專利名稱：：敲除MLDS基因的產(chǎn)油紅球菌Rhodococcussp.RHA-MLDS及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及敲除MLDS基因的產(chǎn)油紅球菌Rhodococcussp.RHA-MLDS及其用途，并涉及MLDS基因和/或MLDS蛋白的抑制劑在生產(chǎn)生物柴油中的應(yīng)用，MLDS基因和/或MLDS蛋白和包含重組MLDS基因蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物、MLDS基因或包含MLDS基因的重組表達(dá)載體的組合物在制備預(yù)防和/或治療與脂質(zhì)的代謝和儲(chǔ)存障礙有關(guān)的代謝性疾病的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
：能源的短缺及環(huán)境的污染已經(jīng)嚴(yán)重地限制了世界經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和生活水平的提高。因此，開發(fā)新型能源，尤其是開發(fā)可持續(xù)和可再生的清潔生物能源就變得勢(shì)在必行。從2009年我國在緑色清潔能源上的投入(三百四十六億美金)高于全世界的總投入的四分之一及美國的兩倍就能看出我國對(duì)綠色清潔能源的需求及重視。微生物能量轉(zhuǎn)化效率遠(yuǎn)高于其它生物物種，美國能源部的研究報(bào)告指出，単位面積土地上微藻的產(chǎn)油量是地面植物的100倍[1]。因此利用微生物生產(chǎn)生物能源已經(jīng)成為人類開發(fā)可持續(xù)可再生能源的ー個(gè)重要方向。其中，利用微生物生產(chǎn)生物柴油又是重中之重[2]。在細(xì)菌中，生物柴油的前體甘油三酯是儲(chǔ)存在一個(gè)叫脂滴的細(xì)胞器中。因此，闡明調(diào)節(jié)脂滴形成及動(dòng)態(tài)變化的相關(guān)分子機(jī)理將大大有助于提高生物柴油的產(chǎn)量及降低生產(chǎn)成本。同吋，人體的多種代謝疾病均與脂質(zhì)的代謝和儲(chǔ)存有著密切的[3]。到目前為止，脂滴的形成機(jī)理依然還處于假說之中，其分子機(jī)理仍待研究。很顯然，脂滴結(jié)合蛋白的確定會(huì)為掲示脂滴形成機(jī)理提供有力的線索和依據(jù)。雖然真核細(xì)胞中脂滴結(jié)合蛋白已經(jīng)大部分被鑒定出來了W-7]，但細(xì)菌的脂滴結(jié)合蛋白仍然是空白。同吋，對(duì)動(dòng)物細(xì)胞脂滴有著很大作用的PAT家族蛋白在細(xì)菌中卻沒有同源蛋白。因此，我們選定產(chǎn)油紅球菌miodococcussp.RHAl[8]為研究材料分析研究細(xì)菌脂滴的有關(guān)蛋白，尤其是調(diào)節(jié)脂滴形成及大小變化的蛋白。Rodococcussp.RHAl起初是從農(nóng)藥污染的土壌中分離出的ー種菌株，它可以利用多種有機(jī)化合物作為碳源，如碳水化合物、類固醇、芳香族化合物、腈類化合物等等。近期的研究主要集中于它的生物降解功能，包括腈、丁子香酚、固醇酮、苯甲酸酯等[9-11]。這種細(xì)菌有很強(qiáng)的在體內(nèi)積累甘油三酯的能力，這是ー種潛在的可再生資源，可以產(chǎn)生脂肪酸甲酷。因此我們選取這種菌為研究材料不僅有助于生物柴油的開發(fā)，而且還會(huì)為治療人類代謝疾病提供理論基礎(chǔ)。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的技術(shù)目的在于探究細(xì)菌脂滴的有關(guān)蛋白并探究該有關(guān)蛋白在生產(chǎn)生物柴油及治療人類代謝疾病中的應(yīng)用。因此，本發(fā)明的第一方面涉及敲除MLDS基因的產(chǎn)油紅球菌Iihodococcussp.RHA-MLDS，其于2010年11月30日保藏在中國微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心，其地址為中華人民共和國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，其分類命名為紅球菌Iihodococcussp.，保藏號(hào)為CGMCCNo.4379，其中所述MLDS基因的NCBI登錄號(hào)為4218150。本發(fā)明的第二方面涉及敲除MLDS基因的產(chǎn)油紅球菌Iihodococcussp.RHA-MLDS在生產(chǎn)生物柴油中的應(yīng)用。本發(fā)明的第三方面涉及利用敲除MLDS基因的產(chǎn)油紅球菌Iihodococcussp.RHA-MLDS生產(chǎn)生物柴油的方法。本發(fā)明的第四方面涉及MLDS基因和/或MLDS蛋白的抑制劑在生產(chǎn)生物柴油中的應(yīng)用，其中所述MLDS基因的NCBI登錄號(hào)為4218150。優(yōu)選地，所述抑制劑為siRNA和/或特異性抗MLDS蛋白的抗體，所述siRNA和/或特異性抗MLDS蛋白的抗體能沉默和/或降低MLDS基因的表達(dá)及中和MLDS蛋白。本發(fā)明的第五方面涉及MLDS基因和/或MLDS蛋白在制備預(yù)防和/或治療與脂質(zhì)的代謝和儲(chǔ)存障礙有關(guān)的代謝性疾病的藥物中的用途，其中所述MLDS基因的NCBI登錄號(hào)為4218150。優(yōu)選地，所述疾病選自肥胖癥、脂肪肝或動(dòng)脈粥樣硬化。優(yōu)選地，所述藥物選自重組MLDS基因蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物、MLDS基因、包含MLDS基因的重組表達(dá)載體或包含MLDS基因的重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，優(yōu)選地，所述重組MLDS基因蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物由原核表達(dá)系統(tǒng)或真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)，優(yōu)選地，所述重組表達(dá)載體為適用于基因治療的重組表達(dá)載體。本發(fā)明的第六方面涉及包含重組MLDS基因蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物、MLDS基因或包含MLDS基因的重組表達(dá)載體的組合物在制備預(yù)防和/或治療與脂質(zhì)的代謝和儲(chǔ)存障礙有關(guān)的代謝性疾病的藥物中的用途，其中所述MLDS基因的NCBI登錄號(hào)為4218150。優(yōu)選地，所述疾病選自肥胖癥、脂肪肝或動(dòng)脈粥樣硬化。換言之，由于細(xì)胞儲(chǔ)存甘油三酯的細(xì)胞器-脂滴的形成和動(dòng)態(tài)變化不但直接與人類代謝疾病有關(guān)，而且還直接決定了生物體合成生物柴油的能力。因此，掲示調(diào)控脂滴形成和動(dòng)態(tài)變化的分子機(jī)理及相關(guān)基因?qū)︻A(yù)防治療代謝疾病以及開發(fā)生物柴油有重大意義。本發(fā)明通過對(duì)產(chǎn)油紅球菌Miod0c0ccussp.RHAl的基因組和蛋白組分析研究從而選定相關(guān)基因，利用基因敲除的手段對(duì)這些選定的基因進(jìn)行敲除，然后用光學(xué)和電子顯微鏡對(duì)這些菌株進(jìn)行分析觀測(cè)，最后用其它生物化學(xué)和分子生物學(xué)方法對(duì)相關(guān)菌株進(jìn)行分析研究，重點(diǎn)在于測(cè)定甘油三酯含量。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)敲除基因ro2104(NCBI登錄號(hào)4218150)可以明顯増加產(chǎn)油紅球菌脂滴的大小，同時(shí)顯著提高細(xì)菌甘油三酯含量。另外，通過借助表達(dá)載體JAM-egfp使綠色熒光蛋白與ro2104形成融合蛋白，使其在產(chǎn)油紅球菌中表達(dá)，還由此觀測(cè)到該蛋白在細(xì)菌中的定位。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)ro2104蛋白完全定位在脂滴上。因此，ro2104有可能是ー個(gè)存在于脂滴上，保護(hù)小脂滴不被融合成大脂滴的蛋白。由此，本發(fā)明命名它為"MicroorganismLipidDropletSmall”，簡(jiǎn)稱"MLDS”。由于MLDS阻止小脂滴融合為大脂滴，因此，敲除了MLDS基因的產(chǎn)油紅球菌Iihodococcussp.RHA-MLDS中的脂滴明顯變大，甘油三酯含量明顯提高。該菌已經(jīng)于2010年11月30日保藏在中國微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，其地址為中華人民共和國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào)為CGMCCNo.4379，其分類命名為紅球菌(拉丁文名稱為Rhodococcussp.)。由于該菌能使菌體內(nèi)的脂滴明顯變大，甘油三酯含量明顯提高，因此其可以用于生產(chǎn)生物柴油。由于MLDS阻止小脂滴融合為大脂滴，因此，MLDS對(duì)于生物柴油的生產(chǎn)是ー種負(fù)面因素，因此，MLDS基因和/或MLDS蛋白的抑制劑可以促進(jìn)相關(guān)生物(如產(chǎn)油紅球菌)細(xì)胞內(nèi)的脂滴變大并顯著提高甘油三酯的含量，也即MLDS基因和/或MLDS蛋白的抑制劑可以用于生產(chǎn)生物柴油。MLDS基因的抑制劑可以是能特異性敲除或敲降MLDS基因表達(dá)的小干擾RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)，也可以是能降低MLDS基因表達(dá)的其他化學(xué)物質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知如何設(shè)計(jì)特異性敲除或敲降某種基因表達(dá)的siRNA的方法以及篩選能降低MLDS基因表達(dá)的其他化學(xué)物質(zhì)的方法。同吋，由于抗原抗體的特異性結(jié)合能中和掉抗原的生物活性，因此，特異性結(jié)合MLDS蛋白的抗體也可以用于生產(chǎn)生物柴油。由于MLDS能保護(hù)小脂滴不被融合成大脂滴，因此，MLDS基因和/或MLDS蛋白以及包含MLDS基因和/或MLDS蛋白的組合物能用于預(yù)防和/或治療與脂質(zhì)的代謝和儲(chǔ)存障礙有關(guān)的代謝性疾病，這樣的疾病可以是肥胖癥、脂肪肝或動(dòng)脈粥樣硬化?？梢訫LDS蛋白、MLDS基因或包含MLDS基因的重組表達(dá)載體的形式應(yīng)用MLDS。敲除了MLDS基因的產(chǎn)油紅球菌Rhodococcussp.RHA-MLDS已經(jīng)于2010年11月30日保藏在中國微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，其地址為中華人民共和國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào)為CGMCCNo.4379，其分類命名為紅球菌Miodococcussp.。產(chǎn)油紅球菌Rhodococcussp.RHAl于2010年12月8日保藏在中國微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，其地址為中華人民共和國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，其分類命名為紅球菌Iihodococcussp.，保藏號(hào)為CGMCCNo.4423ο含有pJAM2_eGFP表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌pJAM2-egfp/S17_l于2010年12月8日保藏在中國微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，其地址為中華人民共和國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，分類命名為大腸埃希氏菌Escherichiacoli，保藏號(hào)為CGMCCNo.4422。圖1:MLDS基因敲除的突變策略及PCR各引物的位置。圖2:MLDS基因敲除構(gòu)建物電泳圖，其中敲除菌株的PCR擴(kuò)增片段(泳道2)大約640bp，與構(gòu)建的基因敲除質(zhì)粒相同(泳道1)。而用同樣的引物PCR擴(kuò)增野生型片段大約1470bp(泳道3)。為了進(jìn)一歩確認(rèn)缺失的準(zhǔn)確性，我們也用PCR檢測(cè)了目的基因及其兩邊的序列。結(jié)果表明目的基因兩側(cè)的序列071bp和372bp)均與野生型菌株一致(泳道4-7)，而目的基因(831bp)只存在于野生型菌株中，缺失菌株中PCR檢測(cè)不到(泳道8-9)，表明缺失菌株已經(jīng)構(gòu)建成功。1，陽性對(duì)照，以基因敲除質(zhì)粒作為模板，以I^rimera.Primerd作為引物。2，用ro02104缺失型細(xì)菌基因組作為模板，Primera.Primerd作為PCR引物。3，陰性對(duì)照，用野生型菌株基因組作為模板，Primera.Primerd作為PCR引物。4_5，以野生型和基因敲除菌株作模板，Primera.Primerb作為引物的PCR結(jié)果。6-7，以野生型和基因敲除菌株作模板，Primerc,Primerd作為引物的PCR結(jié)果。8-9，以野生型和基因敲除菌株作模板，Primerf>Primerr作為引物的PCR結(jié)果。圖3電鏡照片，其中負(fù)染電鏡(a和C)和透射超薄切片電鏡(b和d)分別觀察了野生型菌和MLDS基因敲除菌中脂滴的大小，發(fā)現(xiàn)在基因敲除菌中脂滴遠(yuǎn)大于野生型的脂滴。圖4=TLC實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中TLC顯示在MLDS基因刪除菌的甘油三脂含量增多。圖5=Westernblot檢測(cè)MLDS融合蛋白的定位。圖6用表達(dá)有MLDS-GFP融合蛋白的細(xì)菌定位MLDS的熒光顯微鏡照片，其中，a，明場(chǎng)下轉(zhuǎn)有空載體JAM-egfp的細(xì)菌；b，熒光場(chǎng)下轉(zhuǎn)有空載體JAM-egfp的細(xì)菌；c，明場(chǎng)下轉(zhuǎn)有目標(biāo)基因JAM-MLDS-egfp的細(xì)菌；d，熒光場(chǎng)下轉(zhuǎn)有目標(biāo)基因JAM-MLDS-egfp的細(xì)菌(圖中標(biāo)尺為5μm)。具體實(shí)施例方式下面將通過下述非限制性實(shí)施例進(jìn)ー步說明本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在不背離本發(fā)明精神的情況下，可以對(duì)本發(fā)明做出許多修改，這樣的修改也落入本發(fā)明的范圍。下述實(shí)驗(yàn)方法如無特別說明，均為常規(guī)方法，所使用的實(shí)驗(yàn)材料如無特別說明，均可容易地從商業(yè)公司獲取。實(shí)施例實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備1.菌株與質(zhì)粒產(chǎn)油紅球菌Rhodococcussp.RHAl由加拿大英屬哥倫比亞大學(xué)(UniversityofBritishColumbia)LindsayD.Eltis教授惠贈(zèng)(于2010年12月8日保藏在中國微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，其地址為中華人民共和國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，分類命名為紅球菌miodococcussp.，保藏號(hào)為CGMCCNo.4423；大腸桿菌S17-1(ATCC4705。和pK18mobsacB(ATCC87097)整合質(zhì)粒均購自美國ATCC;pJAM2-eGFP表達(dá)質(zhì)粒為德國明斯特大學(xué)(UniversityofMunster)的DanielBr0ker教授惠贈(zèng)，含有pJAM2-eGFP表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌pJAM2-egfp/S17-l于2010年12月8日保藏在中國微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，其地址為中華人民共和國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，分類命名為大腸埃希氏菌Escherichiacoli，保藏號(hào)為CGMCCNo.4422；大腸桿菌DH5α購自TIANGEN公司。2.限制性內(nèi)切酶和其他修飾酶限制性內(nèi)切酶和PCR用ExTaqDNA聚合酶購自TaKaRa公司；克隆用T載體購自Genstar公ロ]。3.其他主要試劑硫酸卡那霉素(Kanamycin)和萘啶酸(NalidixicAcid)購自Sigma公司；酵母粉(YeastExtrant)禾ロ姨蛋白月東(Tryptone)購自O(shè)xide公司；預(yù)染蛋白Marker為Fermentas公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小量提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購自Tiangen公司；其它試劑均為分析純?cè)噭?.主要儀器設(shè)備電子顯微鏡(FEITecnaiG2F20)為美國FEI公司產(chǎn)品；熒光顯微鏡的型號(hào)為Zeiss-AXIO-Imager；電轉(zhuǎn)化儀為BIO-RADMicopulserl65_2100型；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DPX-9002B-1)為上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；雙層小容量全溫度恒溫?fù)u床(ZHWY-2102C)為上海智城分析儀器制造有限公司產(chǎn)品；潔凈工作臺(tái)(SW-CJ-IFD)為蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；電轉(zhuǎn)化儀為美國BIO-RAD公司產(chǎn)品；超純水制備器為美國PALL公司產(chǎn)品；PCR熱循環(huán)儀(東勝龍EDC-810)為北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司產(chǎn)品；紫外分光光度計(jì)(D-2233IHamburg)為Eppendorf公司產(chǎn)品；離心機(jī)(microfuge16、centrifuge5417R和3K30)分別為Sigma、Eppendorf和Beckman公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)(AlphalmagerEP)為美國Alphahnotech公司產(chǎn)品；紫外透射反射分析儀(ZF-4)為上海長(zhǎng)明光學(xué)電子儀器廠產(chǎn)品；電熱恒溫水槽(DK-8D)為上海一恒科技有限公司產(chǎn)品；高壓蒸汽滅菌鍋aXQ-LS-50SII)為上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；電泳儀和電泳槽為北京六ー廠公司產(chǎn)品；微波爐為L(zhǎng)G和格蘭仕公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)用各種冰箱為海爾公司產(chǎn)品；微型臺(tái)式真空泵(CL-802B)為海門市其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；0.22μπι濾器為德國Sartorius公ロJ廣品。實(shí)驗(yàn)方法1用于缺失ro02104(MLDS)基因的載體的構(gòu)建1.Iro02104(MLDS)基因引物的設(shè)計(jì)從NCBI數(shù)據(jù)庫中查找出目標(biāo)基因RHAlMLDS及其兩側(cè)的序列(分別為ro02103，NCBI登錄號(hào)為4218149，和ro02105,NCBI登錄號(hào)為4218151)，用PCR的方法擴(kuò)增其上游27Ibp段和下游372bp的序列，引物通過primer5.O軟件設(shè)計(jì)。其中，271bp序列由!3rimera(SEQIDNO:1)禾ロPrimerb(SEQIDNO:2)擴(kuò)增，Primera的5'端為EcoRI酶切位點(diǎn)。372bp序列用Primerc(SEQIDNO:3)和Primerd(SEQIDNO:4)引物擴(kuò)增，Primerd的5'端為HindIII酶切位點(diǎn)。I^rimerb和Primerc引物之間有19bp的粘性互補(bǔ)區(qū)，用于PCR擴(kuò)增時(shí)將AB段和⑶段連接到一起。檢測(cè)用的引物為I^rimerf(SEQIDNO5)和Primerr(SEQIDNO:6)，用于擴(kuò)增目標(biāo)基因ro02104。PrimeraPrimerbPrimercPrimerdPrimerfPrimerr5'-CGGAATTCGGGAACAGCAGGAGGACGAGGAAT-3'5'-CCATCCACTAAACTTAAACAGGCTTGATCCTTCACGCTTTTCG-3，5'-GTTTAAGTTTAGTGGATGGTCTTGACGCTGTCGATGGTCTTCT-3，5'-CACAAGCTTTCTGAGTCAGATCGAGCGTGGGTT-3'5'-ATGACTGACCAGAAGACCATCGACAG-3'5'-TCAAGCCTTCTTGGCCGGAGCAGC-3'1.2MLDS基因的擴(kuò)增用primera和primerb擴(kuò)增AB段，用primerc和primerd擴(kuò)增CD段，模板為野生型RHAl的基因組。PCR體系為摸板引物1引物22.5mMdNTPIOxbufferTaq酶ddH20共計(jì)1μνζμνζμν5μν5μν0.5μL34.5μL50μLPCR條件為預(yù)變性94°C,Dmm變性94°C,30sec退火12°C,55sec延伸12°C,1mm循環(huán)數(shù)35后延伸12°C,2mm將AB段和⑶段分別回收以回收后的AB段和CD段為模板，以primera和primerd為引物擴(kuò)增AD段，PCR條件同AB段和⑶段。1.3PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳將擴(kuò)增產(chǎn)物和連接產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖濃度為0.8%，用Goldview核酸染料(購自賽百盛，目錄號(hào)HGV-1)；進(jìn)行著色，用凝膠圖像分析儀對(duì)染色后的凝膠進(jìn)行分析并拍照記錄。1.4PCR產(chǎn)物的回收將AD段進(jìn)行凝膠回收，操作步驟按凝膠回收試劑盒(購自TIANGEN公司)中的說明書進(jìn)行，回收出來的AD段就是體外缺失掉目標(biāo)基因MLDS的DNA序列。2質(zhì)粒整合載體的構(gòu)建2.IMLDS基因與T載體的連接將回收后的AD段序列作為外源片段與T載體連接，連接體系為外源片段4μL，T載體lyL，2X預(yù)混緩沖液5μし連接條件為16°C，過夜。2.2CaCl2法制備DH5α感受態(tài)細(xì)胞從LB平板上挑取新活化的DH5α單菌落，接種于5mLLB液體培養(yǎng)基中，37°C下振蕩培養(yǎng)12hr左右。然后將該菌液以1100的比例接種于IOOmLLB液體培養(yǎng)基中，37°C，220rpm振蕩培養(yǎng)至OD6tltl為0.6。置于冰上20min。在4°C，5000rpm離心5min，棄上清液，用吸頭吸盡殘余培養(yǎng)基。加入適量的MgCl2-CaCl2溶液清洗兩次。加入適量冰預(yù)冷的0.Imol/LCaCl2重懸。此時(shí)的感受態(tài)細(xì)胞既可以進(jìn)行轉(zhuǎn)化，也可以加入甘油之后保存于-80°C。2.3T載體連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化將連接產(chǎn)物加入50μLDH5a感受態(tài)細(xì)胞中，溫和混勻，冰上放置20hr，熱擊(42°C，90sec)。在冰上放置2_;3min，加入0.8mLLB培養(yǎng)基，37°C孵育45min，離心后用200μ1LB培養(yǎng)基重懸，取100μL涂氨芐青霉素家IPTG和Χ-gal平板，37°C過夜培養(yǎng)。2.4轉(zhuǎn)化菌落質(zhì)粒的提取將生長(zhǎng)出來的菌落提取質(zhì)粒驗(yàn)證，提取質(zhì)粒使用天根質(zhì)粒小量快速提取試劑盒。將提取的質(zhì)粒送北京擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明所獲得的重組基因序列完全正確。2.5含MLDS基因的H(18質(zhì)粒整合載體的構(gòu)建1)將測(cè)序正確的陽性克隆和載體pK18mobSaCB進(jìn)行EcoRI和HindIII雙酶切，酶切體系如下表，酶切溫度為37°C，酶切時(shí)間為4hr。質(zhì)粒DNA15μLIOXbufferM5μνEcoRI1μνHindIII1μνddH2028μL共計(jì)50μL2)將酶切產(chǎn)物跑電泳后按凝膠回收試劑盒的說明進(jìn)行凝膠回收。3)將回收后的小片段作為外源片段和載體pKlSmobsacB進(jìn)行連接。連接體系為外源片段4μL，T載體1μL，2X預(yù)混緩沖液5μし連接條件為16°C，過夜。4)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化經(jīng)CaCl2法制備好的感受態(tài)細(xì)胞S17-1，轉(zhuǎn)化方法如2.3?；猛靠敲顾仄桨?，37°C過夜培養(yǎng)。長(zhǎng)出來的菌落即是含有重組質(zhì)粒的陽性菌落。3RHA1菌株基因組上MLDS基因的敲除3.1S17-1和RHAl細(xì)菌的培養(yǎng)挑取大腸桿菌S17-1的單菌落至IOmL含有50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基，于37°C培養(yǎng)。挑取野生型RHAl的單菌落至IOmL含有30μg/mL萘啶酸的LB培養(yǎng)基，于30°Ciロ養(yǎng)。3.2S17-1菌株和RHAl菌株的結(jié)合作用分別培養(yǎng)供體菌S17-1和受體菌野生型RHAl至細(xì)菌生長(zhǎng)指數(shù)末期。各取100μL涂無抗性的固體LB平板，30°C培養(yǎng)過夜。這時(shí)質(zhì)粒就會(huì)從供體菌轉(zhuǎn)進(jìn)受體菌RHAl中。3.3整合篩選MLDS突變株向過夜培養(yǎng)的平板中加入2mL液體LB培養(yǎng)基，用涂布棒將菌體刮下，梯度稀釋成川入川人川づ，涂嫩+！^??！板(萘啶酸+卡那霉素平板)，30°C培養(yǎng)2-3day。長(zhǎng)出來的為第一次整合的細(xì)菌。將長(zhǎng)出來的菌落進(jìn)行第一次整合的鑒定挑一個(gè)單菌落分別扎到NA+Kan平板和NA+Kan+10%蔗糖平板，挑選在NA+Kan平板生長(zhǎng)而在NA+Kan+10%蔗糖平板上不能生長(zhǎng)的菌落。這樣的菌落為第一次整合成功的細(xì)菌。將第一次整合成功的菌落在10%蔗糖平板上劃線，30°C培養(yǎng)2-3day。長(zhǎng)出來的為第二次整合的細(xì)菌。將長(zhǎng)出來的菌落進(jìn)行第二次整合的鑒定挑一個(gè)單菌落分別扎到NA+Kan平板和NA平板，挑選在NA平板生長(zhǎng)而在NA+Kan平板上不能生長(zhǎng)的菌落。這樣的菌落為第二次整合成功的細(xì)菌。4MLDS突變株的分子生物學(xué)水平驗(yàn)證4.1基因組的提取提取方法按照TIANGEN公司細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行4.2PCR鑒定缺失突變株以提取的基因組做模板做PCR驗(yàn)證，陽性對(duì)照為以體外構(gòu)建的重組質(zhì)粒為模板，陰性對(duì)照為以野生型RHAl基因組為模板。同時(shí)以primerf和primerr擴(kuò)增MLDS基因，再次確認(rèn)目標(biāo)基因的缺失與否。5電子顯微鏡觀察菌體形態(tài)5.1電子顯微鏡樣品切片的制備菌體收集3800g離心anin收集2mL菌體，分別用ImL0.IMPBS洗滌菌體2次；包埋加入5%gelatin(明膠)(w/v)，室溫放置lhr，4°C放置30min，然后將包埋塊切成Imm3左右的小塊；前固定將上述小塊用2.5%(w/v)戊ニ醛(pH7.4,0.IMPBS)，4°C固定過夜；洗滌用ImL0.IMPBS在4°C洗滌去除戊ニ醛，洗滌3次，每次IOmin；后固定用200μ11%(w/v)鋨酸4°C固定樣品Mhr；洗滌用ImL0.IMPBS在4°C洗滌去除鋨酸，洗滌3次，每次IOmin；梯度乙醇脫水室溫下分別用ImL30%、50%、70%、90%和95%乙醇脫水lOmin，最后用100%乙醇脫水3次，毎次IOmin；替代室溫下加入ImL環(huán)氧丙烷替代乙醇，替代3次，每次IOmin；滲透室溫下以環(huán)氧丙烷Quetol812分別以31、11、13的比例滲透8hr、10hr、12hr，最后以純Quetol812樹脂滲透12hr；包埋及聚合以加入加速劑的Quetol812全樹脂包埋樣品，并分別在35°C下聚合12hr，45°C下聚合12hr，60°C下聚合Mir；切片用超薄切片機(jī)LeicaEMUC6(Leica公司)將包埋好的樣品切成90nm的超薄切片；染色將超薄切片用2%(w/v)醋酸雙氧鈾在室溫染色20min，水洗3次，然后用2%檸檬酸鉛室溫下染色5min，水洗3次，此超薄切片用電鏡FEITeCnai20(FEIcompany)觀察。6ro02104基因的過表達(dá)6.1表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建6.1.1目標(biāo)基因的擴(kuò)增從NCBI數(shù)據(jù)庫中查找出目標(biāo)基因RHA1MLDS的序列，用PCR的方法擴(kuò)增其序列，弓丨物通過primer5.0軟件設(shè)計(jì)。基因的5'端和3'端都加入BamHI酶切位點(diǎn)。所用引物分別為PrimerF(SEQIDNO7)禾ロPrimerR(SEQIDNO8)PrimerF5'-CAGGATCCACTGACCAGAAGACCATCGACAGCGT-3‘PrimerR5'~CAGGATCCAGCCTTCTTGGCCGGAGCAGCCTT~3‘PCR體系為模板1APrimerF2fiLPrimerR2fiL2.5mMdNTP5^iLlOxbuffer5fiLTaq酶0.5fiLddH2034.5^iL共計(jì)50^iLPCR條件為預(yù)變性94°C，5min變性94°C，30sec退火72°C，55sec延伸72°C，2min循環(huán)數(shù)35后延伸72°C，2min6.1.2將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳及回收，請(qǐng)分別參考1.3和1.4部分。將目的基因進(jìn)行T載體的連接和轉(zhuǎn)化，請(qǐng)分別參考2.1和2.3部分。轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒的提取，請(qǐng)參考2.4部分。6.1.3含ro02104基因的JAM-egfp質(zhì)粒整合載體的構(gòu)建1)將測(cè)序正確的陽性克隆和載體pJAM-egfp進(jìn)行BamHI酶切，酶切體系如下表，酶切溫度為30°C，酶切時(shí)間為4hr。質(zhì)粒DNA15pLlOxbufferM5fiLBamHI2fiLddH2028^iL共計(jì)50pL2)將酶切產(chǎn)物跑電泳后凝膠回收，按試劑盒說明進(jìn)行凝膠回收。3)將回收后的小片段作為外源片段和載體pJAM-egf進(jìn)行連接。連接體系為夕卜源片段4iiL，載體liiL，2X預(yù)混緩沖液5iiL。連接條件為16°C，過夜。4)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，方法同2.3，37°C培養(yǎng)過夜。5)將轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒并酶切鑒定是否有外源片段的插入，方法同2.4。6.2用于電轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞的制備從LB平板上挑取新活化的RHAl單菌落，接種于IOmLLB液體培養(yǎng)基中，30°C下振蕩培養(yǎng)48hr左右。然后將該菌液以I:100的比例接種于IOOmLLB液體培養(yǎng)基中，30°C，220rpm振蕩培養(yǎng)至OD6tltl為0.6。各取45mL菌液加入2個(gè)無菌的50mL離心管中。立即置于冰上20min，使培養(yǎng)物冷卻至0°C，以使菌停止生長(zhǎng)。將離心管在4°C，6000rpm離心lOmin，棄上清液，用吸頭吸盡殘余培養(yǎng)基。每個(gè)離心管里加入25mL冰冷的無菌水重懸。置于冰上若干分鐘。4°C，6000rpm離心lOmin，回收細(xì)胞。再次用25mL冰冷的無菌水重懸，同樣條件離心后棄上清液，用吸頭吸盡殘余培養(yǎng)基。每個(gè)離心管里加入2mL冰冷的10%的甘油重懸，分裝到I.5mL離心管中。保存于_80°C。6.3質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和表達(dá)取2iiL陽性克隆質(zhì)粒加入到50iiL感受態(tài)細(xì)胞中，溫和混勻后轉(zhuǎn)移到0.Icm的電擊杯中，置于冰上20min。選擇“Ec3”程序(3.OkV，6.Omsec)電擊一次。迅速將細(xì)胞SMM配制的LB液體培養(yǎng)基中，于30°C，180rpm培養(yǎng)4hr。涂卡那霉素平板，30°C培養(yǎng)。(SMM配方0.5M蔗糖，20uMMgCl2,20uM順丁烯ニ酸，用NaOH調(diào)pH至6.5)。將長(zhǎng)出來的單菌落挑至IOmLLB液體培養(yǎng)基中，加入卡那霉素至終濃度為50ug/mL,加入誘導(dǎo)劑acetamide(こ酰胺，購自sigma-aldrich,目錄號(hào)695122-1G)至終濃度為0.5%(w/v)，30°C培養(yǎng)約48hr。將菌液離心(4°C,8000rpm,3min),棄上清,加入ImL0.IMPBS重懸,再次同樣條件離心，加入200iiL的PBS重懸，進(jìn)行熒光顯微鏡觀察。7Westernblot鑒定融合蛋白7.I樣品的制備將含有誘導(dǎo)劑acetamide的細(xì)菌培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)末期,取0.5mL菌液離心(4°C,8000rpm,3min),棄上清，加入ImL0.IMPBS重懸，再次同樣條件離心，加入200yL的2Xsamplebuffer(加樣緩沖液)，200瓦功率超聲8次，超聲循環(huán)條件為超聲3s，停頓3s。然后置于金屬加熱器上加熱至95°C,5min,樣品放于4°C冰箱。7.2電泳10%聚丙烯酰胺凝膠的制備配方如下表所示分離膠(10%，IOmL)濃縮膠(5%，5mL)水4mL3.4mL30%丙烯酰胺3.3mL0.83mLTirs-HCl2.5mL(1.5M,pH8.8)0.63mL(lM,pH6.8)10%SDSO.lmL0.05mL10%過硫酸胺O.lmL0.05mLTEMED0.005mL0.005mL分離膠的配制首先安裝好配膠專用裝置，所用的物品需充分洗凈并干燥，測(cè)試不漏水以后方可進(jìn)行。在冰上按配方配好分離膠后，混勻。然后吸取7.5mL分離膠緩緩加入制膠槽中，隨即用移液器慢慢加入2mL去離子水進(jìn)行壓膠。至少聚合45分鐘后方可進(jìn)行濃縮膠的配制。濃縮膠的配制首先吸干壓膠的水，插上合適的樣品梳。然后在冰上按配方配好5mL的濃縮膠，混勻。然后用移液器小心的將濃縮膠加入到制膠槽中直至加滿為止。等待凝膠聚合。此過程中可能會(huì)有縮膠現(xiàn)象，需要補(bǔ)齊濃縮膠。大約聚合30分鐘即可。點(diǎn)樣將梳子從凝膠中拔出，安裝好電泳槽并住滿電泳緩沖液，然后用移液器點(diǎn)樣，每孔點(diǎn)樣品10微升，在靠邊的泳道點(diǎn)IOyL預(yù)染marker(分子量標(biāo)準(zhǔn))。空泳道用上樣緩沖液補(bǔ)齊。電泳恒定電流電泳，25mA每塊膠，電泳至溴酚藍(lán)前沿距凝膠底部0.5cm處停止，此過程大約需要lOOmin。7.3轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)移前準(zhǔn)備將凝膠取下，去除濃縮膠后，置于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡15min。將PVDF膜剪成6.5cm*8.3cm大小，先置于甲醇中活化30sec，然后在轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡15min。同時(shí)剪取2張Bio-rad專用電轉(zhuǎn)濾紙2張，大小為8cm*lcm，置于電轉(zhuǎn)液平衡5min。轉(zhuǎn)移取干凈的25cm直徑的大圓平皿，倒?jié)M轉(zhuǎn)移緩沖液。然后將轉(zhuǎn)印夾黑面朝下，依次平鋪海綿墊、濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙、海綿墊，此過程中用厚梳子趕凈凝膠與PVDF膜中的氣泡，最后夾緊轉(zhuǎn)印夾，按正負(fù)極順序正確置于轉(zhuǎn)印槽中，灌滿轉(zhuǎn)移緩沖液，蓋好電極蓋。整體置于冰上，設(shè)置恒定電流模式，200mA，轉(zhuǎn)印2hr。7.4雜交取下PVDF膜，置于干凈的小方盒中，用TBS漂洗2遍，每次lmin。將PVDF膜置于封閉液中封閉，室溫?fù)u動(dòng)孵育》ir。將封閉的膜用TBS漂洗2遍，每次lmin。加入IOmL用抗體稀釋液配制的GFP小鼠單克隆抗體，稀釋比例為12000，于4°C下置于搖床上搖動(dòng)孵育過夜。用洗膜緩沖液洗ー抗3次。加入20mL山羊抗小鼠ニ杭，稀釋比例為110000，室溫，搖動(dòng)孵育Ihr。用洗膜緩沖液洗3次，毎次:3min。7.5化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)底物孵育將底物A液和B液各取0.5mL，在ParafiIm膜上混勻待用。將PVDF取出后置于濾紙上吸干多余液體。后將其正面朝下平鋪于已經(jīng)混合均勻的底物上，孵育30sec，浙干多余的底物，然后將膜用保鮮膜包好置于X光膠片盒中，注意防止氣泡出現(xiàn)。曝光在暗室紅燈下操作，將膠片迅速貼緊PVDF膜，蓋緊X光膠片盒蓋，根據(jù)熒光強(qiáng)度，控制曝光時(shí)間在lOsec-anin之間。紅燈下顯影至合適的條帶深度，用清水漂洗停止顯影，然后定影45秒左右至膠片完全透亮為止，最后用清水沖洗2遍。將膠片置于架子上晾干，標(biāo)記好預(yù)染marker(分子量標(biāo)準(zhǔn))在膠片上的位置，最后掃描膠片獲得數(shù)據(jù)。7.6相關(guān)溶液的配方Tris-甘氨酸電泳緩沖液25mMTris，250mM甘氨酸，0.1%(m/v)SDS；電泳轉(zhuǎn)移緩沖液25mMTris，192mM甘氨酸，15%甲醇(ν/ν)，冷卻至4°C備用’2X樣品緩沖液100mMTris-HCl(pH6.8)，8%SDS(m/v)，20%甘油(ν/ν)，0.2%溴酚藍(lán)(m/v),200mMDTT；TBS緩沖液20mMTris,150mMNaCl，pH7.5；洗膜緩沖液TBS緩沖液+0.2%奶粉+0.2%Tween20；封閉液TBS緩沖液+5%脫脂奶粉+0.2%Tween20；抗體稀釋液TBS緩沖液+1%脫脂奶粉+0.2%Tween20。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.MLDS基因敲除產(chǎn)油紅球菌Rodococcussp.RHAl起初是從農(nóng)藥污染的土壤中分離出的ー種菌株，它可以利用多種有機(jī)化合物作為碳源，如碳水化合物，類固醇，芳香族化合物，腈類化合物等等。在實(shí)驗(yàn)中，用營養(yǎng)肉湯(NB)培養(yǎng)基維持細(xì)胞生長(zhǎng)，用礦物鹽培養(yǎng)基(MSM)，包括少量的氮，并有充足的葡糖酸鈉作為甘油三酯TAG累積的碳源。在比較蛋白組學(xué)的結(jié)果中，觀察到MLDS(GI111019097)蛋白的肽段數(shù)在MSM環(huán)境的脂滴中明顯減少，表明蛋白表達(dá)降低。有趣的是通過同源序列比較(http://pfam.ianelia.org),這個(gè)基因的同源蛋白是載脂蛋白。為了研究該蛋白的功能，我們利用pKlSmobsacB通過同源重組的方法對(duì)該基因進(jìn)行敲除[12-13]，圖1顯示的是刪除部位及其兩側(cè)的序列PCR引物的設(shè)計(jì)方案。并且通過PCR的方法對(duì)該基因的敲除進(jìn)行確認(rèn)(圖2)。結(jié)果表明與陽性質(zhì)粒對(duì)照(泳道1)相比，MLDS(83Ibp)基因被完全敲除(泳道幻，而細(xì)菌基因組作為陰性對(duì)照(泳道;3)，敲除部位及其兩側(cè)的序列也分別進(jìn)行了PCR檢測(cè)，進(jìn)ー步確認(rèn)基因敲除成功。為了進(jìn)一歩分析該MLDS基因敲除菌的表型，用負(fù)染電鏡和透射超薄切片電鏡(TLC)分別觀察了野生菌和MLDS基因敲除菌，發(fā)現(xiàn)在MLDS基因敲除菌中脂滴明顯變大(圖3)。TLC結(jié)果顯示MLDS基因敲除菌的甘油三脂含量增多(圖4)。2.MLDS蛋白的定位結(jié)果JAM-egfp是ー種能夠在放線菌ー類微生物中表達(dá)外源蛋白的載體，為了研究影響脂滴大小的MLDS蛋白的定位，我們分別將JAM-egfp空載體和JAM-MLDS-egfp在野生型菌株中過表達(dá)[14-16]。與此同時(shí)，通過Wfesternblot鑒定融合蛋白的表達(dá)情況。Westernblot結(jié)果顯示融合蛋白MLDS-GFP的含量很高，而單獨(dú)的GFP幾乎沒有(圖幻。這就確保了我們?cè)跓晒怙@微鏡下看到的綠色是融合蛋白所發(fā)出的顏色，能夠準(zhǔn)確地反映出MLDS的定位情況。通過熒光顯微鏡的觀察，我們看到當(dāng)只有JAM-egfp載體轉(zhuǎn)入細(xì)胞中吋，整個(gè)菌體中是均勻分布的綠色，而當(dāng)JAM-MLDS-egfp轉(zhuǎn)入細(xì)胞中時(shí)，可以看到細(xì)胞中有球型顆粒的分布(圖6)，這表明MLDS蛋白是定位在脂滴表面的。脂滴的由小變大有兩種可能性，其一是脂滴自己長(zhǎng)大，其ニ是小脂滴融合成大脂滴。我們的結(jié)果支持第二種可能性，因?yàn)樵贛MLDS敲除的突變株中脂滴的個(gè)數(shù)明顯變少。而脂滴融合的過程中又有兩種可能的機(jī)制在調(diào)節(jié)，一方面是某些蛋白的正調(diào)節(jié)，例如SNARE、ADRP，他們可以促使小的脂滴融合成大脂滴；另ー方面是某些蛋白的負(fù)調(diào)節(jié)，例如MMLDS，它保護(hù)著脂滴，不讓脂滴之間相互融合，這兩個(gè)方面在細(xì)胞內(nèi)達(dá)到動(dòng)態(tài)的平衡，而當(dāng)我們把起負(fù)調(diào)節(jié)作用的MMLDS敲除之后就會(huì)使脂滴趨向于融合。參考文獻(xiàn)1.Singh,Α.,P.S.Nigam,andJ.D.Murphy,Mechanismandchallengesincommercialisationofalgalbiofuels.BioresourTechnol,2010.2.Smith,V.H.,etal.,Theecologyofalgalbiodieselproduction.TrendsEcolEvol，2010.25(5):p.301-9.3.Maeda,K.,etal.,Adipocyte/macrophagefattyacidDindingproteinscontrolintegratedmetabolicresponsesinobesityanddiabetes.CellMetab,2005.1(2):p.107-19.4.Liu,P.，etal.,ChinesehamsterovaryK2celllipidaropietsappeartobemetabolicorganellesinvolvedinmembranetraffic.JBiolChem,2004.279(5)p.3787-92.5.Bartz,R.，etal.，Dynamicactivityoflipiddroplets:proteinphosphorylationandGTP—mediatedproteintranslocation.JProteomeRes，2007.6(8):p.3256-65.6.Zehmer,J.K.,etal.,Aroleforlipiddropletsininter-membranelipidtraffic.Proteomics,2009.9(4):p.914-21.7.劉平生，張.社.汪.，脂滴-細(xì)胞脂類代謝的細(xì)胞器.生物物理學(xué)報(bào)，2010.26(2):p.97-105.8.McLeod,Μ.P.，etal.，ThecompletegenomeofRnodococcussp.RHAlprovidesinsightsintoacataboiicpowerhouse.ProcNatlAcadSciUSA，2006.103(42):p.15582-7.9.Banerjee,A.,R.Sharma,andU.C.Banerjee,Thenitrile-degradingenzymescurrentstatusandfutureprospects.ApplMicrobiolBiotechnol，2002.60(1-2)p.33-44.10.Larkin，M.J.，L.A.Kulakov，andC.C.Allen，BiodegradationandRhodococcus__mastersofcatabolicversatility.CurrOpinBiotechnol,2005.Ib(3)p.282-90.丄1.Hernandez，M.A.，etal.，BiosynthesisofstoragecompoundsbyRhodococcusjostnRHAlandglobalidentificationofgenesinvolvedintheirmetabolism.BMCGenomics，2008.9:p.600.12.vanderGeize，R.，etal.，UnmarkedgenedeletionmutagenesisofkstD，encoding3-ketosteroidDeltal一dehydrogenase，inRhodococcuserythropolisSQlusingsacBascounter-selectablemarker.FEMSMicrobiolLett,2001.205(2)p.197-202.13.Sharp，J.0.，etal.，AninduciblepropanemonooxygenaseisresponsibleforN-nitrosodimethylaminedegradationbyRhodococcussp.strainRHAl.ApplEnvironMicrobiol,2007.73(21):p.6930-8.14.Hanisch,J.，etal.，Eukaryoticlipidbodyproteinsinoleogenousactinomycetesandtheirtargetingtointracellulartriacylglycerolinclusions.ImpactonmodelsoflipidbodyDiogenesis.ApplEnvironMicrooiol,2006.72(10):p.6743-50.15.Brown,A.C.andT.Parish,Instabilityoftheacetamide-inducibleexpressionvectorpJAM2inMycobacteriumtuberculosis.Plasmid，2006.55(1)p.81-6.16.Hanisch,J.，etal.，TheRalstoniaeutrophaH16phasinPhaPlistargetedtointracellulartriacylglycerolinclusionsinRhodococcusopacusPD630andMycobacteriumsmegmatismc2155,andprovidesananchortotargetotherproteins.Microbiology,2006.152(Pt11):p.3271-80.權(quán)利要求1.敲除MLDS基因的產(chǎn)油紅球菌Rhodococcussp.RHA-MLDS，其于2010年11月30日保藏在中國微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCNo.4379，其中所述MLDS基因的NCBI登錄號(hào)為4218150。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的敲除MLDS基因的產(chǎn)油紅球菌Iihodococcussp.RHA-MLDS在生產(chǎn)生物柴油中的應(yīng)用。3.利用權(quán)利要求1所述的敲除MLDS基因的產(chǎn)油紅球菌Iihodococcussp.RHA-MLDS生產(chǎn)生物柴油的方法。4.MLDS基因和/或MLDS蛋白的抑制劑在生產(chǎn)生物柴油中的應(yīng)用，其中所述MLDS基因的NCBI登錄號(hào)為4218150。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的MLDS基因和/或MLDS蛋白的抑制劑在生產(chǎn)生物柴油中的應(yīng)用，其特征在于所述抑制劑為siRNA和/或特異性抗MLDS蛋白的抗體，所述siRNA和/或特異性抗MLDS蛋白的抗體能沉默和/或降低MLDS基因的表達(dá)及中和MLDS蛋白。6.MLDS基因和/或MLDS蛋白在制備預(yù)防和/或治療與脂質(zhì)的代謝和儲(chǔ)存障礙有關(guān)的代謝性疾病的藥物中的用途，其中所述MLDS基因的NCBI登錄號(hào)為4218150。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的MLDS基因和/或MLDS蛋白在制備預(yù)防和/或治療與脂質(zhì)的代謝和儲(chǔ)存障礙有關(guān)的代謝性疾病的藥物中的用途，其特征在于所述疾病選自肥胖癥、脂肪肝或動(dòng)脈粥樣硬化。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的MLDS基因和/或MLDS蛋白在制備預(yù)防和/或治療與脂質(zhì)的代謝和儲(chǔ)存障礙有關(guān)的代謝性疾病的藥物中的用途，其特征在于所述藥物選自重組MLDS基因蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物、MLDS基因、包含MLDS基因的重組表達(dá)載體或包含MLDS基因的重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，優(yōu)選地，所述重組MLDS基因蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物由原核表達(dá)系統(tǒng)或真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)，優(yōu)選地，所述重組表達(dá)載體為適用于基因治療的重組表達(dá)載體。9.包含重組MLDS基因蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物、MLDS基因或包含MLDS基因的重組表達(dá)載體的組合物在制備預(yù)防和/或治療與脂質(zhì)的代謝和儲(chǔ)存障礙有關(guān)的代謝性疾病的藥物中的用途，其中所述MLDS基因的NCBI登錄號(hào)為4218150。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的包含重組MLDS基因蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物、MLDS基因或包含MLDS基因的重組表達(dá)載體的組合物在制備預(yù)防和/或治療與脂質(zhì)的代謝和儲(chǔ)存障礙有關(guān)的代謝性疾病的藥物中的用途，其特征在于所述疾病選自肥胖癥、脂肪肝或動(dòng)脈粥樣硬化。全文摘要本發(fā)明涉及敲除MLDS基因的產(chǎn)油紅球菌Rhodococcussp.RHA-MLDS及其用途。具體而言，本發(fā)明涉及敲除MLDS基因的產(chǎn)油紅球菌Rhodococcussp.RHA-MLDS及其用途，并涉及MLDS基因和/或MLDS蛋白的抑制劑在生產(chǎn)生物柴油中的應(yīng)用，MLDS基因和/或MLDS蛋白和包含重組MLDS基因蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物、MLDS基因或包含MLDS基因的重組表達(dá)載體的組合物在制備預(yù)防和/或治療與脂質(zhì)的代謝和儲(chǔ)存障礙有關(guān)的代謝性疾病的藥物中的用途。本發(fā)明為生物柴油的生產(chǎn)提供了一種高效的微生物菌種。同時(shí)，本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)為與脂質(zhì)的代謝和儲(chǔ)存障礙有關(guān)的代謝性疾病的治療提供了一種候選藥物。文檔編號(hào)A61P9/10GK102586129SQ20111000378公開日2012年7月18日申請(qǐng)日期2011年1月10日優(yōu)先權(quán)日2011年1月10日發(fā)明者丁云峰,于進(jìn)海,劉平生,張慧娜,張淑妍,彭恭,杜雅蘭,楊麗,汪洋申請(qǐng)人:中國科學(xué)院生物物理研究所