專利名稱：：去細胞化的脂肪組織的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種對脂肪組織進行去細胞化的方法以及去細胞化的脂肪組織，所述去細胞化的脂肪組織具有很好的保留了三維結(jié)構(gòu)的細胞外基質(zhì)。這種去細胞化脂肪組織適用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，例如在軟組織填充中使用或者用做生物支架。不僅如此，在生物反應(yīng)器或者活體內(nèi)，這種去細胞化脂肪組織還可以在原始細胞或者細胞株靜置培養(yǎng)時被用做細胞培養(yǎng)基底物。
背景技術(shù)：
：當前臨床用于軟組織填充的生物材料主要包含自體的、異體的和異質(zhì)的幾種。自體材料的研究興趣多集中于移植脂肪組織。這種方法比較受歡迎的主要原因是多數(shù)病人體內(nèi)存能夠移植的可消耗的脂肪組織，而且抽脂術(shù)的出現(xiàn)加速了脂肪采集的過程。然而，游離脂肪的移植產(chǎn)生了一些不令人滿意和出乎意料的結(jié)果，就是由于缺少提供支持的血管，移植物被不同程度地吸收掉了?？偟膩碚f，通過注射自體的脂肪，只有一些小的缺陷能夠被糾正，而且這些有限的應(yīng)用還需要反復(fù)的處理以維持脂肪的需求量，因為這些移植的脂肪會逐漸被散布者油脂性囊腫的纖維組織所取代。使用包含皮膚、脂肪和肌肉的帶蒂皮瓣進行的自體組織移植需要相當多的外科技巧，但是獲得的效果要遠遠優(yōu)于合成材料植入物。然而，這種皮瓣的成本很高，這主要與供體部位發(fā)病和畸形的情況有關(guān)，當然也與住院和手術(shù)的時間有關(guān)。移植大量的組織也會導(dǎo)致供體部位變得虛弱，尤其是腹部的主要肌肉移植?？勺⑸涞淖泽w膠原蛋白可以利用病人自身皮膚的活體切片或者較大樣本來進行制備。這種物質(zhì)使用中會發(fā)生移植物被吸收，因而只能起到短暫的填充作用。利用這種方法取得的組織的數(shù)量由于在皮膚上產(chǎn)生缺損而受到限制。異體材料主要被用做可注射的填充物在美容方面使用，用量一般比較小，包括臉部的皺紋或者一些小瑕疵。這種材料被臨時填充在真皮區(qū)域，可以使表層皮膚變得平整光滑。大體上這種材料具有一定的局限性，而且需要反復(fù)的、昂貴的治療方法以達到所需要的效果。從動物(例如牛和豬)體內(nèi)獲取的膠原蛋白類材料在使用時通常會伴隨著過敏反應(yīng)和免疫反應(yīng)。其實，移植材料被快速吸收也是一個問題，因此在移植的時候推薦加入過量的材料(100-200%)并且需要經(jīng)過反復(fù)的治療(每3-6個月)來維持所需要的量。膠原蛋白與戊二醛的交聯(lián)可以提高材料的彈性，還能夠降低材料的免疫原性。對病傳染的擔心限制了異種膠原蛋白來臨床上的應(yīng)用。其他異體材料例如去細胞化的人尸體真皮，富含膠原蛋白、彈性蛋白和葡糖氨基葡聚糖(GAGs)的人類尸體的真皮可以被加工成為可注射的劑型或者做成片狀根據(jù)實際情況切割成需要的形狀。這類材料沒有免疫原性而且可以持續(xù)使用長達兩年，然而當吸收出現(xiàn)也需要按照200%的量過量使用?？梢宰⑸涞漠愘|(zhì)材料(包括聚L-乳酸(PLA))已經(jīng)被證實可以用于治療艾滋病人的脂肪萎縮。據(jù)報道，注射需要進行反復(fù)多次，而且會形成明顯觸摸到的結(jié)節(jié)。注射用的聚四氟乙烯(PTFE)可以促進形成永久性的填充而不需要反復(fù)的治療。然而，聚四氟乙烯植入物跟軟組織相比具有明顯不同的機械特性，會從植入點發(fā)生移動，這就增加了感染的危險。上面所說的同體的、異體的和異質(zhì)的軟組織填充方法都有一些明顯的缺陷。現(xiàn)在出現(xiàn)了一種軟組織重建的替代方法，使用的是一種種植細胞的支架。這種支架材料可以是合成的(例如聚乳酸_羥基乙酸、聚羥基乙酸和聚乙二醇二丙烯酸酯)，也可以是純天然的(例如膠原蛋白、纖維蛋白、透明質(zhì)酸的衍生物或者絲蛋白)。一般情況下純天然的支架材料更加受歡迎，但是在使用中有一個潛在的缺點，那就是純天然的材料在使用前需要經(jīng)過像去細胞化這樣的加工，以使發(fā)生免疫原反應(yīng)的可能性降到最小并且確保長期使用的穩(wěn)定性。
發(fā)明內(nèi)容這里描述的是一種對脂肪組織進行去脂肪化的方法，該方法包括將脂肪組織在含有一種或者多種的酶的酶解液中進行一次或者多次的培養(yǎng)，還有一次或者多次的溶劑萃取，最終得到了包括三維結(jié)構(gòu)被很好保留的胞外基質(zhì)的去細胞化脂肪組織。這種很好保留的結(jié)構(gòu)可以包括血管和/或?qū)Ч芙Y(jié)構(gòu)。得到的胞外基質(zhì)可能含有纖維狀的和網(wǎng)狀的膠原蛋白的結(jié)合。得到的胞外基質(zhì)含有IV型蛋白，也可能含有I-III型、V型和VI型膠原蛋白的一種或幾種。這種去細胞化脂肪組織還可能包含彈性蛋白和(或)彈性纖維。這種去細胞化脂肪組織可能含有層粘連蛋白或者纖連蛋白，也可能同時包含兩種蛋白；可能含有透明質(zhì)酸或者硫酸軟骨素，也可能二者同時含有；可能含有一種或多種蛋白多糖、糖蛋白、糖胺聚糖以及幾種物質(zhì)的任意結(jié)合。本方法包括包括一個或者一個以上涉及機械攪拌的步驟,所述一個或者一個以上涉及機械攪拌的步驟可以包含一次或者多次的冷凍-解凍循環(huán)、攪拌，或者是二者的結(jié)合。一次或者多次的冷凍-解凍循環(huán)的過程可以在低滲溶液、高滲溶液或者中性緩沖液中進行。本方法可以包括在沖洗緩沖液中沖洗一次或者多次。本方法可以包括使用至少一種極性溶劑、至少一種非極性溶劑，或者二者的結(jié)合。使用本方法可以得到一種基本沒有完整的脂肪細胞的去細胞化脂肪組織。按照本方法的實施方案，本發(fā)明的主題可以包括基本去除了脂肪組織中具有免疫原性的組分。在一個實施方案中，本方法可以包括(i)在冷凍緩沖液中對脂肪組織進行一次或者多次的冷凍_解凍循環(huán)處理；(ii)對脂肪組織進行酶解；(iii)對脂肪組織進行一次或者多次的極性溶劑萃?。?iv)用沖洗緩沖液對脂肪組織進行沖洗；(V)對脂肪組織進行酶解；(vi)用沖洗緩沖液對脂肪組織進行沖洗；(vii)對脂肪組織進行酶解；(viii)用沖洗緩沖液對脂肪組織進行沖洗；(ix)對脂肪組織進行極性溶劑萃取；(x)用沖洗緩沖液對脂肪組織進行沖洗；這里還描述了一從脂肪組織中充分分離細胞外基質(zhì)材料的方法，包括，將脂肪組織在酶解液中進行一次或多次的培養(yǎng)，經(jīng)過一次或者多次的溶劑萃取，最后得到了三維結(jié)構(gòu)完好保存的胞外基質(zhì)材料。本方法可能涉及一步或者多步的機械破碎、一步或者多步的酶解，一次或者多次的緩沖液沖洗，或者還有一步或者多步的極性溶劑萃取。本方法也包含了使用一種或多種非極性溶劑的混合溶劑和一種或多種極性溶劑的混合溶劑對脂肪組織進行萃取。本方法可能涉及去細胞化因子的灌注，目的是為了放大或者加速去細胞化進程，或者為了促進收集更大的組織切片，包括脂肪組織皮瓣和(或)具有完整供血動脈和(或)靜脈的帶蒂脂肪皮瓣。本方法描述的是一種包括三維結(jié)構(gòu)完好保存的胞外基質(zhì)的去細胞化脂肪組織。這種胞外基質(zhì)可能含有纖維狀和網(wǎng)狀的膠原蛋白的結(jié)合體。這種胞外基質(zhì)可能含有IV型蛋白，也可能含有I-III型、V型和VI型膠原蛋白的一種或幾種。這種去細胞化脂肪組織還可能包含彈性蛋白和(或)彈性纖維。這種去細胞化脂肪組織可能含有層粘連蛋白和(或)纖連蛋白，和(或)一種或者多種的蛋白多糖。這種基質(zhì)可能透明質(zhì)酸和(或)軟骨素，和(或)一種或多種蛋白多糖、糖蛋白、糖胺聚糖以及幾種物質(zhì)的任意結(jié)合。這種去細胞化的脂肪組織可以按照本文描述的方法制備得到。這種去細胞化的脂肪組織基本不含有完整的脂肪細胞，而且基本去除了具有免疫原性的組分。這里還描述了一種采用專利所描述的去細胞化脂肪組織制備的一種生物支架。這種生物支架可以被用于整形外科、普通外科、心臟外科、骨外科、神經(jīng)外科、泌尿外科、婦科和整容外科等各種外科手術(shù)中。這種生物支架還可以被用作止血劑或者傷口愈合敷料。這種生物支架可以是自體同源的、異體同種的或者異種的。在細胞化脂肪組織的基礎(chǔ)上進行一個或多個階段的反應(yīng)可能得到一種合成的生物支架。這種合成的方法可以被用于制造去細胞化脂肪組織與指定幾何形狀和(或)特殊機械性能相結(jié)合的支架，或者用于停止去細胞化脂肪組織的生物降解反應(yīng)。除了去細胞化脂肪組織這種合成的生物支架可能含有天然的水凝膠或者其他支架組分，例如另一種去細胞化支架或者一種膠原蛋白衍生物、明膠、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、殼聚糖、藻酸鹽、絲蛋白、纖維蛋白、蛋白多糖、糖蛋白和多糖。除了去細胞化脂肪組織這種合成的生物支架也可能包含一些合成組分，例如聚乙二醇基(PEG)、聚乙烯基、聚氨酯基、聚乳酸(PLA)基、聚乙醇酸(PGA)基水凝膠或者支架，或者包含一種或幾種單體的聚合物。這種合成的的支架是可以生物降解的。這種合成的支架經(jīng)過化學(xué)的和(或)光化學(xué)的交聯(lián)過程可以使結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。這里還描述了用去細胞化脂肪組織制備的一種細胞培養(yǎng)基底物。這種底物可以被用來促進貼壁細胞或者細胞株的連接。接種了細胞的去細胞化脂肪組織可以在靜態(tài)條件下或生物反應(yīng)器體系(例如灌注生物反應(yīng)器)內(nèi)進行體外培養(yǎng)。無論是否被接種了細胞，這種去細胞化脂肪組織可以在體外培養(yǎng)的臨時點進行移植，例如在皮下或者具有網(wǎng)膜、腸膜或腹膜的腹腔。這種支架培養(yǎng)的目的是細胞擴增、細胞變異、組織生長或者生產(chǎn)出一種或多種感興趣的特殊蛋白質(zhì)。這里還描述了用去細胞化脂肪組織制備的顆粒。這里還描述了有去細胞化脂肪組織制備的一種涂層。這里還描述了由去細胞化脂肪組織制備的一種微載體珠。這種微載體珠包含有文中描述的一種圖層。為了更好的理解本專利，也為了能更清晰的戰(zhàn)士專利如何實施，這里通過參考下面的示意圖以實例來描述專利的實施。圖1(a)到⑷是按照本專利描述的方法獲得的去細胞化脂肪組織(DAT)的掃描電鏡顯微照片。圖1(a)是加工過的基質(zhì)和已確認的細胞提取物的超微結(jié)構(gòu)；圖1(b)是與脂肪組織中富含的基底膜組分并存的網(wǎng)狀型膠原蛋白部位；圖1(c)是膠原蛋白纖維保存的肉眼可見的三維結(jié)構(gòu)；圖1(d)是保存的活體的納米纖維狀的膠原蛋白。圖2(a)和2(b)是本專利描述的去細胞化脂肪組織的高放大倍數(shù)掃描電鏡顯微照片。這些圖片展示了脂肪細胞外基質(zhì)中保留的完好的膠原蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其在整個組織結(jié)構(gòu)中具有可變化的排列。圖2(a)展示的是膠原纖維在組織包中的平行排列的部位。圖2(b)展示的是由基底膜結(jié)構(gòu)構(gòu)成的膠原纖維交織構(gòu)成的富含網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)部位。圖3是去細胞化脂肪組織的掃描電鏡顯微照片，展示的是基質(zhì)在加工完畢后內(nèi)部留存的血管結(jié)構(gòu)。這個圖片顯示血管內(nèi)腔的內(nèi)皮細胞已經(jīng)被去掉，將下面基底膜富含網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)胞外基質(zhì)的特點暴露出來。圖4(a)到4(d)是本專利描述的去細胞化脂肪組織的透射電鏡的顯微照片，照片證實了去細胞處理。圖(a)展示了膠原纖維的交織性質(zhì)。圖(b)展示的是散布在膠原纖維中的彈性纖維。圖(C)是纖維狀膠原的特征性帶型，例如I型膠原這種去細胞化脂肪組織具有纖維整齊排列的區(qū)域。圖(d)是基質(zhì)中膠原纖維密集部位的端視圖(I型膠原的特征)。上邊每個圖右上角的橫條代表的距離是200nm。圖5顯示的是關(guān)于脂肪生成的標識脂蛋白脂肪酶(LPL)、過氧化物酶體增生物激活受體Y(PPARY)、CCAAT增強子結(jié)合蛋白a(CEBPa)與作為管家(也就是連續(xù)表達)基因的甘油醛-3-磷酸脫氫酶在接種了脂肪干細胞(ASC)的支架和對照物中表達的末端逆轉(zhuǎn)錄PCR研究結(jié)果。NI的意思是沒有誘導(dǎo)(在增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天)。I的意思經(jīng)過誘導(dǎo)(在增至培養(yǎng)基中培養(yǎng)72小時，然后在成脂分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天)。CA的意思是細胞聚集培養(yǎng)，而脂肪干細胞是在沒有外源基質(zhì)的Millicell過濾單元上的三維平板格中培養(yǎng)。TCPS的意思組織培養(yǎng)聚苯乙烯。在誘導(dǎo)的去細胞化脂肪組織支架中檢測到了基因表達的最高的相對水平。促進脂肪生成的主要調(diào)節(jié)基因、過氧化物酶體增生物激活受體Y(PPARy)和CCAAT增強子結(jié)合蛋白a(CEBPa)都被表達在未經(jīng)誘導(dǎo)的去細胞化脂肪組織支架中，這表明這個微環(huán)境有助于脂肪的生成而不需要外源的生長因子。這里所顯示的染色的圖案代表了所有研究的樣品(η=3,N=3)。圖6顯示的是胞外基質(zhì)基因在接種了脂肪干細胞(ASC)的支架和對照物中表達的末端逆轉(zhuǎn)錄PCR研究結(jié)果。NI的意思是沒有誘導(dǎo)(在增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天)。I的意思經(jīng)過誘導(dǎo)(在增至培養(yǎng)基中培養(yǎng)72小時，然后在成脂分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天)。I型膠原被表達在了所有樣本之中。II型膠原通常與軟骨細胞的來源有關(guān)，沒有被表達。IV型膠原被表達在所有經(jīng)過誘導(dǎo)的樣本和未分化的組織培養(yǎng)聚苯乙烯控制中。這里所顯示的染色的圖案代表了所有研究的樣品(η=3，N=3)。圖7是一個長條圖，顯示的是甘油-3-磷酸脫氫酶(GPDH)酶活被規(guī)范化為每個去細胞化脂肪組織支架或?qū)φ瘴镌诮?jīng)過成脂分化誘導(dǎo)后的胞內(nèi)總蛋白含量(η=3，N=3)。由于細胞供體變化與反應(yīng)的級別相關(guān)，這三個細胞供體的結(jié)果被分別顯示。誤差線代表了這三個樣品的標準偏差。圖8(a)顯示的是IXIO6個人脂肪干細胞(ASC)(白色)接種在去細胞化脂肪組織上(200mg)(灰色)，圖8(b)顯示的是2.5XIO6個脂肪干細胞(白色)接種在去細胞化脂肪組織上(200mg)(灰色)，二者在缺氧(5%02，370C)的條件下培養(yǎng)7天。圖8(c)顯示的是去細胞化脂肪組織支架上脂肪干細胞的增殖，通過總DNA含量進行測量。去細胞化脂肪組織支架接種了脂肪干細胞，并在增殖培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件或是靜止狀態(tài)(白色)，或是灌注式生物反應(yīng)器體系(灰色)。圖9(a)到9(f)顯示的是去細胞化脂肪組織皮下植入模式的初步的體內(nèi)研究的組織學(xué)和微觀數(shù)據(jù)。(i)去細胞化脂肪組織支架(50mg)和(ii)接種(移植前24小時)了IXIO6個從Wistar公鼠分離的脂肪干細胞的去細胞化脂肪組織支架被移植在Wistar母鼠的背部真皮區(qū)域(圖9(a))。圖9(b)顯示的是接種了脂肪干細胞的去細胞化脂肪組織支架在移植了4天(上部)和14天(下部)時，移植物的表面已經(jīng)具有了可見的血管。圖9(c)顯示的是一個未接種的去細胞化脂肪組織支架在14天時代表性的蘇木精和伊紅染色圖像，圖像顯示支架中具有肉眼可見的植入物體積保存(R代表大鼠組織；C代表纖維囊；D代表去細胞化脂肪組織支架；線段的長度是100m)。圖9(d)顯示的是一個未接種的去細胞化脂肪組織支架在14天植入后的代表性的掃描電鏡照片，能夠看到相對單薄的纖維囊和與宿主組織很好的融合。未接種的去細胞化脂肪組織和接種了脂肪干細胞的去細胞化脂肪組織中心部位在14天時的蘇木精和伊紅染色圖見圖9(e)和9(f)，從圖中可以看到接種了脂肪干細胞的去細胞化脂肪組織支架的細胞浸潤具有較高水平的多孔結(jié)構(gòu)(線段代表20m)圖10顯示的是一種由去細胞化脂肪組織和一種水凝膠(光交聯(lián)甲基丙烯酸硫酸軟骨素)構(gòu)成的兩相復(fù)合支架。圖11(a)和11(b)顯示的是使用噴氣液滴技術(shù)利用去細胞化脂肪組織加工球狀微載體的方法。下面的圖是掃描電鏡照片，分別是球形的以去細胞化脂肪組織為基礎(chǔ)的微載體的宏觀視圖(左)、去細胞化脂肪組織微載體的多孔表面結(jié)構(gòu)(中)和以去細胞化脂肪組織為基礎(chǔ)的微載體的內(nèi)部微結(jié)構(gòu)(右)。圖12(a)顯示的是一個含水的以去細胞化脂肪組織為基礎(chǔ)的微載體。圖12(b)顯示的是接種了人脂肪干細胞的以去細胞化脂肪組織為基礎(chǔ)的微載體在燒瓶攪拌體系的動態(tài)條件下培養(yǎng)了28天。圖12(c)是肉眼可見的接種了人脂肪干細胞的以去細胞化脂肪組織為基礎(chǔ)的微載體(培養(yǎng)28天以后)的聚合體，體積大約為lcm3。圖12(d)是18號注射器加載微載體的最小液量。圖12(e)是微載體通過18號針頭皮下注射器擠出。圖13是一個條形圖，顯示的是人脂肪干細胞在以去細胞化脂肪組織為基礎(chǔ)的微載體和以明膠為基礎(chǔ)的微載體上在燒瓶攪拌體系培養(yǎng)14天以上的細胞增殖，通過總DNA含量來進行定量。數(shù)據(jù)以平均值土三個樣品的標準偏差來表示。圖14是一個條形圖，顯示的是甘油-3-磷酸脫氫酶酶活與接種了人脂肪干細胞的以去細胞化脂肪組織為基礎(chǔ)的微載體，以明膠為基礎(chǔ)的微載體和組織培養(yǎng)聚苯乙烯對照品上總胞內(nèi)蛋白含量的關(guān)系，三個樣品在成脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)。誤差線代表的是三個樣品的標準偏差。具體實施方式本方法研究了去細胞化胎盤、軟骨和骨骼與間充質(zhì)干細胞的結(jié)合，以分別檢驗其形成脂肪的、形成軟骨的和形成骨骼的用途[5-7]。組織去細胞化方法非常典型的包含了物理方法、化學(xué)方法和生物方法的結(jié)合，這種方法對去除細胞物質(zhì)和收集胞外基質(zhì)(ECM)很有幫助。去細胞化過程的效果取決于組織的性質(zhì)、處理的時間長短和所采用的特殊的技術(shù)。雖然描述了許多采用其他組織的不同的去細胞化方法，至今為止，沒有發(fā)展從脂肪組織中收集三維結(jié)構(gòu)完好保存的胞外基質(zhì)的方法。脂肪組織富含胞外基質(zhì)，特別是基底膜(在上皮細胞和內(nèi)皮細胞下面的胞外基質(zhì)薄層，其固定細胞和組織的作用，它對脂肪組織代謝很有用。胞外基質(zhì)包含膠原和其他組分，例如彈性纖維、層粘連蛋白和纖維連接蛋白。完整的基底膜來源是組織工程的特殊興趣，因為這個結(jié)構(gòu)在器官形成和創(chuàng)傷治愈的過程中起關(guān)鍵作用。從脂肪中提取膠原的技術(shù)已經(jīng)得到了發(fā)展，為了在大體積移植時將胞外基質(zhì)用作可注射的細胞運載工具或者三維多孔支架[8，9]。然而，沒有促進來自脂肪組織的完好保存了三維結(jié)構(gòu)的完整的胞外基質(zhì)收集的方法被描述過?；|(zhì)的組成是調(diào)節(jié)細胞反應(yīng)的一個重要因素，三維結(jié)構(gòu)的構(gòu)成也是同樣重要。這里所描述的是一種去細胞化脂肪組織的方法，而胞外基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)和構(gòu)架大體上保留了下來。所說的脂肪組織可能是來自哺乳動物，例如人、牛、羊和豬，但不限定于這幾個，或者也可以來自其他動物。這里使用的術(shù)語“結(jié)構(gòu)”和“架構(gòu)”是可以互換的。本方法所提供的去細胞化脂肪組織是包含胞外基質(zhì)的。胞外基質(zhì)包含膠原在內(nèi)。胞外基質(zhì)可能包含有纖維狀膠原和網(wǎng)狀膠原的結(jié)合。胞外基質(zhì)可能含有IV型膠原。胞外基質(zhì)可能含有I型、II型、III型、V型和VI型膠原中的一種或者多種。這種去細胞化脂肪組織可能含有一種或這多種其他蛋白，例如層粘連蛋白和纖維連接蛋白。層粘連蛋白可能與網(wǎng)狀膠原有關(guān)系。這種去細胞化脂肪組織可能還含有一種或者多種生長因子。這種去細胞化脂肪組織可能含有蛋白多糖、糖蛋白和(或)粘多糖。這種去細胞化脂肪組織可能含有透明質(zhì)酸和(或)者硫酸軟骨素。這種去細胞化脂肪組織可能含有粘性纖維或者黏性蛋白。這種去細胞化脂肪組織可能包含一些細胞碎片，但是基本去除了完整的細胞。本方法已經(jīng)被用于25g的脂肪塊和脂肪抽出物，而且本方法可能已經(jīng)做好準備被用于加工更大的組織切塊。方法可能會用到去細胞化因子的灌注，這可能會加速和擴大去細胞化過程，或者促進更大組織切塊的去細胞化過程。去細胞化因子的灌注通過脂肪組織內(nèi)的維管結(jié)構(gòu)進行，可能包括血管的套管插入術(shù)，例如分離的脂肪組織內(nèi)的動脈或者靜脈。根據(jù)這里描述的，去細胞化脂肪組織是膠原的一個來源，而膠原在很多領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，例如整形外科、置換外科、骨科、心血管、普通外科、泌尿外科、婦科和神經(jīng)外科，例如可以被用于硬腦膜修復(fù)，用作止血劑(血塊誘導(dǎo)材料)或者創(chuàng)傷愈合屏障，還可被用用于治療燒傷或者糖尿病性潰瘍。這里描述的也是一種從脂肪組織中充分分離三維結(jié)構(gòu)完好保存的胞外基質(zhì)的方法?！叭S結(jié)構(gòu)完好保存”意思是分離得到的胞外基質(zhì)含有的三維結(jié)構(gòu)包含有纖維狀膠原和網(wǎng)狀膠原的高度組織性結(jié)合，這種結(jié)構(gòu)與完整脂肪組織中胞外基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)十分相似。同樣地，這種分離得到的胞外基質(zhì)所具有的完好保存的三維結(jié)構(gòu)，通過復(fù)制細胞在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的微環(huán)境，促進或者說不影響培養(yǎng)基中正常的細胞形成和細胞行為，從而支撐包括細胞生長和增殖的自然細胞過程。充分分離得到的胞外基質(zhì)可能含有IV型膠原。充分分離得到的胞外基質(zhì)可能含有I型、II型、III型、V型和VI型膠原中的一種或者多種。充分分離得到的胞外基質(zhì)可能含有一種或這多種其他蛋白，例如層粘連蛋白和纖維連接蛋白。層粘連蛋白可能與網(wǎng)狀膠原有關(guān)系。充分分離得到的胞外基質(zhì)可能還含有一種或者多種生長因子。充分分離得到的胞外基質(zhì)可能含有蛋白多糖、糖蛋白和(或)粘多糖。充分分離得到的胞外基質(zhì)可能含有透明質(zhì)酸和(或)者硫酸軟骨素。充分分離得到的胞外基質(zhì)可能含有粘性纖維或者黏性蛋白。充分分離得到的胞外基質(zhì)可能含有保存了管狀三維結(jié)構(gòu)的去細胞化的血管，例如動脈和靜脈。充分分離得到的胞外基質(zhì)可能含有去細胞化的導(dǎo)管結(jié)構(gòu)，例如，將脂肪組織從胸部取走。充分分離得到的胞外基質(zhì)可能包含有脂肪組織組分例如蛋白和細胞碎片，但是基本去除了完整的脂肪細胞，無論是肉眼可見的還是不可見的。在某些實例中，分離得到的胞外基質(zhì)基本不含有免疫原性組分，包括溶解細胞和類似的細胞殘骸?！盎静缓忻庖咴越M分”意思是這種組分在引入這種物質(zhì)的受試者體內(nèi)處于一個不足以產(chǎn)生免疫反應(yīng)的水平。去細胞化脂肪組織可以被用于制造一種用于軟組織填充的天然得到的生物支架。去細胞化脂肪組織可以在整容和整形過程中被用做填充劑，例如做為美容外科手術(shù)的軟組織填充劑，舉例來說，對于臉部，包括修復(fù)皺紋或者一些小的瑕疵，也包括隆唇。去細胞化脂肪組織也可以被用作整形應(yīng)用和創(chuàng)傷修復(fù)，例如用于修復(fù)先天性缺陷，用于治療燒傷和糖尿病性潰瘍，用于修復(fù)外生殖器軟組織感染，或者用于腫瘤切除后的軟組織重建。一種去細胞化脂肪組織生物支架可以被用于普通外科手術(shù)和特殊外科手術(shù)，例如心臟外科、骨科神經(jīng)外科、泌尿外科、婦科或者整容外科。這種生物支架可以被用做止血劑或者傷口愈合敷料。這種支架可以是自體同源的、異體同種的或者異種的。舉例來說，去細胞化脂肪組織可以在泌尿外科和婦科手術(shù)中被用作填充劑，用于幫忙阻止尿失禁。此外，去細胞化脂肪組織可以用在骨科手術(shù)中。例如，對于受器官萎縮之苦的老年人來說，去細胞化脂肪組織可以被用于填充腳部的軟組織，以提高緩沖作用和與之相關(guān)的活動性，或者被用于韌帶修復(fù)。去細胞化脂肪組織可以被用于神經(jīng)外科，例如用于修復(fù)硬腦膜或者用作橋堵材料修復(fù)末梢神經(jīng)的缺口。去細胞化脂肪組織可以被用于心血管手術(shù)，例如在治療心臟和外周局部缺血時用作細胞和生長因子的載體。去細胞化脂肪組織1可以被用作止血劑無論是非外科手術(shù)還是外科手術(shù)(開放手術(shù)和內(nèi)窺鏡手術(shù))。至今為止多數(shù)美容的軟組織填充方法都包括真皮層的增大。但是這可以做為林芝的矯正方法，臉部的軟組織缺陷主要是由于真皮下面的皮下脂肪組織層發(fā)生了改變。隨著人們年齡增長，臉上某些部位的皮下脂肪層趨于萎縮，導(dǎo)致真皮網(wǎng)狀層與下面的肌肉組織黏在一起。肌肉反復(fù)的收縮對皮膚施加壓力，導(dǎo)致皮膚纖維化并產(chǎn)生深深的皺紋。填充使用本文描述的充分分離的胞外基質(zhì)，去細胞化脂肪組織將是皮下的脂肪組織層恢復(fù)原來的狀態(tài)，比那些僅僅增大真皮層的方法更加有效。由于胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)和組成已經(jīng)被顯示可以戲劇性的影響細胞行為，利用脂肪作為基質(zhì)來源可以促進長期的軟組織重建。希望從脂肪組織獲得的胞外基質(zhì)將來能夠為脂肪生成提供一個理想的環(huán)境。去細胞化脂肪組織可以被用作生物支架來支撐細胞吸附。作為脂肪為基礎(chǔ)的應(yīng)用，去細胞化脂肪組織支架可以支撐接種的間質(zhì)干細胞的成脂分化或者其他的脂肪起源。一個用去細胞化脂肪組織制造的用于軟組織重建的生物支架可能具有一些機械特性，就是這個支架能夠模擬與之合并的原生軟組織。這保證了植入物具有天然的質(zhì)感，并且可以是組織形成是的炎癥和疤痕降到最小。與此同時，這種支架的印度可能會影響接種的干細胞的分化反應(yīng)，例如間質(zhì)干細胞。用作脂肪組織工程應(yīng)用的去細胞化脂肪組織支架可以是柔軟的、靈活的、有彈性的，其楊格模量與正常的脂肪類似或者相同，例如在大概3_4kPa的范圍內(nèi)[10]。這種生物支架具有足夠的機械完整性以抵抗植入后作用在組織上的力，防止出現(xiàn)支架結(jié)構(gòu)倒塌，這對脂肪再生時毀滅性的。去細胞化脂肪組織生物支架會隨著支撐新的成熟的脂肪組織發(fā)展發(fā)生退化，包括接種過的支架的分化的細胞和/或宿主組織的浸潤數(shù)量。以去細胞化脂肪組織為基礎(chǔ)的復(fù)合支架出去細胞化脂肪組織外還結(jié)合了一種或多種生物材料，這種支架可以被制造用作生物支架。這種復(fù)合的生物支架可能包含一種或者多種天然的和/或合成的生物材料。這種復(fù)合的生物支架可能包含一種或者多種其他的去細胞化支架，包括但不限制于去礦物質(zhì)的骨基質(zhì)、去細胞化骨骼、去細胞化血管、去細胞化軟骨、去細胞化胎盤、去細胞化心臟瓣膜、去細胞化人帶、去細胞化心肌膜、去細胞化心包膜、去細胞化平滑肌、去細胞化腸道、去細胞化粘膜或者去細胞化神經(jīng)。這種復(fù)合的生物支架除了完整的去細胞化脂肪組織之外，還可以結(jié)合以去細胞化脂肪組織為基礎(chǔ)的微載體或者顆粒。這種復(fù)合的生物支架除了去細胞化脂肪組織之外，還可以在其他天然獲得的生物材料，包括蛋白、多糖、蛋白多糖或者粘多糖上結(jié)合膠原的各種衍生物、明膠、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、殼聚糖、藻酸鹽、蠶絲或者纖維蛋白。這種復(fù)合材料除了去細胞化脂肪組織之外，還可以在其他合成的生物材料上結(jié)合以聚己酸內(nèi)酯(PCL)、聚酯、聚氨酯、聚乙二醇(PEG)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)為基礎(chǔ)的水凝膠或者支架。這種復(fù)合生物支架可能要經(jīng)過熱的、化學(xué)的、酶的和/或光化學(xué)的交聯(lián)過程以增強其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。加工這種復(fù)合的生物支架的目的可能是要創(chuàng)造一種明確的三維結(jié)構(gòu)和/或外形。加工這種復(fù)合的生物支架的目的可能是要協(xié)調(diào)生物支架的機械性能和/或生物降解性。一種去細胞化脂肪組織生物支架或者一種復(fù)合的去細胞化脂肪組織生物支架可能包含一種或者多種其他材料，例如但不限定于，一種藥劑(例如一種抗炎藥劑、一種止痛劑)、一種激素、一種生長印因子、一種蛋白或者肽、一種血管再生因子、一種誘使局部細胞分化的因子或者一種誘導(dǎo)脂肪生成的因子(例如胰島素活化劑)、一種噻唑烷二酮(例如羅格列酮、曲格列酮和吡格列酮)、一種抑制環(huán)磷酸腺苷降解的因子(例如甲基黃嘌呤)、一種促進骨骼礦化的因子(例如β-甘油磷酸鹽、抗壞血酸)。去細胞化脂肪組織支架可以被接種人或者動物的原始細胞或者細胞株,包括能夠分化成成熟細胞的那些細胞，例如但不限定于脂肪干細胞、骨髓起源的間質(zhì)干細胞、胚胎干細胞、心肌細胞、心臟干細胞、軟骨細胞、骨細胞、肌細胞、內(nèi)皮細胞、內(nèi)皮祖細胞、上皮細胞、纖維細胞、造血干細胞、周細胞、神經(jīng)細胞、神經(jīng)干細胞、神經(jīng)嵴細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，還有就是細胞反應(yīng)可以通過體外和/或體內(nèi)的方式進行探索調(diào)查。例如，脂肪干細胞對于包含脂肪組織工程在內(nèi)的一系列重建策略是一類合適的細胞源。脂肪是一種豐富的和可使用的細胞源，具有多向的分化能力。脂肪干細胞能夠分化成為成熟的脂肪細胞和體內(nèi)的分泌因子，分泌因子通過觸動宿主干細胞向植入位點進行移動來對重建做出貢獻，同時也促進血管的形成，這需要長期的脂肪穩(wěn)定性。脂肪干細胞還可以調(diào)整免疫反應(yīng)，因此可以被用作異體同種的或者異種的細胞源。包含去細胞化脂肪組織的去細胞化脂肪組織生物支架或者復(fù)合的生物支架可以被用作細胞培養(yǎng)基底物，例如培養(yǎng)包括原始細胞或者細胞株的貼壁細胞。接種了細胞的以去細胞化脂肪組織為基礎(chǔ)的生物支架可以在靜態(tài)條件下或者在一個生物反應(yīng)器體系內(nèi)進行體外培養(yǎng)，例如一個以支架為基礎(chǔ)的灌注式生物反應(yīng)器體系。去細胞化脂肪組織無論是否接種了細胞都可以在皮下空間或者腹部空間進行體內(nèi)移植，包括網(wǎng)膜、腸系膜，或者腹膜。這樣的移植可能是臨時性的。使用去細胞化脂肪組織作為細胞培養(yǎng)基底物可能目的是為了特殊細胞的擴張，為了細胞分化或者是為了生產(chǎn)例如組織或者一種或者多種過的生物產(chǎn)品。在一個例子中，一種去細胞化脂肪組織生物支架被用于促進細胞的大規(guī)模擴增，例如來自小的活體檢查樣本的人脂肪干細胞，目的是為了獲得臨床相關(guān)的干細胞產(chǎn)出以進行異體的和異種的應(yīng)用。在去細胞化脂肪組織支架培養(yǎng)末期，細胞可以通過使用例如膠原酶或者胰蛋白酶等酶處理而被提取出來。同樣，細胞可以用作治療應(yīng)用，例如與去細胞化脂肪組織結(jié)合成為生物支架。為了證實去細胞化脂肪組織在脂肪組織工程中作為一種再生的支架的用途，體外培養(yǎng)的接種了人脂肪干細胞的體外脂肪生成反應(yīng)被探測到。結(jié)果強調(diào)了三維微環(huán)境在細胞行為上的重要性。而且，基本完整的去細胞化脂肪組織胞外基質(zhì)好像是脂肪形成的一個自由的環(huán)境，包括脂肪生成標識(也就是基因)的表達不需要外源性的分化因子，如圖5所示。同樣地，這里所描述的具體化身適合大容量的軟組織填充。本文所描述的組織去細胞化的目的是去除將產(chǎn)生免疫反應(yīng)的細胞組分并且基本保留胞外基質(zhì)天然的結(jié)構(gòu)和構(gòu)成。本文所描述的組織去細胞化不使用清潔劑，由于對細胞毒性和清潔劑殘留相關(guān)的關(guān)注，這是有好處的。在一個具體例子中，本方法包含了使脂肪組織在酶解液(包含一種或者多種酶)中進行一次或者多次的培養(yǎng)發(fā)酵，和一次或者多次極性溶劑萃取。在另一個具體例子中，本方法包含了使脂肪組織進行一步或者多步的機械破碎，一次或者多次的酶解液中培養(yǎng)發(fā)酵，和一次或者多次極性溶劑萃取。在另一個具體例子中，本方法包含了使脂肪組織進行一步或者多步的機械破碎，一次或者多次的酶解液中培養(yǎng)發(fā)酵，一次或者多次極性溶劑萃取，和一次或者多次的緩沖溶液沖洗。本方法中各種步驟可以按任意順序進行實施。每個步驟的持續(xù)時間可以根據(jù)需要進行調(diào)節(jié)或者為了方便進行處理階段在冷凍緩沖溶液中進行的冷凍-解凍在酶解融液中進行培養(yǎng)急性溶劑萃取用沖洗緩沖溶液清洗在酶解融液中進行培養(yǎng)用沖洗緩沖溶液清洗在酶解融液中進行培養(yǎng)用沖洗緩沖溶液清洗急性溶劑萃取用沖洗緩沖溶液清洗另一個具體實例，如表3所示，方法中使用了不同的酶解溶液并且進行了超過五O表3.另一個去細胞化脂肪組織方法的具體實例天的時調(diào)節(jié)。例如，酶解可能進行一個或者多個小時，或者整夜進行。機械破碎包含了不能從實質(zhì)上破壞胞外基質(zhì)的方法。例如，機械破碎可能包含一次或者多次的冷凍-解凍循環(huán)，或者一步或者多步的攪拌，或者是二者的結(jié)合。攪拌可能包含脂肪組織的物理攪拌和/或使用脂肪組織浸泡的溶劑或者溶液進行攪拌或者流動。在冷凍_解凍循環(huán)過程中可能會用到冷凍的緩沖液。例如，一個包含了機械破碎的一般的具體例子可見表I。酶解和記性溶劑萃取步驟也可以在緩沖溶液沖洗之后，而這些具體的步驟可以根據(jù)需要進行重復(fù)。表I.去細胞化脂肪組織的普遍制備方法的一個例子步驟處理階段1機械破碎2在酶解液中進行培養(yǎng)3極性溶劑萃取4沖洗緩沖液清洗。對于各種具體實例，機械破碎、酶解、急性溶劑萃取、和沖洗緩沖溶液步驟可以進行一次或者一次以上。例如，酶解可以進行兩次或者三次，見表2和表3的具體實例。作為另一個例子，記性溶劑萃取可以進行兩次，如表2和表3的具體實例所示，或者進行三次或者更多次。作為另一個例子，沖洗緩沖液步驟可以進行兩次、三次或者四次，如表2和表3的具體實例所示，或者更多次。沖洗緩沖液步驟可以根據(jù)需要進行，需要多少次就進行多少次，需要多長時間就進行多長時間，目的是基本去除前面所進行的酶解步驟或者急性溶劑萃取步驟的活性。表2.去細胞化脂肪組織方法的一個具體實例步驟3456789步驟處理階段1在冷凍緩沖液中進行3次冷凍-解凍循環(huán)在1#酶解液中進行培養(yǎng)過夜2急性溶劑萃取3急性溶劑萃取4用清洗緩沖溶液清洗3次(每次30分鐘)在1#酶解液中培養(yǎng)6小時用清洗緩沖溶液清洗3次(每次30分鐘)在2#酶解液中進行培養(yǎng)過夜5用清洗緩沖溶液清洗3次(每次30分鐘)急性溶劑萃取用清洗緩沖溶液清洗3次(每次30分鐘)冷凍緩沖液可能是低滲的或者是高滲的，而且可能包含一種或者多種離子螯合劑，例如乙二胺四乙酸(EDTA)或者乙二醇-雙-(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)，目的是抑制從脂肪組織得到的某種酶的活性。有一個例子是IOmM三羥甲基氨基甲烷和5mM乙二胺四乙酸混合的pH值是8.O。三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液可以用于替代三羥甲基氨基甲烷。其他低滲的或者高滲的溶液的配制材料可能包括有一種或者多種鹽的水溶液，如NaCl或者KCl，或者低滲的磷酸鹽緩沖液。低滲溶液的pH值最典型的是8.0，但是多數(shù)是在pH7.0-9.O范圍之間。酶解溶液可能包含一種或者多種蛋白酶，這些蛋白酶能有效打開細胞和間質(zhì)之間交互作用，而對胞外間質(zhì)的改變最小或者沒有改變。例如胰蛋白酶就是一個合適的蛋白酶，而其他的一些蛋白酶也可以接受，例如從某些細菌菌株中獲得的枯草桿菌蛋白酶。這種酶解溶液中可能包含一種或者多種其他的降解酶，例如但不限定于脫氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、脂肪酶、和/或磷脂酶。也就是說，降解大分子的酶在本方法中是有用的。根據(jù)需要，一種螯合劑例如EDTA和/或一種或者多種鹽可能包含在這個酶解溶液之中。例如，1#酶解溶液可能含有O.25%的胰蛋白酶和O.1%的EDTA。這個媒介溶液中另外的酶可能包括脫氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、脂肪酶、和/或磷脂酶。2#酶解溶液包含55mMNa2HP04、17mMKH2PO4,4.9mMMgSO4·7H20、15000單位II型脫氧核糖核酸酶、12.5mgIIIA型核糖核酸酶和2000單位的VI-S型脂肪酶。2#酶解溶液還可能含有胰蛋白酶、EDTA和/或磷脂酶，也可能含有各種來源的脫氧核糖核酸酶、核糖核酸酶和/或脂肪酶的任意組合。極性溶劑的一個例子就是含有99.9%的異丙醇。其他可以使用的的極性溶劑包括但不限制于乙醇、甲醇、丁醇、正丙醇、戊醇、己醇、異戊醇、水、甲酸、乙酸、氯仿、二甲氧基丙烷、二氯甲烷、四氫呋喃、乙腈、甲乙酮、甲基丙基酮、二甲亞砜、二甲基甲酰胺、異丙醚、乙酸乙酯或者包括非極性組分的混合溶劑，例如正己烷、異己烷或者乙醚。由于對這些溶劑安全性的關(guān)注，過程中最好避免使用高毒性的或者潛在致癌、致突變的溶劑，例如苯或者甲苯。這里所說的清洗緩沖溶液可能包含水和一種或者多種鹽類，pH值基本處于中性。一個清洗緩沖溶液的例子是包含8g/LNaCl、200mg/LKClUg/LNa2HP04和200mg/LKH2P04，pH值是7.4。一個替代的清洗緩沖溶液是磷酸鹽緩沖溶液(不含鈣鎂離子)，pH值是7.4。另一個沖洗緩沖溶液的例子是漢克斯緩沖鹽溶液補充IOmM的羥乙基哌嗪乙硫磺酸，pH值是7.4。緩沖溶液的加工在37°C攪拌條件下進行。這個緩沖溶液可以增加抗生素和/或抗真菌劑，還有蛋白酶抑制劑。表3的具體實例已經(jīng)被優(yōu)化到了最少的加工時間和溶液必須條件。這是一個劃算的方法并且希望是可以擴展的。然而，這個方法可以被調(diào)整或者進一步優(yōu)化因為這個方法可能需要用作有特殊的應(yīng)用。例如，1#和2#酶解溶液可以是相同的或者不同的。每個步驟包含的急性溶劑萃取可以使用相同的或者不同的溶劑溶液，而且可能包記性溶劑和非極性溶劑的混合。類似地，每一步緩沖溶液清洗包含的一種清洗緩沖溶液可以使用相同的或者不同的清洗緩沖溶液。脂肪組織可以從進行選擇性手術(shù)的病人得到，例如包括腹部和胸部的的手術(shù)。然而，任何可以利用的脂肪源(例如來自其他組織部位的脂肪)都可以被加工，包括網(wǎng)膜脂肪或者內(nèi)臟脂肪，或者包括臉、胳膊、腿和腳在內(nèi)的末端脂肪組織。表3的具體實例已經(jīng)使用了離體的組織塊，而且可能適用于加工更大的組織塊，例如，通過增加包含酶解和溶劑萃取的步驟。這個具體實例也可能適合于包括將去細胞因子灌注到組織中去。灌注可能包含在一塊脂肪組織蒂或者皮瓣上插入一個或多個血管的套管插入術(shù)。這樣一個實例可能被用作處理抽脂手術(shù)得到的脂肪抽出物。對于脂肪抽提物樣本，濾器坑能被包含在促進樣本收集和溶液改變的方法中。做為一個替代物，這種中脂肪抽提物質(zhì)在加工過程中可以被離心分離來收集細胞內(nèi)的去細胞化脂肪組織，上清液是上面所描述過的各種價格溶液。這里所描述的使用脂肪組織作為胞外基質(zhì)的一個來源的方法，利用了脂肪是一種獨特的消耗材料并且量大可利用的事實。此外，依照這里所描述的實例，由于脂肪組織擴增應(yīng)用，使用從整形醫(yī)生努力填補和再造的脂肪組織特殊獲得的基質(zhì)是一個獨一無二的方法(例如，使用脂肪而不是皮膚來源的基質(zhì)進行體積增大)。脂肪組織是基膜組分的特殊的豐富的來源，含有IV型膠原和層粘連蛋白，它被很好的認可因為基膜在組織和器官形成和創(chuàng)傷愈合時扮演了關(guān)鍵的角色。去細胞化脂肪組織還可能含有彈性纖維和/或彈性蛋白，還有完整的去細胞化管狀結(jié)構(gòu)。去細胞化脂肪組織可能含有一種或者多種生長因子。去細胞化脂肪組織可以被用作異體同種的或者異種的支架。這里所描述的方法可以被用于處理來自人類和非人類對象的脂肪組織。這里描述的組織擴增和外科手術(shù)使用去細胞化脂肪組織和胞外基質(zhì)的方法可以被用于人類和非人類對象。動物來源的脂肪組織包括但不限制于牛和豬的脂肪，動物來源脂肪也可以被加工作為異種的支架在人類中使用。這里描述的去細胞化脂肪組織方法基本去除了組織中的免疫原性組分，因此適合加工成異種的材料。可是，人的脂肪組織經(jīng)常作為醫(yī)療廢物被遺棄，而且代表了隨時可以利用的人類膠原的豐富來源，與此同時，本方法避免了關(guān)于異種疾病傳播的擔心。廢棄的脂肪在加工前可以被手機和儲存在冷柜中。冷凍不是一個問題，因為冷凍可能是去細胞化過程的第一個步驟。抽脂術(shù)可以作為獲得少量脂肪組織的方法，獲得的脂肪組織在異體同種的一種的脂肪擴增方面很有用，例如在整容手術(shù)中使用。希望去細胞化脂肪組織可以穩(wěn)定儲存數(shù)年而作為一種常備的生物材料使用。替代用的去細胞化方法已經(jīng)進行了研究，包括的方案涉及非離子型清潔劑聚乙二醇辛基苯基醚TritonX-100和陰離子型清潔劑月桂酰肌氨酸、十二烷基硫酸鈉(SDS)和脫氧膽酸鈉。所有這些清潔劑在其他種類組織的去細胞化中進行了使用并取得了不同程度的成功[11]。近來，三個其他的團體已經(jīng)報道了關(guān)于去細胞化脂肪組織或者脂肪抽提物的研究，研究方案基本不同于本文所描述的方法，而且主要依賴于以清潔劑為基礎(chǔ)的方法[12-14]。清潔劑的使用增加了對安全性的擔心，因為加工的基質(zhì)中具有殘留細胞毒素類化學(xué)物質(zhì)的可能性。特別是十二烷基硫酸鈉已經(jīng)顯示出了與胞外基質(zhì)組分有強烈的互相作用，可以改變基質(zhì)的構(gòu)造[15]。其他的清潔劑也能與胞外基質(zhì)相互作用，可能導(dǎo)致結(jié)構(gòu)的降解。在所進行的研究中，十二烷基硫酸鈉和脫氧膽酸鈉都能導(dǎo)致基質(zhì)戲劇性的膨脹和結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆的肉眼可見的降解而變成一種膠狀的物質(zhì)。不僅如此，十二烷基硫酸鈉在加工的末期很難去除掉，而且可能影響細胞的生存能力和滲透進加工過的基質(zhì)中[16]。這些結(jié)果表明本文說描述的沒有清潔劑的提取方案提供了一個更適合臨床應(yīng)用的方法。不僅如此，雖然一些以清潔劑為基礎(chǔ)的方法顯示出希望，但是所有這些方法都比本文所描述的酶和極性溶劑提取的方法需要明顯更長的加工時間。這種去細胞化脂肪組織材料可以被更深層加工，通過酶解和/或酸溶解來制備一個涂層，或者制造微載體用于細胞培養(yǎng)和輸送。這種去細胞化脂肪組織材料也可以物理加工，例如通過冷凍粉碎來制造顆粒。雖然消化和溶解過程階段總是破壞胞外基質(zhì)保留的三維結(jié)構(gòu)，這些技術(shù)使用去細胞化脂肪組織作為純化的膠原的豐富來源。例如，去細胞化脂肪組織可以在O.5M乙酸溶液中進行消化，溶液中含有25mg胃蛋白酶/g去細胞化脂肪組織濕重。在消化結(jié)束后，通過使用IOMNaOH將溶液pH調(diào)到8.O而使胃蛋白酶失活，接著再使用冰乙酸是溶液的PH值降到3.5以下。經(jīng)過消化的去細胞化脂肪組織適用于各種各樣的表面涂層，然后進行空氣干燥。通過使用交聯(lián)劑，例如戊二醛、玫瑰紅或者核黃素，這個涂層是穩(wěn)定的。Tebb等人[17]對這個方法進行了發(fā)展，深加工建立在對現(xiàn)有方法修飾的基礎(chǔ)上，允許用去細胞化脂肪組織制造多孔的微載體(例如小珠子)。簡言之，溶解過的去細胞化脂肪組織可以與致孔劑混合，例如藻朊酸鈉溶液(典型的濃度大約在3%w/v左右)，然后在注射泵的控制下通過一個鈍的針頭一滴一滴加入穩(wěn)定緩沖液中，例如氯化鈣溶液?；靵y的氣流和攪拌可以用來控制珠子的直徑。這些珠子通過與各種試劑進行交聯(lián)而變得穩(wěn)定，試劑例如戊二醛、核黃素、玫瑰紅或者桅子素?；蛘撸@些珠子通過使用酶交聯(lián)劑而變得穩(wěn)定，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。然后將致孔劑萃取出而產(chǎn)出多孔的珠子。例如，藻朊酸鹽可以通過使用檸檬酸鈉溶液而被從珠子里萃取出來，從而產(chǎn)生多孔的三維結(jié)構(gòu)。這些微載體珠子對細胞的大規(guī)模擴張是有效的，各種細胞的類型包括但不限制于間質(zhì)干細胞、脂肪干細胞、骨細胞和軟骨細胞。這種微載體可以被用于支撐干細胞和祖細胞的分化。這種微載體可以被用作細胞和生長因子的可注射的運載工具，或者作為小體積增加的填充劑，例如用作臉部小瑕疵和皺紋的修正使用。所有引用的出版物其內(nèi)容在此通過弓I證被全部納入本文。具體實施方式用下面非限制性的實施例子進一步說明。實施例I材料所有化學(xué)物質(zhì)除非另作說明均購自加拿大西格瑪奧德里奇公司(加拿大奧克維爾市)并且直接使用。脂肪組織取得離體的脂肪組織樣品和脂肪抽出物都是從加拿大Kingston總醫(yī)院和HotelDieu醫(yī)院進行腹部或胸部選擇性手術(shù)的女病人處收集得到的。這些組織正常情況下作為常規(guī)的操作程序的一部分應(yīng)該已經(jīng)被丟棄的。這些樣品被放到冰上面送到實驗室，然后進行不超過2個小時的萃取，在無菌條的、沒有陽離子的磷酸鹽緩沖液(PBS)中。脂肪組織去細胞化表3中詳細說明的一種去細胞化方案被用于離體的脂肪組織和脂肪抽提物材料的加工。在加工之前，新鮮分離的離體脂肪組織樣品被切成小塊，重量大概在20-25克左右。至于脂肪抽出物，他的體積被選定生產(chǎn)同樣大小塊。多達四個離體組織部分在一個含有IOOmL的去細胞化溶液的250mL塑料容器中被同時加工，使用Excella24Benchtop培養(yǎng)箱(NewBrunswickScientific)在37°C、120RPM條件下震蕩培養(yǎng)。所有的去細胞化溶液都被補充了1%抗生素-抗真菌溶液(ABAM)1%苯甲基磺酰氟(PMSF).這些樣品先在冷凍緩沖液中進行三次的冷凍-解凍循環(huán)(_80°Cto37°C)，緩沖溶液是一個低滲的三羥甲基氨基甲烷緩沖液(PH8.O)，包含IOmM三羥甲基氨基甲烷和5mM乙二胺四乙酸(EDTA)。然后，這些組織被轉(zhuǎn)移到1#酶解溶液中培養(yǎng)過夜，大概16小時，1#酶解液含有O.25%胰蛋白酶/O.1%EDTA(Gibco，Burlington，Canada)。隨后，這些樣品在99.9%異丙醇中經(jīng)受48小時的極性溶劑萃取以去除脂肪成分。然后加工過的組織用含有8g/LNaCl、200mg/LKClUg/LNa2HP04和200mg/LKH2P04(pH8.0)的沖洗緩沖溶液沖洗3次(30分鐘)，然后在1#酶解溶液中培養(yǎng)6小時。接著再用沖洗緩沖溶液沖洗3次后，樣品被轉(zhuǎn)移到2#酶解溶液中過夜培養(yǎng)16小時，2#酶解液含有55mMNa2HPO4U7mMKH2PO4,4.9mM18304*7!120、15000單位11型脫氧核糖核酸酶(來自牛胰腺)、12.51^IIIA型核糖核酸酶(來自牛胰腺)和2000單位的VI-S型脂肪酶(來自豬胰腺)。第二天早上，把基質(zhì)用沖洗緩沖溶液沖洗3次(30分鐘)，然后在99.9%異丙醇中用最后的極性溶劑萃取8小時。在加工的最后，這種去細胞化脂肪組織用沖洗緩沖溶液最后沖洗3次(30分鐘)，在70%乙醇中沖洗3次(30分鐘)，然后在4°C儲存在無菌的含有I%苯甲基磺酰氟的磷酸鹽緩沖液中。組織學(xué)和免疫組織化學(xué)特性描述人脂肪組織和去細胞化脂肪組織有代表性的樣品被固定在10%中性的福爾馬林緩沖溶液中24小時，沖洗后放進無菌的磷酸鹽緩沖液送到加拿大多倫多市的多倫多總醫(yī)院的病理研究實驗室進行組織學(xué)和免疫組織化學(xué)的染色。這個染色的目的是確認細胞萃取加工的效果，還為了描繪基底膜組分IV型膠原(CIV)和層粘連蛋白(LN)分布的特征。所有樣品都進行了石蠟包埋，并被切割成片(6m切片)。為了檢測殘留的細胞或者細胞碎片的存在，采用了蘇木精和伊紅染色和Masson三色染色，也為了描繪去細胞化脂肪組織的膠原結(jié)構(gòu)特征。對本地化人類IV型膠原(I100稀釋，加拿大達可公司，克隆IV型膠原22)和層粘連蛋白(胃蛋白酶抗原表位取回，I100稀釋，Sigma，兔多克隆)的免疫組織化學(xué)染色包含了用鏈霉親和素-ABC(親和素或者生物素化的酶復(fù)合體)或者辣根過氧化物酶(HRP)的體系并以NovaRedTM作為底物(Vector實驗室)進行的測定。掃描電子顯微鏡檢查法(SEM)去細胞化脂肪組織樣品在加工末期采用掃描電子顯微鏡檢查法來證實去細胞化過程和評價基質(zhì)的構(gòu)架。為了分析，將200mg樣品固定在2.5%戊二醛中，室溫下存放I小時，然后4°C存放24小時。經(jīng)過大量的磷酸鹽緩沖溶液沖洗，樣品在液氮中被突然冷凍和破碎。樣品的制備是采用了一種化學(xué)干燥方法。簡單說，樣品現(xiàn)在乙醇中被脫水，然后用六甲基_■娃氣燒(無水乙醇TK甲基_■娃氣燒=2:I,for15min;無水乙醇TK甲基_■娃氣烷=I2，15min;100%六甲基二硅氮烷，15min，重復(fù)3次使用空氣整宿干燥)進行干燥。脂肪干細胞培養(yǎng)人類脂肪干細胞的原始培養(yǎng)按照參考文獻[15]描述的方法，用腹部皮下脂肪組織樣品而建立。供體年齡、體重和身高都做了記錄。第二代細胞被用于接種實驗。為了減少成脂分化，細胞在不含血清的DMEM:Ham’sF_12培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基包括15mMNaHC03、15mM羥乙基哌嗪乙硫磺酸、33M生物素、17M泛酸、10g/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白、IOOnM可的松、66nM胰島素、InM三碘甲狀腺氨酸(T3)、100U/mL青霉素andO.lmg/mL鏈霉素。在分化的第一個72小時里，O.25mM甲基黃嘌呤和Iμg/mL曲格列酮被加入到分化培養(yǎng)基中。細胞接種為了制備去細胞化脂肪組織用于細胞集中實驗，過量的緩沖溶液通過吸去而移除，加工過的組織被切成200mg含水的支架。這些支架通過3個30分鐘的70%乙醇沖洗而凈化，再在磷酸鹽緩沖液中用3個30分鐘的清洗而脫水，然后在生長培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(37°C,5%CO2)。每個去細胞化脂肪組織支架都被調(diào)入一個不加涂層的Millicell過濾單元(直徑12mm，孔徑O.4m,Millipore,Billerica,MA,USA)，然后在200L完全生長培養(yǎng)基中接種IxIO6個脂肪干細胞(第二代)以促進細胞連接。每個過濾器被培養(yǎng)在含有5mL完全生長培養(yǎng)基的6孔培養(yǎng)板的一個獨立的孔里(37°C，5%CO2)。培養(yǎng)24小時以后，去細胞化脂肪組織支架被從過濾單元中移除而放在6孔培養(yǎng)板里，是的支架更多得接觸培養(yǎng)基。接種了的去細胞化脂肪組織支架樣品在24小時時收集，然后固定在10%中性的福爾馬林緩沖液中24小時，根據(jù)上面描述的方法準備組織學(xué)和免疫組織化學(xué)特性描述。為了更好的評估三維的、高密度的細胞團(CA)樣品中去細胞化脂肪組織支架對細胞行為的影響，根據(jù)文獻[18]描述的方法制備了樣品。簡單來說，Millicell過濾單元(直徑12mm，孔徑O.4m)被O.5mg/mL的IV型膠原(來源于人胎盤)所包衣，然后在500L完全生長培養(yǎng)基中接種IxIO6個脂肪干細胞(第二代)。這些濾器被培養(yǎng)在6孔培養(yǎng)板里(37°C,5%CO2)，每個孔含有5mL完全生長培養(yǎng)基。培養(yǎng)基每2到3天改變一次。為了減少分化，72小時后，去細胞化脂肪組織和細胞團樣品在無菌的磷酸鹽緩沖溶液中沖洗了3次，然后如前面所描述的用分化培養(yǎng)基替代了完全生長培養(yǎng)基。為所有實驗準備的三份組織培養(yǎng)聚苯乙烯對照物(分化和不分化)通過向6孔培養(yǎng)板里每孔5mL的完全生長培養(yǎng)基中接種300，000個細胞。由于邏輯的原因，三個不同供體的脂肪被用于基因表達研究(N=3)，而來自另外三個受體(N=3)的細胞被用作甘油磷酸脫氫酶酶活性的定量。成脂分化被去細胞化脂肪組織和細胞團樣品所誘導(dǎo)在磷酸鹽緩沖溶液中沖洗后培養(yǎng)72小時。為了將對細胞供體變化的關(guān)注降到最低，來自同一供體的脂肪干細胞在每次分析的單次實驗的每一個時間點被用于接種在全部的去細胞化脂肪組織、細胞團和組織培養(yǎng)聚苯乙烯樣品上。逆轉(zhuǎn)錄PCR分析進行末端逆轉(zhuǎn)錄PCR是為了描繪培養(yǎng)在生長培養(yǎng)基(接種后培養(yǎng)10天)和分化培養(yǎng)基(接種后10天、誘導(dǎo)分化后7天)條件下(n=3，N=3)的樣品中主要成脂標識(過氧化物酶體增生物激活受體Y、CCAAT增強子結(jié)合蛋白α、脂蛋白脂肪酶)和胞外基質(zhì)組分(I型膠原、II型膠原和IV型膠原)的基因表達特征。3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)被誘導(dǎo)成為管家基因[19]?？偟腞NA通過使用TRIzol㊣試劑(Invitrogen,Burlington,Canada)被分離出來。簡單地說，去細胞化脂肪組織支架在液氮中被迅速冷凍，然后用研缽和研棒進行研磨。每個支架都在ImLTRIzol⑧試劑按照組織的標準方法被勻質(zhì)化。與RNA萃取同樣的方法被用于細胞團和組織培養(yǎng)聚苯乙烯樣品。RNA的濃度和純度使用NanoDiOpf分光光度計來測定(ND1000；NanoDropProducts,Wilmington,DE,USA)。260/280比率一般介于I.9和2.O之間。未接種的去細胞化脂肪組織支架在初步的實驗中作為負面的對照品，但是收集的RNA不足以促進更進一步的分析。第一條cDNA用總RNA中的Ig在一個20L的反應(yīng)體積中被合成出來，體系中含有第一股緩沖液(50mMTris-HCl,75mMKCl,3mMMgC12)、IOmM二硫蘇糖醇(DTT)、O.09OD260單位的任意引物(Invitrogen公司)、每種脫氧核苷三磷酸O.5mM(Invitrogen公司)、200單位的SuperScriptIIRT(Invitrogen公司)。每個樣品的Minus-RT控制原件已經(jīng)制備。使用Primer3軟件進行設(shè)計的基因特異性引物(Invitrogen公司，50nM,已脫鹽)見表4。所有這些引物的解鏈溫度都是60°C。為了探測基因污染，除了CEBP以外的所有引物都被設(shè)計跨域內(nèi)含子_外顯子的邊界。每個PCR反應(yīng)都被引導(dǎo)在一個50L反應(yīng)體積中進行，這個體系中包含2.5L稀釋過的cDNA(含有50ng投入的RNA)、1XTaq緩沖液(IOmMTris-HCl,50mMKCl、O.08%諾乃清潔劑P40)、250nM正向引物、250nM反向引物、每種脫氧核苷三磷酸(Invitrogen公司)250nM、2.5mMMgCl2和O.375單位重組TaqDNA聚合酶(Fermentas公司)。使用的是Bio-Rad公司的ClOOO熱循環(huán)儀，PCR的條件是95°C5分鐘，接著是在95°C35個30秒，然后是58°C30秒和72°CI分鐘。一個最后的延伸條件是72°C5分鐘。Minus-RT和無污染控制包含在機器沒一次運行中。PCR產(chǎn)品通過5%瓊脂糖膠電泳來分離，用溴化乙錠來染色，在紫外燈下進行檢測(G:BoxChemiHR16;Syngene,Cambridge,UK)。表4.PCR研究中使用的基因特異性弓丨物基因增加描述引物碎片長度(bp)PPARyNM—138712人過氧化物酶體增生物84激活受體γCEBPaΝΜ_004364人CCAAT增強子結(jié)合107蛋白aLPLNM_000237人脂蛋白脂肪酶94COLlAlNM_000088人I型膠原，al91COL2A1NM—001844人II型膠原，al137COL4A1NM_001845人IV型膠原，al139GAPDHNM_002046人3-鱗酸甘油膝脫氫酶94TfRNM_003234人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體623-磷酸甘油醛脫氫酶活性細胞的甘油憐酸脫氫酶酶活水平(GPDHAssayKit,KT-OlO；KamiyaBiomedicalCorporation)在72小時被確定特征,而在去細胞化脂肪組織和細胞團樣品中誘導(dǎo)分化(η=3,N=3)7天后，采用文獻[20]描述的方法。組織培養(yǎng)聚苯乙烯上面的分化的細胞和未分化的細胞分別包含正向的控制和負向的控制。Bio-Rad的蛋白分析儀具有白蛋白標準，為了數(shù)據(jù)規(guī)范化的目的，可以用來測定每一個樣品里的總細胞質(zhì)蛋白含量。每個去細胞化脂肪組織和細胞團樣品都在kit(4°C)提供的ImL的酶提取試劑被切碎加工，被三次5秒的超聲破壞，伴隨著在冰上的間歇冷卻。組織培養(yǎng)聚苯乙烯樣品在超聲時被類似的破壞了。細胞質(zhì)蛋白片段通過樣品在4°C、16000g條件下離心15分鐘而獲得。所有上層的樣品都根據(jù)廠家說明書被立刻檢測3-磷酸甘油醛脫氫酶酶活和總蛋白含量。3-磷酸甘油醛脫氫酶數(shù)據(jù)被表示依據(jù)mU/mg總細胞質(zhì)蛋白含量，而I個單位的3-磷酸甘油醛脫氫酶酶活需要氧化lmoleNADHl分鐘結(jié)果去細胞化過程不含清潔劑的去細胞化方法建立以分離脂肪組織和抽脂材料中富含膠原的胞外基質(zhì)。在5天抽提過程的最后，大量疏松的、白色的基質(zhì)被收集到。從品質(zhì)上講，對于切除的樣品，去細胞化脂肪組織與加之初的脂肪塊相比具有近似的體積。進一步定性來講，基質(zhì)的水化質(zhì)量通常相當于30-45%的最初組織質(zhì)量，主要取決于具體的組織來源?？偟膩碚f，從胸部分離的組織比腹部分離的組織具有較高的纖維含量。作為一種支架材料，去細胞化脂肪組織很容易使用鑷子進行操作，切割成各種大小包裝在各種三維結(jié)構(gòu)的模具中。蘇木精和伊紅染色證實在加工最后基質(zhì)中不含有細胞或者細胞碎片。免疫組織化學(xué)的染色可以定位去細胞化基質(zhì)的基膜組分層粘連蛋白和IV型膠原。成熟的人的脂肪組織，層粘連蛋白被表達在基膜上，也能沿著支撐的血管結(jié)構(gòu)的內(nèi)壁上，可以分離單獨的脂肪細胞。在組織加工過程中，層粘連蛋白的含量是守恒的。染色模式表明前面的血管空腔有層粘連蛋白內(nèi)襯，在脂肪細胞部分已經(jīng)被移除的富含網(wǎng)格的區(qū)域進行漫反射染色也是一樣。與預(yù)加工染色結(jié)果一致，層粘連蛋白誒呦被表達在基質(zhì)中高纖維區(qū)域。與層粘連蛋白類似，IV型膠原被表達在與成熟的脂肪細胞和血管相關(guān)的基膜上。在加工以后，雖然染色的強度輕微的減弱了，在基質(zhì)的網(wǎng)狀型區(qū)域和空腔有可檢測到的水平的IV型膠原。膠原架構(gòu)肉眼看，基質(zhì)的架構(gòu)在經(jīng)過加工后好像被很好的保留了下來。Masson的三色染色法證實去細胞化方法的效力，說明在加工最后基質(zhì)中已經(jīng)沒有殘留的細胞和細胞碎片。另夕卜，染色被用于更詳細的檢查膠原?；诓煌娜旧Ｊ剑ゼ毎窘M織中的基質(zhì)構(gòu)架有四個截然不同的區(qū)域。第一個區(qū)域由密集塞滿的膠原纖維形成組成，這些膠原被安排形成捆，這給與支架以大的體積和機械完整性。脂肪組織中的這些區(qū)域是從纖維組織衍生來的，可以明確并分離獨立的脂肪區(qū)域包含細胞裂片。胸部組織，具有明確的小葉結(jié)構(gòu)，比皮下腹部脂肪具有大的相連的組織量。在纖維帶，區(qū)域包含的空腔已經(jīng)被識別，每個都具有一個界定明確的邊界。免疫組織化學(xué)的染色顯示這些空腔排有層粘連蛋白和IV型膠原?；诓煌娜旧Ｊ?，空腔代表了去細胞化血管結(jié)構(gòu)，并且在加工過程中保留了下來。第三個可識別的區(qū)域有一個纖維狀膠原交叉編織的模式。最后的區(qū)域是類似安排的，但是由更好的網(wǎng)狀膠原纖維構(gòu)成的，而且覺有較高含量的IV型膠原。掃描電鏡分析掃描電鏡分析證實了去細胞化草案的效力，由于加工的基質(zhì)的任意區(qū)域沒有可見的細胞或者細胞片段(圖I)。而且，胞外基質(zhì)整體的超微結(jié)構(gòu)在加工后好像很好的保留了下來。由于使用Masson的三色染色方法，去細胞化脂肪組織基質(zhì)構(gòu)架中的不同區(qū)域可以被看見。厚捆的纖維狀膠原，將要傳遞機械的力，與更好的網(wǎng)狀的膠原相連(圖la，c).。有一些區(qū)域，基本完全由網(wǎng)格分支、互相交織的膠原構(gòu)成，與脂肪組織中發(fā)現(xiàn)的高基膜含量相一致(圖lb)。即使在高放大倍數(shù)，納米纖維膠原結(jié)構(gòu)都是完整的，這表明發(fā)展的方法對基質(zhì)破壞最小(圖Id)。細胞接種去細胞化脂肪組織支架接種在Millicell過濾單元為的是讓細胞最大程度連接在基質(zhì)上。在接種24小時以后，樣品送去做組織學(xué)分析，結(jié)果顯示脂肪干細胞分布良好，而且已經(jīng)與支架連接并分散在支架上。去細胞化脂肪組織支架寬松的本性加速了細胞的滲透，在支架構(gòu)造的上部、中部和下部取樣進行蘇木精和伊紅染色，結(jié)果都發(fā)現(xiàn)了細胞。沒接種的對照支架沒有發(fā)現(xiàn)細胞的證據(jù)。免疫組織化學(xué)的染色也揭示了脂肪干細胞被表達了層粘連蛋白。確實，染色的細胞在去細胞化脂肪組織支架的纖維狀區(qū)域容易看到，先前顯示不含層粘連蛋白。類似的IV型膠原染色部分的檢查揭示了脂肪干細胞不能表達IV型膠原，染色模式與未接種的對照組一致?；虮磉_在脂肪生成的基因表達研究中，脂肪生成的標識LPL，PPAR，orCEBP沒有可檢測的水平，發(fā)現(xiàn)當脂肪干細胞培養(yǎng)在生長培養(yǎng)基中，無論在Millicell過濾單元上細胞團培養(yǎng)或者在組織培養(yǎng)聚苯乙烯上單層培養(yǎng)(圖5)。作為對比，非誘導(dǎo)的去細胞化脂肪組織支架顯示出對PPAR和CEBP相對高的表達水平，PPAR和CEBP是成脂分化的主要調(diào)節(jié)子卩在成脂分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)天，這三個成脂標識被在全部的樣品中做了檢測。然而，最高水平的表達始終與接種在去細胞化脂肪組織支架上細胞相關(guān)(圖)。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的內(nèi)含物作為一個二級管家基因(結(jié)果未顯示)證實了作為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的結(jié)果。由于基質(zhì)生產(chǎn)的脂肪干細胞是脂肪生成過程中胞外基質(zhì)環(huán)境重組的原因[22，23]，開展了一項研究以檢驗三個關(guān)聯(lián)的膠原的表達(圖6)。I型膠原在非誘導(dǎo)和誘導(dǎo)的條件下在去細胞化脂肪組織支架、細胞團和組織培養(yǎng)聚苯乙烯的培養(yǎng)條件下做了表達。然而I型膠原經(jīng)常與成骨的血統(tǒng)相連，也被高度表帶在了與脂肪組織相連的組織成分中[24]。II型膠原非常典型的與軟骨生成血統(tǒng)相關(guān)[25]，沒有被表達在任何樣品中。與文獻一致，基膜組分IV型膠原在所有誘導(dǎo)的樣品中被發(fā)現(xiàn)[26]。有意思的是，IV型膠原也被表達在非誘導(dǎo)的生長在組織培養(yǎng)聚苯乙烯上的脂肪干細胞(圖6)。相比之下，只有非常低水平的表達在非誘導(dǎo)的去細胞化脂肪組織支架組(與IV型膠原免疫染色結(jié)果一直)上被發(fā)現(xiàn)看，而且在非誘導(dǎo)的細胞團樣品中基本沒檢測到基因。酶活性甘油醛-3-磷酸脫氫酶酶活的研究結(jié)果證實了基因表達的數(shù)據(jù)依據(jù)微環(huán)境和脂肪生成。由于更大的細胞受體變化依據(jù)活性水平的級別，來自三個不同供體的樣品數(shù)據(jù)沒有合并，恰恰相反，獨立考慮為了評價組間的整體趨勢(圖7)。根據(jù)美國衛(wèi)生研究院標準，一個細胞供體超重了(BMI29.I)，兩個是肥胖的。(BMI38.3和44.O)。去細胞化脂肪組織樣品中最高水平的活性已經(jīng)檢測到，表明環(huán)境對成脂很有指導(dǎo)作用?？偟膩碚f，甘油醛-3-磷酸脫氫酶酶活從72小時到7天增加了，這與脂肪成熟進步是享福的。除了去細胞化脂肪組織組，在72小時點只發(fā)現(xiàn)了相對低的活性水平。正如預(yù)期的，在同一個時間點上，在非誘導(dǎo)的組織培養(yǎng)聚苯乙烯的付對照樣品只發(fā)現(xiàn)了非常低的酶活水平。在所測驗過的實驗條件下，7天時在去細胞化脂肪組織支架和組織培養(yǎng)聚苯乙烯的正向?qū)φ諛悠分?，供體的BMI值越低，甘油醛-3-磷酸脫氫酶的酶活越高。更特別的是，對于BMI29，1樣品，在去細胞化脂肪組織支架中甘油醛-3-磷酸脫氫酶的酶活從72小時(10.7±3.6mU/mg)到7天(77.2±13.0mU/mg)酶活增加了超過7倍。對于接種了來自于BMI38.3的供體細胞的去細胞化脂肪組織支架，甘油醛-3-磷酸脫氫酶的酶活在72小時高一些(28.8±I.OmU/mg)，在7天時增加了大約2倍達到了56.9±7.3mU/mg。對于BMI44.O受體，去細胞化脂肪組織支架活性水平是11.4±2·7mU/mg(72小時)和29.3±0·8mU/mg(7天)。總之，在沒有外源基質(zhì)的條件下，在Millicell過濾單元上培養(yǎng)脂肪干細胞與去細胞化脂肪組織支架或者在組織培養(yǎng)聚苯乙烯上單程細胞培養(yǎng)相比不能促進脂肪生成。討論這個例子可以證明胞外基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)對指導(dǎo)細胞反應(yīng)是重要的。這里描述的去除細胞碎片基本保留基質(zhì)環(huán)境的天然性，而在胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)上只有很小的改變。因此，這里所描述的方法要優(yōu)于其他需要將組織切碎或者磨碎、或者進行膠原酶降解的方法。掃描電鏡的照片清楚的顯示出在加工過的基質(zhì)中保留的完好的網(wǎng)狀膠原。組織學(xué)的染色劑過表明至少一個片段的血管結(jié)構(gòu)被保存下來，這可能最終在促進組織浸潤的內(nèi)皮細胞來在支架中形成血管有好處。基因表達的結(jié)果清楚的表明去細胞化脂肪組織為人脂肪干細胞的成脂分化提供了一個寬松的微環(huán)境。很明顯，當在增殖培養(yǎng)基中接種的脂肪干細胞表達了相對高水平的成脂標識PPAR和CEBP。PPAR和CEBP已經(jīng)被認可作為成脂分化的主要調(diào)節(jié)子。這兩個基因的表達被交叉管理并且在脂肪細胞中維持在一個高水平，相信在保留成熟表型有一個必需的角色。這兩個因子誘導(dǎo)其他轉(zhuǎn)錄因子，與大量的與蛋白相關(guān)的基因需要脂肪形成是一樣的.。強迫表達PPAR和CEBP中的一個在非脂肪生成的纖維母細胞中已經(jīng)顯示出足夠的誘導(dǎo)脂肪生成[28，30]。然而間質(zhì)干細胞能夠表達多向的分化標識，他們能在低水平下被典型的表達，然后相互交叉管理以保持不分化的狀態(tài)i。典型的，需要一個包含各種刺激因子的誘導(dǎo)培養(yǎng)基來促進朝著特殊的血統(tǒng)進行分化，而且觀察高水瓶的包括PPAR和CEBP在內(nèi)的特殊血統(tǒng)基因表達i。這個趨勢在包含在當前例子中的組織培養(yǎng)聚苯乙烯對照中被清楚的觀測到?？傊?，最高水平的脂肪生成基因表達顯示在誘導(dǎo)的去細胞化脂肪組織樣品中。月旨蛋白脂肪酶(LPL)作為一個較早的成脂分化標識，是一個在脂肪生成過程中扮演了促進毛細血管中三甘油酯水解產(chǎn)生游離脂肪酸角色的酶，它可以通過脂肪酸結(jié)合aP2蛋白隨后被轉(zhuǎn)移到發(fā)展的脂肪細胞中[32，33]。結(jié)果表明分化培養(yǎng)基需要去誘導(dǎo)脂蛋白脂肪酶(LPL)表達在所有的樣品組中，同時設(shè)計當前的研究的框架。將來的研究可能識別另外的成脂標識，例如脂蛋白脂肪酶(LPL)，標識在后邊的時間點被表達在非誘導(dǎo)的去細胞化脂肪組織微環(huán)境。有意思的是在非誘導(dǎo)條件下，IV型膠原被表達在組織培養(yǎng)聚苯乙烯樣品中，而不是去細胞化脂肪組織支架。富含IV型膠原的去細胞化脂肪組織支架微環(huán)境開創(chuàng)了一個壓制IV型膠原合成的消極的反饋機制，類似于型膠原通過現(xiàn)為母細胞在型膠原凝膠中培養(yǎng)表達所觀察到的結(jié)果。成脂分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)高水平的IV型膠原表達在所有的樣品組中，這與脂肪生成期間胞外間質(zhì)表達模式是一致的。在非誘導(dǎo)的細胞聚集樣品中缺少脂肪生成的基因表達與設(shè)計去細胞化脂肪組織的誘導(dǎo)的樣品中的低水平表達是一樣的，說明了異基因基質(zhì)對脂肪生成的重要性。使用過濾單元的方法已經(jīng)在軟骨生成的培養(yǎng)中被普遍的采用。這個技術(shù)已經(jīng)顯示能夠促進形成一個更飽滿的細胞組織，這對于軟骨的生成是有好處的[35]。II型膠原基因表達的分析包括當前的研究以確認培養(yǎng)方法沒有誘導(dǎo)接種了的脂肪干細胞去生產(chǎn)一種更像軟骨的基質(zhì)。隨著進一步研究，這個圓形的形態(tài)潛在的是有利于脂肪的生成，以顯示出的骨生成對脂肪生成的二維研究結(jié)果的延伸為基礎(chǔ)[36]。然而，包括去細胞化脂肪組織支架是有一個事實支撐的，這個事實就是去細胞化基質(zhì)明顯的增加了成脂基因和蛋白標識的表達，也向工程組織提供了散裝的和機械的完整性，尤其是作為體積增大應(yīng)用。甘油醛-3-磷酸脫氫酶蛋白表達的研究結(jié)果支持基因表達數(shù)據(jù)，表明去細胞化脂肪組織促進脂肪生成。與之前包括去細胞化人胎盤的工作比較，使用相同的描述方法，在去細胞化脂肪組織支架中比去細胞化胎盤中觀測到了更高水平的甘油醛-3-磷酸脫氫酶酶活，去細胞化胎盤中的平均酶活水平在誘導(dǎo)分化72小時、7天、14天后不足5mU/mg[20]。這個對比明顯支撐了胞外基質(zhì)組成和結(jié)構(gòu)在指導(dǎo)細胞反應(yīng)時扮演了決定性的角色，因為脂肪組織和胎盤的胞外基質(zhì)含有類似的膠原，但是分布和濃度不同[15]。甘油醛-3-磷酸脫氫酶的數(shù)據(jù)還強調(diào)了細胞供體變化對觀測到的細胞反應(yīng)的影響。然而對于三個不同的供體各種培養(yǎng)條件中觀測到了類似的趨勢，反應(yīng)的兩級是高度可變的?；谶@三個供體的研究，在甘油醛-3-磷酸脫氫酶酶活和供體BMI值之間存在一個反比關(guān)系。這個結(jié)果與肥胖伴隨著發(fā)展的胰島素抵抗的知識是一致的[37，38]。用在當前研究中的誘導(dǎo)培養(yǎng)基同時包含胰島素和胰島素增敏劑和取格列酮。非常有可能來自肥胖供體的脂肪干細胞越多，對這些刺激物的誘導(dǎo)效應(yīng)就越抵制。這個實施具有深遠的影響按照包括異體同種的或則異種的脂肪干細胞的普通的脂肪組織工程策略?？赡茈S著進一步研究，可能發(fā)展更多的克服這些在成脂分化能力獨立的限制。當前研究中觀測到的趨勢的一致性表明工程微環(huán)境可能更加有助于脂肪合成而不管細胞供體來源。實施例2這里描述的去細胞化脂肪組織被用作貼壁細胞的培養(yǎng)基質(zhì)，而且更特別的是用作人脂肪干細胞在去細胞化脂肪組織支架上連接和增殖。結(jié)果如圖8(a)和(b)，顯示用CellTrackergreen(Invitrogen公司)標記的脂肪干細胞(圖中顯示為白色)和用Alexafluor350(Invitrogen公司)標記的去細胞化脂肪組織(圖中顯示為灰色)在共聚焦顯微鏡下容易顯像。圖8(a)和(b)顯示的是有代表性的圖像，分別為IXlO6個脂肪干細胞接種在去細胞化脂肪組織上(200mg)和2.5XIO6個脂肪干細胞接種在去細胞化脂肪組織上(200mg)，二者在缺氧(5%02，37°C)的條件下培養(yǎng)7天。圖8(c)顯示的是用PicoGreen(Invitrogen公司)通過測量總DNA含量分析脂肪干細胞在去細胞化脂肪組織支架上的增殖。去細胞化脂肪組織支架(200mg)接種了IXIO6個脂肪干細胞(第二代)，在增殖培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)以促進細胞增殖，培養(yǎng)條件是靜止狀態(tài)(白線)或者是灌注式生物反應(yīng)器體系(灰線)(培養(yǎng)基流速是I.5mL/min)。兩種不同條件下的實驗數(shù)據(jù)斗魚細胞增殖一致，但是數(shù)據(jù)表明灌注式生物反應(yīng)器體系可以獲得更高細胞密度。實施例3關(guān)于去細胞化脂肪組織初步的體內(nèi)研究通過皮下移植的模式已經(jīng)開展。研究服從與加拿大動物保護協(xié)會(CCAC)的指導(dǎo)方針。所有工作都是在女王大學(xué)的Botterell禮堂內(nèi)的動物處置實驗室進行管理的。擬定動物保護議定書的工作由女王大學(xué)動物保護委員會(UACC)進行審核和批準。圖9(a)到9(f)顯示的是組織學(xué)和微觀數(shù)據(jù)。在這些研究中，(i)去細胞化脂肪組織支架(50mg)和(ii)接種(移植前24小時)了IXlO6個從Wistar公鼠分離的脂肪干細胞的去細胞化脂肪組織支架被移植在Wistar母鼠的背部真皮區(qū)域(圖9(a))。每只鼠接受了兩個未接種的和兩個接種了脂肪干細胞的去細胞化脂肪組織支架。在移植后的4天、7天和14天，動物被人道的犧牲，然后去細胞化脂肪組織支架被取出。用肉眼可以看到，在任何時間點兩組對照中的去細胞化脂肪組織支架的體積都完好的保存下來，而且有證據(jù)表明植入物有血管形成。圖9(b)顯示的是接種了脂肪干細胞的去細胞化脂肪組織支架在移植了4天(上部)和14天(下部)時，移植物的表面已經(jīng)具有了可見的血管。圖9(c)顯示的是一個未接種的去細胞化脂肪組織支架在14天時代表性的蘇木精和伊紅染色圖像，圖像顯示支架中具有肉眼可見的植入物體積保存(R代表大鼠組織；C代表纖維囊山代表去細胞化脂肪組織支架；線段的長度是IOOm)。組織學(xué)的結(jié)果表明正常的創(chuàng)傷愈合過程中兩組都沒有強烈的免疫反應(yīng)證據(jù)。隨著時間的進展，從4天到14天，兩組試驗中宿主反應(yīng)減弱了，伴隨著正常的創(chuàng)傷愈合，還有纖維囊厚度和血管密度的連續(xù)降低，表明去細胞化脂肪組織已經(jīng)與宿主形成了整體。圖9(d)顯示的是一個未接種的去細胞化脂肪組織支架在植入后14天的代表性的掃描電鏡照片(線段的長度是500m)，能夠看到相對單薄的纖維囊和與宿主組織很好的融合。未接種的去細胞化脂肪組織和接種了脂肪干細胞的去細胞化脂肪組織中心部位在14天時的蘇木精和伊紅染色圖見圖9(e)和9(f)，從圖中可以看到接種了脂肪干細胞的去細胞化脂肪組織支架的細胞浸潤具有較高水平的多孔結(jié)構(gòu)(線段代表20m)。實施例4由去細胞化脂肪組織和水凝膠(光交聯(lián)的甲基丙烯酸基硫酸軟骨素)組成的兩相復(fù)合支架的初步研究已經(jīng)開展過。圖10展示了一個有代表性的實例。復(fù)合的硫酸軟骨素和去細胞化脂肪組織支架在一個模具(6mmX8mm)里被制造出來,并且在波長320-380nm的紫外光下進行交聯(lián)，光強為lOmW/cm2，光源是EFOS3000。這個復(fù)合的支架的體積和形狀由模具來確定，其肉眼可見的機械特性與軟組織類似。實施例5在這個例子里，球形的微載體是使用噴氣液滴技術(shù)利用去細胞化脂肪組織加工制造的。本實施例子中使用的方法用圖解顯示在圖11(a)和(b)中。簡單來說，溶解的去細胞化脂肪組織通過使用一種致孔劑(海藻酸鹽)而被臨時穩(wěn)定住，這種復(fù)合的珠子發(fā)生交聯(lián)，然后通過將致孔劑萃取出而生產(chǎn)出以去細胞化脂肪組織為基礎(chǔ)的微載體。具有代表性的掃描電鏡圖片(圖11中三個下面的圖)顯示肉眼可見的球形的以去細胞化脂肪組織為基礎(chǔ)的微載體(左)、去細胞化脂肪組織微載體的多孔表面結(jié)構(gòu)(中)和細胞化脂肪組織微載體的內(nèi)部微結(jié)構(gòu)(右)圖12(a)到(e)顯示的是通過光學(xué)顯微鏡看到的含水的以去細胞化脂肪組織為基礎(chǔ)的微載體的形態(tài)學(xué)，而且顯示出這個以去細胞化脂肪組織為基礎(chǔ)的微載體的注射能力。圖12(a)顯示的是一個含水的以去細胞化脂肪組織為基礎(chǔ)的微載體。圖12(b)顯示的是接種了人脂肪干細胞的以去細胞化脂肪組織為基礎(chǔ)的微載體在燒瓶攪拌體系的動態(tài)條件下培養(yǎng)了28天。這些微載體在培養(yǎng)期間促進細胞粘和并且展示出了優(yōu)秀的機械完整性，而且沒有可觀察到的降解發(fā)生。圖12(c)是肉眼可見的接種了人脂肪干細胞的以去細胞化脂肪組織為基礎(chǔ)的微載體(培養(yǎng)28天以后)的聚合體，體積大約為lcm3。圖12(d)是18號注射器加載微載體的最小液量。圖12(e)是微載體通過18號針頭皮下注射器擠出。這種以細胞化脂肪組織為基礎(chǔ)的微載體容易通過針頭擠壓出并且很好保存，當用光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡成像時沒有發(fā)現(xiàn)可觀察到的毀壞標志或者可檢測到的珠子尺寸或則形態(tài)的改變。根據(jù)注射位點的不同，擠出的微載體可能形成單層或者大體積的聚合物。人脂肪干細胞在以去細胞化脂肪組織為基礎(chǔ)的微載體和以明膠為基礎(chǔ)的微載體上在燒瓶攪拌體系培養(yǎng)14天以上的細胞增殖，通過使用PicoGreenassay(Invitrogen公司)測量總DNA含量來進行定量。在圖13中，數(shù)據(jù)以平均值土三個樣品的標準偏差來表示。在以去細胞化脂肪組織為基礎(chǔ)的微載體上測得了比以明膠為基礎(chǔ)的微載體上更高的細胞增殖水平，二者使用相同的方法制造的。檢測了甘油-3-磷酸脫氫酶平均酶活與接種了人脂肪干細胞的以去細胞化脂肪組織為基礎(chǔ)的微載體，以明膠為基礎(chǔ)的微載體和組織培養(yǎng)聚苯乙烯對照品上總胞內(nèi)蛋白含量的關(guān)系，三個樣品在成脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)。數(shù)據(jù)如圖14所示，誤差線代表的是三個樣品的標準偏差。圖中數(shù)據(jù)顯示以去細胞化脂肪組織為基礎(chǔ)的微載體相對于用同樣方法制造的以明膠為基礎(chǔ)的微載體促進了一個更強的脂肪形成的反應(yīng)。等同原則雖然本發(fā)明已經(jīng)通過說明性的實施例做了描述，由此，它將被理解為實施例可能被迫做各種各樣變化但不會偏離本發(fā)明的范圍。因此，這里所描述的實施例僅僅是典范性的，而本發(fā)明并不限制于此。參考文獻I.FernandezEM,MackleyCL.Softtissueaugmentationareview.JDrugsDermatol.2006Jul-Aug；5(7):630-41.2.HomiczMR,WatsonD.Reviewofinjectablematerialsforsofttissueaugmentation.FacialPlastSurg.2004Feb；20(I):21-9.3.FischbachC，SprussT，WeiserB，NeubauerM，BeckerC，HackerM，etal.Generationofmaturefatpadsinvitroandinvivoutilizing3-Dlong-termcultureof3T3-L1preadipocytes.ExpCellRes.2004Oct15；300(I):54-64.4.AlhadlaqA，TangM，MaoJJ.Engineeredadiposetissuefromhumanmesenchymalstemcellsmaintainspredefinedshapeanddimension!implicationsinsofttissueaugmentationandreconstruction.TissueEng.2005Mar-Apr；11(3-4)556-66.5.FlynnLE,PrestwichGD，SempleJL,WoodhouseKA.Proliferationanddifferentiationofadipose-derivedstemcellsonnaturallyderivedscaffolds.Biomaterials.2008APR；29(12):1862-71.6.YangQ，PengJ，LuS，HuangJ,YaoJiYangF，etal.AcartilageECM-derived3-DporousacellularmatrixscaffoldforinvivocartilagetissueengineeringwithPKH26_labeledchondrogenicbonemarrow-derivedmesenchymalstemcells.TissueEngineeringPartA.2008MAY；14(5):800-.7.ZhaoYN,LinH，ZhangJ，ChenB，SunWJ,WangX，etal.CrosslinkedThree-DimensionalDemineralizedBoneMatrixfortheAdipose-DerivedStromalCellProliferationandDifferentiation.TissueEngineeringPartA.2009JAN；15(1):13-21.8.ChoiJS,YangHJ,KimBS,KimJD,LeeSH,LeeEK,etal.Fabricationofporousextracellularmatrix(ECM)scaffoldsfromhumanadiposetissue.TissueEngPartCMethods.2009;E_publishedaheadofprintJuly14,2009·9.ChoiJSiYangHJiKimBSiKimJDiKimJYjYooB，etal.Humanextracellularmatrix(ECM)powdersforinjectablecelldeliveryandadiposetissueengineering.JControlRelease.2009;138(I)2-7.10.SamaniA，BishopJ，LuginbuhlC，PlewesDB.Measuringtheelasticmodulusofexvivosmalltissuesamples.PhysMedBiol.2003Jul21；48(14)2183-98.11.GilbertTW,SellaroTL，BadylakSF.Decellularizationoftissuesandorgans.Biomaterials.2006Jul；27(19):3675-83.12.YoungDA,IbrahimD0，HuD,ChristmanKLInjectablehydrogelscaffoldfromdecellularizedhumanlipoaspirate.ActaBiomater.2010Oct16.13.RossenG,ElisseeffJH,NahasZ,YeZ,HillelA,inventors；CompositionsandmethodsforimplantationofadiposetissueandadiposetissueproductspatentW02009102452.2009.14.BrownBN,FruendJM,LiH，RubinPJ,ReingJE,JeffriesEM,etal.ComparisonofThreeMethodsfortheDerivationofaBiologicScaffoldComposedofAdiposeTissueExtracellularMatrix.TissueEngPartCMethods.2010Nov3.15.FlynnL，SempleJL,WoodhouseKA.Decellularizedplacentalma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quán)利要求12所說的去細胞化脂肪組織，可以用作細胞培養(yǎng)基底物。23.根據(jù)權(quán)利要求22所說的去細胞化脂肪組織，這里的細胞培養(yǎng)基是用于細胞擴增和/或細胞分化，和/或為了生產(chǎn)包括組織和一種或多種蛋白在內(nèi)的生物產(chǎn)品。24.根據(jù)權(quán)利要求22所說的去細胞化脂肪組織，這里的細胞在體外靜止培養(yǎng)和/或在體外生物反應(yīng)器體系培養(yǎng)。25.根據(jù)權(quán)利要求22所說的去細胞化脂肪組織，細胞在體內(nèi)進行培養(yǎng)。26.—種去細胞化脂肪組織，根據(jù)權(quán)利要求I中的方法進行制備。27.—種生物支架，利用權(quán)利要求12所說的去細胞化脂肪組織進行制備。28.根據(jù)權(quán)利要求27所說的生物支架，可以用在外科手術(shù)中。29.根據(jù)權(quán)利要求28所說的生物支架，這里說的外科手術(shù)包括普通外科、整形外科、整容外科、心臟外科、骨外科、神經(jīng)外科或者泌尿外科或者婦外科。30.根據(jù)權(quán)利要求27所說的生物支架，這個生物支架可以用于創(chuàng)傷愈合。31.根據(jù)權(quán)利要求27所說的生物支架，這個生物支架可以用作止血劑。32.根據(jù)權(quán)利要求27所說的生物支架，這個生物支架包含一種或者多種額外的材料。33.根據(jù)權(quán)利要求32所說的生物支架，這里的一種或者多種額外的材料可以從其他去細胞化基質(zhì)、天然材料、合成材料、一種藥物組分、一種激素、一種生長因子和他們的任意結(jié)合中選擇。34.根據(jù)權(quán)利要求27所說的生物支架，這個生物支架是異體同種的或者異種的。35.根據(jù)權(quán)利要求27所說的生物支架，這個生物支架是異基因的。36.用權(quán)利要求12所說的去細胞化脂肪組織來制備的涂層。37.一種微載體珠子，用權(quán)利要求12所說的去細胞化脂肪組織來制備。38.一種微載體珠子，包含權(quán)利要求36所說的涂層。39.根據(jù)權(quán)利要求37所說的微載體珠子，可以用作細胞和/或藥物和/或生長因子的傳遞工具。40.根據(jù)權(quán)利要求37所說的微載體珠子，可以做小體積填充劑用于整容或者整形外科。41.根據(jù)權(quán)利要求37所說的微載體珠子，可以用于和去細胞化脂肪組織一起制造一種復(fù)合的生物支架。42.一種顆粒，用權(quán)利要求12所說的去細胞化脂肪組織來制備。43.一種顆粒，包含權(quán)利要求36所說的涂層。全文摘要本發(fā)明提供了一種對脂肪組織去細胞化的方法，包括將脂肪組織在含有一種或者多種的酶的酶解液中進行一次或者多次的培養(yǎng)，還有一次或者多次的溶劑萃取，其中，得到了包括三維結(jié)構(gòu)很好保留的胞外基質(zhì)的去細胞化脂肪組織。本發(fā)明還提供了一種包括三維結(jié)構(gòu)很好保存的胞外基質(zhì)的去細胞化脂肪組織，和生物支架、微載體珠，和包括去細胞化脂肪組織的涂層。文檔編號A61P7/04GK102933705SQ201080064286公開日2013年2月13日申請日期2010年12月17日優(yōu)先權(quán)日2009年12月17日發(fā)明者L·E·弗林申請人:金斯頓女王大學(xué)