專利名稱：免疫原性組合物和相關(guān)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，特別地，涉及佐劑及其在免疫中的用途。
背景技術(shù)：
佐劑是摻入疫苗制劑中以增強疫苗抗原免疫原性的物質(zhì)。鋁鹽(例如磷酸鋁和氫氧化鋁)是現(xiàn)今在人和獸用疫苗中使用的最常用佐劑。雖然許多包含鋁的佐劑是可得的，但是對于任何一種特定的疫苗制劑，由其提供的佐劑/抗原效果可能不是最優(yōu)的。兩種方法已一般被用于制備具有鋁化合物的疫苗和類毒素-在存在抗原下原位沉淀鋁化合物和將抗原吸附到預(yù)形成的鋁凝膠上。在鋁佐劑的原位沉淀或到預(yù)形成的鋁凝膠上期間，在鋁佐劑上吸附抗原取決于抗原的物理和化學(xué)特性、使用的鋁佐劑類型和吸附條件。可影響抗原在鋁佐劑上的吸附的因素包括靜電力、疏水相互作用、范德瓦爾斯力、氫結(jié)合、pH、溫度、凝膠顆粒尺寸和反應(yīng)混合物的離子強度。通常，抗原通過靜電吸引(即，佐劑和抗原具有相反的電荷)和/或配體交換(例如，抗原上的磷酸基置換佐劑表面上的氫氧基)吸附于招佐劑(Seeber SJ,等 Vaccine 1991 ;9:201-3 ;Iyer S.等，Vaccine2004 ；29:1475-9)。氫氧化鋁在其脫氫、結(jié)晶形式化學(xué)上是偏氫氧化鋁[AlO(OH)],但在其水相通過獲得另外的水分子，它變成氫氧化鋁[Al(OH)3] (Hem S. L.等2007 Vaccine25:4985-4986)。偏氫氧化鋁具有11的零電荷點(PZC)，因此它在pH 7. 4下帶正電荷。該正電荷使得偏氫氧化鋁對于帶負(fù)電荷的抗原(例如酸性蛋白)是好的吸附劑。在一個研究中，發(fā)現(xiàn)用磷酸陰離子預(yù)處理氫氧化鋁佐劑改變佐劑的表面電荷特性，使得堿性蛋白(溶菌酶，即P.+11.1)可被吸附。發(fā)現(xiàn)磷酸陰離子降低佐劑的正 電位(mV)，且佐劑表面電荷的該改變將佐劑和溶菌酶之間的靜電力從排斥變化為吸引，使得蛋白被佐劑吸附(Rinella Jr. J. V.,等，Vaccine 1996 ; 14(第 4 期)298-300)。可以單層吸附于佐劑的抗原最大量被稱為“吸附能力”和吸附力的強度被稱為“吸附系數(shù)”(Jendrick等，Vaccine 2003 ； 21:3011-8)。吸附能力對疫苗免疫原性的影響研究表明吸附的抗原劑量百分比與制劑的免疫原性不相關(guān)(Chang M-F.等，Vaccine2001 ； 19:2884-9 ；Romero Mendez IZ 等 Vaccine 2007 ;25 (5) : 825-33)。與此相反，一個研究顯示抗原與包含鋁的佐劑的吸附系數(shù)與由制劑引起的免疫反應(yīng)之間相關(guān)(Hansen等，Vaccine 2007;25:6618-6624)。吸附可影響蛋白的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性。來自關(guān)于吸附于包含鋁的佐劑的影響的研究結(jié)果不完全一致在一個研究中，吸附到Alhydrogel 或Adju_Phos 上后，去穩(wěn)定化三種蛋白(牛血清白蛋白(BSA)、溶菌酶和卵白蛋白)；在另一研究中，通過吸附到氫氧化鋁上，穩(wěn)定化BSA和 2-乳球蛋白(BLG)的結(jié)構(gòu)(Jones L. S.等，J. Biol Chem 2005 ；280(14) :13406-13414 ;Zheng Y.等，Spectroscopy 2007 ;21 (5-6) : 257-268)。用于穩(wěn)定化具有鋁鹽佐劑的疫苗組合物液體制劑儲存的方法包括凍干、冷凍和冷凍干燥，但經(jīng)常引起佐劑團(tuán)聚、免疫原濃度降低和免疫原性損失(例如，Maa等，(2003) J. Pharm. Sci.92:319-332 ；Diminsky 等(1999) Vaccine 18:3-17 ；Alving 等(1993) Ann. NY Acad.Sci. 690:265-275 ;和Warren 等(1986) Ann Rev Immunol. 4:369-388，所有的這些通過引用結(jié)合)。甚至對于在冷藏條件(例如2V -8°C )下保持的那些制劑，吸附的抗原可能化學(xué)上不穩(wěn)定，因此，隨時間推移可經(jīng)歷水解和破碎。因此，需要一種用于解決這些問題(例如，化學(xué)不穩(wěn)定性、抗原濃度降低)的生產(chǎn)包含鋁鹽佐劑的疫苗組合物的方法。發(fā)明概沭
本發(fā)明涉及制備抗原穩(wěn)定性增加的包含至少一種抗原和含有氫氧基的鋁化合物的免 疫原性組合物的方法。該方法包括(a)將含有氫氧基的鋁化合物用選自以下的化合物處理(i)磷酸鹽、(ii)羧酸鹽、(iii)碳酸鹽、(iv)硫酸鹽、(v) 二膦酸鹽和(vi) (i)-(v)中兩種或更多種的混合物；和(b)將步驟(a)中的制備物與至少一種抗原混合?？蓪X化合物備選地用氟化物處理。相對于其中抗原與未處理的含有氫氧基的鋁化合物混合的組合物，將抗原與處理的含有氫氧基的鋁化合物混合增加抗原的穩(wěn)定性。亦提供包含至少一種抗原和已用磷酸鹽、羧酸鹽、碳酸鹽、硫酸鹽、二膦酸鹽、氟化物或者這些化合物中兩種或更多種的混合物處理的含有氫氧基的鋁化合物的免疫原性組合物以及使用這些組合物用于預(yù)防和治療疾病的方法。在一個實例中，根據(jù)公開的方法，制備包含肺炎鏈球菌蛋白PcpA和已用選擇的化合物之一(例如，磷酸鹽)處理的含有氫氧基的鋁化合物的組合物。組合物亦可包含來自多組氨酸三聯(lián)體家族的肺炎鏈球菌蛋白(PhtX :PhtA、PhtB、PhtD、PhtE)和/或解毒的肺炎鏈球菌溶血素。本發(fā)明提供數(shù)個優(yōu)勢。例如，本發(fā)明的組合物是免疫原性的并具有改善的穩(wěn)定性。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)勢從下述詳述、附圖和權(quán)利要求中將顯而易見。附圖概述
參考附圖，從下述描述將進(jìn)一步理解本發(fā)明。圖la-f.多價制劑(用AlO (OH)或磷酸鹽處理的AlO (OH) (PTH)配制)中的PcpA和PhtD的穩(wěn)定性。使用AlO(OH)或具有終濃度為2mM磷酸鹽的PTH制備制劑，然后在各種溫度(即5°C、25°C、37°C*45°C )下孵育30周。然后通過RP-HPLC評估完整的抗原濃度。圖2.通過ELISA評價的PhtD和PcpA在應(yīng)激條件下的穩(wěn)定性。將100 μ g/mL的二價制劑在37°C孵育12周，并通過ELSIA評價抗原性。圖3是關(guān)于本發(fā)明抗原(Prtl、Prt2和Prt3)和鋁化合物的配制過程概況的圖示。圖4a，4b，4c.將Balb/c小鼠用于評估由用幾種不同佐劑之一配制的二價疫苗組合物引起的免疫反應(yīng)(實施例4)。使用純化的重組PhtD和PcpA蛋白制備制劑(如在實施例I中所述)。通過終點稀釋ELISA測量總抗原-特異性IgG效價(圖4a)并計算各組的幾何平均效價(+/_ SD)。計算抗原-特異性IgGl (圖4b)和IgG2效價(圖4c)以評估IgGl/2a亞類。結(jié)果的概述描繪在該圖中。
圖5.描繪通過終點稀釋ELISA測量的總抗原_特異性IgG效價和各組的幾何平均效價(+/_ SD)。在該研究中(實施例6)，將Balb/c小鼠用于評估由新鮮制備的和老化的有佐劑的二價制劑引起的免疫反應(yīng)。將重組PhtD和PcpA與A100H或含有PO4 (2 mM)的A100H配制。該研究中使用的老化的制劑在第一次免疫前已儲存大約6個月(約2°C_8°C)。該研究中使用的新鮮制備的制劑在第一次免疫的一周內(nèi)制備。將多組小鼠用合適的制劑以3周間隔肌內(nèi)(IM)免疫3次。圖6描繪各免疫小鼠組的存活百分比(實施例6)。在該研究中，使用鼻內(nèi)攻擊模型評價重組PhtD和PcpA的二價制劑。將免疫的動物用致死劑量的肺炎鏈球菌菌株(MD、14453 或 941192)攻擊。 圖7.描繪通過定量ELISA測量的總抗原_特異性IgG效價和各組的幾何平均效價(+/_ SD)。在該研究中(實施例6)，將Balb/c小鼠用于評估由新鮮制備的和老化的有佐劑的二價制劑引起的免疫反應(yīng)。為了制備二價制劑，將重組PhtD和PcpA與用PO4 (2 mM)處理的A100H配制。老化的制劑在開始研究前已在2-8°C或37°C儲存大約6-7個月。該研究中使用的新鮮制備的制劑在第一次免疫的一周內(nèi)制備。將多組小鼠用合適的制劑以3周間隔肌內(nèi)(頂)免疫3次。圖8.描繪通過定量ELISA測量的總抗原_特異性IgG效價和各組的幾何平均效價(+/_ SD)。在該研究中(實施例8)，將Balb/c小鼠用于評估由具有磷酸鹽預(yù)處理的AlO(OH)和不同濃度的元素鋁的多價制劑引起的免疫反應(yīng)。圖9.不同批次的A100H (A)、PTH⑶和AlPO4 (C)的X-射線衍射圖。

圖10.不同批次的 PTH、A100H (Alhydrogel )和 AlPO4 (Adjuphos )的 TEM 分析。圖11. pH對有佐劑的蛋白的物理穩(wěn)定性的影響。將PcpA (A)、PhtD⑶和PlyDl(C)用不同pH值的氫氧化鋁或磷酸鋁輔佐(adjuvant)，并通過熒光跡線的導(dǎo)數(shù)分析獲得Tm值。圖12A 在 10% 山梨糖醇(■ )、10% 海藻糖(·)、10% 蔗糖(Λ )、TBS pH 9.0()和TBS pH 7· 4 (〇)存在下，通過RP-HPLC研究賦形劑對PcpA (在50°C儲存3天)穩(wěn)定性的影響。圖12B在10%山梨糖醇、10%海藻糖、10%蔗糖、TBS pH 9. O和TBS pH 7. 4存在下，通過定量夾心ELISA研究賦形劑對PcpA (在50°C儲存3天)抗原性的影響。將制劑在50°C儲存3天。對于各制劑，在零時(白條)和三天儲存后(黑條)評價抗原性。發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及制備包含抗原和含有氫氧基的鋁化合物的免疫原性組合物的穩(wěn)定制劑的方法。該方法包括以足以穩(wěn)定抗原的量加入鋁化合物離子，例如磷酸鹽、碳酸鹽、羧酸鹽、硫酸鹽、二膦酸鹽或氟化物的離子，或者這些離子的混合物。亦提供包含抗原和含有氫氧基的鋁化合物的免疫原性組合物以及使用這些組合物用于預(yù)防和治療特定疾病的方法。本文使用的術(shù)語“抗原”指，當(dāng)導(dǎo)入哺乳動物中時，能夠起始并介導(dǎo)相應(yīng)的免疫體(抗體)形成的物質(zhì)?？乖蓳碛卸鄠€抗原決定簇，使得將抗原暴露于哺乳動物可產(chǎn)生多種具有不同特異性的相應(yīng)抗體?？乖砂ǖ幌抻诘鞍住㈦?、多肽、核酸及其片段、變體和組合?？乖嗫砂ㄝ^大的組分，例如細(xì)胞、細(xì)菌、病毒和其他微生物的全部或部分，以及這些組分的部分或組合。細(xì)菌和病毒(尤其是造成哺乳動物中疾病的那些)是可用于本發(fā)明中的抗原來源。細(xì)菌抗原包括來源于細(xì)胞外表面、來自細(xì)胞內(nèi)部或來自鞭毛的蛋白或多糖。其他抗原可為由感染的細(xì)胞分泌或在細(xì)胞死亡或破碎時釋放的那些。這樣的抗原的實例包括白喉、破傷風(fēng)和肉毒毒素(botulism toxin)?？山Y(jié)合到本發(fā)明實踐中的特定抗原實例包括但不限于，白喉抗原、破傷風(fēng)抗原、人乳頭瘤病毒抗原、炭疽抗原、大腸桿菌(B· coif)抗原、狂犬病抗原和流感抗原、肺炎鏈球菌{Streptococcus pneumoniae)抗原、C型腦膜炎球菌抗原、A型腦膜炎球菌抗原、HIV抗原、瘧疾抗原、單純皰疹病毒抗原、麻疹抗原、麻疹-腮腺炎-風(fēng)疹抗原、黃熱抗原、水痘抗原、日本腦炎病毒抗原、登革熱抗原、輪狀病毒抗原、艱難梭菌{C. difficile)抗原、牙銀P卜啉單胞菌(P. gingivalis)抗原和衣原體抗原(例如，沙眼衣原體 if. iracAoffiaiis)、肺炎衣原體 ijl prwumormie)〉。本發(fā)明中使用的抗原可為抗原的天然存在的形式，如來源于其天然來源。由于毒性，可將抗原轉(zhuǎn)化為保留引起針對天然抗原的免疫反應(yīng)能力的較少毒性形式或片段。白喉類毒素和破傷風(fēng)類毒素是一般由化學(xué)處理(例如，甲醛)產(chǎn)生的天然抗原的解毒形式的實例。其他用于消除抗原毒性的方法是本領(lǐng)域公知的，并例如包括蛋白抗原的酶促消化/片 段化、變性(通常通過熱或化學(xué)處理)、綴合、化學(xué)修飾和遺傳解毒。適合于本發(fā)明中使用的肺炎鏈球菌的解毒肺炎鏈球菌溶血素蛋白包括W02010/071986中描述的那些。用于本發(fā)明中使用的優(yōu)選的解毒肺炎鏈球菌溶血素蛋白是PlyDl (SEQ ID NO: 9)。本發(fā)明中使用的抗原亦可為融合蛋白的形式。本文使用的融合多肽包含在N或C末端與任何其他多肽(下文稱為肽尾)融合的本發(fā)明的多肽或多肽衍生物。獲得這種融合多肽的簡便方法是通過翻譯框內(nèi)融合的多核苷酸序列(即雜合基因)。將編碼融合多肽的雜合基因插入到用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的表達(dá)載體中。備選地，將編碼多肽或多肽衍生物的多核苷酸序列插入到其中已經(jīng)存在編碼肽尾的多核苷酸的表達(dá)載體中。這樣的載體及其使用說明市售可得，例如來自New England Biolabs的pMal_c2或pMal_p2系統(tǒng)(其中肽尾是麥芽糖結(jié)合蛋白)、Pharmacia的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)或從Novagen獲得的His-標(biāo)簽系統(tǒng)。這些和其他表達(dá)系統(tǒng)為進(jìn)一步純化本發(fā)明的多肽和衍生物提供便利的方法。融合多肽的一個有利的實例是以下的融合多肽其中本發(fā)明的多肽或同源物或片段與具有佐劑活性的多肽(例如霍亂毒素或大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素的亞基B)融合。另一有利的融合是以下融合多肽其中多肽、同源物或片段與強T-細(xì)胞表位或B-細(xì)胞表位融合。這樣的表位可為本領(lǐng)域中已知的表位，或在本發(fā)明的另一多肽中基于計算機(jī)輔助分析可能的T-或B-細(xì)胞表位已被鑒定的表位。與本發(fā)明的該方面一致的是包含來自SEQ ID NO:1、2、5、7、9或10或者其同源物或片段的T-或B-細(xì)胞表位的融合多肽，其中該表位來源于所述多肽或同源物或片段的多種變體，各變體與另一變體不同在于多肽內(nèi)其表位的位置和序列。為了實現(xiàn)融合，將本發(fā)明的多肽與具有至少一個T-或B-細(xì)胞表位的多肽的N或優(yōu)選C末端融合。T-或B-細(xì)胞表位亦可被內(nèi)部地插入本發(fā)明多肽的氨基酸序列內(nèi)。本發(fā)明的抗原可為與抗原綴合的載體蛋白，例如細(xì)菌多糖。通過本領(lǐng)域中存在的任何已知方法可進(jìn)行這些多糖的綴合，例如W02008/143709。如上文所述，術(shù)語“抗原”可包括但不限于蛋白、肽、多肽、核酸及其片段、變體和組合。本文交換地使用術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白”來指氨基酸殘基的聚合物。用于本發(fā)明中使用的抗原可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法產(chǎn)生。例如，可使用標(biāo)準(zhǔn)純化技術(shù)直接自天然來源分離抗原。備選地，可使用已知技術(shù)重組產(chǎn)生抗原。重組產(chǎn)生的抗原和目標(biāo)抗原的變體或片段可用于本發(fā)明。用于本文使用的抗原亦可通過化學(xué)聚合物合成(例如固相肽合成)合成。這樣的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。包含多肽的抗原變體和片段亦被本發(fā)明所涵蓋?！白凅w”指實質(zhì)上類似的序列。本發(fā)明氨基酸或核苷酸序列的變體將通常與參比序列具有至少約65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%以上的序列同一性。在特定實施方案中，本發(fā)明抗原性多肽的變體將保留全長多肽的生物活性并因此是免疫原性的。用于產(chǎn)生變體序列的方法是本領(lǐng)域公知的，如同用于確定多肽或多核苷酸序列的百分比同一性的方法。術(shù)語“片段”指包含具體數(shù)量的連續(xù)氨基酸或核苷酸殘基的多肽或多核苷酸部分。在特定實施方案中，本發(fā)明免疫原性多肽的片段可保留全長多肽的生物活性并因此是免疫原性的。多核苷酸的片段可編碼保留蛋白生物活性并因此是免疫原性的蛋白片段。本發(fā)明多肽和多核苷酸的片段可為任何長度，前提是它們具有所需的特性(例如免疫原性)。用于產(chǎn)生多肽或多核苷酸片段的方法是本領(lǐng)域已知的。來自肺炎鏈球菌的本發(fā)明抗原可選自(但不限于)多組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX PhtA、B、D、E)、膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX) ,LytX家族、肺炎鏈球菌溶血素(Ply) >PspA,PsaA和 PcpA0PcpA多肽包含全長PcpA氨基酸序列(存在或不存在信號序列)、其片段及其變體。適合于本文所述的組合物中使用的PcpA多肽包括例如來自肺炎鏈球菌菌株B6的GenBank登錄號CAB04758、來自肺炎鏈球菌菌株TIGR4的GenBank登錄號NP_和來自肺炎鏈球菌菌株R6的GenBank登錄號NP_359536的那些，和來自肺炎鏈球菌菌株14453的那些。肺炎鏈球菌14453基因組中的全長PcpA的氨基酸序列是SEQ ID NO: 2。優(yōu)選的PcpA多肽是 SEQ ID NO: 7。適合于本發(fā)明組合物的PhtX多肽包含全長PhtA、PhtB, PhtD或PhtE氨基酸序列(存在或不存在信號序列)、其免疫原性片段、其變體及其融合蛋白。適合于本文所述的組合物中使用的PhtD多肽包括例如尤其GenBank登錄號AAK06760、YP816370和NP35851的那些。肺炎鏈球菌14453基因組中的全長PhtD的氨基酸序列是SEQ ID NO: I。優(yōu)選的PhtD多肽(來源于肺炎鏈球菌14453基因組)是SEQ ID NO: 5。肺炎鏈球菌溶血素(Ply)是涉及肺炎球菌發(fā)病機(jī)制的多個步驟(包括抑制纖毛搏動和破壞上皮細(xì)胞之間的緊密連接)的溶細(xì)胞-活化毒素(Hirst等Clinical andExperimental Immunology (2004))。數(shù)種肺炎鏈球菌溶血素是已知的，且(解毒后)適合于本文所述的組合物中使用，包括例如尤其GenBank登錄號Q04IN8、P0C2J9、Q7ZAK5和AB021381。在一個實施方案中，Ply具有SEQ ID NO: 10中所示的氨基酸序列。本發(fā)明的肺炎鏈球菌溶血素多肽優(yōu)選是解毒的；即，與由肺炎鏈球菌產(chǎn)生并釋放的成熟野生型肺炎鏈球菌溶血素蛋白相比，它們沒有或具有降低的毒性。本發(fā)明的肺炎鏈球菌溶血素多肽可被例如化學(xué)(例如，使用甲醛處理)或遺傳(例如，以突變形式重組產(chǎn)生)解毒。用于本發(fā)明中使用的解毒的肺炎鏈球菌溶血素的優(yōu)選實例公開于PCT公布號WO 2010/071986。如該篇申請中所公開，解毒的肺炎鏈球菌溶血素可為在野生型序列的位置65、293和428上包含氨基酸取代的突變體肺炎鏈球菌溶血素蛋白。在優(yōu)選的解毒的肺炎鏈球菌溶血素蛋白中，三個氨基酸取代包含T65 — C、G293 — C和C428 — A0優(yōu)選的免疫原性并解毒的肺炎鏈球菌溶血素多肽是SEQ ID NO: 9。本文使用的“免疫原性”指，當(dāng)給予受試者時，物質(zhì)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的能力(例如，細(xì)胞免疫原-特異性免疫反應(yīng)和/或體液抗體反應(yīng))。本文使用的和本領(lǐng)域中定義的“抗原性”是抗體識別并結(jié)合蛋白(例如，抗原)的能力。本文使用的術(shù)語“佐劑”指連同抗原一起給予受試者以增強抗原免疫原性的物質(zhì)。鋁鹽佐劑(或化合物)是本發(fā)明的實踐中使用的佐劑之一。尤其使用氫氧化鋁(例如，結(jié)晶偏氫氧化鋁AlO(OH)和氫氧化鋁Al (OH)3)。氫氧化鋁是包含Al3+離子和氫氧基(-0H)的鋁化合物。當(dāng)產(chǎn)生的混合物是包含氫氧基的鋁化合物時，亦可使用氫氧化鋁與其他鋁化合物(例如羥基磷酸鹽或羥基硫酸鹽)的混合物。具有鋁鹽佐劑的組合物不應(yīng)該暴露于極端溫度(即低于冰點(0°C )或極其熱(例如，^ 70°O)是本領(lǐng)域公知的，因為這樣的暴露可不利地影響吸附的抗原和佐劑兩者的穩(wěn)定性和免疫原性。 在特定實施方案中，鋁佐劑是偏氫氧化鋁(例如，Alhydrogel )。在本發(fā)明一個具體實施方案中，將含有氫氧基的鋁化合物(例如，氫氧化鋁佐劑)用磷酸鹽、碳酸鹽、硫酸鹽、羧酸鹽、二膦酸鹽或氟化物或者這些化合物中兩種或更多種的混合物處理。通過以這種方式處理鋁化合物，鋁化合物中的許多氫氧基(-0H)被對其進(jìn)行處理所用的相應(yīng)離子置換(例如，磷酸基(P04))。該置換降低鋁化合物的PZC和化合物微環(huán)境的pH。以足夠的量加入磷酸鹽、碳酸鹽、硫酸鹽、羧酸鹽、二膦酸鹽或氟化物離子來降低微環(huán)境的PH至使抗原穩(wěn)定的水平(即，抗原水解的速率降低)。必要的量將取決于許多因素，例如所涉及的抗原、抗原的等電點、抗原的濃度、抗原與佐劑之間的相互作用力、使用的輔佐方法和制劑中存在的任何另外抗原的量和性質(zhì)。疫苗領(lǐng)域的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠評估相關(guān)的因素并確定加入鋁化合物中以增加抗原穩(wěn)定性的磷酸鹽、碳酸鹽、硫酸鹽、羧酸鹽、二膦酸鹽、氟化物的濃度(并因此，可制備相應(yīng)的制劑和組合物)。例如，可進(jìn)行滴定研究(即，加入增加濃度的磷酸鹽等至鋁化合物中)。適合使用的磷酸鹽化合物包括與磷酸相關(guān)的任何化合物(例如，磷酸的無機(jī)鹽和有機(jī)酯)。磷酸鹽是包含磷酸根離子(PO/-)、磷酸氫根離子(HPO42-)或磷酸二氫根離子(H2PO4-)連同任何陽離子的無機(jī)化合物。磷酸酯是其中磷酸的氫被有機(jī)基團(tuán)置換的有機(jī)化合物?？纱媪姿猁}使用的化合物實例包括陰離子氨基酸(例如，谷氨酸、天冬氨酸)和磷脂。適合使用的羧酸鹽化合物包括羧酸的任何有機(jī)酯、鹽和陰離子(例如，蘋果酸、乳酸、富馬酸、戊二酸、EDTA和EGTA)。適合使用的硫陰離子包括包含硫酸基(SO4基)的任何化合物，例如硫酸的鹽或酯(例如硫酸鈉、硫酸銨、亞硫酸鹽、偏亞硫酸氫鹽、硫代硫酸鹽)。適合使用的二膦酸鹽化合物實例包括氯膦酸鹽、帕米膦酸鹽、替魯膦酸鹽和阿倫膦酸鹽。在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方案中，將磷酸基以鹽的形式加入氫氧化鋁佐劑中。優(yōu)選地，磷酸根離子由包含磷酸二鈉一鈉的緩沖溶液提供。在本發(fā)明的優(yōu)選實踐中，如本文所例示，將鋁化合物(例如偏氫氧化鋁)用磷酸鹽處理(例如，通過如實施例中所述的方法)。在該方法中，將偏氫氧化鋁的水性懸浮液(大約20 mg/mL)與磷酸緩沖溶液(例如，大約400 mmol/L)混合。優(yōu)選的終磷酸基濃度為約2 mM-20mM。然后將混合物用緩沖劑(例如，Tris_HCl、具有鹽水的Tris_HCl、HEPES)稀釋以制備偏氫氧化鋁與磷酸基(PO4)的懸浮液。優(yōu)選地，緩沖劑是10 mM TriS-HCl和150 mM似(1，？!1為約7.4。然后將懸浮液在室溫混合大約24小時。優(yōu)選地，元素鋁在終懸浮液中的濃度在約O. 28 mg/mL-1. 68 mg/mL的范圍內(nèi)。更優(yōu)選地，元素鋁的濃度為約O. 56 mg/mL。然后可將抗原(單獨或組合地)吸附于處理的氫氧化鋁。優(yōu)選地，將大約O. 2-0. 4mg/mL的抗原與處理的偏氫氧化鋁的懸浮液混合(例如，在室溫或在2 - 8°C，在定軌混合器中，大約30分鐘或大約12-15小時或大約24小時)。在一個實例中，然后可將PcpA、PhtX (例如，PhtD)和肺炎鏈球菌溶血素的解毒突變體的免疫原性多肽(單獨或組合地)吸附于處理的氫氧化鋁。優(yōu)選地，將大約O. 2-0. 4mg/mL的各抗原與處理的氫氧化鋁佐劑的懸浮液混合(例如，在室溫或在2 - 8°C，在定軌混合器中，大約30分鐘或大約12-15小時或大約24小時)。使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法，可評估抗原吸附的百分比。例如，可移除并離心(例如，以10，OOOrpm)抗原/佐劑制備物的等分試樣，以從佐劑懸液(上清液)中分離未吸附的 蛋白(沉淀)?？墒褂枚量蓪幩岬鞍诇y定(BCA)或反相高效液相色譜(RP-HPLC)測定上清液中的蛋白濃度。如下計算吸附百分比%A=100-([PrSN] X 100/[PrCtr])，其中[PrSN]是上清液中蛋白的濃度，[PfCtr]是相應(yīng)的無佐劑的對照中的濃度。在優(yōu)選的實施方案中，％吸附范圍為約70%-約100%。在更優(yōu)選的實施方案中，％吸附為至少約70%。當(dāng)在常規(guī)冷藏溫度(例如約2V -約8°C )長期儲存時，公開的制劑是穩(wěn)定的。制劑顯示很少或無顆粒團(tuán)聚、抗原濃度無顯著降低或抗原降解速率降低并保留顯著水平的免疫原性和/或抗原性至少6個月或12個月，優(yōu)選18個月。短語“抗原濃度無顯著降低”旨在意指組合物保留至少50%、60%或70%的最初抗原濃度，更優(yōu)選至少約80%、85%或90%的最初抗原濃度，更優(yōu)選至少約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上的初次配制時呈現(xiàn)的抗原濃度?？乖瓭舛瓤衫缤ㄟ^基于RP-HPLC、SDS-PAGE或ELISA的方法測量。穩(wěn)定制劑或包含穩(wěn)定制劑的免疫原性組合物維持實質(zhì)程度的結(jié)構(gòu)完整性(例如，維持實質(zhì)量的最初抗原濃度等)?？赏ㄟ^測量例如呈現(xiàn)的抗原濃度(例如，通過RP-HPLC)或通過利用例如SDS-PAGE分析評估抗原降解，來評估穩(wěn)定性?？蓪⒅苿┲械目乖瓭舛扰c用相同但未處理(例如未用磷酸鹽或碳酸鹽離子處理)的鋁化合物制備的制劑濃度比較。穩(wěn)定性預(yù)測和/或比較工具包括例如Stability System (ScienTek Software, Inc.),其使用 Arrhenius Treatment預(yù)測儲存溫度(2°C -8°C )下的速率常數(shù)。用于測量抗原濃度和免疫原性的標(biāo)準(zhǔn)測定是本領(lǐng)域已知的并在實施例中描述?？赏ㄟ^例如用引起疾病的對應(yīng)于制劑中存在的特定抗原的病原體或毒素攻擊后評價免疫和未免疫的受試者的存活率，評估保護(hù)功效。相對于用相應(yīng)的未處理的含有氫氧基的鋁化合物輔佐，通過將這些多肽(單獨或組合地)用處理的含有氫氧基的鋁化合物輔佐，可改善例如肺炎鏈球菌蛋白(例如PcpA、PhtX (例如，PhtD)和肺炎鏈球菌溶血素(例如，解毒的肺炎鏈球菌溶血素，PlyDl))的穩(wěn)定性。當(dāng)用氫氧化鋁佐劑(AlO(OH))輔佐時，這些多肽的降解速率高(如在下文實施例中討論)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，相對于將這些多肽(例如，PcpA、PhtD)用相應(yīng)的未處理的鋁化合物輔佐，將它們用已用磷酸鹽(或例如，碳酸鹽、硫酸鹽、羧酸鹽、二膦酸鹽或者這些化合物中兩種或更多種的混合物)預(yù)處理的含有氫氧基的鋁化合物(例如，氫氧化鋁)輔佐，可增加這些多肽的穩(wěn)定性(例如，通過減少抗原降解)。因此，本文提供包含免疫原性PcpA多肽和/或免疫原性PhtX多肽(例如，PhtD)和/或肺炎鏈球菌溶血素(例如，解毒的肺炎鏈球菌溶血素；PlyDl (SEQ ID NO:9))和已用磷酸鹽、碳酸鹽、硫酸鹽、羧酸鹽、二膦酸鹽或者這些化合物中兩種或更多種的混合物處理的含有氫氧基的鋁化合物的組合物制劑，其中相對于其中多肽吸附于未處理的含有氫氧基的鋁化合物的組合物，該處理增加免疫原性多肽的穩(wěn)定性。在優(yōu)選的實施方案中，將鋁化合物用磷酸鹽處理。亦提供用這種處理的鋁化合物為佐劑的多價組合物，其包含PcpA和PhtX (例如，PhtD)的免疫原性多肽或者包含肺炎鏈球菌溶血素(例如，解毒的肺炎鏈球菌溶血素；PlyDl)、PcpA和PhtX (例如，PhtD)多肽。免疫原性組合物優(yōu)選為液體形式，但其可為凍干的(按照標(biāo)準(zhǔn)方法)或泡沫干燥的(如在 WO2OO9Ol26Ol, Antigen-Adjuvant Compositions and Methods (抗原 _ 佐劑組合物和方法)中所述)。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，組合物為液體形式?？蓪⒚庖邉┝颗渲瞥蒓. 5-1. O ml的體積。液體制劑可為適合給藥的任何形式，包括例如溶液劑或混懸劑。 因此，組合物可包含可被緩沖的液體介質(zhì)(例如鹽水或水)。制劑(和組合物)的pH優(yōu)選為約6. 4-約8. 4。更優(yōu)選地，pH為約7. 4。制劑的例示性pH范圍為5-10，(例如5-9、5-8、5. 5-9,6-7. 5或6. 5-7)。pH可通過使用緩沖劑維持。本發(fā)明免疫原性組合物的藥物制劑亦可任選包含一種或多種本領(lǐng)域公知的賦形劑(例如稀釋劑、增稠劑、緩沖劑、防腐劑、表面活性劑、佐劑、洗滌劑和/或免疫刺激劑)。合適的賦形劑將與抗原和本領(lǐng)域已知的鋁佐劑相容。稀釋劑的實例包括粘合劑、崩解劑或分散劑，例如淀粉、纖維素衍生物、苯酚、聚乙二醇、丙二醇或甘油。藥物制劑亦可包含一種或多種活性成分，例如抗微生物劑、抗炎劑和麻醉劑。洗滌劑的實例包括Tween (聚山梨醇酯)，例如Tween 80。優(yōu)選地，在與一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑結(jié)合之前，純化吸附于處理的鋁化合物的抗原。本發(fā)明的一個實施方案的組合物可通過以下方法制備(i)將含有氫氧基的鋁化合物用磷酸鹽、碳酸鹽、硫酸鹽、羧酸鹽、二膦酸鹽或者這些化合物中兩種或更多種的混合物處理，和(ii)將處理的鋁化合物與至少一種抗原混合。在優(yōu)選的實施方案中(如實施例中所述)，抗原單獨或組合地包括(但不限于)，PcpA,PhtX (例如，PhtD)和解毒的肺炎鏈球菌溶血素(例如，PlyDl，SEQ ID NO: 9)。亦提供包含用根據(jù)本發(fā)明(例如，用磷酸鹽)處理的含有氫氧基的鋁化合物(例如氫氧化鋁)(單獨或組合地)輔佐的PcpA、PhtX (例如，PhtD)和/或解毒的肺炎鏈球菌溶血素以及包含一種或多種對組合物提供有益性質(zhì)(例如，增加組合物的一種或多種蛋白的穩(wěn)定性)的藥學(xué)上可接受的賦形劑的制劑。在一個實例中，制劑包含磷酸鹽處理的氫氧化鋁(PTH)。本發(fā)明的組合物中可包含的化合物或賦形劑包括例如，緩沖劑(例如，甘氨酸、組氨酸)；張度劑(例如，甘露糖醇)；碳水化合物(例如糖或糖醇(例如山梨糖醇、海藻糖或蔗糖；1-30%))或碳水化合物聚合物(例如葡聚糖)；氨基酸，寡肽或多氨基酸(多達(dá)100 mM);多元醇(例如，甘油，且濃度多達(dá)20%);洗滌劑，脂質(zhì)或表面活性劑(例如Tween
20、Tween 80或pluronics,具有多達(dá)0. 5%的濃度);抗氧化劑；鹽(例如氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂或醋酸鎂，多達(dá)150 mM)或者它們的組合?？杀皇褂玫馁x形劑的實例包括在表13和下文實施例中列出的那些。在各種實例中，賦形劑可為引起熱穩(wěn)定性增加(例如，至少0. 5(例如0. 5-5、1-4或2-3))的那些，如通過例如下文所述的測定(例如，SYPRO Orange的外部熒光)測量。例示性的賦形劑和緩沖劑包括山梨糖醇(例如，4-20%，5-10%)，(參見表13)。這些賦形劑可以表13中所列的濃度使用。備選地，該量可變化于例如O. 1-10倍，如本領(lǐng)域所理解。亦可包含本領(lǐng)域已知的其他碳水化合物、糖醇、表面活性劑和氨基酸?？蓡为毣蚪M合地使用賦形劑和緩沖劑。這種組合物的pH可為，例如5. 5-8. O或
6.5-7. 5，并可將組合物以液體或凍干形式儲存在例如2-8°C。在組合物的變化中，可將山梨糖醇用蔗糖(例如，4-20%或5-10%)或海藻糖(例如，4-20%或5-10%)替換。組合物的其他變化亦是可能的并涉及使用本文所列的其他組分?；谏衔模琍cpA、PhtD和解毒的肺炎鏈球菌溶血素的例示性制劑(單獨或組合地)包含10%山梨糖醇，pH 7. 4。在一個實施方案中，單價PlyDl (SEQ ID NO: 9)組合物每劑可包含，在約IOmMTris HCl和約150mM NaCl J^JpH 7. 4中的范圍為5-50 μ g的抗原、PTH佐劑(具有約O. 56 mg/mL元素鋁，包含2mM磷酸鈉緩沖液，在約pH 7.5)。在優(yōu)選的實例中，PlyDl范圍為25-50 μ g/ 劑量。在另一個實施方案中，單價PhtD組合物每劑可包含，在約10mM Tris HCl和約150mM NaCl J^JpH 7. 4中的范圍為5_50 μ g的抗原、PTH佐劑(具有約O. 56 mg/mL元素鋁，包含2mM磷酸鈉緩沖液，在約pH 7. 5)。在優(yōu)選的實例中，PlyD范圍為25-50 μ g/劑量。在另一個實施方案中，單價PcpA組合物每劑可包含，在約10mM Tris HCl和約150mM NaCl J^JpH 7. 4中的范圍為5_50 μ g的抗原、PTH佐劑(具有約O. 56 mg/mL元素鋁，包含2mM磷酸鈉緩沖液，在約pH 7. 5)。在優(yōu)選的實例中，PcpA范圍為25-50 μ g/劑量。在另一個實施方案中，二價制劑組合物每劑可包含，在約10mM Tris HCl和約150mM NaClJ^JpH 7. 4中的范圍各為5_50 μ g/劑量的兩種蛋白(選自下述PhtD、PlyDl或PcpA)、PTH佐劑(具有約O. 56 mg/mL元素鋁，包含2mM磷酸鈉緩沖液，在約pH 7.5)。在特定實例中，兩種抗原以1:1抗原/劑量比存在。在又一個實施方案中，三價制劑組合物每劑可包含，在約10mM Tris HCl和約150mM NaCl J^JpH 7. 4中的范圍各為5_50 μ g/劑量的三種蛋白(PhtD、PlyDl、PcpA)、PTH佐劑(具有約O. 56 mg/mL元素鋁，包含2mM磷酸鈉緩沖液，在約PH 7.5)。在特定實例中，三種抗原各自的量(抗原/劑量)是以約1:1:1的比例。在另一實例中，組合物包含山梨糖醇或蔗糖，其關(guān)于穩(wěn)定性已顯示提供益處(參見下文)。這些組分的量可為例如5-15%、8-12%或10%山梨糖醇或蔗糖。下文描述其中這些組分以10%存在的具體實例。在一個優(yōu)選的實施方案中，組合物包含10%山梨糖醇或10%蔗糖。本發(fā)明的免疫原性組合物在預(yù)防或治療與特定抗原有關(guān)的疾病、病癥、病況或癥狀的方法中有用。術(shù)語疾病、病癥和病況本文將交換地使用。特別地，預(yù)防和治療方法包括將治療有效量的藥物組合物給予受試者。在特定實施方案中，提供用于預(yù)防或治療肺炎鏈球菌的方法。本文使用的預(yù)防疾病或病癥旨在意指，將治療有效量的本發(fā)明的藥物組合物給予受試者以便保護(hù)受試者免于發(fā)生與抗原相關(guān)的特定疾病或病癥。治療疾病或病癥旨在將治療有效量的本發(fā)明的藥物組合物給予受疾病折磨或暴露于引起疾病的病原體的受試者，其中目的是為了治愈、愈合、緩和、緩解、改變、補救、減輕、改善或影響病況或疾病的癥狀。治療有效量指，對給定的病況和給藥方案提供治療作用的量。治療有效量可由普通技術(shù)醫(yī)務(wù)人員基于患者特征(年齡、體重、性別、病況、并發(fā)癥、其他疾病等)確定。治療有效量將另外受組合物的給藥途徑影響。本發(fā)明的組合物可通過本領(lǐng)域已知的多種方法給予受試者。用于將組合物給予受試者的任何方法可在本發(fā)明的實踐中使用。定義
術(shù)語“包含”涵蓋“含有”以及“由…組成”(例如，組合物“包含”x可僅由X組成或可包含另外的某物，例如，X+Y)。術(shù)語“實質(zhì)上”不排除“完全地”(例如“實質(zhì)上不含”Y的組合物可完全不含Y)。與數(shù)值X有關(guān)的術(shù)語“約”意指，例如X土 10%。 術(shù)語“免疫原”是能夠誘導(dǎo)獲得性免疫反應(yīng)的物質(zhì)。術(shù)語“受試者”涵蓋以下物種，例如哺乳動物(例如人或動物(例如小鼠、狗、貓、馬、綿羊、豬等))、鳥類。除非特別說明，否則包括將兩種或更多種組分混合的步驟的方法不要求任何具體的混合次序。因此組分可以任何次序混合。當(dāng)有三種組分時，那么可將兩種組分彼此混合，接著可將組合與第三種組分混合等。應(yīng)認(rèn)識到，可電離基可以本文所示的中性形式存在，或可以帶電荷的形式存在，例如取決于pH。本公開內(nèi)引用的所有參考文獻(xiàn)通過弓I用以其整體結(jié)合到本文中。
實施例以上公開大體上描述了本發(fā)明。通過參考下述具體實施例可獲得更完整的理解。描述這些實施例僅用于例證的目的而不旨在限制本發(fā)明的范圍。形式的改變和等價替代預(yù)期為可表明或提出權(quán)宜的情況。雖然本文已使用特定的術(shù)語，但是這樣的術(shù)語旨在描述性的意思而不是限制的目的。在本公開和這些實施例中使用但未明確描述的分子遺傳學(xué)、蛋白質(zhì)生物化學(xué)、免疫學(xué)和發(fā)酵技術(shù)方法，在科學(xué)文獻(xiàn)中被充分報道并完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力內(nèi)。實施例I
本實施例描述表面修飾的佐劑和具有該佐劑的制劑的制備。通過將氫氧化鋁佐劑(Alhydrogel , Brenntag)用磷酸鹽處理,制備表面修飾的佐劑。使用的氫氧化招佐劑是濕凝膠懸浮液，其根據(jù)制造商耐受再高壓滅菌但如果冷凍則損壞。根據(jù)制造商，當(dāng)PH維持在5-7時，佐劑具有正電荷并可吸附帶負(fù)電的抗原(例如，當(dāng)在中性pH下保持時具有酸性等電點的蛋白)。a)磷酸鹽處理AlO (OH)-將AlO (OH)的水性懸浮液(大約20 mg/mL)與磷酸鹽緩沖液的忙存液(大約400 mmol/L)混合,并用約pH 7. 4的10 mM Tris-HCL緩沖液(SigmaAldrich)稀釋，以制備具有大約13 mg/mL A100H/200 mM PO4的磷酸鹽處理的AlO (OH)懸浮液(本文稱為“PTH” )。然后在室溫將該懸浮液混合大約30分鐘至24小時。b)重組制備PcpA蛋白和PhtD蛋白-簡言之，將來自肺炎鏈球菌(血清型6菌株14453，在1997年6月27日作為ATCC 55987保藏)的兩種重組來源的蛋白抗原PhtD(W02009/012588)和PcpA (WO 2008/022302)在大腸桿菌中重組表達(dá)，常規(guī)純化方案后通過系列柱層析分離并純化。更具體而言，使用AccuPrime高保真性聚合酶(Invitrogen)以及引物Spn0211和Spn0213，從肺炎鏈球菌14453基因組(血清型6菌株，在1997年6月27日作為ATCC55987保藏，小鼠-強毒莢膜血清型6B菌株)PCR擴(kuò)增#切基因(但不包括其天然信號肽)。Spn0211和Spn0213分別將NocI和XhoI限制性位點導(dǎo)入到5’和3’端中(參見表I)。使用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen)純化PCR產(chǎn)物，并在瓊脂糖凝膠上運行來確定大小。將PCT產(chǎn)物和pET28a(+)載體(Novagen)兩者用AfcoI和通ol消化，并隨后使用QIAEX凝膠提取試劑盒(Qiagen)從瓊脂糖凝膠中純化。使用T4 DNA連接酶(Invitrogen)將消化的載體與基因連接在一起。將連接混合物轉(zhuǎn)化到化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌DH5 α中，并通過接種在包含SOPg/ml卡那霉素的Luria瓊脂上，挑選陽性克隆。將來自質(zhì)?？寺BAC27的DNA分離，并通過測序確認(rèn)為正確的。
然后通過電穿孔將質(zhì)粒(pBAC27)導(dǎo)入到大腸桿菌BL21 (DE3)細(xì)胞中。在大約37°C培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的菌株并通過加入ImM IPTG來誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。通過SDS-PAGE分析，由正確大小(即，大約91. 9 kDa)的誘導(dǎo)蛋白條帶的存在證實基因產(chǎn)物的表達(dá)
權(quán)利要求
1.一種包含至少一種吸附于含有氫氧基的鋁化合物的抗原的免疫原性組合物，所述含有氫氧基的鋁化合物已用選自以下的化合物處理(i)磷酸鹽、(ii)碳酸鹽、(iii)硫酸鹽、(iv)羧酸鹽、(V) 二膦酸鹽和(Vi) (i)-(v)中兩種或更多種的混合物，其中，相對于其中至少一種抗原吸附于未處理的含有氫氧基的鋁化合物的組合物，所述處理增加至少一種吸附抗原的穩(wěn)定性。
2.權(quán)利要求I的免疫原性組合物，其中所述鋁化合物是氫氧化鋁佐劑。
3.權(quán)利要求2的免疫原性組合物，其中所述佐劑是偏氫氧化鋁。
4.權(quán)利要求I的免疫原性組合物，其中所述含有氫氧基的鋁化合物已用磷酸鹽或碳酸鹽處理。
5.權(quán)利要求4的免疫原性組合物，其中所述鋁化合物已用磷酸鹽處理。
6.權(quán)利要求I的免疫原性組合物,其中元素鋁的濃度為約O.28 mg/ml-1. 68 mg/ml。
7.權(quán)利要求I的組合物，其中所述至少一種抗原是蛋白或多糖，或蛋白多糖綴合物。
8.權(quán)利要求7的組合物，其中所述抗原為選自以下的細(xì)菌抗原 來自肺炎鏈球菌的抗原； 來自腦膜炎奈瑟氏球菌的抗原； 來自艱難梭菌的抗原； 來自沙眼衣原體的抗原； 來自肺炎衣原體的抗原；和 來自牙齦卟啉單胞菌的抗原。
9.權(quán)利要求5的組合物，其中元素磷的濃度為約2.O mM-約80. O mM。
10.權(quán)利要求I的組合物，其中所述組合物包含緩沖劑。
11.權(quán)利要求I的組合物,其中所述組合物的pH為約6.4-約8. 4。
12.權(quán)利要求11的組合物,其中所述組合物的pH為約7.4。
13.權(quán)利要求I的組合物，其中所述組合物包含超過一種抗原。
14.權(quán)利要求13的組合物，其中鋁化合物是氫氧化鋁佐劑。
15.權(quán)利要求14的組合物，其中超過一種抗原吸附于氫氧化鋁佐劑。
16.權(quán)利要求I的組合物，其中所述至少一種抗原選自多組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX)、膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)、LytX家族、肺炎鏈球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA和PcpA。
17.權(quán)利要求13的組合物，其中一種抗原是PcpA和第二種抗原是PhtD。
18.權(quán)利要求17的組合物，其中所述組合物另外包含無酶活性的肺炎鏈球菌溶血素。
19.權(quán)利要求18的組合物，其中所述無酶活性的肺炎鏈球菌溶血素是在野生型序列的位置65、293和428上包含氨基酸取代的突變體肺炎鏈球菌溶血素蛋白。
20.權(quán)利要求19的組合物，其中所述突變體肺炎鏈球菌溶血素蛋白是PlyDl，SEQIDNO: 9。
21.一種用于制備免疫原性組合物的方法，其包括(a)將含有氫氧基的鋁化合物用選自以下的化合物處理(i)磷酸鹽、(ii)羧酸鹽、(iii)碳酸鹽、(iv)硫酸鹽、(v) 二膦酸鹽和(vi) (i)-(v)中兩種或更多種的混合物；和(b)將步驟(a)中的制備物與至少一種抗原混合，其中，相對于其中至少一種抗原與未處理的含有氫氧基的鋁化合物混合的組合物，將步驟(a)中的制備物與至少一種抗原混合增加至少一種抗原的穩(wěn)定性。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述鋁化合物是氫氧化鋁佐劑。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述佐劑是偏氫氧化鋁。
24.權(quán)利要求21的方法，其中所述鋁化合物的濃度為約O.28 mg/mL-1. 68 mg/mL。
25.權(quán)利要求21的方法，其中所述抗原是蛋白或多糖。
26.權(quán)利要求21的方法，其中所述抗原為選自以下的細(xì)菌抗原 來自肺炎鏈球菌的抗原； 來自腦膜炎奈瑟氏球菌的抗原； 來自艱難梭菌的抗原； 來自沙眼衣原體的抗原； 來自肺炎衣原體的抗原；和 來自牙齦卟啉單胞菌的抗原。
27.權(quán)利要求21的方法，其中所述抗原吸附于鋁化合物。
28.權(quán)利要求21的方法，其中磷酸鹽的濃度為約2.O mM-約80. O mM。
29.權(quán)利要求21的方法，其中所述組合物另外包含緩沖劑。
30.權(quán)利要求21的方法，其中所述組合物的pH為約6.4-約8. 4。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述組合物的pH為約7.4。
32.權(quán)利要求21的方法，其中所述組合物包含超過一種抗原。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述鋁化合物是氫氧化鋁佐劑，和超過一種抗原吸附于佐劑。
34.權(quán)利要求21的方法，其中所述至少一種抗原是PcpA或PhtD。
35.權(quán)利要求34的方法，其中一種抗原是PcpA和第二種抗原是PhtD。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述組合物另外包含解毒的肺炎鏈球菌溶血素蛋白。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述解毒的肺炎鏈球菌溶血素蛋白是在野生型序列的位置65、293和428上包含氨基酸取代的突變體肺炎鏈球菌溶血素蛋白。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述解毒的肺炎鏈球菌溶血素蛋白是PlyDl，SEQID NO:9。
39.一種包含吸附于氫氧化鋁佐劑的PcpA的免疫原性組合物，所述氫氧化鋁佐劑已用選自以下的化合物處理(i)磷酸鹽、(ii)碳酸鹽、(iii)硫酸鹽、(iv)羧酸鹽、(v) 二膦酸鹽和(vi) (i)-(v)中兩種或更多種的混合物，其中，相對于其中PcpA吸附于未處理的含有氫氧基的鋁化合物的組合物，所述處理增加PcpA的穩(wěn)定性。
40.權(quán)利要求39的免疫原性組合物，其中所述組合物另外包含至少一種另外的抗原。
41.權(quán)利要求40的免疫原性組合物，其中所述組合物另外包含PhtD。
42.權(quán)利要求41的免疫原性組合物，其中所述組合物另外包含無酶活性的肺炎鏈球菌溶血素。
43.權(quán)利要求42的組合物，其中所述無酶活性的肺炎鏈球菌溶血素是在野生型序列的位置65、293和428上包含氨基酸取代的突變體肺炎鏈球菌溶血素蛋白。
44.權(quán)利要求43的組合物，其中所述肺炎鏈球菌溶血素蛋白是PlyDl，SEQID NO: 9。
45.一種包含吸附于氫氧化鋁佐劑的PhtD的免疫原性組合物，所述氫氧化鋁佐劑已用選自以下的化合物處理(i)磷酸鹽、(ii)碳酸鹽、(iii)硫酸鹽、(iv)羧酸鹽、(v) 二膦酸鹽和(vi) (i)-(v)中兩種或更多種的混合物，其中，相對于其中PhtD吸附于未處理的含有氫氧基的鋁化合物的組合物，所述處理增加PhtD的穩(wěn)定性。
46.權(quán)利要求45的組合物，其中所述組合物另外包含至少一種另外的抗原。
47.權(quán)利要求46的組合物，其中所述組合物另外包含解毒的肺炎鏈球菌溶血素。
48.。
49.權(quán)利要求47的組合物，其中所述解毒的肺炎鏈球菌溶血素是在野生型序列的位置65、293和428上包含氨基酸取代的突變體肺炎鏈球菌溶血素蛋白。
50.權(quán)利要求48的組合物，其中所述解毒的肺炎鏈球菌溶血素是PlyDl。
51.一種預(yù)防受試者中的與肺炎鏈球菌感染有關(guān)的疾病發(fā)生的方法，其包括給予受試者治療有效量的權(quán)利要求39、41、42或45的免疫原性組合物。
52.權(quán)利要求50的方法，其中給藥途徑是皮下或肌內(nèi)。
53.—種治療受試者中的與肺炎鏈球菌感染有關(guān)的疾病的方法,其包括給予受試者治療有效量的權(quán)利要求39、41、42或45的免疫原性組合物。
54.權(quán)利要求39、41、42或45中任一項的免疫原性組合物在制備用于預(yù)防或治療受試者中的與肺炎鏈球菌感染有關(guān)的疾病的藥物中的用途。
55.一種引起哺乳動物中的免疫反應(yīng)的方法，其包括給予有效量的權(quán)利要求I的組合物的步驟。
56.一種疫苗，其包含權(quán)利要求I的組合物和藥學(xué)上可接受的賦形劑。
57.一種包含至少一種吸附于含有氫氧基的鋁化合物的抗原的免疫原性組合物的穩(wěn)定制劑，所述含有氫氧基的鋁化合物已用選自以下的化合物處理(i)磷酸鹽、(ii)碳酸鹽、(iii)硫酸鹽、(iv)羧酸鹽、(V) 二膦酸鹽和(Vi) (i)-(v)中兩種或更多種的混合物，其中，相對于其中至少一種抗原吸附于未處理的含有氫氧基的鋁化合物的組合物，所述處理增加至少一種吸附抗原的穩(wěn)定性。
58.權(quán)利要求56的制劑，其中所述含有氫氧基的鋁化合物已用磷酸鹽處理。
59.權(quán)利要求56的制劑，其中所述制劑為液體形式。
60.權(quán)利要求58的制劑，其另外包含Tris緩沖鹽水和Tween80。
61.權(quán)利要求56的制劑，其中所述鋁化合物濃度為約O.28 mg/ml-1. 69 mg/mL·
62.權(quán)利要求21的方法，其中將所述含有氫氧基的鋁化合物用磷酸鹽或碳酸鹽處理。
63.權(quán)利要求40的免疫原性組合物，其中將所述鋁化合物用磷酸鹽處理。
64.一種包含分離的免疫原性肺炎鏈球菌PcpA多肽和含有氫氧基的鋁化合物的免疫原性組合物，所述含有氫氧基的鋁化合物已用選自以下的化合物處理(i)磷酸鹽、(ii)碳酸鹽、(iii)硫酸鹽、(iv)羧酸鹽、(V) 二膦酸鹽和(vi) (i)-(v)中兩種或更多種的混合物，其中，相對于其中PcpA多肽與未處理的含有氫氧基的鋁化合物組合的組合物，所述處理增加PcpA多肽的穩(wěn)定性。
65.一種用于在受試者中針對由肺炎鏈球菌引起的疾病賦予保護(hù)的免疫原性組合物，其包含分離的免疫原性肺炎鏈球菌PcpA多肽和含有氫氧基的鋁化合物，所述含有氫氧基的鋁化合物已用選自以下的化合物處理(i)磷酸鹽、(ii)碳酸鹽、(iii)硫酸鹽、(iv)羧酸鹽、(V) 二膦酸鹽和(vi) (i)-(v)中兩種或更多種的混合物，其中，相對于其中PcpA多肽與未處理的含有氫氧基的鋁化合物組合的組合物，所述處理增加PcpA多肽的穩(wěn)定性。
66.一種包含分離的免疫原性肺炎鏈球菌PhtX多肽、至少一種另外的肺炎鏈球菌多肽和含有氫氧基的鋁化合物的免疫原性組合物，所述含有氫氧基的鋁化合物已用選自以下的化合物處理(i)磷酸鹽、(ii)碳酸鹽、(iii)硫酸鹽、(iv)羧酸鹽、(v) 二膦酸鹽和(vi) (i)-(v)中兩種或更多種的混合物，其中，相對于其中至少一種抗原與未處理的含有氫氧基的鋁化合物組合的組合物，所述處理增加PhtX多肽的穩(wěn)定性。
67.一種用于在受試者中針對由肺炎鏈球菌引起的疾病賦予保護(hù)的免疫原性組合物，其包含分離的免疫原性肺炎鏈球菌PhtX多肽、至少一種另外的肺炎鏈球菌多肽和含有氫氧基的鋁化合物，所述含有氫氧基的鋁化合物已用選自以下的化合物處理(i)磷酸鹽、(ii)碳酸鹽、(iii)硫酸鹽、(iv)羧酸鹽、(v) 二膦酸鹽和(vi) (i)_(v)中兩種或更多種的混合物，其中，相對于其中PhtX多肽與未處理的含有氫氧基的鋁化合物組合的組合物，所述處理增加PhtX多肽的穩(wěn)定性。
68.權(quán)利要求64或65的組合物，其中所述組合物另外包含至少一種另外的肺炎鏈球菌抗原。
69.權(quán)利要求68的組合物，其中所述組合物包含肺炎鏈球菌溶血素。
70.權(quán)利要求68的組合物，其中所述肺炎鏈球菌溶血素是解毒的。
71.權(quán)利要求69的組合物，其中所述肺炎鏈球菌溶血素已被遺傳解毒。
72.權(quán)利要求68或69的組合物，其中所述組合物另外包含PhtX的免疫原性多肽。
73.權(quán)利要求72的組合物，其中所述組合物包含PhtD。
74.權(quán)利要求66或67的組合物，其中所述組合物另外包含至少一種另外的肺炎鏈球菌抗原。
75.權(quán)利要求74的組合物，其中所述組合物另外包含肺炎鏈球菌溶血素。
76.權(quán)利要求75的組合物，其中所述肺炎鏈球菌溶血素是解毒的。
77.權(quán)利要求76的組合物，其中所述肺炎鏈球菌溶血素已被遺傳解毒。
78.權(quán)利要求74或75的組合物，其中所述組合物另外包含PcpA的免疫原性多肽。
全文摘要
本公開涉及用于在免疫原性組合物中使用的佐劑，所述組合物包含至少一種抗原和已用磷酸鹽、羧酸鹽、碳酸鹽、硫酸鹽、二膦酸鹽或者這些化合物中兩種或更多種的混合物處理的含有氫氧基的鋁化合物，亦提供使用這些組合物用于預(yù)防和治療疾病的方法。
文檔編號A61K39/39GK102939105SQ201080064570
公開日2013年2月20日 申請日期2010年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月22日
發(fā)明者K.哈珀, B.朱蒂奇, S.加利錢, M.奧赫斯-奧諾蘭漢姆亨, G.莫爾菲爾德, F.奧薩, M-D.薩爾哈 申請人:賽諾菲巴斯德有限公司