生產(chǎn)實施方式的中性至偏中性的殼聚糖/礦物支架海綿的方法的流程框圖。在框1802中，制作殼聚糖溶液。殼聚糖溶液可在約1%至約25%的范圍內(nèi)。然后，在框1804中，加入以粉末或顆粒形式的礦物質(zhì)，并且攪成同質(zhì)混合物。在框1806中，然后加入酸(例如醋酸)以促使溶液成為懸浮液，并且在框1808中攪拌。酸可在約0. 1%至約25%的范圍內(nèi)。在框1810中，然后將懸浮液置入模中以符合一種或多種期望的形狀。在框1812中，接著將懸浮液冷凍干燥。將模置入制冷器中并且將懸浮液凍結(jié)以允許形成結(jié)晶。凍干已凍結(jié)的懸浮液并將形成的支架從模中推出。在框1814中，接著通過浸入堿性溶液(例如氫氧化鈉或氫氧化銨)而將支架中和或部分中和。在框1816中，然后將 支架在無菌水或PBS中清洗任何剩余的堿性溶液并且在框1818中，在支架凍結(jié)和凍干的地方冷凍干燥。在框1820中，將支架壓縮成期望的形狀并在框1822中包裝和消毒。現(xiàn)在參考圖19，所顯示的是說明以生產(chǎn)另外的實施方式的中性至偏中性的殼聚糖/礦物支架海綿的方法的流程框圖。在框1902中，制作殼聚糖溶液。殼聚糖溶液可在約1%至約25%的范圍內(nèi)。然后，在框1904中，加入以粉末或顆粒形式的礦物質(zhì)，并且攪成同質(zhì)混合物。在框1906中，然后加入酸(例如醋酸)以促使溶液成為懸浮液，并在框1908中攪拌。酸可在約0. 1%至約25%的范圍內(nèi)。在框1910中，然后將懸浮液置入模中以符合一種或多種期望的形狀。在框1912中，接著將懸浮液冷凍干燥。將模置入制冷器中并且將懸浮液凍結(jié)以允許形成結(jié)晶。凍干已凍結(jié)的懸浮液并將形成的支架從模中推出。在框1914中，接著通過浸入堿性溶液(例如氫氧化鈉或氫氧化銨)而將支架中和或部分中和。在框1916中，然后將支架在無菌水或PBS中清洗任何剩余的堿性溶液并且在框1918中，在支架凍結(jié)和凍干的地方冷凍干燥。在框1920中，接著將蛋白通過浸泡或真空灌注的方式結(jié)合到支架上。現(xiàn)在參考圖20，其描繪說明以生產(chǎn)實施方式的中性至偏中性含種子細(xì)胞的殼聚糖/礦物支架海綿的方法的流程框圖。在框2002中，制作殼聚糖溶液。殼聚糖溶液可在約1%至約25%的范圍內(nèi)。然后，在框2004中，加入以粉末或顆粒形式的礦物質(zhì)，并且攪成同質(zhì)混合物。在框2006中，然后加入酸(例如醋酸)以促使溶液成為懸浮液，并且在框2008中攪拌。酸可在約0. 1%至約25%的范圍內(nèi)。在框2010中，然后將懸浮液置入模中以符合一種或多種期望的形狀。在框2012中，接著將懸浮液冷凍干燥。將模置入制冷器中并且將懸浮液凍結(jié)以允許形成結(jié)晶。凍干已凍結(jié)的懸浮液并將形成的支架從模中推出。在框2014中，接著通過浸入堿性溶液(例如氫氧化鈉或氫氧化銨)而將支架中和或部分中和。在框2016中，然后將支架在無菌水或PBS中清洗任何剩余的堿性溶液并且在框2018中，在支架凍結(jié)和凍干的地方冷凍干燥。在框2020中，然后將種子細(xì)胞通過水化、浸泡或真空灌注的方式結(jié)合到支架上?，F(xiàn)在參考圖21，所顯示的是說明以生產(chǎn)實施方式的中性至偏中性的殼聚糖/骨支架海綿的方法的流程框圖。在框2102中，制作殼聚糖溶液。殼聚糖溶液可在約1%至約25%的范圍內(nèi)。然后，在框2104中，加入以粉末或顆粒形式的骨，并且攪拌成同質(zhì)混合物。在框2106中，然后加入酸(例如醋酸)以促使溶液成為懸浮液，并且在框2108中攪拌。酸可在約0. 1%至約25%的范圍內(nèi)。在框2110中，然后將懸浮液置入模中以符合一種或多種期望的形狀。在框2112中，接著將懸浮液冷凍干燥。將模置入制冷器中并且將懸浮液凍結(jié)以允許形成結(jié)晶。凍干已凍結(jié)的懸浮液并將形成的支架從模中推出。在框2114中，接著通過浸入堿性溶液(例如氫氧化鈉或氫氧化銨)而將支架中和或部分中和。在框2116中，然后將支架在無菌水或PBS中清洗任何剩余的堿性溶液并且在框2118中，在支架凍結(jié)和凍干的地方冷凍干燥。在框2120中，將支架壓縮成期望的形狀并在框2122中包裝和消毒?，F(xiàn)在參考圖22，所顯示的是說明以生產(chǎn)另外的實施方式的中性至偏中性的殼聚糖/骨支架海綿的方法的流程框圖。在框2202中，制作殼聚糖溶液。殼聚糖溶液可在約1%至約25%的范圍內(nèi)。然后，在框2204中，加入以粉末或顆粒形式的骨，并且攪拌成同質(zhì)混合物。在框2206中，然后加入酸(例如醋酸)以促使溶液成為懸浮液，并且在框2208中攪拌。酸可在約0. 1%至約25%的范圍內(nèi)。在框2210中，然后將懸浮液置入模中以符合一種或多 種期望的形狀。在框2212中，接著將懸浮液冷凍干燥。將模置入制冷器中并且將懸浮液凍結(jié)以允許形成結(jié)晶。凍干已凍結(jié)的懸浮液并將形成的支架從模中推出。在框2214中，接著通過浸入堿性溶液(例如氫氧化鈉或氫氧化銨)而將支架中和或部分中和。在框2216中，然后將支架在無菌水或PBS中清洗任何剩余的堿性溶液并且在框2218中，在支架凍結(jié)和凍干的地方冷凍干燥。在框2220中，接著將蛋白通過浸泡或真空灌注的方式結(jié)合到支架上。現(xiàn)在參考圖23，其描繪說明以生產(chǎn)實施方式的中性至偏中性含種子細(xì)胞的殼聚糖/骨支架海綿的方法的流程框圖。在框2302中，制作殼聚糖溶液。殼聚糖溶液可在約1%至約25%的范圍內(nèi)。然后，在框2304中，加入以粉末或顆粒形式的骨，并且攪拌成同質(zhì)混合物。在框2306中，然后加入酸(例如醋酸)以促使溶液成為懸浮液，并且在框2308中攪拌。酸可在約0. 1%至約25%的范圍內(nèi)。在框2310中，然后將懸浮液置入模中以符合一種或多種期望的形狀。在框2312中，接著將懸浮液冷凍干燥。將模置入制冷器中并且將懸浮液凍結(jié)以允許形成結(jié)晶。凍干已凍結(jié)的懸浮液并將形成的支架從模中推出。在框2314中，接著通過浸入堿性溶液(例如氫氧化鈉或氫氧化銨)而將支架中和或部分中和。在框2316中，然后將支架在無菌水或PBS中清洗任何剩余的堿性溶液并且在框2318中，在支架凍結(jié)和凍干的地方冷凍干燥。在框2320中，然后將種子細(xì)胞通過水化、浸泡或真空灌注的方式結(jié)合到支架上?，F(xiàn)在參考圖24，所顯示的是說明以生產(chǎn)實施方式的中性至偏中性的殼聚糖/去礦化骨支架海綿的方法的流程框圖。在框2402中，制作殼聚糖溶液。殼聚糖溶液可在約1%至約25%的范圍內(nèi)。然后，在框2404中，加入以粉末或顆粒形式的去礦化或部分去礦化骨，并攪成同質(zhì)混合物。在框2406中，然后加入酸(例如醋酸)以促使溶液成為懸浮液，并且在框2408中攪拌。酸可在約0. 1%至約25%的范圍內(nèi)。在框2410中，然后將懸浮液置入模中以符合一種或多種期望的形狀。在框2412中，接著將懸浮液冷凍干燥。將模置入制冷器中并且將懸浮液凍結(jié)以允許形成結(jié)晶。凍干已凍結(jié)的懸浮液并將形成的支架從模中推出。在框2414中，接著通過浸入堿性溶液(例如氫氧化鈉或氫氧化銨)而將支架中和或部分中和。在框2416中，然后將支架在無菌水或PBS中清洗任何剩余的堿性溶液并且在框2418中，在支架凍結(jié)和凍干的地方冷凍干燥。在框2420中，將支架壓縮成期望的形狀并在框2422中包裝和消毒。現(xiàn)在參考圖25，所顯示的是說明以生產(chǎn)另外的實施方式的中性至偏中性的殼聚糖/去礦化骨支架海綿的方法的流程框圖。在框2502中，制作殼聚糖溶液。殼聚糖溶液可在約1%至約25%的范圍內(nèi)。然后，在框2504中，加入以粉末或顆粒形式的去礦化或部分去礦化骨，并攪成同質(zhì)混合物。在框2506中，接著加入酸(例如醋酸)以促使溶液成為懸浮液，并且在框2508中攪拌。酸可在約0. 1%至約25%的范圍內(nèi)。在框2510中，然后將懸浮液置入模中以符合一種或多種期望的形狀。在框2512中，接著將懸浮液冷凍干燥。將模置入制冷器中并且將懸浮液凍結(jié)以允許形成結(jié)晶。凍干已凍結(jié)的懸浮液并將形成的支架從模中推出。在框2514中，接著通過浸入堿性溶液(例如氫氧化鈉或氫氧化銨)而將支架中和或部分中和。在框2516中，然后將支架在無菌水或PBS中清洗任何剩余的堿性溶液并且在框2518中，在支架凍結(jié)和凍干的地方冷凍干燥。在框2520中，接著將蛋白通過浸泡或真空灌注的方式結(jié)合到支架上。
現(xiàn)在參考圖26，其描繪說明以生產(chǎn)實施方式的中性至偏中性含種子細(xì)胞的殼聚糖/去礦化骨支架海綿的方法的流程框圖。在框2602中，制作殼聚糖溶液。殼聚糖溶液可在約1%至約25%的范圍內(nèi)。然后，在框2604中，加入以粉末或顆粒形式的去礦化或部分去礦化骨，并攪成同質(zhì)混合物。在框2606中，然后加入酸(例如醋酸)以促使溶液成為懸浮液，并且在框2608中攪拌。酸可在約0. 1%至約25%的范圍內(nèi)。在框2610中，然后將懸浮液置入模中以符合一種或多種期望的形狀。在框2612中，接著將懸浮液冷凍干燥。將模置入制冷器中并且將懸浮液凍結(jié)以允許形成結(jié)晶。凍干已凍結(jié)的懸浮液并將形成的支架從模中推出。在框2614中，接著通過浸入堿性溶液(例如氫氧化鈉或氫氧化銨)而將支架中和或部分中和。在框2616中，然后將支架在無菌水或PBS中清洗任何剩余的堿性溶液并且在框2618中，在支架凍結(jié)和凍干的地方冷凍干燥。在框2620中，然后將種子細(xì)胞通過水化、浸泡或真空灌注的方式結(jié)合到支架上。一旦細(xì)胞被結(jié)合，可帶有低溫防腐劑并凍結(jié)而包裝支架。提供下面的非限制性實施例用于進(jìn)一步地說明。支架海綿制劑-質(zhì)量百分比(份/100份)在第一非限制性實施例中，最終產(chǎn)生在83. 6%的水中，混入6%的磷酸三鈣(TCP)的6%的大于300kDa分子量的殼聚糖溶液(>75%去乙酰化)。然后將該溶液混入4. 4%的醋酸以促使該溶液成為懸浮液。接著將懸浮液置入模中并以每15分鐘5° C變速控制速率凍結(jié)到-80° C的溫度。一旦懸浮液轉(zhuǎn)變?yōu)楣腆w，將模凍干，直至完成干燥。然后，將支架用2摩爾NaOH溶液水化。接著用無菌水清洗支架，直至達(dá)到中性pH。然后將支架以控制速率凍結(jié)，并冷凍干燥，直至干燥。在第二非限制性實施例中，混入6%的TCP的4%的大于300kDa分子量的殼聚糖溶液(>75%去乙?；?產(chǎn)生在85. 6%的水中。然后將該溶液混入4. 5%的醋酸以促使該溶液成為懸浮液。接著將懸浮液置入模中并以每15分鐘5° C變速控制速率凍結(jié)到-80° C的溫度。一旦懸浮液轉(zhuǎn)變?yōu)楣腆w，將模凍干，直至完成干燥。然后，將支架用2摩爾NaOH溶液水化。接著用無菌水清洗支架，直至達(dá)到中性pH。然后將支架以控制速率凍結(jié)，并冷凍干燥，直至干燥。在第三非限制性實施例中，最終產(chǎn)生在86. 45%的水中，混入6%份的TCP的3%的大于300kDal分子量的殼聚糖溶液(>75%去乙?；?。然后將該溶液混入4. 55%的醋酸以促使該溶液成為懸浮液。接著將懸浮液置入模中并以每15分鐘5° C變速控制速率凍結(jié)到-80° C的溫度。一旦懸浮液轉(zhuǎn)變?yōu)楣腆w，將模凍干，直至完成干燥。然后，將支架用2摩爾NaOH溶液水化。接著用無菌水清洗支架，直至達(dá)到中性pH。然后將支架以控制速率凍結(jié)，并冷凍干燥，直至干燥。在第四非限制性實施例中，最終產(chǎn)生在87. 4%的水中，混入6%的TCP的2%的大于300kDa分子量的殼聚糖溶液(>75%去乙酰化)。然后將該溶液混入4. 6%的醋酸以促使該溶液成為懸浮液。接著將懸浮液置入模中并以每15分鐘5° C變速控制速率凍結(jié)到-80° C的溫度。一旦懸浮液轉(zhuǎn)變?yōu)楣腆w，將模凍干，直至完成干燥。然后，將支架用2摩爾NaOH溶液水化。接著用無菌水清洗支架，直至達(dá)到中性pH。然后將支架以控制速率凍結(jié)，并冷凍干燥，直至干燥。
含蛋白的海綿制劑-質(zhì)量百分比(份/100份)在非限制性實施例中，最終產(chǎn)生在86. 45%的水中，混入6%份的TCP的3%的大于300kDa分子量的殼聚糖溶液(>75%去乙?；?。然后將該溶液混入4. 55%的醋酸以促使該溶液成為懸浮液。接著將懸浮液置入模中并以每15分鐘5° C變速控制速率凍結(jié)到-80° C的溫度。一旦懸浮液轉(zhuǎn)變?yōu)楣腆w，將模凍干，直至完成干燥。然后，將支架用2摩爾NaOH溶液水化。接著用無菌水清洗支架，直至達(dá)到中性pH。然后將支架以控制速率凍結(jié)，并冷凍干燥，直至干燥。接著將支架用蛋白溶液充分滲透。含細(xì)胞的海綿制劑-質(zhì)量百分比(份/100份)在非限制性實施例中，最終產(chǎn)生在86. 45%的水中，混入6%份的TCP的3%的大于300kDa分子量的殼聚糖溶液(>75%去乙?；?。然后將該溶液混入4. 55%的醋酸以促使該溶液成為懸浮液。接著將懸浮液置入模中并以每15分鐘5° C變速控制速率凍結(jié)到-80° C的溫度。一旦懸浮液轉(zhuǎn)變?yōu)楣腆w，將模凍干，直至完成干燥。然后，將支架用2摩爾NaOH溶液水化。接著用無菌水清洗支架，直至達(dá)到中性pH。然后將支架以控制速率凍結(jié)，并冷凍干燥，直至干燥。接著將支架用含活細(xì)胞的生理溶液充分滲透。酸性油灰制劑-質(zhì)量百分比(份/100份)在第一非限制性實施例中，最終產(chǎn)生混入45%的水的1%的大于300kDa分子量的殼聚糖溶液(>75%去乙?；?。然后將該溶液混入1%的醋酸以促使該溶液成為懸浮液。接著將53%的TCP加入到懸浮液里，并且攪拌，直至到達(dá)勻質(zhì)混合物。在第二非限制性實施例中，最終產(chǎn)生混入44%的水的1%的大于300kDa分子量的殼聚糖溶液(>75%去乙?；?。然后將該溶液混入2%的醋酸以促使該溶液成為懸浮液。接著將53%的TCP加入到懸浮液里，并且攪拌，直至到達(dá)勻質(zhì)混合物。在第三非限制性實施例中，最終產(chǎn)生混入43%的水的1%的大于300kDa分子量的殼聚糖溶液(>75%去乙?；?。然后將該溶液混入3%的醋酸以促使該溶液成為懸浮液。接著將53%的TCP加入到懸浮液里，并且攪拌，直至到達(dá)勻質(zhì)混合物。中性油灰制劑-質(zhì)量百分比(份/100份)在非限制性實施例中，最終產(chǎn)生混入45%的水的1%的大于300kDa分子量的殼聚糖溶液(>75%去乙酰化)。然后將該溶液混入1%的醋酸以促使該溶液成為懸浮液。接著將懸浮液用3%2摩爾NaOH溶液中和并且攪拌。接著將53%的TCP加入到懸浮液里并攪拌，直至到達(dá)油灰樣稠度。含蛋白的油灰制劑-質(zhì)量百分比(份/100份)在非限制性實施例中，最終產(chǎn)生混入45%的水的1%的大于300kDa分子量的殼聚糖溶液(>75%去乙?；?。然后將該溶液混入1%的醋酸以促使該溶液成為懸浮液。接著將懸浮液用3%2摩爾NaOH溶液中和并且攪拌。接著將53%的TCP加入到懸浮液里并攪拌，直至到達(dá)油灰樣稠度。接著將油灰用蛋白溶液充分滲透。含細(xì)胞的油灰制劑-質(zhì)量百分比(份/100份)在非限制性實例中，最終產(chǎn)生混入45%的水的1%的大于300kDa分子量的殼聚糖溶液(>75%去乙?；?。然后將該溶液混入1%的醋酸以促使該溶液成為懸浮液。接著將懸浮液用3%2摩爾NaOH溶液中和并且攪拌。接著將53%的TCP加入到懸浮液里并攪拌，直至到達(dá)油灰樣稠度。接著將油灰用含活細(xì)胞的生理溶液充分滲透。顆粒狀粉末制劑-質(zhì)量百分比(份/100份) 在非限制性實施例中，最終產(chǎn)生混入45%的水的2%的大于300kDa分子量的殼聚糖溶液(>75%去乙酰化)。然后將該溶液混入2%的醋酸以促使該溶液成為懸浮液。接著將51%的TCP加入到懸浮液里并攪拌，直至到達(dá)油灰樣稠度。將油灰凍干并磨成粉末。將粉末與自體移植骨或手術(shù)中的生理溶液混合，以產(chǎn)生凝膠或油灰。顆粒狀粉末可保持為粉末，用于后面的再組成。殼聚糖/TCP支架表現(xiàn)出范圍從約20至80 iim的孔隙度。圖27提供41. 13%和20. 42%材料密度支架的材料性質(zhì)的實施例，包括體積、材料體積、靜體積以及ROI。接著參考圖28，所顯示的是根據(jù)支架的示例性實施方式的圓周膨脹的圖。在該實施方式中，比較支架的水化尺寸與壓縮尺寸，并基于含60mg/mL TCP的30mg/ml殼聚糖制劑計算總的膨脹百分比。接著參考圖29，所顯示的是根據(jù)支架的示例性實施方式的單軸膨脹的圖。在該實施方式中，比較支架的水化尺寸與壓縮尺寸。計算對于不同制劑的總的膨脹百分比，制劑分別包含對應(yīng)40、60、80、100、和120mg/ml的磷酸三鈣濃度的20、30、40、50、和60mg/ml的殼
聚糖濃度。應(yīng)當(dāng)指出，本文中表達(dá)比率、濃度、量和其他數(shù)值數(shù)據(jù)可以采用范圍形式。應(yīng)理解，使用此范圍形式是為了方便和簡潔，因此，應(yīng)以靈活的方式解釋成，不僅包括明確列舉為范圍界限的數(shù)值，而且還包括包含在該范圍內(nèi)的所有單個數(shù)值或子范圍，如同明確地列舉每個數(shù)值和子范圍。為了說明，“約0. 1%至約5%”的濃度范圍，應(yīng)解釋以不僅包括約0. lwt%至5wt%的明顯列舉的濃度，而且還包括在指示范圍內(nèi)的單個濃度(例如1%、2%、3%、和4%)和子范圍(例如0. 5%、1. 1%、2. 2%、3. 3%、和4. 4%)。在一個實施方式中，術(shù)語“約”可以包括根據(jù)數(shù)值的有效數(shù)字的傳統(tǒng)約數(shù)。此外，術(shù)語“約‘X’至‘y’”包括“約‘X’至約‘y’”。雖然在包括的附圖中所描繪的流程圖顯示執(zhí)行各步驟的具體順序，應(yīng)理解執(zhí)行的順序可不同于所描繪的。例如，相對于所顯示的順序可以打亂兩個或更多個塊的執(zhí)行順序。此外，顯示連續(xù)的兩個或更多個塊可同時或部分同時地執(zhí)行。應(yīng)當(dāng)強調(diào)的是本發(fā)明上面所描述的實施方式僅是為了明確理解本發(fā)明的原理而列的可能的實施例的實施。在不基本背離本發(fā)明的精神和原理的條件下，可以對上面所描述的(多個)實施方式進(jìn)行改變和修改。旨在所有這樣的改變和修改包括在本發(fā)明的并由所附權(quán)利要求保護(hù)的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種多孔形狀記憶骨傳導(dǎo)性矯形植入物，包含 抗菌性多糖；以及 骨刺激劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的植入物，其中，所述多糖是殼聚糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的植入物，其中，所述殼聚糖濃度高于約5%。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的植入物，其中，所述殼聚糖濃度高于約30%。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的植入物，其中，所述骨刺激劑包含鈣鹽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的植入物，其中，所述鈣鹽濃度高于約10%。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的植入物，其中，所述鈣鹽濃度高于約30%。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的植入物，其中，所述鈣鹽為磷酸鈣。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的植入物，其中，所述骨刺激劑包含大于約ΙΟΟμπι的顆粒。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的植入物，其中，所述骨刺激劑包含組織。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的植入物，其中，所述組織是同種異體移植、異種移植或自體移植組織。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的植入物，其中，所述組織為至少部分去礦化的骨。
13.根據(jù)權(quán)利要求I所述的植入物，其中，所述植入物是交聯(lián)的。
14.根據(jù)權(quán)利要求I所述的植入物，其中，所述植入物的孔徑至少部分基于控制速率的冷凍。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的植入物，其中，所述植入物的孔的走向至少部分基于所述植入物的指定表面的定向冷凍而調(diào)節(jié)。
16.根據(jù)權(quán)利要求I所述的植入物，其中，所述植入物至少部分脫水并壓縮。
17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的植入物，其中，所述壓縮的植入物的水化使所述植入物恢復(fù)至未壓縮形狀。
18.一種有延展性的矯形植入物，包含 抗菌性多糖； 骨刺激劑；和 水。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的植入物，其中，所述多糖是殼聚糖。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的植入物，其中，所述殼聚糖濃度低于約10%。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的植入物，其中，所述殼聚糖濃度低于約2.5%。
22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的植入物，其中，所述骨刺激劑包含鈣鹽。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的植入物，其中，所述鈣鹽濃度高于約10%。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的植入物，其中，所述鈣鹽濃度高于約40%。
25.根據(jù)權(quán)利要求18所述的植入物，其中，所述骨刺激劑包含組織。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的植入物，其中，所述組織為同種異體移植組織。
27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的植入物，其中，所述組織為至少部分去礦化的骨。
28.根據(jù)權(quán)利要求18所述的植入物，其中，所述骨刺激劑包含大于約ΙΟΟμπι的顆粒。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的植入物，其中，所述顆粒是骨傳導(dǎo)性的。
30.根據(jù)權(quán)利要求18所述的植入物，其中，所述植入物表現(xiàn)出針對金黃色葡萄球菌(MSRA)的抗菌活性。
31.一種矯形植入物涂層，包含 抗菌性多糖。
32.一種包括權(quán)利要求31所述的植入物涂層的植入物。
33.一種矯形植入物，包含 抗菌性多糖； 其中，所述矯形植入物是顆粒形式的。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的植入物，其中，在與自身移植骨混合時，配制所述植入物以形成油灰。
35.根據(jù)權(quán)利要求33所述的植入物，其中，在與生理流體混合時，配制所述植入物以形成油灰。
36.根據(jù)權(quán)利要求33所述的植入物，進(jìn)一步包含骨刺激劑。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的植入物，其中，所述骨刺激劑包含鈣鹽。
全文摘要
本發(fā)明公開了各種生物活性移植物和/或生物相容性材料以及制作其的方法。在一個實施方式中，骨材料獲自獲自捐獻(xiàn)者。所獲得的骨材料與溶解劑接觸，所述溶解劑配制成從所獲得的骨材料的細(xì)胞材料中釋放生長因子和生物活性物質(zhì)。然后將獲得的骨材料用清洗劑清洗。所獲得的骨材料的pH被基本中和。在另外的實施方式中，矯形植入物包含抗菌性多糖。該植入物還可以包含骨刺激劑。
文檔編號A61F2/28GK102781487SQ201080063724
公開日2012年11月14日 申請日期2010年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月13日
發(fā)明者克里斯蒂安·甘博亞, 阿米特·普拉卡什·戈維 申請人:阿米特·普拉卡什·戈維