專利名稱：螺旋藻多糖免疫佐劑及含有該佐劑的流感疫苗的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種螺旋藻多糖免疫佐劑，還涉及含有螺旋藻多糖免疫佐劑的流 感疫苗，屬于生物技術(shù)領域。技術(shù)背景
螺旋藻(Spirulina)是一種營養(yǎng)豐富，分布廣泛，且極具開發(fā)潛力的水生生物資 源，1974年聯(lián)合國糧農(nóng)組織會議確定其為“最佳蛋白源之一”和“全球人類最理想的食品”。 研究表明，螺旋藻多糖(PSP)具有促進細胞生長、提高機體免疫力、抗腫瘤、抗氧化和抗衰老 等功能，是螺旋藻體中的重要天然生物活性物質(zhì)之一，也是目前國內(nèi)外海洋藥物研究開發(fā) 白勺^^ ； ^^ ο
螺旋藻多糖是采用現(xiàn)代化生物化學技術(shù)與工藝，從螺旋藻中提取的，含多種且生 物活性更高的純天然生物制品，它是九十年代中期開發(fā)出的。螺旋藻多糖被廣泛用于化妝、 保健、醫(yī)藥等行業(yè)。
研究表明螺旋藻多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用，從云南螺旋藻中分離純化出螺旋藻多 糖。腹腔內(nèi)注射能顯著增加小鼠脾重，促進小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能及小鼠血清溶血 素的形成，對環(huán)磷酰胺所致小鼠免疫器官萎縮，白細胞減少，腹腔巨噬細胞吞噬功能降低及 小鼠血清溶血素的形成減少等有明顯對抗作用。同時具有明顯提高荷瘤小鼠脾指數(shù)和胸腺 指數(shù)的作用，以MTT法檢測的荷瘤小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化和對NK細胞活性的影響，也顯示具 有提高淋巴細胞轉(zhuǎn)化率和促進NK細胞殺傷靶細胞的作用。
另外，螺旋藻多糖還具有促進細胞生長、抗腫瘤、抗輻射、抗氧化、抗衰老、對核酸 內(nèi)切酶活性和DNA修復合成有增強作用等功能的重要天然生物活性物質(zhì)。
佐劑是一類能增強抗原的免疫原性、提高疫苗效果的物質(zhì)，正是佐劑技術(shù)，使國 產(chǎn)疫苗在價格上具有明顯優(yōu)勢。在流感疫苗中使用佐劑不僅可以增強免疫原性，還可以降 低抗原用量。特別在應對大流行流感時，使用佐劑降低抗原用量進而擴大接種人群數(shù)量的 特性顯得尤為重要。在大流行流感疫苗研究中應用到的佐劑主要有鋁佐劑(氧化鋁、氫 氧化鋁、磷酸鋁)、MF59 (是一種水包油的乳劑，包含1%鯊烯，0. 5%Tween80和0. 5%三油 酸聚山梨脂的水包油乳液)、LTK63和新型佐劑等。
目前上市流感疫苗使用的佐劑主要是鋁佐劑和MF59。但事實上鋁佐劑對蛋白亞單 位疫苗誘導抗體產(chǎn)生的能力較弱，不能有效地誘導免疫應答，在一些情況下還可產(chǎn)生與 超敏反應有關(guān)的IgE ;MF59作為佐劑使用在增免疫原性的同時，也增強了反應原性，如接 種部位紅、腫、熱、痛等癥狀增加。此外，由于安全性、副作用等問題，LTK63和新型佐劑等其 他物質(zhì)，包括殼聚糖、ISCOMs等作為流感疫苗佐劑也還只限于研究階段。因此，隨著各種新 發(fā)流感在世界的爆發(fā)和對人感染性的增強，加快新型流感疫苗的研究，尋求更高安全性 和免疫原性的佐劑仍然是流感疫苗發(fā)展的一個需要。
佐劑發(fā)揮作用是由于能增強抗原的免疫原性、提高疫苗效果，因此佐劑一般可在 多種疫苗中進行使用，如目前的鋁佐劑。所以佐劑的研究不僅對流感，而且對其它感染性疾 病的防治也有很高的價值。
流行性感冒(簡稱流感)是指由流感病毒引起，具有高度傳染性的急性呼吸道傳染 病。流感發(fā)病快，傳染性強，發(fā)病率高，主要通過空氣飛沫傳播。流感的流行沒有明顯的季 節(jié)性，只是冬末春初發(fā)病率稍高一點，而且?guī)缀趺磕甓紩l(fā)生，或者局部爆發(fā)，或者大規(guī) 模流行，甚至造成世界規(guī)模的大流行，嚴重危害了人類的健康和生命，給社會造成了沉重的 負擔。到目前為止，接種流感疫苗被認為是預防流感發(fā)生與傳播的最佳方法。由于流感病 毒變異很快，通常每年的流行類型都有所不同，生產(chǎn)企業(yè)一般都在世界衛(wèi)生組織(WHO)指導 下選擇流感病毒毒株進行疫苗生產(chǎn)，每年接種最新的流感疫苗才能達到預防的效果。一旦 流感病毒變異造成大規(guī)模流行或者是世界性流行，疫苗需求量會大量增加，但由于目前流 感疫苗生產(chǎn)工藝的限制，短時間內(nèi)不可能提供足量疫苗，所以，應用免疫佐劑，減少疫苗用 量并提高其效果就顯得非常重要。
經(jīng)系統(tǒng)查閱文獻和專利，目前未發(fā)現(xiàn)關(guān)于螺旋藻多糖具有免疫佐劑作用的報道。 發(fā)明內(nèi)容
為解決目前免疫佐劑單一，副作用難以避免，疫苗生產(chǎn)供應量有限，難以應付感染 性疾病暴發(fā)時疫苗需求量大，疫苗起效時間慢等問題，本發(fā)明提供一種能提高疫苗免疫效 果，同時帶來巨大的經(jīng)濟效益和社會效益的螺旋藻多糖免疫佐劑。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種含有螺旋藻多糖免疫佐劑的流感疫苗。
本發(fā)明提供的螺旋藻多糖免疫佐劑是由下列質(zhì)量比的組分組成的 螺旋藻多糖0. 001 100%載體0 99. 999%O
所述載體由下列質(zhì)量比的組分組成 乳化劑20 70% 助乳化劑 20 70% 油相 1 50% 水相 1 30%。
所述乳化劑為常規(guī)的TweenSO或聚氧乙烯蓖麻油中的一種，或者為質(zhì)量混合比為 3 2 2 3的常規(guī)TweenSO與SpanSO的混合物，或者為質(zhì)量混合比為1 1的常規(guī)聚 氧乙烯蓖麻油與SpanSO的混合物。
所述助乳化劑為常規(guī)的1，2_丙二醇或聚乙二醇400中的一種。
所述油相為常規(guī)的肉豆蔻酸異丙酯或油酸乙酯或注射用大豆油中的一種。
所述水相為注射用水或者含有藥物或疫苗成分的注射用水溶液。
本發(fā)明提供的螺旋藻多糖免疫佐劑，優(yōu)選下列質(zhì)量比 螺旋藻多糖0.1 100%載體0 99. 9%O
本發(fā)明提供的一種含有螺旋藻多糖免疫佐劑的流感疫苗的組成是螺旋藻多糖免 疫佐劑與流感疫苗血凝素的質(zhì)量比為75 150000，其中，所述螺旋藻多糖免疫佐劑由下列質(zhì)量比的組分組成螺旋藻多糖0. 001 100%載體0 99. 999%O
所述螺旋藻多糖為市售產(chǎn)品。
本發(fā)明提供的螺旋藻多糖免疫佐劑與傳統(tǒng)氫氧化鋁佐劑相比，具有以下優(yōu)點 1)螺旋藻多糖制備方法簡單、經(jīng)濟、環(huán)保。
2)螺旋藻多糖是一種天然物質(zhì)，常作為保健品使用。螺旋藻多糖作為免疫佐劑的 應用，以流行性感冒(簡稱流感)病毒疫苗為例得到了應用性的實驗結(jié)果，在流感疫苗中作 為佐劑使用，其安全性高、副作用小。例如用含螺旋藻多糖的流感疫苗肌肉注射小鼠，4小時 內(nèi)觀察小鼠活動性無明顯減弱，未見全身不良反應。而用含氫氧化鋁佐劑流感疫苗注射，可 觀察到小鼠活動性明顯減弱，注射局部腫脹明顯。
3)用螺旋藻多糖為佐劑的流感疫苗，制備方法簡便，疫苗質(zhì)量容易控制；而以氫氧 化鋁為佐劑制備流感疫苗，制備和存儲過程中，影響因素較多，對于疫苗的質(zhì)量較難控制。
4)用螺旋藻多糖作為流感疫苗佐劑，可更好的提高疫苗免疫原性，大大降低疫苗 抗原用量。例如通過以螺旋藻多糖為佐劑的流感疫苗和以氫氧化鋁為佐劑的流感疫苗免疫 小鼠發(fā)現(xiàn)，以螺旋藻多糖為佐劑使用的疫苗抗原用量即使是以氫氧化鋁為佐劑的疫苗抗原 用量的一半或者更少，同樣可以達到理想的免疫保護效果。


圖1為不同接種組在56天內(nèi)的血凝抑制抗體效價變化； 圖2為不同接種組在加免后2周的血凝抑制抗體效價；圖3為不同接種組在接種后7天內(nèi)的體重增長情況； 圖4為不同接種組在加免后2周的血凝抑制抗體效價。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明，但并不以此來限定本發(fā)明。
本發(fā)明實施例中未特別指明的組分均為市購產(chǎn)品，所用設備或儀器均是常規(guī)的。 實施例1納米乳劑載體的制備1)按下列質(zhì)量比備料3g注射用水，3g注射用大豆油，2g聚乙二醇400，1.2g Tween80,0. 8g Span80 ；2)向混合攪拌瓶內(nèi)加入1.2g Tween80,0. 8g Span80，及2g聚乙二醇400，在轉(zhuǎn)速為200 轉(zhuǎn)/分鐘，室溫條件下，持續(xù)攪拌1 10分鐘，混勻后加入3g注射用大豆油，混合均勻得混 合物；3)在上述2)的混合物中滴入3g注射用水，同時在轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，室溫下，攪拌 混合物至液體為透明，得到納米乳劑；4)對3)制得的納米乳劑進行如下檢測1.經(jīng)馬爾文粒徑檢測儀檢測，粒徑范圍為 28. 985 56. 493nm,合格；2.經(jīng)3000rpm, 15min離心分離，納米乳劑體系不分層，合格； 3.經(jīng)4°C放置50天，納米乳劑體系無變化，合格。
實施例21)稱取市購的螺旋藻多糖10mg，溶于ΙΟΟΟμΙ無水乙醇中，制成螺旋藻多糖溶液，備用；2)將上述1)制備的螺旋藻多糖溶液與1075μ1市購的Η3Ν2流感病毒裂解疫苗(血凝 素含量為43. 67Pg/ml)混合，然后再向其混合物中加入925μ1生理鹽水，得總體積為3000μ1 的含螺旋藻多糖的流感疫苗，備用；3)稱取3g注射用大豆油，2g聚乙二醇400，1.2g Tween80,0. 8g Span80于攪拌瓶 中，轉(zhuǎn)速維持在200轉(zhuǎn)/分鐘，室溫攪拌1 10分鐘，至充分混勻，得混合溶液；4)在上述3)的混合溶液中緩慢滴入2)的含螺旋藻多糖的流感疫苗3000μ1，同時維持 轉(zhuǎn)速在200轉(zhuǎn)/分鐘，攪拌至呈淡紅棕色的透明溶液，得到以螺旋藻多糖、納米乳劑為佐劑 的流感病毒疫苗。其中螺旋藻多糖的質(zhì)量比為0. 143%，載體質(zhì)量比為99. 857% ；螺旋藻多 糖納米佐劑與流感疫苗血凝素的質(zhì)量比為149467。
用實施例2制備的螺旋藻多糖納米乳劑流感病毒疫苗肌肉注射標準體重昆明種 雌性小鼠，每只小鼠200μ1。此200μ1注射疫苗中流感疫苗血凝素含量為0. 94gg，螺旋藻多 糖0. 2mgo同時設立注射等量的生理鹽水空白對照組、等血凝素含量的Al (OH)3佐劑流感疫 苗的佐劑對照組、等血凝素含量的單獨流感疫苗對照組。間隔3周，免疫2次。于首次免疫 后第一周開始，每隔7天采尾血，分離血清測定血凝抑制抗體效價。所測結(jié)果顯示藻多糖納 米乳劑型佐劑疫苗組血凝抑制抗體效價水平整體明顯高于鋁佐劑組及單獨疫苗組，具體結(jié) 果見附圖1。
實施例31)稱取市購的螺旋藻多糖7.6mg，溶于400μ1無水乙醇中，得螺旋藻多糖溶液，備用；2)將1)的螺旋藻多糖溶液與3.4ml市購的H3N2流感病毒裂解疫苗(血凝素含量 43. 67μδ/πι1)混合，得3. 8ml含螺旋藻多糖的流感疫苗；3)取1.Ig聚氧乙烯蓖麻油，1.6g Span80, 6g 1，2-丙二醇，3g肉豆蔻酸異丙酯放于 攪拌瓶中，轉(zhuǎn)速維持在200轉(zhuǎn)/分鐘，室溫攪拌10分鐘，至充分混勻，得混合溶液；4)在上述3)的混合溶液中緩慢滴入2)制備的含螺旋藻多糖的流感疫苗3.8ml,同時 維持轉(zhuǎn)速在200轉(zhuǎn)/分鐘，攪拌至溶液為淡黃色透明，得到以螺旋藻多糖、納米乳劑載體為 佐劑的流感病毒疫苗，其中螺旋藻多糖的質(zhì)量比為0. 065%，載體質(zhì)量比為99. 935% ；螺旋 藻多糖納米乳劑與流感疫苗血凝素的質(zhì)量比為78850。
實施例41)制備下列不同的佐劑或溶液a)取市購的螺旋藻多糖0. 2 mg，溶于30ul無水乙醇，然后與ΙΙΟμΙ生理鹽水混合， 得140ul螺旋藻多糖溶液，備用；b)取濃度為15. 98 mg/ml的氫氧化鋁12. 5 μ ，其中含AL(OH)3 0. 2mg，加入生理鹽水 至體積為140 μ ，備用；c)140 μ 生理鹽水，備用；d)200 μ 生理鹽水，備用；2)制備下列不同的疫苗取血凝素含量為43. 67 μδ/πι1的市購Η3Ν2流感病毒裂解疫苗60μ1，分別和上述a、b、 c不同溶液混合，分別得到含有螺旋藻多糖免疫佐劑的流感疫苗樣品A、含有AL(OH)3佐劑的流感疫苗樣品B、單獨的流感疫苗樣品C、不加疫苗僅為生理鹽水的空白對照樣品D。所配 置的上述A、B、C、D四個樣品均制備五份，體積均為200 μ ，備用；其中含有螺旋藻多糖的流 感疫苗樣品A中螺旋藻多糖質(zhì)量比為100%，載體質(zhì)量比為0 % ；螺旋藻多糖免疫佐劑與流 感疫苗血凝素的質(zhì)量比為76; 3)免疫接種及檢測用上述2)所配的Α、B、C、D四個不同的樣品分別免疫標準體重雌性昆明小鼠，每組5 只，每只肌肉注射200μ1，間隔3周，免疫2次。于加免后2周取尾血，分離血清測定血凝抑 制效價，所測結(jié)果顯示螺旋藻多糖佐劑組血凝抑制抗體效價水平明顯高于鋁佐劑組及單獨 疫苗組，具體結(jié)果見附圖2。并于第一天接種前和接種后第8天對各組小鼠進行體重測量， 對7天內(nèi)各組平均增長的體重進行計算，所測結(jié)果顯示藻多糖佐劑組較之鋁佐劑組及單獨 疫苗組小鼠體重增長受影響最低，并與空白對照組相比，小鼠體重增長幅度反而較大，可能 是由于螺旋藻多糖本身具有一定的補益作用，具體結(jié)果見附圖3。
實施例5Α、取市購的螺旋藻多糖0. 3 mg，溶于40μ1無水乙醇，再與130μ1生理鹽水混合，然后加 入市購的Η3Ν2流感裂解疫苗30μ1至終體積為200 μ ，含Η3Ν2流感裂解疫苗的血凝素含量 為1.3lPg，得含有螺旋藻多糖的流感病毒疫苗，備用；其中螺旋藻多糖的質(zhì)量比為100%， 載體質(zhì)量比為0 % ；螺旋藻多糖佐劑與流感疫苗血凝素的質(zhì)量比為2四。
B、取H3N2流感裂解疫苗60 μ ，其中含血凝素2. 62μδ,與140 μ 生理鹽水混合至 終體積為200 μ ，作為單獨疫苗對照組，備用；C、取濃度為15.98 mg/ml的氫氧化鋁佐劑12. 5 μ ，其中含OJmg AL(OH)3，與含血凝 素為2. 62Pg的流感疫苗60 μ 混合，然后加入生理鹽水至終體積200 PlJtSAL(OH)3K 劑疫苗對照組，備用D、生理鹽水200μ ，為空白對照組，備用； F、免疫接種及抗體檢測將上述配好的A、B、C、D四個樣品分別免疫標準體重昆明雌性小鼠，肌肉注射，每只200 μ ，每組5只，間隔3周，免疫2次，于加免后2周進行尾部采血，分離血清，檢測血凝抑制抗 體效價，所測結(jié)果顯示，即使在螺旋藻多糖佐劑疫苗組HA (1. 31ug)含量減半的情況下，所 產(chǎn)生的血凝抑制抗體效價水平也稍微高于HA含量為2. 62ug的鋁佐劑組及單獨疫苗組，說 明螺旋藻多糖佐劑能明顯降低疫苗抗原用量，具體結(jié)果見附圖4。
權(quán)利要求
1.一種螺旋藻多糖免疫佐劑，其特征在于由下列質(zhì)量比的組分組成螺旋藻多糖0. 001 100%載體0 99. 999%O
2.如權(quán)利要求1所述的螺旋藻多糖免疫佐劑，其特征在于所述載體由下列質(zhì)量比的組 分組成乳化劑20 70%助乳化劑20 70%油相1 50%水相1 30%。
3.如權(quán)利要求2所述的螺旋藻多糖免疫佐劑，其特征在于所述乳化劑為常規(guī)的 TweenSO或聚氧乙烯蓖麻油中的一種，或者為質(zhì)量混合比為3 2 2 3的常規(guī)TweenSO 與SpanSO的混合物，或者為質(zhì)量混合比為1 1的常規(guī)聚氧乙烯蓖麻油與SpanSO的混合 物。
4.如權(quán)利要求2所述的螺旋藻多糖免疫佐劑，其特征在于所述助乳化劑為常規(guī)的1， 2-丙二醇或聚乙二醇400中的一種。
5.如權(quán)利要求2所述的螺旋藻多糖免疫佐劑，其特征在于所述油相為常規(guī)的肉豆蔻酸 異丙酯或油酸乙酯或注射用大豆油中的一種。
6.如權(quán)利要求1所述的螺旋藻多糖免疫佐劑，其特征在于所述水相為注射用水或者含 有藥物或疫苗成分的注射用水溶液。
7.一種含有如權(quán)利要求1所述螺旋藻多糖免疫佐劑的流感疫苗，其特征在于螺旋藻 多糖免疫佐劑與流感疫苗血凝素的質(zhì)量比為75 150000，其中，所述螺旋藻多糖免疫佐劑由 下列質(zhì)量比的組分組成螺旋藻多糖0. 001 100%載體0 99. 999%ο
全文摘要
本發(fā)明提供一種螺旋藻多糖免疫佐劑及含有該佐劑的流感疫苗，其特征在于所述螺旋藻多糖免疫佐劑由下列質(zhì)量比的組分組成螺旋藻多糖0.001～100%，載體0～99.999%?？筛玫奶岣咭呙缑庖咴?，大大降低疫苗抗原用量，以螺旋藻多糖為佐劑使用的疫苗抗原用量，僅是以氫氧化鋁為佐劑的疫苗抗原用量的一半或者更少，同樣可以達到理想的免疫保護效果，且其安全性高、副作用小，用螺旋藻多糖為佐劑的流感疫苗，制備方法簡便，疫苗質(zhì)量容易控制。
文檔編號A61K39/39GK102028945SQ20111000189
公開日2011年4月27日 申請日期2011年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月6日
發(fā)明者李慧, 李映波, 陳芹芹, 高天榮 申請人:中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所