專利名稱：用于肝細胞癌診斷的含微rna生物標記的診斷試劑盒和方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及用于肝細胞癌(hepatocellular cancer)血衆(zhòng)中的微RNA(microRNA)表達譜分析的組合物和方法。
背景技術(shù)：
肝細胞癌(也稱作肝細胞癌癥(hepatocellular carcinoma, HCC))是世界范圍內(nèi)最常見的實體惡性腫瘤之一。其代表了肝癌的主要組織學類型，可能占所有肝癌病例的70%-85%。世界每年有大約500，000個新病例，和幾乎相同數(shù)目的死亡病例，這反映出對這種疾病缺乏有效的早期檢測和治療選擇(Thorgeirsson, S. S. and Grisham, J. ff. (2002) Nat. Genet. 31, 339-346 ；Parkin, D. M. et al. (2005) CA Cancer J. Clin. 55, 74-108)。肝細胞癌因此是一類預后極差的癌癥?；颊哳A后取決于癌癥確診時的分期。肝細胞癌患者未進行手術(shù)的5年生存率〈5%，而術(shù)后5年生存率為60%-70%。當腫瘤大小<2cm時行手術(shù)切除，5年生存率可達到86%。但是早期肝癌患者(腫瘤大小<5cm)未行任何治療者的3年生存率僅17%-21%。這表明癌癥早發(fā)現(xiàn)對于治療和患者生存很重要。(Tang，Z.Y. (2001)World J Gastroenterol 7, 445-454;Chambers, A.F.et al. (2002)Nat RevCancer 2, 563-572;Mola-Kuba D. et al. (2006)Annals of Hepatology 5,16-24).盡管近年來肝細胞腫瘤的早發(fā)現(xiàn)和手術(shù)切除顯著提高了患者存活率，但是大多數(shù)腫瘤并不能在其發(fā)生期即非致命階段發(fā)現(xiàn)。然而，目前僅大約10%-20%的肝細胞癌患者符合外科手術(shù)條件，所述肝細胞癌的手術(shù)條件是通過可利用的臨床分期系統(tǒng)根據(jù)相對正常的肝功能和可處理的腫瘤損害等參數(shù)而確定。此外，進行切除術(shù)的患者通常具有高頻率的轉(zhuǎn)移/復發(fā)，術(shù)后5年存活率僅為30%-40%。肝癌的確診通常依靠組織學證據(jù)。組織采樣通過穿刺針吸出或活檢。然而一些肝癌分化良好，也就是說它們是由幾乎完全發(fā)育的成熟的肝細胞組成，因此這些肝癌組織在顯微鏡下酷似非癌肝組織。而且并不是所有的病理醫(yī)師都被訓練得可以辨別分化良好的肝癌和正常肝組織之間的細微區(qū)別。還有一些病理醫(yī)師會將肝細胞癌誤診為肝腺癌。腺癌是肝癌的另外一種類型，它一般起源于肝外。更重要的是，轉(zhuǎn)移性腺癌其治療與原發(fā)性肝癌截然不同。因此早期診斷這些在患者身上表現(xiàn)為一種類型的肝細胞癌的腫瘤對于區(qū)分不同類型的腫瘤并且指導不同的治療方案是可取的，因而可顯著改善遠期存活率。肝組織穿刺或活檢最常見的危險是出血，尤其因為肝癌是富含脈管的腫瘤(容納許多血管)。有許多病例可能沒有必要通過穿刺或活檢進行組織學診斷。如果一個患者有發(fā)生肝癌的危險因素(例如肝硬化、慢性乙型肝炎或慢性丙型肝炎)并且血液中α-胎甲球蛋白(AFP)顯著提高，醫(yī)生幾乎可以不通過活檢就能確定這個患者發(fā)生了肝癌。目前，僅有一種血清標記(a-甲胎蛋白，AFP)通常用于早期檢測肝細胞癌(MizejeWSki，G.J. (2003)Expert Rev. Anticancer Ther. 2, 709-735 ；Paul, S. B. et al. (2007)Oncology72，Suppl. I, 117-123)。然而這個單一標記具有低特異性，且通常由于假陽性結(jié)果而是不合適的。血清AFP檢驗僅在60%的患者中可易于檢測出肝細胞腫瘤。另一方面，在大量的肝硬化患者中，在不存在癌癥狀態(tài)時AFP也可升高。因此，我們?nèi)匀恍枰_定一些可供選擇的分子標記并且開發(fā)一些敏感的血液學檢測來早期發(fā)現(xiàn)和鑒別診斷肝細胞癌。解決這個問題的一種途徑可以基于一些小的調(diào)節(jié)性RNA分子，特別是基于微RNA(miRNA)，它們是一類進化保守的內(nèi)源表達的小的非編碼RNA，大小為20-25個核苷酸(nt)，可以介導靶mRNA的表達。自從它們在大約10年前被發(fā)現(xiàn)就被認為在細胞發(fā)育、分化、增殖和凋亡中有重要功能。(Bartel, D. P. (2004) Cell 116, 281-297, Ambros, V. (2004)Nature 431, 350-355; He, L. et al. (2004) Nat Rev Genet 5,522-531)。而且 miRNA 在作為癌癥生物標記上比mRNA有優(yōu)勢，因為它們在體外很穩(wěn)定而且在體內(nèi)壽命長。(Lu，J. etal. , (2005)Nature 435, 834-838;Lim, L. P. et al. , (2005)Nature 433, 769-773).miRNA是從初級轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生的,初級轉(zhuǎn)錄物被RNase III Drosha加工為莖-環(huán)結(jié)構(gòu)前體(pre-miRNA)。在轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)后,另一種稱為Dicer的RNase III切割pre_miRNA發(fā)夾的環(huán)以形成短雙鏈(ds)RNA，其中一條鏈作為成熟miRNA摻入miRNA-蛋白質(zhì)(miRNP)1中。miRNA指導miRNP到達它們的靶mRNA，在此它們發(fā)揮功能(Bartel, D. P. (2004)Cell23, 281-292 ； He, L. and Hannon, G. J. (2004) Nat. Rev. Genet. 5, 522-531)。根據(jù)miRNA與其祀之間的互補性程度,miRNA可以指導不同的調(diào)節(jié)過程。與miRNA高度互補的靶mRNA通過與RNA干擾(RNAi)相同的機制被特異切割。因此，在這種情況中，miRNA的功能是作為短干擾RNA(siRNA)。與miRNA互補性較低的靶mRNA要么被指引進入細胞降解途徑要么被翻譯性阻遏而不影響mRNA水平。但是，miRNA如何阻遏它們的靶mRNA的翻譯的機制尚有爭論。高通量的miRNA定量技術(shù)，例如miRNA生物芯片技術(shù)，實時的基于RT-PCR的TaqMan miRNA分析，為全球整個癌癥基因組miRNA輪廓研究提供了強大的的工具?？色@得的現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明miRNA表達的調(diào)節(jié)異常(dysregulation)可能與某些類型癌癥的發(fā)生和/或發(fā)展相關。例如，已表明兩種miRNA，miR-15及miR-16-l定位在慢性淋巴性白血病(CLL)中缺失的遺傳基因座上，并且發(fā)現(xiàn)在大約70%的CLL患者中，兩種miRNA基因被缺失或下調(diào)。另外，在結(jié)腸直腸瘤形成中觀察到miR-143及miR-145的下調(diào)，而miRNA let_7的表達在肺癌中經(jīng)常降低(Michael, Μ. Z. et al. (2003)Mol. Cancer Res. I, 882-891 ；Mayr, C. etal. (2007) Science 315,1576-1579)。事實上，基于miRNA表達中的癌癥相關改變和miRNA通常位于參與癌癥的基因組區(qū)域的觀察推測miRNA可能既作為腫瘤阻抑基因也作為癌基因(Esquela-Kerscher, A. and Slack, F. J (2006)Nat. Rev. Cancer 6, 259-269 ；Calin, G.A. and Croce, C. M. (2007) J. Clin. Invest. 117, 2059-2066 ；Blenkiron, C. and Miska, E.A. (2007) Hum. Mol. Genet. 16，R106-R113)。提示這些人類癌癥組織中異常表達的miRNA突出了它們作為診斷和預后的生物標記的潛能。一些研究報道了人肝細胞癌中的miRNA的表達譜(Murakami, Y. et al. (2006)Oncogene 25,2537-2545;Li, ff. et al. (2008)Int J Cancer 123,1616-1622;Huang, Y.S. et al. (2008)Hepatology 23，87-94;Ladeiro, Y. et al. (2008)Hepatology47, 1955-1963; Jiang, J. et al. (2008) Cl in Cancer Res 14，419-427)。此外，這些研究已經(jīng)顯示出，與非惡性的肝細胞或組織相比，在惡性的細胞或組織中，特定的miRNA異常表達。因此，此類miRNA可以提供對涉及到惡性轉(zhuǎn)變和進展中的細胞過程的了解。在許多可能的樣本類型中，血液被認為是最理想的來監(jiān)測高危的個體，導向早發(fā)現(xiàn)、早診斷、監(jiān)控、和有效地治療癌癥，因為血樣易于用微創(chuàng)的方法采集。已被證實腫瘤衍生的miRNA以相當穩(wěn)定的形式存在于人血漿或血清中，因為它們被保護而不受內(nèi)源性RNA酶活性影響。這些存在于血清或血漿中的衍生于腫瘤的miRNA的水平足夠作為癌癥檢測的生物標記。而且血漿或血清中的miRNA有強的相關性，表明不管是血漿還是血清樣本都適于臨床應用miRNA作為癌癥診斷的生物標記。(Mitchell, P. S. et al. (2008)Proc NatlAcad Sci USA 105，10513 - 10518;Gilad, S. et al. (2008)PLoS ONE 3，e3148;Chen, X. etal. (2008) Cell Res 18，997_1006)。至今，還沒有基于血樣的miRNA生物標記在肝細胞癌患者的血漿或血清中確定。因此，急需基于血液的診斷標記，特別是“表達特征(expression signature)”或“分子足跡(molecular footprint) ”形式的診斷標記，以使得可以快速、可靠和節(jié)約成本地診斷肝細胞癌。而且仍然需要一致的方法來在高危個體中篩選早期肝細胞癌(earlystage-HCC)，鑒別診斷HCC，早發(fā)現(xiàn)肝癌復發(fā)，和/或監(jiān)測肝癌治療。發(fā)明目的和概述
本發(fā)明的目的是提供用于診斷肝細胞癌、監(jiān)測癌治療、和/或治療癌的新方法，其中通過測定血中的多種核酸分子，每種核酸分子均編碼微RNA(miRNA)序列，其中所述多種核酸分子的一或多種在肝細胞癌的血漿中經(jīng)分析與健康對照相比和/或與健康個體、結(jié)直腸癌和肺癌相比差異表達，其中所述一或多種差異表達的核酸分子一起代表核酸表達特征，該核酸表達特征指示肝細胞癌的存在，其中所述核酸表達特征包括腫瘤相關特征(tumor-related signature)和血衆(zhòng)特異性特征(plasma-specific signature)。此外，本發(fā)明的目的是提供用于在展現(xiàn)肝細胞癌的血液中鑒別一或多種核酸表達特征的相應方法。更具體地，本發(fā)明的目的是提供用于與健康對照、和/或健康個體、結(jié)直腸癌和肺癌相比較來區(qū)分肝細胞癌的方法。這些及其它目的從以下描述將變得清楚，其通過獨立權(quán)利要求的主題來達成。本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案則通過從屬權(quán)利要求的主題來限定。在第一方面，本發(fā)明涉及用于鑒別一或多種展現(xiàn)出肝細胞癌的目標血漿的血液中分子標記物的診斷試劑盒，所述試劑盒包含多種核酸分子，每種核酸分子編碼微RNA序列，其中所述多種核酸分子的一或多種在目標血漿中和在一或多種對照血漿中差異表達，其中所述一或多種差異表達的核酸分子源于腫瘤相關或血漿特異性特征，其中所述一或多種差異表達的核酸分子一起代表核酸表達特征，所述核酸表達特征指示肝細胞癌的存在。本文限定的核酸表達特征可包括至少三十二種核酸分子，優(yōu)選至少十二種核酸分子，特別優(yōu)選至少六種核酸分子。在優(yōu)選的實施方案中，所述核酸表達特征包含至少一種編碼微RNA序列的核酸分子，其表達在一或多種目標血漿中與一或多種健康對照相比被上調(diào)；及包含至少一種編碼微RNA序列的核酸分子，其表達在一或多種目標血漿中與一或多種健康對照相比被下調(diào)。在優(yōu)選的實施方案中，所述核酸表達特征包含編碼腫瘤相關特征hsa-miR-122、hsa-miR-199b_3p、 hsa-miR-192、 hsa-miR-21、 hsa-miR-139_3p、 hsa-miR-10a、hsa-miR-103、hsa_miR-181d、hsa-miR-125b_2*、a-miR-125a_3p ;血衆(zhòng)特異性特征hsa-miR-34aλ hsa-miR-Ι36λ hsa-miR-Ι51~5ρλhsa-miR-lQSb5^λ hsa-miR-Ι24λhsa-miR-936λhsa-miR-198、hsa-miR-149*、hsa-miR-138、hsa-miR-601、hsa-miR-769-3p、hsa-miR-513c、hsa-miR-525_5p、hsa-miR-654_5p、hsa_miR-518c*、hsa-miR-500、hsa_miR-181c*、hsa-miR-1226*、hsa-miR-202、hsa-miR-629* 和內(nèi)部穩(wěn)定的對照 hsa-miR-1238 和hsa-miR-1228的任意一種或多種核酸分子。特別優(yōu)選地，與一或多種健康對照相比，在所述一或多種目標血漿中 編碼hsa-miR-122、hsa-miR-199b_3p、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-10a、hsa-miR-103、hsa-miR_34a、hsa_miR-136、hsa-miR-151_5p的任意一種或多種核酸分子的表達被上調(diào)；編碼 hsa-miR-139_3p、hsa_miR-193b*、hsa-miR-124、hsa_miR-181d、hsa-miR-125b_2*、hsa-miR-125a-3p、hsa-miR-936、hsa-miR-198、hsa-miR-149*、hsa-miR-138、hsa-miR-601、hsa-miR-769_3p、hsa_miR-513c、hsa-miR-525_5p、hsa-miR-654_5p、hsa_miR-518c*、hsa-miR-500、hsa_miR-181c*、hsa-miR-1226*、hsa-miR-202、hsa-miR-629* 的任意一種或多種核酸分子表達被下調(diào)；hsa-miR-1238和hsa-miR-1228沒有變化。在更優(yōu)選的實施方案中，核酸表達特征包括編碼腫瘤相關特征hsa-miR-122、hsa-miR-199b_3p、hsa-miR-192、hsa_miR-2I、hsa-miR-139-3p、hsa_miR-10a、hsa-miR-103和編碼血衆(zhòng)特異性特征 hsa_miR-34a、hsa-miR-136、hsa-miR-151_5p、hsa_miR-193b*、hsa-miR-124的任意一種或多種核酸分子。特別優(yōu)選地，與一種或多種健康對照相比，在一種或多種目標血漿中 編碼hsa-miR-122、hsa-miR-199b_3p、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-10a、hsa-miR-103、hsa-miR_34a、hsa-miR-136、hsa-miR-151_5p的任意一或多種核酸分子表達被上調(diào)；而編碼hsa-miR-139_3p、hsa-miR-193b*、hsa-miR-124的任意一種或多種核酸分子表達被下調(diào)。
在另一優(yōu)選的實施方案中，核酸表達特征包含編碼腫瘤相關特征hsa-miR-122、hsa-miR-199b_3p、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-139_3p 和血衆(zhòng)特異性特征hsa-miR-34a的任意一種或多種核酸分子。特別優(yōu)選地，與一種或多種健康對照相比，在一種或多種目標血漿中 編碼hsa-miR-122、hsa-miR-199b_3p、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa_miR-34a 的任意一種或多種核酸分子的表達被上調(diào)，而編碼hsa-miR-139_3p的任意一種或多種核酸分子的表達被下調(diào)。在特別優(yōu)選的實施方案中，核酸表達特征包括編碼hsa-miR-34a/hsa-miR_193b*、hsa-miR-21/hsa_miR-936、hsa-miR-192/hsa_miR-124、hsa-miR-122/hsa_miR-193b*、hsa-miR-34a/hsa_miR-138、hsa-miR-34a/hsa_miR-198、hsa-miR-122/hsa_miR-124、hsa-miR-103/hsa-miR-139_3p、hsa-miR-192/hsa_miR-193b*、hsa-miR-122/hsa—miR-138、hsa-miR-34a/hsa-miR-139_3p、hsa-miR-122/hsa_miR-198、hsa-miR-122/hsa-miR-769_3p、hsa-miR-103/hsa_miR-193b*、hsa-miR-34a/hsa_miR-124、hsa-miR-192/hsa-miR-139_3p、hsa-miR-34a/hsa-miR-769_3p、hsa-miR-192/hsa_miR-936、hsa-miR-10a/hsa_miR-193b*、hsa-miR-122/hsa_miR-601、hsa-miR-21/hsa-miR-769_3p、hsa-miR-199b-3p/hsa_miR-193b*、hsa-miR-103/hsa_miR-138、hsa-miR-103/hsa-miR-198、 hsa-miR-199b-3p/hsa-miR-139_3p、 hsa-miR-21/hsa-miR-139_3p 和hsa-miR-21/hsa-miR_193b*的任意一種或多種核酸分子的組合。在第二方面，本發(fā)明涉及用于將肝細胞癌與健康個體、結(jié)直腸癌和肺癌的區(qū)別開的診斷試劑盒。所述試劑盒包含多種核酸分子，每種核酸分子編碼微RNA序列，其中所述多種核酸分子的一或多種在目標血漿中和在一或多種健康個體、結(jié)直腸癌和肺癌中差異表達，而其中所述一或多種差異表達的核酸分子一起代表核酸表達特征，所述核酸表達特征指示肝細胞癌的存在。本文限定的核酸表達特征可包括至少十六種核酸分子，優(yōu)選至少六種核酸分子。在優(yōu)選的實施方案中，所述核酸表達特征包括至少一種編碼微RNA序列的核酸分子，其表達在一或多種目標血漿中與一或多種健康個體、結(jié)直腸癌和肺癌相比被上調(diào)；以及包括至少一種編碼微RNA序列的核酸分子,其表達在一或多種目標血衆(zhòng)中與一或多種健康個體、結(jié)直腸癌和肺癌相比被下調(diào)。在優(yōu)選實施方案中，核酸表達特征包含編碼腫瘤相關特征hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-215、hsa_let_7c、hsa-miR-103、hsa-miR-139_3p、hsa_miR-26b;血衆(zhòng)特異性特征 hsa-miR-936、hsa_miR-193b*、hsa-miR-124、hsa_miR-34a、hsa-miR-198、hsa-let-7g、hsa_miR-363 和內(nèi)部穩(wěn)定對照has_miR-1228 和 hsa-miR-1238 的任意一種或多種核酸分子。
特別優(yōu)選地，與健康個體、結(jié)直腸癌和肺癌相比，一或多種目標血漿中編碼hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-215、hsa_let_7c、hsa-miR-103、hsa_miR-26b、hsa-miR_34a、hsa_let_7g、hsa-miR-363的任意一種或多種核酸分子表達被上調(diào)，而編碼hsa-miR-936、hsa_miR-193b*、hsa-miR-124、hsa-miR-139_3p、hsa-miR-198 的任意一種或多種核酸分子表達被下調(diào)；hsa-miR-1238和hsa-miR-1228沒有變化。在更優(yōu)選的實施方案中，核酸表達特征包括編碼腫瘤相關特征hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-215 和血衆(zhòng)特異性特征 hsa-miR-936、hsa_miR-193b* 和hsa-miR-124的任意一種或多種核酸分子。特別優(yōu)選地，與健康個體、結(jié)直腸癌和肺癌相比，一種或多種目標血漿中編碼hsa-miR-122、hsa-miR-192和hsa-miR-215的任意一種或多種核酸分子表達被上調(diào)；而編碼hsa-miR-936、hsa_miR-193b*和hsaniR-124的任意一種或多種核酸分子表達被下調(diào)。在特別優(yōu)選的方案中，核酸表達特征包括編碼hsa-miR-122/hsa-miR-936, hsa-miR-34a/hsa_miR-193b*，hsa-miR-34a/hsa_miR-198，hsa-miR-192/hsa-miR-936,hsa-miR-122/hsa_miR-193b*，hsa-miR-122/hsa-miR-198, hsa-miR-192/hsa_miR-124，hsa-miR-192/hsa_miR-193b*，hsa-miR-122/hsa-miR-124, hsa-miR-192/hsa_miR-198，hsa-miR-363/hsa_miR-936，hsa-miR-215/hsa-miR-193b*，hsa-miR-103/hsa_miR-936，hsa-miR-122/hsa-miR-139-3phsa-let_7c/hsa-miR-936, hsa-miR-215/hsa_miR-198，hsa-miR-192/hsa-miR-139_3p，hsa_miR-27b/hsa-miR-198, hsa-miR-26b/hsa_miR-936，hsa-let-7g/hsa-miR-936, hsa-miR-103/hsa-miR-198, hsa-let-7c/hsa_miR-193b*，hsa-miR-103/hsa_miR-193b*，hsa_miR-26b/hsa-miR-139_3p，hsa-let-7c/hsa_miR-198，hsa-miR-27b/hsa_miR-193b*，hsa_let_7g/hsa_miR-193b*，hsa-miR-363/hsa-miR-139_3p，hsa-let-7g/hsa_miR-198，hsa-miR-363/hsa-miR-198, hsa-miR-26b/hsa_miR-198，hsa-miR-103/hsa-miR-139_3p，hsa_miR-301a/hsa-miR-198, hsa-miR-26b/hsa_miR-193b*，hsa-let-7g/hsa-miR-139_3p，hsa-miR-363/hsa-miR-124, hsa-let-7c/hsa-miR-139_3p，hsa_miR-301a/hsa_miR-193b*，hsa-miR-301a/hsa-miR-139_3p，hsa-miR-26b/hsa_miR-124，hsa-let_7d/hsa-miR-198, hsa-let-7d/hsa-miR-139_3p，hsa-miR-103/hsa-miR-124, hsa-miR-363/hsa_miR-193b* 和 hsa-let-7d/hsa_miR-193b* 的任意一種或多種核酸組合。第三方面，本發(fā)明涉及用于鑒別一或多種展現(xiàn)出肝細胞癌的血漿的方法，所述方法包括(a)在所述一或多種目標 血漿中確定多種核酸分子的表達水平，每種核酸分子編碼微RNA序列；(b)在一或多種健康對照血漿中確定所述多種核酸分子的表達水平；(c)通過對比在步驟(a)和(b)中獲得的各自的表達水平，從所述多種核酸分子中鑒別出在所述目標血漿和對照血漿中差異表達的一或多種核酸分子，其中所述差異表達的一或多種核酸分子一起代表本文所定義的特征(signature),其指示肝細胞癌的存在。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述方法包括(a)在一或多種目標血漿中確定核酸分子組合的表達水平，每種核酸分子均編碼微RNA序列，并用特定的公式計算；(b)在一或多種健康對照血漿中確定所述核酸分子組合的表達水平，并用特定的公式計算；以及 (C)通過比較在(a)和(b)步驟中所獲得的各自的表達水平來鑒別所述組合在所述一或多種目標血漿中的差異，其中一或多種差異表達的組合一切代表特征，其指示肝細胞癌的存在。在更優(yōu)選的實施方案中，本方法進一步用于將肝細胞癌與健康個體、結(jié)直腸癌和肺癌區(qū)別開。第四方面，本發(fā)明涉及用于監(jiān)測肝細胞癌治療的方法，所述方法包括(a)通過使用本文所定義的方法在一或多種目標血漿中鑒別核酸表達特征；和(b)在血液中監(jiān)測所述核酸表達特征所包含的編碼微RNA序列的一或多種核酸分子的表達，所述監(jiān)測以如下的方式進行，即其血漿中的表達在治療前被上調(diào)的核酸分子的表達在治療后被下調(diào)，而其血漿中的表達在治療如被下調(diào)的核Ife分子的表達在治療后被上調(diào)。第五方面，本發(fā)明涉及用于預防或治療肝細胞癌的方法，所述方法包括(a)用本文限定的方法在血漿中鑒別核酸表達特征；和(b)在血液中改變所述核酸表達特征所包含的編碼微RNA序列的一或多種核酸分子的表達，所述改變以如下的方式進行，即其表達在血液中被上調(diào)的核酸分子的表達被下調(diào)，而其表達在血液中被下調(diào)的核酸分子的表達被上調(diào)。第六方面，本發(fā)明涉及用于預防和/或治療血液中的肝細胞癌的藥物組合物，所述組合物包含一或多種核酸分子，每種核酸分子均編碼序列，所述序列與如本文所定義的在來自肝細胞癌患者的血漿中其表達被上調(diào)的核酸分子所編碼的微RNA序列至少部分互補，和/或所述序列對應于如本文所定義的在來自肝細胞癌患者的血漿中其表達被下調(diào)的核酸分子所編碼的微RNA序列。最后，第七方面，本發(fā)明涉及所述藥物組合物在制備用于預防和/或治療肝細胞癌的藥物中的用途。本發(fā)明的其它實施方案從以下詳細描述中將變得明了。附圖
簡述圖I :示出流程圖，其系統(tǒng)地闡明了參照本發(fā)明的方法來確定表達特征的基本方法步驟，用于鑒別一或多種展現(xiàn)出肝細胞癌的目標血漿。圖2 :示出包含在本發(fā)明的特別優(yōu)選的表達特征中的人類miRNA，所述表達特征分別用于鑒別展現(xiàn)肝細胞癌的一或多種目標血漿。圖中還示出與健康對照相比，在肝細胞癌血漿中這些miRNA的表達水平和準確性(即上調(diào)或下調(diào))。在前五個六種不同miRNA的組合來作為診斷性生物標記鑒別肝細胞癌和健康對照中的準確性在87%-94%圖3 :示一例肝細胞癌和健康對照血漿中的兩個腫瘤相關miRNA (hsa-miR-122和has-miR-139-3p)的ROC曲線分析(O :健康對照組；1 :肝細胞癌組)。結(jié)果顯示這些miRNA作為診斷性生物標記的敏感性和特異性。這些經(jīng)過微陣列(生物芯片)分析獲得的數(shù)據(jù)經(jīng)過內(nèi)部穩(wěn)定對照miR-1238規(guī)范化。圖4 :示出在另一方面包含在本發(fā)明的特別優(yōu)選的表達特征中的人類miRNA，參照本發(fā)明的遠期應用鑒別肝細胞癌和健康個體、結(jié)直腸癌和肺癌。還顯示與健康個體、結(jié)直腸癌和肺癌相比肝細胞癌患者中的miRNA的表達水平和準確性(即上調(diào)或下調(diào))。在前五個miRNA的組合來作為診斷性生物標記鑒別肝細胞癌的準確性在85%-88%圖5 :示由五種不同的miRNA組成的四中組合的比較平臺。由微陣列獲得的數(shù)據(jù)變化與由實時定量PCR(quantitative RT-PCR)獲得的數(shù)據(jù)之間數(shù)量上的相關性(R)為O. 76。這些結(jié)果顯不，由Agilent miRNA微陣列(Agilent miRNA microarray)獲得的miRNA特征·是聞度可彳目的。發(fā)明詳沭本發(fā)明基于如下出乎意料的發(fā)現(xiàn)，即肝細胞癌(HCC)能可靠地通過血漿中特定miRNA表達特征以高準確性和靈敏性來鑒定，其中所述表達特征如本文定義典型地包括被上調(diào)和下調(diào)的人類miRNA。更特別地,所述miRNA表達特征一通過分析血衆(zhòng)中整體miRNA表達模式和/或各個miRNA表達水平一使得能檢測早期疾病狀態(tài)下的HCC以及鑒別健康個體、結(jié)直腸癌和肺癌。以下例證的本發(fā)明可以合適地在不存在未在本文中具體揭示的任何一或多個元件、一或多種限制的條件下實施。本發(fā)明將根據(jù)特定的實施方案并參照附圖加以描述，但是本發(fā)明不受其限制，僅受權(quán)利要求書限制。所描述的附圖僅是示意性的，被認為是非限制性的。當術(shù)語“包含”被用于本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中時，其不排除其它元件或步驟。為本發(fā)明目的，術(shù)語“由…組成”被認為是術(shù)語“包含”的優(yōu)選實施方案。如果在下文中組被限定為包含至少一定數(shù)目的實施方案，這也被理解為揭示了優(yōu)選地僅由這些實施方案組成的組。當指代單數(shù)形式名詞使用不定冠詞或定冠詞例如“一個”或“一種”，“所述”時，包括該名詞的復數(shù)形式，除非特別指出。術(shù)語“大約”在本發(fā)明中是指本領域技術(shù)人員理解仍能保證目的特征的技術(shù)效果的準確性區(qū)間。該術(shù)語通常表示偏離指示值的±10%，優(yōu)選±5%。另外，術(shù)語第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)等在說明書和權(quán)利要求書中用于區(qū)分類似的元件，不是描述順序或時間次序必須的。應理解如此應用的術(shù)語在合適情況下可互換，并且本發(fā)明描述的實施方案能以不同于本文所述或例證的其它順序操作。術(shù)語的進一步定義在以下使用術(shù)語時給出。以下術(shù)語或定義僅為了理解本發(fā)明而提供。這些定義不應被認為具有小于本領域技術(shù)人員理解的范圍。本發(fā)明的一個目的是提供用于診斷肝細胞癌、監(jiān)測癌治療、和/或治療癌的新方法，其中通過測定血中的多種核酸分子，每種核酸分子均編碼微RNA (miRNA)序列，其中所述多種核酸分子的一或多種在肝細胞癌的血漿中經(jīng)分析與健康對照相比和/或與健康個體、結(jié)直腸癌和肺癌相比差異表達，其中所述一或多種差異表達的核酸分子一起代表核酸表達特征，該核酸表達特征指示肝細胞癌的存在，其中所述核酸表達特征包括腫瘤相關特征和血漿特異性特征。本文所用術(shù)語“癌癥”(也稱為“癌(carcinoma) ”)通常指任何類型的惡性贅生物，即與未受影響的(健康)野生型對照細胞相比顯示或具有發(fā)生癌特征傾向的靶細胞的任何形態(tài)學和/或生理學改變(基于遺傳重編程(genetic re-programming)) 這種改變的例子可涉及細胞大小和形狀(變大或變小)、細胞增殖(細胞數(shù)增加)、細胞分化(生理學狀態(tài)變化)、凋亡(程序性細胞死亡)或細胞存活。本文所用術(shù)語“肝細胞”涉及肝臟。因此，術(shù)語“肝細胞癌”是指在肝細胞的癌性生長。

最常見類型的肝細胞癌是肝細胞癌(也稱作肝癌，通?？s寫為HCC)。本文所用術(shù)語“肝細胞癌”是指原發(fā)的肝臟惡性腫瘤。大多數(shù)HCC繼發(fā)于病毒性肝炎感染(乙型肝炎或丙型肝炎)或者肝硬化(酒精中毒是導致肝硬化的最常見因素)。在肝炎不是地方病的國家中，大多數(shù)肝臟惡性癌癥不是原發(fā)HCC，而是從機體其它部位例如結(jié)腸的癌癥轉(zhuǎn)移(傳播)。HCC的治療選擇和預后依賴于許多因素，但是特別依賴于腫瘤大小和分期。腫瘤等級(tumor grade)也是重要的。高等級(high-grade)腫瘤預后不佳,而低等級(low-grade)腫瘤也許可被忽視很多年。通常結(jié)果不佳是因為僅10%-20%的肝細胞癌通過手術(shù)可完全切除。如果癌癥不能被完全切除，則該疾病通常在3-6個月內(nèi)是致命的。肝細胞癌與任何其它癌癥一樣，當存在引起細胞高速復制和/或?qū)е录毎苊獾蛲龅姆肿訖C制突變時而發(fā)生。特別地，乙型肝炎和/或丙型肝炎的慢性病毒感染通過重復導致機體自身免疫系統(tǒng)攻擊肝細胞(其中一些被病毒感染，其它的僅是旁觀者)而可助于肝細胞癌的發(fā)生。雖然這種損傷之后修復的恒定循環(huán)可導致修復期間的錯誤，隨之導致癌發(fā)生，但是目前這種假說更適用于丙型肝炎。然而，在乙型肝炎中，病毒基因組整合進感染的細胞中是惡性腫瘤中最一致相關的因素。另外，重復大量飲酒可具有相似作用。因此，在本發(fā)明范圍中，乙型肝炎和/或丙型肝炎感染或者肝硬化不僅被認為是腫瘤病因?qū)W的危險因素，而且還是腫瘤發(fā)展的早期/中間期(即“癌前狀態(tài)”)，其與導致(通常為良性)非侵襲性贅生物的過度增殖性組織生長(隨之可發(fā)展為惡性腫瘤如HCC)相關。這種惡性腫瘤侵襲其它組織并在時間足夠時經(jīng)常發(fā)生轉(zhuǎn)移。惡性細胞通常特征在于進展性(progressive)和不受控制的生長。肉眼觀察HCC看起來是結(jié)節(jié)性或侵潤性腫瘤。結(jié)節(jié)型腫瘤可以是單發(fā)性(具有大團)或多發(fā)性(當發(fā)展為硬化并發(fā)癥時)。腫瘤結(jié)節(jié)為圓形至橢圓形，邊界清楚但無包膜。彌漫型邊界不清，且侵潤門靜脈，很少侵潤肝靜脈。本發(fā)明中采用的哺乳動物目標血漿可以是人或非人類來源的。然而，本發(fā)明典型地用人類血漿進行。本文所用術(shù)語“一或多種血漿”應被理解為不僅包括個體血漿。本文所用術(shù)語“目標血漿”是指被至少認定是顯示或具有發(fā)生肝細胞癌傾向的血漿，而術(shù)語“對照血漿”典型地是指不具有這種癌表型特征的(健康)型。但是在一些應用中，例如當比較顯示不同癌或癌前狀態(tài)的血漿時，具有不太嚴重的疾病特征的細胞典型地被認為是“對照血漿”。本文所用術(shù)語“血漿”是血液中的黃色液體組分，全血中的血細胞在其中可以正常懸浮。其體積約占全血體積的55%。血漿中大部分成分是水(體積占90%)，包含可溶性蛋白、葡萄糖、凝血因子、礦物質(zhì)離子、激素和二氧化碳(血漿是排泄物運輸?shù)闹饕橘|(zhì))。血漿準備是通過將新鮮血液在離心機里離心，直到血細胞沉到管底。然后將血漿傾出。血漿的密度大概在1025kg/m3，or I. 025kg/L。近期的研究發(fā)現(xiàn)miRNA在血漿中是穩(wěn)定的。術(shù)語“血漿樣本”是指從個體或健康對照獲取的待檢的血漿。本文所用術(shù)語“患者”，是指至少應該被認為是患有肝細胞癌的人；本文所用術(shù)語“目標血漿”是指從患者獲取的血漿；術(shù)語“健康個體”或“健康對照”特指不具有任一癌癥表現(xiàn)的健康個體。并且這里“對照血漿”是指從這些健康個體獲取的血漿。但是，在一些應用里，例如，當比較不同的癌癥類型時，這些個人有其他的癌癥類型，這些從這些個體中獲取的血漿也被特指為“對照”。典型地，所用的目標血漿和對照血漿衍生自從待被診斷是否存在肝細胞癌或發(fā)生·肝細胞癌傾向的對象中收集的生物學樣品。另外，為了確證獲得的數(shù)據(jù)，“比較樣品”也可以從患有給定已知疾病狀態(tài)的對象中收集。生物學樣品可包括機體組織和液體，如組織、血清、血細胞、痰和尿。另外，如果需要，細胞可以從獲得的機體組織和液體中純化，然后用作生物學樣品。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的核酸標記的表達水平在對象衍生的生物學樣品中確定在本發(fā)明的體外方法中用于檢測的樣品通常應以臨床可接受的方式收集，優(yōu)選以保護核酸(特別是RNA)或蛋白質(zhì)的方式收集。待分析的樣品典型地是血液。另外，肝組織及其它類型樣品也可以使用。樣品特別在最初加工之后可以合并。但是也可以使用未合并的樣品。本文所用術(shù)語“微RNA”(或“miRNA”)是其在本領域的普通含義(Bartel，D.P. (2004) Cell 23，281-292 ；He, L. and Hannon, G. J. (2004)Nat. Rev. Genet. 5，522-531)。因此，“微RNA”是指衍生自基因組基因座的RNA分子，其從可以形成局部RNA前體miRNA結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄物加工而來。成熟miRNA通常長度為20、21、22、23、24或25個核苷酸，其它數(shù)目的核苷酸也可存在，例如18、19、26或27個核苷酸。miRNA編碼序列具有與側(cè)翼基因組序列配對的潛力，使成熟miRNA放置在非完全配對的RNA雙鏈體之內(nèi)(本文也稱作莖-環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)或pre-miRNA)，所述雙鏈體作為從更長的前體轉(zhuǎn)錄物進行miRNA加工的中間體。這一加工典型地通過分別稱為Drosha和Dicer的兩種特異的內(nèi)切核酸酶的連續(xù)作用而發(fā)生。Drosha從初級轉(zhuǎn)錄物(本文也稱作“pri-miRNA”)產(chǎn)生典型地折疊成發(fā)夾或莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA前體(本文也稱作“pre-miRNA”)。從這個miRNA前體，通過Dicer切割miRNA雙鏈體，其在發(fā)夾或莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的一條臂包含成熟miRNA，在另一條臂包含類似大小的節(jié)段(通常稱為miRNA*)。miRNA然后被導向其靶mRNA以發(fā)揮其功能，而miRNA*被降解。另外，miRNA典型地衍生自與預測的蛋白質(zhì)編碼區(qū)不同的基因組節(jié)段。本文所用術(shù)語“miRNA前體”(或“前體miRNA”或“pre-miRNA” )是指從其加工成熟miRNA的miRNA初級轉(zhuǎn)錄物的部分。典型地,pre-miRNA折疊成穩(wěn)定的發(fā)夾(即雙鏈體)或莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)典型地長度為50-80個核苷酸，優(yōu)選60-70個核苷酸(計數(shù)miRNA殘基，與miRNA配對的殘基，及任何間插節(jié)段，但排除更遠端的序列)。
本文所用術(shù)語“編碼微RNA序列的核酸分子”是指編碼微RNA (miRNA)的任何核酸分子。因此，該術(shù)語不僅指成熟miRNA,也指相應的如上所述的前體miRNA及初級miRNA轉(zhuǎn)錄物。另外，本發(fā)明不限于RNA分子，也包括相應的編碼微RNA的DNA分子，例如通過逆轉(zhuǎn)錄miRNA序列產(chǎn)生的DNA分子。編碼本發(fā)明的微RNA序列的核酸分子典型地編碼單個miRNA序列(即個體miRNA)。但是，也可能這種核酸分子編碼兩個或多個miRNA序列(即兩個或多個miRNA)，例如一個轉(zhuǎn)錄單位包含在常用調(diào)節(jié)序列如啟動子或轉(zhuǎn)錄終止子控制下的兩個或多個miRNA序列。本文所用術(shù)語“編碼微RNA序列的核酸分子”也被理解為包括“有義核酸分子”(即核酸序列(5' —3')匹配或相應于所編碼的miRNA (5, —3')序列的分子)及“反義核酸分子”(即核酸序列互補于所編碼的miRNA (5, —3')序列或者換句話說匹配所編碼的miRNA序列的反向互補序列(3' —5,)的分子)。本文所用術(shù)語“互補”是指“反義”核酸分子序列與相應的“有義”核酸分子序列(具有互補于反義序列的序列)形成堿基對、優(yōu)選Watson-Crick堿基對的能力。 在本發(fā)明范圍內(nèi)，兩個核酸分子(即“有義”和“反義”分子)可以完全互補，即它們不含有任何堿基錯配和/或額外的或缺失的核苷酸。或者，兩個分子包含一或多個堿基錯配或者在它們的核苷酸總數(shù)上不同(由于添加或缺失導致)。優(yōu)選地，“互補”核酸分子包含與包含在相應的“有義”核酸分子中的序列顯示完全互補性的至少10個連續(xù)核苷酸。因此，包含在本發(fā)明的診斷試劑盒中的編碼miRNA序列的多種核酸分子可包括一或多種“有義核酸分子”和/或一或多種“反義核酸分子”。有時，診斷試劑盒包括一或多種“有義核酸分子”(即miRNA序列本身)，所述分子被認為組成了差異表達的miRNA(即分子標記)的全體或至少亞集合，所述差異表達的miRNA是存在或發(fā)生特定病癥傾向的指征，本文是肝細胞癌。另一方面，當診斷試劑盒包括一或多種“反義核酸分子”(即與miRNA序列互補的序列)時，所述分子可包含適合用于檢測和/或定量給定樣品中的一或多種特定(互補)miRNA序列的探針分子(用于進行雜交測定)和/或寡核苷酸引物(例如用于逆轉(zhuǎn)錄或PCR應用)。在本發(fā)明中定義的多種核酸分子可以包含至少2種、至少10種、至少50種、至少100種、至少200種、至少500種、至少1000種、至少10000種或至少100000種核酸分子，每種分子編碼miRNA序列。本文所用術(shù)語“差異表達”是指特定miRNA在目標血漿中的表達水平相比于健康對照血漿是改變的，其可以是上調(diào)(即在目標血漿中miRNA濃度增加)或下調(diào)(即在目標血漿中miRNA濃度降低或消失)。換句話說，核酸分子在目標血漿中被激活至比在對照血漿中更高或更低的水平。本發(fā)明范圍內(nèi)，核酸分子被認為是差異表達的，如果該核酸分子在靶細胞和對照細胞中的相應表達水平典型地相差至少5%或至少10%，優(yōu)選地至少20%或至少25%，最優(yōu)選地至少30%或至少50%。因此，后者的值相應于給定核酸分子在靶細胞中的表達水平相比于野生型對照細胞分別上調(diào)至少I. 3倍或至少I. 5倍，或者反之在靶細胞中的表達水平下調(diào)至少O. 7倍或至少O. 5倍。本文所用術(shù)語“表達水平”是指特定的miRNA序列從其基因組基因座被轉(zhuǎn)錄的程度，即miRNA在一或多種被分析血漿中的濃度。
如上所述，術(shù)語“對照血漿”典型地是指不具有HCC表型特征的(健康)血漿。但是，在一些應用中，例如當比較顯示不同的癌或癌前狀態(tài)的血漿時，具有較不嚴重疾病特征的血漿典型地被認為是“對照血漿”。表達水平的確定典型地遵循本領域熟知的已建立的標準程序(Sambrook，J.et al. (1989)Molecular Cloning:A Laborary Manual. 2nd Ed. , Cold Spring HarborLibrary Press, Cold Spring Harbor, NY ；AusubeI, F. M. et al. (2001)Current Pro-colsin Molecular Biology. Wiley & Sons, Hoboken, NJ)。確定可以在 RNA 水平進行，例如使用miRNA特異性探針進行Northern印跡分析,或者在逆轉(zhuǎn)錄(及克隆)RNA群后例如通過定量PCR或?qū)崟rPCR技術(shù)在DNA水平進行。本文所用術(shù)語“確定”包括分析編碼上述微RNA序列的任何核酸分子。但是，由于pri-miRNA及re_mRNA半衰期短,典型地僅測量成熟miRNA的濃度。在具體的實施方案中，在給定樣品的若干獨立測量(例如兩個、三個、五個或十個測量)和/或在一群目標血漿或?qū)φ昭獫{內(nèi)的若干測量中獲得的表達水平的標準值被用于分析。標準值可以用本領域已知的任何方法獲得。例如，平均值±2SD(標準差)或平均值 ±3SD的范圍可被用作標準值。所獲得的疾病和對照血漿的表達水平之間的差異可以歸一化至進一步的對照核酸例如管家基因的表達水平，管家基因的表達水平已知不根據(jù)細胞的疾病狀態(tài)而不同。舉例的管家基因包括β_肌動蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和核糖體蛋白Pl等。在優(yōu)選的實施方案中，對照核酸是已知在樣品中的不同非癌和癌(前)狀態(tài)中穩(wěn)定表達的另一種miRNA。但是，代替在任何實驗中確定一或多種對照血漿的表達水平，也可以基于實驗證據(jù)和/或現(xiàn)有技術(shù)數(shù)據(jù)定義針對特定疾病表型(即疾病狀態(tài))的一或多個截斷值。在這種情況中，一或多種目標血衆(zhòng)的相應表達水平可以用用于歸一化的穩(wěn)定表達的對照miRNA確定。如果計算的“歸一化”的表達水平高于相應定義的截斷值，則這一發(fā)現(xiàn)是基因表達上調(diào)的指征。反之，如果計算的“歸一化”的表達水平低于相應定義的截斷值，則這一發(fā)現(xiàn)是基因表達下調(diào)的指征。在本發(fā)明中，術(shù)語“鑒定肝細胞癌和/或鑒別其他癌癥類型”也包括預測和可能性分析(“診斷”意義上)。本文公開的組合物和方法意在臨床應用，以決定治療形式，包括治療性干預，診斷標準如疾病階段，和疾病監(jiān)測和疾病監(jiān)視。根據(jù)本發(fā)明，可提供用于檢查對象狀態(tài)的中間結(jié)果。這種中間結(jié)果可與額外信息組合以幫助醫(yī)生、護士或其它從業(yè)人員診斷出該對象患有該疾病?；蛘?，本發(fā)明可用于通過血樣標本檢測癌癥傾向的改變，并提供有用信息給醫(yī)生以進行診斷。另外，本發(fā)明還用于區(qū)別不同類型的肝細胞腫瘤及其他癌癥類型包括結(jié)直腸癌和肺癌。在本發(fā)明中，所鑒定的一或多種差異表達的核酸分子一起代表一種核酸表達特征，該核酸表達特征是在目標血漿中存在肝細胞癌的指征。本文所用術(shù)語“表達特征”是指一組核酸分子(例如miRNA),其中各個核酸分子的表達水平在(癌性)目標血衆(zhòng)和(非癌性)對照血漿之間不同。本文中，核酸表達特征也指一組標記并代表最低數(shù)目的(不同)核酸分子，每種核酸分子編碼能鑒定目標血漿的表型狀態(tài)的miRNA序列。在第一方面，本發(fā)明涉及用于鑒別一或多種展現(xiàn)出肝細胞癌的目標血漿的血液中分子標記物的診斷試劑盒，所述試劑盒包含多種核酸分子，每種核酸分子編碼微RNA序列，其中所述多種核酸分子的一或多種在目標血漿中和在一或多種對照血漿中差異表達，其中所述一或多種差異表達的核酸分子源于腫瘤相關或血漿特異性特征，其中所述一或多種差異表達的核酸分子一起代表核酸表達特征，所述核酸表達特征指示肝細胞癌的存在。本文限定的核酸表達特征可包括至少三十二種核酸分子，優(yōu)選至少十二種核酸分子，特別優(yōu)選至少六種核酸分子。

在優(yōu)選的實施方案中，所述核酸表達特征包括至少一種編碼微RNA序列的核酸分子，其表達在一或多種目標血漿中與一或多種對照血漿相比被上調(diào)；以及包括至少一種編碼微RNA序列的核酸分子，其表達與一或多種對照相比被下調(diào)本文的術(shù)語“血漿特異性”(plasma-specific)是指在肝癌患者和正常對照的血漿有差異性表達的特征，但在肝細胞癌組織細胞和非癌組織細胞之間沒有發(fā)現(xiàn)顯著的差異表達。典型地，包含在核酸表達特征中的核酸分子是人類序列(以后稱為“has”(智人(Homo sapiens)))。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，核酸表達特征包括編碼腫瘤相關的hsa-miR-122(SEQ ID NO:I)，hsa-miR-199b_3p (SEQ ID NO:2), hsa-miR-192(SEQ IDN0:3), hsa-miR-21(SEQ ID NO:4)，hsa-miR-139_3p (SEQ ID NO:5)，hsa-miR-lOa (SEQ IDNO:6), hsa-miR-103(SEQ ID NO:7)，hsa_miR-181d(SEQ ID NO:8)，hsa-miR-125b_2*(SEQID N0:9),hsa-miR-125a-3p (SEQ ID NO: 10)的任意一種或多種核酸分子的表達；編碼血漿特異性的 hsa-miR-34a(SEQ ID NO: 11)，hsa-miR-136 (SEQ ID NO: 12)，hsa-miR-151_5p(SEQ ID NO: 13),hsa-miR-193b*(SEQ ID NO: 14),hsa-miR-124(SEQ IDNO:15)，hsa-miR-936(SEQ ID NO:16)，hsa-miR-198(SEQ ID NO:17)，hsa-miR-149* (SEQID N0:18)，hsa-miR-138(SEQ ID NO:19)，hsa-miR-601(SEQ ID NO:20)，hsa-miR-769_3p(SEQ ID NO:21)，hsa-miR-513c (SEQ ID NO :22)，hsa-miR-525_5p (SEQID NO :23),hsa-miR-654-5p (SEQ ID NO :24)，hsa_miR-5I 8c*(SEQ IDNO:25)，hsa-miR-500(SEQ ID NO:26)，hsa_miR-181c*(SEQ ID NO:27)，hsa-miR-1226*(SEQID NO:28)，hsa-miR-202(SEQ ID NO:29)，hsa-miR-629*(SEQ ID NO:30)任意一種或多種核酸分子的表達；編碼穩(wěn)定內(nèi)部穩(wěn)定對照的hsa-miR-1238 (SEQ ID NO:36)和hsa-miR-1228 (SEQ ID NO :37)的核酸分子。上述miRNA的核酸序列列于表I。表權(quán)利要求
1.用于鑒別一或多種展現(xiàn)出肝細胞癌的目標血漿的血液中分子標記物的診斷試劑盒，所述試劑盒包含多種核酸分子，每種核酸分子編碼微RNA序列， 其中所述多種核酸分子的一或多種在目標血漿中和在一或多種對照血漿中差異表達， 其中所述一或多種差異表達的核酸分子一起代表核酸表達特征，所述核酸表達特征指示肝細胞癌的存在。
2.權(quán)利要求I的試劑盒，其中所述核酸表達特征可包含至少三十二種核酸分子，優(yōu)選至少六種核酸分子。
3.權(quán)利要求I或2的試劑盒，其中所述核酸表達特征包含至少一種編碼微RNA序列的核酸分子，其表達在一或多種目標血漿中與在一或多種對照血漿中相比被上調(diào)；及包含至少一種編碼微RNA序列的核酸分子，其表達在一或多種目標血衆(zhòng)中與在一或多種對照血衆(zhòng)中相比被下調(diào)。
4.權(quán)利要求1-3任一項的試劑盒，其中所述核酸表達特征包含編碼腫瘤相關特征 hsa-miR-122、hsa-miR-199b_3p、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-139_3p、hsa-miR-lOa、hsa-miR-103、hsa_miR-181d、hsa-miR-125b_2*、a-miR-125a_3p ;血衆(zhòng)特異性特征 hsa_miR-34a、hsa-miR-136、hsa-miR-151_5p、hsa_miR-193b*、hsa-miR-124、hsa-miR-936、hsa-miR-198、hsa-miR-149*、hsa-miR-138、hsa-miR-601、hsa-miR-769_3p、hsa_miR-513c、 hsa-miR-525_5p、 hsa-miR-654_5p、 hsa-miR-SISc*、 hsa_miR-500、hsa_miR-181c*、hsa-miR-1226*、hsa-miR-202、hsa-miR-629* 和內(nèi)部穩(wěn)定的對照hsa-miR-1238和hsaniR-1228的任意一種或多種核酸分子。
5.權(quán)利要求4的試劑盒，其中與一或多種健康對照相比，在所述一或多種目標血衆(zhòng)中編碼 hsa-miR-122、hsa-miR-199b_3p、hsa-miR-192、hsa-miR-21 Λ hsa-miR-lOa、hsa-miR-103、hsa_miR-34a、hsa-miR-136、hsa-miR-151_5p 的任意一種或多種核酸分子的表達被上調(diào)；編碼 hsa-miR-139_3p、hsa_miR-193b*、hsa-miR-124、hsa_miR-181d、hsa-miR-125b_2*、hsa-miR-125a_3p、hsa-miR-936Λ hsa-miR-198、hsa-miR-149*、hsa-miR-138、 hsa-miR-601、 hsa-miR-769_3p、 hsa_miR-513c、 hsa-miR-525_5p、hsa-miR-654_5p、 hsa-miR-518c*、 hsa-miR-500、 hsa_miR-181c*、 hsa-miR-1226*、hsaniR-202、hsa-miR-629^的任意一種或多種核酸分子表達被下調(diào)；hsaniR-1238和hsa-miR-1228 沒有變化。
6.利要求1-3任一項的試劑盒，其中所述核酸表達特征包括編碼hsa-miR-34a/hsa_miR-193b*、hsa-miR-21/hsa-miR-936Λ hsa-miR-192/hsa_miR-124、hsa-miR-122/hsa_miR-193b*、hsa-miR-34a/hsa_miR-138、hsa-miR-34a/hsa_miR-198、hsa-miR-122/hsa-miR-124、hsa-miR-103/hsa-miR-139_3p、hsa-miR-192/hsa_miR-193b*、hsa-miR-122/hsa-miR-138、hsaiiR-34a/hsa-miR-139_3p、hsa-miR-122/hsa-miR-198Λ hsa-miR-122/hsa-miR-769_3p、hsa-miR-103/hsa_miR-193b*、hsa-miR-34a/hsa_miR-124、hsa-miR-192/hsa-miR-139_3p、hsa-miR-34a/hsa-miR-769-3p、hsa-miR-192/hsa_miR-936、hsa-miR-10a/hsa_miR-193b*、hsa-miR-122/hsa_miR-601、hsa-miR-21/hsa-miR-769_3p、hsa-miR-199b-3p/hsa-miR-193b^λ hsa-miR-103/hsa_miR-138、hsa-miR-103/hsa-miR-198、hsa-miR-199b-3p/hsa-miR-139_3p、hsa-miR-21/hsa-miR-139_3p 和hsa-miR-21/hsa_miR-193b*的任意一種或多種核酸組合。
7.權(quán)利要求1-6任一項的試劑盒，進一步用于將肝細胞癌與健康個體、結(jié)直腸癌和肺癌區(qū)別開。
8.權(quán)利要求7的試劑盒，其中所述核酸表達特征可包括至少16種核酸分子，優(yōu)選至少6種核酸分子。
9.權(quán)利要求1-8任一項的試劑盒，其中所述核酸表達特征包含任意一種或多種編碼腫瘤相關特征 hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-215、hsa_let_7c、hsa-miR-103、hsa-miR-139_3p、hsa_miR-26b;血衆(zhòng)特異性特征 hsa-miR-936、hsa_miR-193b*、hsa-miR-124、hsa_miR-34a、hsa-miR-198、hsa_let_7g、hsa-miR-363 和內(nèi)部穩(wěn)定對照has-miR-1228 和 hsa-miR-1238 的核酸分子。
10.權(quán)利要求9的試劑盒，其中與一種或多種健康個體、結(jié)直腸癌和肺癌相比，在所述一或多種目標血衆(zhòng)中，編碼 hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-215、hsa_let_7c、hsa-miR-103、hsa_miR-26b、hsa_miR-34a、hsa_let_7g、hsa-miR-363 的任意一種或多種核酸分子表達被上調(diào)；而編碼 hsa-miR-936、hsa-miR-igSb*、hsa_miR124、hsa-miR-139_3p、hsa-miR-198的任意一種或多種核酸分子表達被下調(diào)；hsaniR-1238和hsaniR-1228沒有變化。
11.權(quán)利要求7-10任一項的試劑盒，其中所述核酸表達特征包括編碼hsa-miR-122/hsa-miR-936、hsa-miR-34a/hsa_miR-193b*、hsa-miR-34a/hsa_miR-198、hsa-miR-192/hsa-miR-936、hsa-miR-122/hsa_miR-193b*、hsa-miR-122/hsa_miR-198、hsa-miR-192/hsa-miR-124、hsa-miR-192/hsa_miR-193b*、hsa-miR-l22/hsa-miR-124Λ hsa-miR-192/hsa-miR-198、hsa-miR-363/hsa_miR-936、hsa-miR-215/hsa_miR-193b*、hsa-miR-103/hsa-miR-936、hsa-miR-122/hsa-miR-139_3p、hsa-let-7c/hsa_miR-936、hsa-miR-215/hsa-miR-198、hsa-miR-192/hsa-miR-139_3p、hsa-miR-27b/hsa_miR-198、hsa_miR-26b/hsa-miR-936、hsa-let-7g/hsa-miR-936Λ hsa-miR-103/hsa_miR-198、hsa_let_7c/hsa-miR-193b*、 hsa-miR-103/hsa_miR-193b*、 hsa-miR-26b/hsa-miR-139_3p、hsa-let-7c/hsa_miR-198、hsa-miR-27b/hsa_miR-193b*、hsa-let-7g/hsa_miR-193b*、hsa-miR-363/hsa-miR-139_3p、hsa-let-7g/hsa_miR-198、hsa-miR-363/hsa_miR-198、hsa-miR-26b/hsa_miR-198、hsa-miR-103/hsa-miR-139_3p、hsa-miR-30la/hsa-miR-198、hsa-miR-26b/hsa_miR-193b*、hsa-let-7g/hsa-miR-139_3p、hsa-miR-363/hsa_miR-124、hsa-let-7c/hsa-miR-139_3p、 hsa-miR-301a/hsa_miR-193b*、 hsa-miR-30Ia/hsa-miR-139_3p、hsa-miR-26b/hsa_miR-124、hsa-let-7d/hsa_miR-198、hsa-let_7d/hsa-miR-139_3p、 hsa-miR-103/hsa_miR-124、 hsa-miR-363/hsa-miR-l93b^ 和hsa-let-7d/hsa_miR-193b*的任意一種或多種核酸組合。
12.用于鑒別展現(xiàn)出肝細胞癌的一或多種目標血漿的方法，所述方法包括 (a)在所述一或多種目標血漿中確定多種核酸分子的表達水平，每種核酸分子編碼微RNA序列； (b)在一或多種健康對照血漿中確定所述多種核酸分子的表達水平；及 (c)通過對比在步驟(a)和(b)中獲得的各自的表達水平，從所述多種核酸分子中鑒別出在所述目標血漿和對照血漿中差異表達的一或多種核酸分子，其中所述差異表達的一或多種核酸分子一起代表如權(quán)利要求ι-ii任一項所定義的核酸表達特征，所述核酸表達特征指示肝細胞癌的存在。
13.權(quán)利要求12的方法，其進一步用于將肝細胞癌與健康個體、結(jié)直腸癌和肺癌區(qū)別開。
14.用于監(jiān)測肝細胞癌治療的方法，所述方法包括 (a)通過使用本文所定義的方法在一或多種目標血漿中鑒別核酸表達特征'及 (b)在血液中監(jiān)測所述核酸表達特征所包含的編碼微RNA序列的一或多種核酸分子的表達，所述監(jiān)測以如下的方式進行，即其血漿中的表達在治療前被上調(diào)的核酸分子的表達在治療后被下調(diào)，而其血漿中的表達在治療前被下調(diào)的核酸分子的表達在治療后被上調(diào)。
15.用于預防或治療肝細胞癌的方法，所述方法包括 (a)通過使用權(quán)利要求12或13的方法在血液中鑒別核酸表達特征'及 (b)在血液中改變所述核酸表達特征所包含的編碼微RNA序列的一或多種核酸分子的表達，所述改變以如下的方式進行，即其表達在血液中被上調(diào)的核酸分子的表達被下調(diào)，而其表達在血液中被下調(diào)的核酸分子的表達被上調(diào)。
16.用于預防和/或治療血液中肝細胞癌的藥物組合物，所述組合物包含一或多種核酸分子，每種核酸分子均編碼序列， 所述序列與如本文所定義的在來自肝細胞癌患者的血漿中其表達被上調(diào)的核酸分子所編碼的微RNA序列至少部分互補，和/或所述序列對應于如權(quán)利要求1-13任一項所定義的在來自肝細胞癌患者的血漿中其表達被下調(diào)的核酸分子所編碼的微RNA序列。
17.權(quán)利要求16的藥物組合物在制備用于預防和/或治療肝細胞癌的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了微RNA生物標記和包含多種編碼所述微RNA生物標記的核酸分子的診斷試劑盒，用于鑒別展現(xiàn)出肝細胞癌的一或多種目標血漿。本發(fā)明還提供了用于診斷和治療肝細胞癌的方法，以及用于預防和治療肝細胞癌的藥物組合物。
文檔編號A61P35/00GK102892898SQ201080064802
公開日2013年1月23日 申請日期2010年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月24日
發(fā)明者吳瑩, 朱虹光, 高雪, 盧韶華, 李兆勇, 任一萍, 李健 申請人:復旦大學