專利名稱：?jiǎn)伪谔技{米管轉(zhuǎn)載抗腫瘤藥物技術(shù)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物藥物轉(zhuǎn)導(dǎo)、納米藥劑學(xué)領(lǐng)域，更具體地講，涉及一種針對(duì)腫瘤的蛋白或核酸防治藥物的單壁碳納米管轉(zhuǎn)載技術(shù)。
背景技術(shù)：
目前，癌癥已經(jīng)成為危害全世界人類健康的一大疾病，全世界每年約600萬(wàn)人死于惡性腫瘤，中國(guó)現(xiàn)有癌癥患者約450萬(wàn)人，死亡率逾30%，造成了嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題。用于腫瘤治療的化療藥物能夠殺死腫瘤細(xì)胞，但缺乏對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性。同時(shí)，我們也應(yīng)該看到，以蛋白質(zhì)與核酸為主體的生物大分子藥物在實(shí)際應(yīng)用中也存在著一些區(qū)別于化學(xué)藥物的特殊問(wèn)題，諸如，這些大分子藥物難于進(jìn)入細(xì)胞起作用，而且在血液或者體液中被降解，產(chǎn)生免疫反應(yīng)等問(wèn)題，因此，研究副作用小、載藥量大、靶向性好、生物相溶性生物抗腫瘤藥物已成為全球醫(yī)藥研究領(lǐng)域的最重要目標(biāo)和方向。傳統(tǒng)的藥物給藥方式不能通過(guò)生物屏障，無(wú)法對(duì)特殊病灶部位進(jìn)行有效治療。靶向給藥充分體現(xiàn)了以生物分子為靶點(diǎn)治療的潛力。如何使高效遞送生物活性分子(肽、蛋白、DNA等)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞特定部位是重點(diǎn)，開發(fā)新型藥物載體有積極意義。 雖然前幾年已經(jīng)有多種納米材料應(yīng)用于藥物傳遞與診斷，特別是金屬納米材料，但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)在應(yīng)用性能、載藥量、可控性與靶向性等方面還是存在比較多的缺陷。單壁碳納米管 (SCNTs)具有獨(dú)特的中空結(jié)構(gòu)和納米管徑，SCNTs具有高純度和尺寸一致等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)人體毒性較小，在結(jié)構(gòu)上表面積大，能攜帶大量藥物。因此，國(guó)際上許多科學(xué)技術(shù)機(jī)構(gòu)的科學(xué)家正著手對(duì)抗癌藥物傳送系統(tǒng)進(jìn)行試驗(yàn)。本發(fā)明在優(yōu)選適合的單壁碳納米管的基礎(chǔ)上，利用PL-PEG5000-Amine對(duì)其進(jìn)行功能化修飾以提高SWCNTs的溶解性，然后與核酸藥物分子偶聯(lián)，對(duì)乳腺癌細(xì)胞B-cap的轉(zhuǎn)染性進(jìn)行研究，同時(shí)在SWCNTs空載情況下，對(duì)細(xì)胞的毒性進(jìn)行研究。研究表明低濃度的 SffCNTs對(duì)細(xì)胞幾乎沒有毒性，轉(zhuǎn)染效率略低于傳統(tǒng)的lip2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。SWCNTs作為藥物載體有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，并以幾種核酸與蛋白藥物作為目標(biāo)藥物進(jìn)行抗腫瘤生物治療，顯示出一定的優(yōu)勢(shì)，是一種適合有效的生物大分子抗腫瘤藥物技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種單壁碳納米管轉(zhuǎn)載抗腫瘤藥物技術(shù)。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供所述單壁碳納米管轉(zhuǎn)載抗腫瘤藥物技術(shù)在促進(jìn)所述藥物靶向性中的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明公開以下技術(shù)方案單壁碳納米管轉(zhuǎn)載抗腫瘤藥物技術(shù)， 包括以下步驟
(1)單壁碳納米管的分散、質(zhì)量檢測(cè)與單壁碳納米管PL-PEG-Amine功能化；
(2)功能化的單壁碳納米管與目標(biāo)分子連接，所述目標(biāo)分子是指生物大分子抗腫瘤藥物，包括核酸藥物或者蛋白藥物；(3 )單壁碳納米管介導(dǎo)的步驟(2 )所述目標(biāo)分子轉(zhuǎn)載。步驟(1)獲得的單壁碳納米管直徑1-4納米、長(zhǎng)度4-500納米。步驟(1)獲得的功能化的單壁碳納米管保存在4攝氏度、PL-PEG過(guò)量的溶液中。步驟(2)功能化的單壁碳納米管通過(guò)-NH2或-SH與目標(biāo)分子連接。步驟(2)所述核酸藥物或者蛋白藥物是指生存素(survivin)及其突變體與剪接體、P53 及其突變體、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) 抗體與單鏈抗體、MDM2癌基因(murinedoubleminute 2，MDM2)、成纖維細(xì)胞激活蛋白 (FAP)、貝塔聯(lián)蛋白(β -Catenin)中的一種或幾種。單壁碳納米管轉(zhuǎn)載抗腫瘤藥物技術(shù)在促進(jìn)所述藥物靶向性中的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于單壁碳納米管轉(zhuǎn)載的藥物制劑對(duì)細(xì)胞的毒性低，轉(zhuǎn)染效率接近于傳統(tǒng)采用的脂質(zhì)體LIP2000，而且相對(duì)穩(wěn)定，在用量上比較小，由于它與目標(biāo)大分子是通過(guò)化學(xué)鍵連接，因此對(duì)目的生物大分子的結(jié)合上比較牢固、易與運(yùn)載，具有重要的發(fā)展前景。本發(fā)明中所采用的單壁碳納米管偶聯(lián)其它與腫瘤細(xì)胞特異結(jié)合的基團(tuán)或抗體分子，使其有效的靶向腫瘤細(xì)胞，可以針對(duì)體外細(xì)胞，也可以針對(duì)人或動(dòng)物。


圖1為SWNT溶液RAMAN光譜檢測(cè)結(jié)果。圖2為SWNT分散與連接效果圖，連接后PEG-SWNT濃度為5. 29mg/L,濃縮后濃度為 13.90mg/L。圖3為PEG-SWNT溶液稀釋10倍后的分散與連接效果圖，最終PEG-SWNT濃度為 53. 68mg/L。圖4為808nm吸收值與碳納米管濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(molar extinction coef cient of SffNT, ε =7. 9X106 ifW1)。圖5為單壁碳納米管載體與脂質(zhì)體lip2000轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)結(jié)果表。圖6為單壁碳納米管載體與脂質(zhì)體lip2000轉(zhuǎn)染效率比較圖。圖7為對(duì)單壁碳納米管載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的效果與脂質(zhì)體(LIP2000)效率檢測(cè)結(jié)果， 其中，A為Mh的檢測(cè)結(jié)果，B為48h的檢測(cè)結(jié)果。圖8為不同SWNTs濃度Mh，48h，72h的細(xì)胞增值率數(shù)據(jù)表。圖9為不同SWNTs濃度Mh，48h，72h的細(xì)胞增值率比較圖，評(píng)價(jià)單壁碳納米管載體毒性。圖10為SWNTs與LIP2000相對(duì)比的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖11為流試細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果，顯示被SWNT攜帶入細(xì)胞內(nèi)的被選siRNA，與對(duì)照相比，對(duì)乳腺癌細(xì)胞有明顯的促凋亡作用。圖12為SWCNT與目標(biāo)蛋白的連接結(jié)果示意圖，其中，①SWCNT(l-2nm，IOOnm)； ②磷脂；③支鏈PEG (15h)；④二硫鍵；⑤靶向分子(TFR/CD71)；⑥Survivin (T34A)； ⑦ RFP(635nm)。圖13為SWCNT與目標(biāo)蛋白的連接方式示意圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說(shuō)明，實(shí)施例的作用僅是解釋而非限定本發(fā)明。實(shí)施例一單壁碳納米管(SWCNT)轉(zhuǎn)載核酸藥物。步驟(1)單壁碳納米管的分散、質(zhì)量檢測(cè)與單壁碳納米管PL-PEG-Amine功能化。1)向20ml玻璃閃爍瓶中加入Img SffNTs和5mgPL-PEG_Amine，加入5ml水，震蕩至PL-PEG完全溶解。2)注意SWNTs非常輕，易擴(kuò)散，要避免吸入SWNTs。操作時(shí)穿戴眼鏡、實(shí)驗(yàn)服和面罩。3)將1)中的閃爍瓶置于超聲水槽中超聲60min，每20min更換一次水槽的水，避免水溫過(guò)熱。4)注意將閃爍瓶置于水槽的最佳位置，以期獲得最佳超聲效果。5)離心上述SWNT懸浮液，24，000g，6h，室溫(22°C)。收集上清。6)用UV-VIS-OTR測(cè)定獲得的SWNT溶液的808nm的吸光度，如圖4所示。確定 SWNT的濃度，4攝氏度保存。7) PL-PEG功能化的SWNT在結(jié)合其他基團(tuán)前能在4攝氏度保存1_2個(gè)月，強(qiáng)烈建議將SWNT保存在PL-PEG過(guò)量的溶液中。8)將Iml得到的SWNT溶液加入細(xì)1微量過(guò)濾濃縮裝置(MWCOlOOkDa)。加入3ml 水，室溫4000g離心lOmin，殘留的體積應(yīng)該小于0. 5ml。再補(bǔ)充水到細(xì)1，離心，重復(fù)5_6次， 洗去SWNT溶液中多余的PL-PEG。加入適量的水，調(diào)節(jié)SWNT的濃度為50mg/L。(UV-VIS-NIR 在808nm測(cè)定的質(zhì)量吸光比為0. 0465mg/ (L*cm))。步驟(2)目標(biāo)分子SiRNA與功能化的SWNT連接。1)將 500 μ IPL-PEG-Amine 功能化的 SffNT 與 0. 5mgSuIfo-LC-SPDP 混合，加入 50 μ 110XPBS中，室溫孵化2h。2)在1)開始的同時(shí)，配制IOmM的DTT (1. 54mgDTT溶解于Iml水中)。將15μ1 100 μ MsiRNA 與 1· 5 μ IDTT 混合，室溫反應(yīng) 1. 5h。3)在1)結(jié)束后，用微量過(guò)濾濃縮裝置(MWCO=IOOkDa)去除多余的Sulfo-LC-SPDP， 重復(fù)洗滌5-6次(用3-鈿1 DNAse / RNAse水，IOOOOg離心6_8min)，使得終體積低于10 μ 1。注意得到的活化的SWNT必需立即用于SiRNA結(jié)合。4)在2)結(jié)束后，與3)同時(shí)進(jìn)行，使用ΝΑΡ-5柱子用純凈的DTT處理siRNA (按照 NAP-5柱子使用說(shuō)明書)。用DNAse / RNAse free IX PBS從柱子上洗脫下siRNA。5)重懸3)得到的活化的SWNTs和500 μ L經(jīng)4)純化后的siRNA，4攝氏度結(jié)合反應(yīng)24h。SffNT和siRNA的終濃度分別為40mg/L和2. 5 μ Μ。SWNT-siRNA結(jié)合后立即使用， 這樣降低污染和siRNA降解的風(fēng)險(xiǎn)。研究結(jié)果顯示，利用PL-PEG5000-Amine合理地對(duì)單壁碳納米管進(jìn)行功能化修飾，使其溶解性與生物相容性得到提高。同時(shí)可以與選擇的目標(biāo)分子，包括=Survivin及其突變體與剪接體、P53及其突變體、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor , VEGF)抗體與單鏈抗體、MDM2癌基因(murinedoubleminute 2，MDM2)、成纖維細(xì)胞激活蛋白(FAP)、貝塔聯(lián)蛋白(β -Catenin)進(jìn)行偶連，以用于腫瘤防治。步驟(3) =SffNTs與Lip2000脂質(zhì)體分別介導(dǎo)的siRNA轉(zhuǎn)染(Lip2000脂質(zhì)體為對(duì)照)。
1)準(zhǔn)備細(xì)胞。貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染前M hrs，在500 L無(wú)抗培養(yǎng)基中接種0. 5-2X105 個(gè)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合度為30-50% (注鋪板時(shí)要將細(xì)胞消化完全混勻，避免細(xì)胞堆積生長(zhǎng))。2)懸浮細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前M虹8，在500 1^無(wú)抗培養(yǎng)基中接種0.5-2\105個(gè)細(xì)胞， 轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞數(shù)量應(yīng)在4-8X IO5/孔。對(duì)于每個(gè)轉(zhuǎn)染樣品，按下面的方法準(zhǔn)備。3)用50 μ L Opti-MEM稀釋siRNA (轉(zhuǎn)染細(xì)胞的終濃度為33 nM)，輕輕吹吸3_5 次混勻。輕輕顛倒混勻轉(zhuǎn)染試劑，用50 μ L Opti-MEM稀釋1.0 yL LipofectamineTM2000, 輕輕吹吸3-5次混勻，室溫下靜置5 min?；旌限D(zhuǎn)染試劑和siRNA稀釋液，輕輕吹吸3_5次混勻，室溫下靜置20 min.轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到M孔細(xì)胞板中，100 μ L/孔，前后輕搖細(xì)胞板混合均勻。細(xì)胞板置于37 oC、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-48 hrs。轉(zhuǎn)染4_6 hrs后可換新鮮培養(yǎng)基。單壁碳納米管載體與脂質(zhì)體lip2000轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)結(jié)果表見圖5，單壁碳納米管載體與脂質(zhì)體lip2000轉(zhuǎn)染效率繪圖比較見圖6。由結(jié)果可見，在稍高濃度時(shí)，其轉(zhuǎn)染效率可接近傳統(tǒng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率。實(shí)施例二 SWNTs的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)——MTT法(與脂質(zhì)體LIP2000作為對(duì)照)。1)接種細(xì)胞用含10%胎小牛血清的培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔1000 -10000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積200ul。2)培養(yǎng)細(xì)胞同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)3 — 5天(可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時(shí)間)。3)呈色培養(yǎng)3 - 5天后，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS溶解)20ul.繼續(xù)孵育 4小時(shí)，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150ul DMS0，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分融解。4)比色選擇490nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以碳納米管濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞增殖率為縱坐標(biāo)繪制條形圖。對(duì)單壁碳納米管載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的效果與脂質(zhì)體(LIP2000)效率檢測(cè)結(jié)果如圖7所
7J\ ο5)單壁碳納米管載體的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)通過(guò)對(duì)SWNTs的功能化，利用超濾濃縮，制備不同濃度梯度的SWNTs濃度，檢測(cè)Mh，48h，72h的細(xì)胞增值率，結(jié)果見圖8，繪圖比較見圖 9。結(jié)果顯示，低濃度的單壁碳納米管對(duì)細(xì)胞幾乎沒有毒性，可作為良好的載藥系統(tǒng)。實(shí)施例三單壁碳納米管轉(zhuǎn)載核酸藥物(siRNA)對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用(與脂質(zhì)體 LIP2000作為對(duì)照)。1)連接方法將 500 μ IPL-PEG-Amine 功能化的 SWNT 與 0. 5mgSuIfo-LC-SPDP 混合，加入50 μ 110XPBS中，室溫孵化濁。2)在1)開始的同時(shí)，配制IOmM的DTT (1. 5%igDTT溶解于Iml水中)。將15μ1 100 μ MsiRNA 與 1· 5 μ IDTT 混合，室溫反應(yīng) 1. 5h。3)在1)結(jié)束后，用微量過(guò)濾濃縮裝置(MWCO=IOOkDa)去除多余的Sulfo-LC-SPDP， 重復(fù)洗滌5-6次(用3-4ml DNAse / RNAse水，IOOOOg離心6_&ι η)。使得終濃度低于10 μ 1。 (注得到的活化的SWNT必需立即用于siRNA結(jié)合)。4)上述2)結(jié)束后，與3)同時(shí)進(jìn)行，使用ΝΑΡ-5柱子用純凈的DTT處理siRNA (按照NAP-5柱子使用說(shuō)明書)。用DNAse / RNAse free IX PBS從柱子上洗脫下siRNA。5)重懸3)得到的活化的SWNTs和500 μ L經(jīng)4)純化后的siRNA。4攝氏度結(jié)合反應(yīng)24h, SffNT和siRNA的終濃度分別為40mg/L和2. 5 μ Μ。(注SWNT_siRNA結(jié)合后立即使用，以降低無(wú)所謂污染和siRNA降解)。6)MTT實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率與對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用效果。設(shè)定MTT實(shí)驗(yàn)藥物濃度為20匪、30匪、44匪、67匪、100匪。細(xì)胞鋪板調(diào)稀，控制鋪板時(shí)細(xì)胞濃度為30-50%。鋪板后6小時(shí)培養(yǎng)基中不加血清。LIP2000組和SWNTs組濃度相同，分別設(shè)定載有100匪的陰性siRNA作為對(duì)照。 圖10為與陽(yáng)離子脂質(zhì)體相對(duì)比的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果，顯示其進(jìn)入細(xì)胞的效率與通常采用的 LIP2000作用效果是相接近的。7)通過(guò)流試細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，被SWNT攜帶入細(xì)胞內(nèi)的被選siRNA，與對(duì)照相比， 對(duì)乳腺癌細(xì)胞有明顯的促凋亡作用(圖11所示)，顯示了這種技術(shù)應(yīng)用于轉(zhuǎn)導(dǎo)核酸抗腫瘤藥物是有效的。實(shí)施例四單壁碳納米管(SWCNT )轉(zhuǎn)載蛋白藥物。將直徑l-2nm，長(zhǎng)度在Γ ΟΟηπι的單壁碳納米管(SffCNT)通過(guò)混分散后，利用混酸處理和活化后，依次與合成的磷脂分子交聯(lián)，利用支鏈PEG修飾15h;通過(guò)二硫鍵與靶向腫瘤細(xì)胞的分子(如葉酸、抗體分子或受體分子)相連接；同時(shí)與目標(biāo)蛋白(如 Survivin (T34A)、P53、MDM2等)，同時(shí)，為了顯示這種轉(zhuǎn)載體系在腫瘤組織中的位置，還將 63(T700nm 的熒光蛋白，如紅色熒光蛋白(Red Fluorescent Proteins，RFP s)與 SWCNT 上的目標(biāo)藥物蛋白，通過(guò)基因工程融合表達(dá)制備，然后相連接而成一個(gè)具有示蹤功能的單壁碳納米管轉(zhuǎn)載抗腫瘤蛋白體系。其中一種連接結(jié)果示意圖如圖12。實(shí)施例五單壁碳納米管(SWCNT)轉(zhuǎn)載蛋白藥物。SffCNT與目標(biāo)蛋白的連接技術(shù)利用一定比例的硝酸與硫酸混酸處理后的單壁碳納米管(SWCNT)在氯仿中與己二胺反應(yīng)得到多氨基終端的碳納米管即CNT-NH。酸化的碳納米管與十六烷基溴等在一定條件下反應(yīng)得到CNT-NH。功能化碳納米管在Tris-HCl緩沖液中超聲后加入酶液震蕩離心。固定化酶量利用Brandford測(cè)定上清中蛋白含量。單壁碳納米管與目標(biāo)蛋白連接產(chǎn)物的表征采用CNT - C00H的FIlR光譜與拉曼光譜，結(jié)果皆展現(xiàn)出典型的條帶。然后對(duì)比分析CNT-C00H、CNT-NH、CNT-R固定化效率，發(fā)現(xiàn) CNT-C00H效率最高，裝載量也最大。在此基礎(chǔ)上，將連接好的對(duì)照蛋白與目標(biāo)蛋白分別孵育腫瘤細(xì)胞，然后收集各時(shí)間段細(xì)胞。進(jìn)行熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞檢測(cè)蛋白進(jìn)入細(xì)胞的情況，裂解細(xì)胞進(jìn)行 ffesternbolt檢測(cè)蛋白被切割的情況與作用效果。圖13為一種單壁碳納米管(SWCNT)與目標(biāo)蛋白的連接方式示意圖。SffCNT對(duì)候選蛋白藥物的轉(zhuǎn)載技術(shù)為了檢測(cè)單壁碳納米管(SWCNT) 對(duì)候選蛋白藥物的轉(zhuǎn)載技術(shù)的有效性，作為對(duì)照，先在pET-22b上構(gòu)建表達(dá) ① TAT—I inker—UbGG-mCherry、② TAT—1 inker—mCherry、③ TAT—linker—UbGV— mCherry三個(gè)示范性蛋白，并用his柱純化，用TAT代替SWCNT檢測(cè)腫瘤細(xì)胞質(zhì)中的泛素專一性酶對(duì)泛素切割的有效性。判斷依據(jù)①與②為了說(shuō)明具有WdGG能在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)被切割； ①與③為了說(shuō)明泛素專一性酶對(duì)泛素的切割發(fā)生在兩個(gè)GG之后，把GG突變?yōu)镚V后會(huì)阻止泛素專一性酶的切割。在上述檢測(cè)有效的基礎(chǔ)上，構(gòu)建目標(biāo)載體系統(tǒng)=SWCNT-Iinker-UbGG-Protein,其中的蛋白質(zhì)ftOtein為本發(fā)明中候選的下列蛋白質(zhì)=Survivin及其突變體與剪接體、P53及其突變體、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)抗體與單鏈抗體、癌基因(murinedoubleminute 2，MDM2)、成纖維細(xì)胞激活蛋白(FAP)、貝塔聯(lián)蛋白 (β -Catenin)。在前一步的基礎(chǔ)上，檢驗(yàn)了泛素專一性酶對(duì)泛素切割的有效性后，將蛋白轉(zhuǎn)移到 SffCNT上，在pTWim構(gòu)建下列3個(gè)表達(dá)質(zhì)粒
①linker—UbGG-mCherry ；
②Iinker-UbGG-Pr (P53、Sm34 或抗 Survivin 多肽)；
③scFv單鏈抗體(在pTXBl上表達(dá)，幾丁質(zhì)純化)。通過(guò)構(gòu)建上述三個(gè)質(zhì)粒以實(shí)現(xiàn)下列目標(biāo)①起示范作用；②需要轉(zhuǎn)載的蛋白；③ 靶向性作用。選用不同的scFv可以靶向不同的腫瘤細(xì)胞。在pTWim上表達(dá)，純化出來(lái)的蛋白在N端具有一個(gè)半胱氨酸，便于通過(guò)二硫鍵與SWCNT連接；在pTXBl上表達(dá)，純化出來(lái)的蛋白在C端具有一個(gè)硫酯，便于通過(guò)酰胺鍵與SWCNT連接。酰胺鍵比二硫鍵牢固，不易斷開。具體實(shí)驗(yàn)方法采用1 inker—UbGG-P與scFv通過(guò)摩爾比(如10 1)與SWCNT連接構(gòu)成載體系統(tǒng)SWCNT-Iinker-UbGG-Pr。然后進(jìn)行靶向性，有效性評(píng)價(jià)。通過(guò)具體的優(yōu)化與檢測(cè)后，證明單壁碳納米管(SWCNT)通過(guò)轉(zhuǎn)載候選蛋白藥物，起到了靶向傳遞蛋白質(zhì)藥物與抗腫瘤功效。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.單壁碳納米管轉(zhuǎn)載抗腫瘤藥物技術(shù)，其特征在于，包括以下步驟(1)單壁碳納米管的分散、質(zhì)量檢測(cè)與單壁碳納米管PL-PEG-Amine功能化；(2)功能化的單壁碳納米管與目標(biāo)分子連接，所述目標(biāo)分子是指生物大分子抗腫瘤藥物，包括核酸藥物或者蛋白藥物；(3 )單壁碳納米管介導(dǎo)的步驟(2 )所述目標(biāo)分子轉(zhuǎn)載。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單壁碳納米管轉(zhuǎn)載抗腫瘤藥物技術(shù)，其特征在于，步驟(1)獲得的所述單壁碳納米管直徑1-4納米、長(zhǎng)度4-500納米。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單壁碳納米管轉(zhuǎn)載抗腫瘤藥物技術(shù)，其特征在于，步驟(1)獲得的功能化的單壁碳納米管保存在4攝氏度、PL-PEG過(guò)量的溶液中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單壁碳納米管轉(zhuǎn)載抗腫瘤藥物技術(shù)，其特征在于，步驟(2)功能化的單壁碳納米管通過(guò)-NH2或-SH與目標(biāo)分子連接。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單壁碳納米管轉(zhuǎn)載抗腫瘤藥物技術(shù)，其特征在于，步驟(2)所述核酸藥物或者蛋白藥物是指生存素及其突變體與剪接體、P53及其突變體、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子抗體與單鏈抗體、MDM2癌基因、成纖維細(xì)胞激活蛋白、貝塔聯(lián)蛋白中的一種或幾種。
6.權(quán)利要求1所述的單壁碳納米管轉(zhuǎn)載抗腫瘤藥物技術(shù)在促進(jìn)所述藥物靶向性中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種單壁碳納米管轉(zhuǎn)載抗腫瘤藥物技術(shù)及其應(yīng)用，包括以下步驟(1)單壁碳納米管的分散、質(zhì)量檢測(cè)與單壁碳納米管PL-PEG-Amine功能化；(2)功能化的單壁碳納米管與目標(biāo)分子連接，所述目標(biāo)分子是指生物大分子抗腫瘤藥物，包括核酸藥物或者蛋白藥物；(3)單壁碳納米管介導(dǎo)的步驟(2)所述目標(biāo)分子轉(zhuǎn)載。單壁碳納米管轉(zhuǎn)載的藥物制劑對(duì)細(xì)胞的毒性低，轉(zhuǎn)染效率接近于傳統(tǒng)采用的脂質(zhì)體LIP2000,而且相對(duì)穩(wěn)定，在用量上比較小，由于它與目標(biāo)大分子是通過(guò)化學(xué)鍵連接，因此對(duì)目的生物大分子的結(jié)合上比較牢固、易與運(yùn)載，具有重要的發(fā)展前景。
文檔編號(hào)A61K38/17GK102370988SQ201110003490
公開日2012年3月14日 申請(qǐng)日期2011年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月10日
發(fā)明者安學(xué)勤, 張翼, 林南靜, 鄭文云, 陳海龍, 馬興元 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)