專利名稱：一種小分子非編碼RNA基因hsa-miR-29b及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種RNA及其應(yīng)用，尤其涉及一種小分子非編碼RNA及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
癌癥(惡性腫瘤)已成為一個(gè)全球性公共健康問題，在我國尤為突出。衛(wèi)生部報(bào) 道，中國城鄉(xiāng)居民的癌癥死亡率在過去30年中增長了八成以上。目前，癌癥已經(jīng)成為中國 城市居民的首位死因和農(nóng)村居民的第二位死因。其中，原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(h印atocellular carcinoma,HCC)是目前世界上最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生率和死亡率均高居各種惡性 腫瘤前列。中國是肝癌的高發(fā)區(qū)，占全世界HCC患者總數(shù)的55%?，F(xiàn)今惡性腫瘤主要的治 療方法以根治性切除為主，癌癥難以根治的主要原因是局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移癌是腫 瘤復(fù)發(fā)的主要原因。眾所周知，血行轉(zhuǎn)移是腫瘤轉(zhuǎn)移的主要途徑，所以以血管生成為治療靶 標(biāo)可以有效抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，這也是目前腫瘤學(xué)研究亟待解決的問題。惡性腫瘤都是高度血 管化的，血管生成在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。新生的血管不僅為腫瘤細(xì)胞提供 營養(yǎng)，也為腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移提供了渠道，故抗血管生成是一種有效的抗腫瘤方法。一 些抑制血管生成的藥物，如多吉美，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于抗肝癌。小分子非編碼RNA，也稱微小RNA(microRNA)，是廣泛存在于各種生物體內(nèi)的一 類小分子非編碼的核糖核酸，長度約為20-22個(gè)堿基。它通過堿基配對識別靶基因信使 RNA(mRNA)的3’端非翻譯區(qū)(3’ UTO)，促進(jìn)靶基因降解或抑制其翻譯來實(shí)現(xiàn)對基因表達(dá)的 負(fù)調(diào)控，從而參與了細(xì)胞的多種生物學(xué)過程。多個(gè)證據(jù)表明，microRNA的異常表達(dá)和功能 失調(diào)直接影響著惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，一種命名為hSa-miRj9b的小分子非編碼RNA的表達(dá)在肝細(xì)胞肝 癌組織標(biāo)本中普遍下調(diào)，并且hsa-miR-29b表達(dá)低的患者無瘤生存時(shí)間顯著較短，提示其 與肝癌復(fù)發(fā)相關(guān)。而現(xiàn)有的國內(nèi)外文獻(xiàn)中至今未見有關(guān)hsa-miR-29b與腫瘤血管生成的研 究報(bào)道。進(jìn)一步研究hsa-miR-29b在腫瘤血管生成中的作用，對于制備新型抗血管生成、抗 血行轉(zhuǎn)移和抗腫瘤藥物意義重大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種小分子非編碼RNA基因，該基因命名為hSa-miRj9b， 其序列如序列表<400>1序列所示。本發(fā)明的另一目的在于提供hsa-miR-29b在制備抑制腫瘤細(xì)胞促血管生成藥物 中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的在于提供hSa-miRj9b在制備抗腫瘤血管生成藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的在于提供hsa-miR-29b在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的在于提供hsa-miR-29b在制備抗腫瘤血行轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用。本發(fā)明通過體外管形成實(shí)驗(yàn)研究hsa-miR-29b在體外恢復(fù)表達(dá)對腫瘤細(xì)胞促血 管生成功能的作用。體外管形成實(shí)驗(yàn)是在體外模擬血管內(nèi)皮細(xì)胞在體內(nèi)形成管腔結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)，通過管狀結(jié)構(gòu)的節(jié)點(diǎn)數(shù)來評估人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC出芽能力并表征人臍靜脈內(nèi)皮 細(xì)胞HUVEC的血管生成能力。上述體外管形成實(shí)驗(yàn)設(shè)A、B、C、D、E五個(gè)實(shí)驗(yàn)，上述五個(gè)實(shí)驗(yàn)內(nèi)均設(shè)置空白對照 組、陰性對照組和實(shí)驗(yàn)組。步驟一利用目的RNA轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞株，使目的RNA在腫瘤細(xì)胞株內(nèi)恢復(fù)表達(dá)，空 白對照組的腫瘤細(xì)胞株不轉(zhuǎn)染任何RNA ；上述目的RNA為hsa-miR19b、hsa-miR-29b的反義核苷酸(也稱為 anti-hsa-miR-29b)、陰性對照RNA (也稱為NC)、陰性對照RNA的反義核苷酸(也稱為 ant i-NC)其中的一種。上述腫瘤細(xì)胞株為肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞株LM6 (簡稱LM6)、肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞株H2M(簡 稱H2M)、肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞株95D (簡稱95D)或結(jié)腸腺癌細(xì)胞株HCTl 16 (簡稱HCTl 16)其中 的一種。上述NC 序列為 UUCUCCGAAC⑶⑶CACCTdTdT。步驟二 收集步驟一的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清孵育人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC，孵育后 在顯微鏡下觀察人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的生成情況。實(shí)驗(yàn)A:空白對照組加入未經(jīng)轉(zhuǎn)染的LM6腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清；陰性對照組加入NC的LM6腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清；實(shí)驗(yàn)組加入轉(zhuǎn)染hSa-miRj9b的LM6腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清；實(shí)驗(yàn)B:空白對照組加入未經(jīng)轉(zhuǎn)染的H2M腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清；陰性對照組加入轉(zhuǎn)染NC的H2M腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清；實(shí)驗(yàn)組加入轉(zhuǎn)染hSa-miRj9b的H2M腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清；實(shí)驗(yàn)C 空白對照組加入未經(jīng)轉(zhuǎn)染的LM6腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清；陰性對照組加入轉(zhuǎn)染了 anti-NC的LM6腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清；實(shí)驗(yàn)組加入轉(zhuǎn)染了 anti-hSa-miRj9b的LM6腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清；實(shí)驗(yàn)D 空白對照組加入未經(jīng)轉(zhuǎn)染的95D腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清；
陰性對照組加入NC的95D腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清；實(shí)驗(yàn)組加入轉(zhuǎn)染hSa-miRj9b的95D腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清；實(shí)驗(yàn)E 空白對照組加入未經(jīng)轉(zhuǎn)染的HCTl 16腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清；陰性對照組加入NC的HCTl 16腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清；實(shí)驗(yàn)組加入轉(zhuǎn)染hSa-miRj9b的HCTl 16腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清；對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對比分析及相關(guān)性統(tǒng)計(jì)表明實(shí)驗(yàn)A中，相對于陰性對照組和空 白對照組，實(shí)驗(yàn)組的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清明顯抑制了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC管狀結(jié)構(gòu)的形 成；實(shí)驗(yàn)B、實(shí)驗(yàn)D和實(shí)驗(yàn)E的結(jié)果與實(shí)驗(yàn)A相同。而在實(shí)驗(yàn)C中，相對于陰性對照組和空 白對照組，實(shí)驗(yàn)組中腫瘤細(xì)胞內(nèi)源表達(dá)的hsa-miR-29b被轉(zhuǎn)染后表達(dá)的ariti-hsa-miRj9b拈抗后，收集的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清更顯著的促進(jìn)了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC管狀結(jié)構(gòu)的形 成。管狀結(jié)構(gòu)的節(jié)點(diǎn)數(shù)與hsa-miR-29b表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。體外管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，hsa-miR-29b可抑制腫瘤細(xì)胞的促血管生成能力，且該 抑制腫瘤細(xì)胞的促血管生成能力的性能不具有腫瘤特異性。本發(fā)明通過裸鼠成瘤及免疫組化實(shí)驗(yàn)研究hsa-miR-29b在體內(nèi)表達(dá)對腫瘤細(xì)胞 生長和促血管生成的影響。具體實(shí)驗(yàn)步驟為(1)細(xì)胞轉(zhuǎn)染將目的RNA (NC或hsa_miR19b)轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞株，使目的RNA在腫 瘤細(xì)胞株內(nèi)恢復(fù)表達(dá)；(2)裸鼠成瘤收集步驟(1)中恢復(fù)表達(dá)的腫瘤細(xì)胞對BALB/c裸鼠進(jìn)行皮下注 射，選取5只BALB/c裸鼠，在每只BALB/c裸鼠的兩只后腿分別注射實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組的 腫瘤細(xì)胞，連續(xù)觀察并測量腫瘤的大小至1個(gè)月以上。觀察完畢后完整剝離腫瘤組織，制成 石蠟切片4°C保存。(3)免疫組化將步驟( 得到的裸鼠腫瘤組織切片和人肝癌組織切片分別進(jìn)行 免疫組化染色后在顯微鏡下觀察腫瘤組織中血管生成情況。上述步驟(2)裸鼠成瘤設(shè)置陰性對照組和實(shí)驗(yàn)組。陰性對照組的腫瘤細(xì)胞株中轉(zhuǎn) 染NC，實(shí)驗(yàn)組的腫瘤細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染hSa-miRj9b。上述步驟( 裸鼠成瘤所采用的腫瘤細(xì)胞株為肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞株LM6。上述步驟(3)人肝癌組織切片中hSa-miRj9b的表達(dá)水平通過實(shí)時(shí)定量PCR (也 稱為 realtime PCR)測定。裸鼠成瘤及對裸鼠腫瘤組織切片的免疫組化結(jié)果相對于陰性對照組，實(shí)驗(yàn)組腫 瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)形成的腫瘤生長速率明顯較低，體積較??；且實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織中形成的 微血管密度明顯較高，腫瘤細(xì)胞表達(dá)的hsa-miR-29b濃度與微血管密度呈顯著負(fù)相關(guān)。對人肝癌組織切片的免疫組化結(jié)果hSa-miR-29b表達(dá)水平高的人肝癌組織切片 血管管徑明顯較小且血管密度明顯較低。人肝癌組織切片中hsa-miR-29b濃度與微血管密 度的相對統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，兩者呈顯著負(fù)相關(guān)。裸鼠成瘤及免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，體內(nèi)恢復(fù)小分子非編碼RNA基因 hsa-miR-29b表達(dá)不僅可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力，而且顯著抑制了腫瘤血管 生成能力，從而抑制腫瘤的血行轉(zhuǎn)移。綜上所述，本發(fā)明提供的hsa-miR-29b在制備抑制腫瘤細(xì)胞促血管生成藥物、抗 腫瘤血管生成藥物、抗腫瘤藥物以及抑制腫瘤血行轉(zhuǎn)移藥物方面都有廣泛應(yīng)用。


圖1為體外管形成實(shí)驗(yàn)中經(jīng)腫瘤細(xì)胞上清孵育后的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC在 100倍顯微鏡下成像圖及其管狀結(jié)構(gòu)的相對節(jié)點(diǎn)數(shù)統(tǒng)計(jì)圖。圖1A、圖1B、圖IC分別對應(yīng)實(shí) 施例1中的實(shí)驗(yàn)A、B、C的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖1A、圖IB和圖IC從左至右依次為空白對照組、陰 性對照組和實(shí)驗(yàn)組的顯微鏡成像圖，最右側(cè)為相對節(jié)點(diǎn)數(shù)統(tǒng)計(jì)圖。圖2為體外管形成實(shí)驗(yàn)中經(jīng)腫瘤細(xì)胞上清孵育后的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC在 100倍顯微鏡下成像圖及其管狀結(jié)構(gòu)的相對節(jié)點(diǎn)數(shù)統(tǒng)計(jì)圖。圖2A采用的腫瘤細(xì)胞為肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞株95D，圖2B采用的腫瘤細(xì)胞為結(jié)腸腺癌細(xì)胞株HCT116。圖2A和圖2B從左至右 依次為空白對照組、陰性對照組和實(shí)驗(yàn)組的顯微鏡成像圖；最右側(cè)為相對節(jié)點(diǎn)數(shù)統(tǒng)計(jì)圖。圖3為裸鼠成瘤及裸鼠腫瘤組織免疫組化結(jié)果圖。圖3A為從裸鼠皮下分離出來 的腫瘤成像圖；圖3B為腫瘤生長曲線圖；圖3C為⑶34標(biāo)記的裸鼠腫瘤組織切片血管內(nèi)皮 細(xì)胞在顯微鏡下成像圖，圖3D為裸鼠腫瘤組織切片hsa-mir-29b表達(dá)水平與微血管密 度相關(guān)性分析圖。圖4為人肝癌組織免疫組化示意圖。圖4A為⑶34標(biāo)記的人肝癌組織血管內(nèi)皮細(xì) 胞于100倍鏡下成像圖；圖4B為人肝癌組織切片中has-mir-2%表達(dá)水平與微血管密度的 相關(guān)性分析圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。應(yīng)理解，以下實(shí)施例只用 于說明本發(fā)明而不以任何形式限制本發(fā)明。本發(fā)明所采用的hsa-miR-29b序列從Sanger microRNA序列數(shù)據(jù)庫miRBase V15.0獲得，由上海吉瑪公司合成。陰性對照組的陰性對照RNA序列(簡稱NC)為上海 吉瑪公司合成的用于microRNA實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)陰性對照序列，NC序列從5’端到3’端為 5，UUCUCCGAAC⑶⑶CACGUdTdT 3，。實(shí)施例1 體外管形成實(shí)驗(yàn)體外管形成實(shí)驗(yàn)是在體外模擬血管內(nèi)皮細(xì)胞在體內(nèi)形成管腔結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)。血管生 成涉及血管基底膜的降解，血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移到細(xì)胞外基質(zhì)和重組血管內(nèi)皮細(xì)胞后 成三維管狀結(jié)構(gòu)，形成新的基底膜。在體外管形成實(shí)驗(yàn)中，通過鋪基質(zhì)膠為人臍靜脈內(nèi)皮 細(xì)胞HUVEC提供細(xì)胞外基質(zhì)，模擬體內(nèi)環(huán)境，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC通過增殖，遷移和粘 附等過程，形成二維管狀結(jié)構(gòu)。出芽是血管生成的必須步驟，因此，體外可通過計(jì)算上述二 維管狀結(jié)構(gòu)的節(jié)點(diǎn)數(shù)來評估人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC出芽能力并表征人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 HUVEC的血管生成能力。1. 1細(xì)胞轉(zhuǎn)染此步驟的目的是在腫瘤細(xì)胞株中恢復(fù)目的RNA的表達(dá)，將目的RNA導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞 并恢復(fù)表達(dá)的步驟是利用hvitrogen公司的轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine RNAi MAX進(jìn)行反轉(zhuǎn) 實(shí)現(xiàn)。以M孔板為例，具體實(shí)驗(yàn)步驟為(1)取胰蛋白酶消化細(xì)胞重懸于含有10% FBS的無雙抗DMEM培養(yǎng)基(購自 Invitrogen公司)中，使得細(xì)胞密度為3 X IO4個(gè)細(xì)胞/ml ；(2)將 30p mol 目的 RNA稀釋于 100 μ 1 opti-MEM(購自 hvitrogen 公司)中，輕 敲管壁混勻；每管加入Iul Lipofectamine RNAi MAX，輕敲管壁混勻，室溫放置15min ；得到 RNAi MAX/siRNA 稀釋液；(3)每孔加入100 μ 1 RNAi MAX/siRNA稀釋液，再加入500 μ 1細(xì)胞稀釋液，該細(xì)胞 稀釋液可使細(xì)胞密度在轉(zhuǎn)染24h后大約為30-50%匯合，混勻后培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時(shí)間混 勻后培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36-48小時(shí)后進(jìn)行上清收集。獲得hsa-miRj9b的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清。 上述實(shí)施例為M孔板，其他孔板可根據(jù)孔的大小按比例放大或者縮小試劑用量。
1. 2管形成檢測按照步驟1. 1在腫瘤細(xì)胞株中恢復(fù)目的RNA的表達(dá)，收集轉(zhuǎn)染后恢復(fù)表達(dá)的腫瘤 細(xì)胞培養(yǎng)上清，與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC共培養(yǎng)。上述目的RNA可為hsa-miR19b、hsa-miR-29b的反義核苷酸(簡稱 anti-hsa-miR-29b)、陰性對照RNA (簡稱NC)、陰性對照RNA的反義核苷酸(簡稱anti_NC) 其中的一種。本實(shí)施例中采用的腫瘤細(xì)胞株選自肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞株LM6 (簡稱LM6)、肝細(xì)胞肝 癌細(xì)胞株H2M (簡稱H2M)、肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞株95D (簡稱95D)或結(jié)腸腺癌細(xì)胞株HCTl 16 (簡 稱HCTl 16)其中的一種。本實(shí)施例中LM6出自上海細(xì)胞所；H2M出自香港大學(xué)；95D從中科院細(xì)胞中心購 得；HCT116出自Bert Vogelstein&Kenneth W. Kinzler實(shí)驗(yàn)室。本實(shí)施例中未標(biāo)明具體來 源的試劑與材料均為市售標(biāo)樣。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC為本實(shí)驗(yàn)室按本領(lǐng)域常規(guī)方法制備以人臍帶(出自中 山大學(xué)附屬第二醫(yī)院)為原材料，將內(nèi)皮細(xì)胞從臍靜脈中用胰酶(購于廣州展晨公司)消 化出來后，貼于培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。本實(shí)施例共設(shè)A、B、C、D、E五個(gè)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)中均設(shè)置空白對照組、陰性對照組 和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)A 空白對照組加入未經(jīng)轉(zhuǎn)染的LM6腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清；陰性對照組加入NC的LM6腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清；實(shí)驗(yàn)組加入轉(zhuǎn)染hSa-miRj9b的LM6腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清；實(shí)驗(yàn)B 空白對照組加入未經(jīng)轉(zhuǎn)染的H2M腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清；陰性對照組加入轉(zhuǎn)染NC的H2M腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清；實(shí)驗(yàn)組加入轉(zhuǎn)染hSa-miRj9b的H2M腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清；實(shí)驗(yàn)C 空白對照組加入未經(jīng)轉(zhuǎn)染的LM6腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清；陰性對照組加入轉(zhuǎn)染了 anti-NC的LM6腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清；實(shí)驗(yàn)組加入轉(zhuǎn)染了 anti-hSa-miRj9b的LM6腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清；實(shí)驗(yàn)D 空白對照組加入未經(jīng)轉(zhuǎn)染的95D腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清；陰性對照組加入NC的95D腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清；實(shí)驗(yàn)組加入轉(zhuǎn)染hSa-miRj9b的95D腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清；實(shí)驗(yàn)E 空白對照組加入未經(jīng)轉(zhuǎn)染的HCTl 16腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清；陰性對照組加入NC的HCTl 16腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清；實(shí)驗(yàn)組加入轉(zhuǎn)染hSa-miRj9b的HCTl 16腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清；具體實(shí)驗(yàn)步驟為(1)取96孔板，以每孔1.2 X IO4個(gè)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC (細(xì)胞懸液腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清=25% 75% )貼于預(yù)包被Matrigel (R&D，MN, USA)的孔中；于37°C孵育10 小時(shí)；(2)顯微鏡下觀察加入不同腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清的各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)皮細(xì)胞的管形成情 況。通過對管狀結(jié)構(gòu)節(jié)點(diǎn)的計(jì)數(shù)表征腫瘤細(xì)胞促血管生成能力的強(qiáng)弱。所有實(shí)驗(yàn)組都是計(jì) 數(shù)復(fù)孔，以三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)取平均值。1. 3結(jié)果分析實(shí)驗(yàn)A、實(shí)驗(yàn)B和實(shí)驗(yàn)C的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。圖IA為實(shí)驗(yàn)A的結(jié)果示意圖，圖 IB為實(shí)驗(yàn)B的結(jié)果示意圖，圖IC為實(shí)驗(yàn)C的結(jié)果示意圖；實(shí)驗(yàn)D和實(shí)驗(yàn)E的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖 2所示，圖2A為實(shí)驗(yàn)D的結(jié)果示意圖，圖2B為實(shí)驗(yàn)E的結(jié)果示意圖。實(shí)驗(yàn)A、實(shí)驗(yàn)B、實(shí)驗(yàn)D、實(shí)驗(yàn)E結(jié)果分析實(shí)驗(yàn)A結(jié)果如圖IA所示，顯微鏡下空白對 照組和陰性對照組的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC形成的管狀結(jié)構(gòu)密度差異不大，而實(shí)驗(yàn)組的 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC形成的管狀結(jié)構(gòu)密度相對于空白對照組和陰性對照組明顯較低； 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC形成的管狀結(jié)構(gòu)的節(jié)點(diǎn)數(shù)與hsa-miR-29b的表達(dá)濃度的相對性統(tǒng) 計(jì)結(jié)果表明，腫瘤細(xì)胞上清中hsa-miR19b的表達(dá)水平與上述管狀結(jié)構(gòu)的節(jié)點(diǎn)數(shù)呈顯著負(fù) 相關(guān)。實(shí)驗(yàn)B、實(shí)驗(yàn)D、實(shí)驗(yàn)E的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別如圖1B、圖2A、圖2B所示，與實(shí)驗(yàn)A的實(shí)驗(yàn) 結(jié)果相同。說明腫瘤細(xì)胞上清中hsa-miRj9b的表達(dá)明顯抑制了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC 的管狀結(jié)構(gòu)形成。實(shí)驗(yàn)C的結(jié)果分析如圖IC所示，顯微鏡下空白對照組和陰性對照組的人臍靜 脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC形成的管狀結(jié)構(gòu)密度差異不大，而實(shí)驗(yàn)組的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC 形成的管狀結(jié)構(gòu)密度相對于空白對照組和陰性對照組明顯較高；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 HUVEC形成的管狀結(jié)構(gòu)的節(jié)點(diǎn)數(shù)與anti-hsa-miR-29b表達(dá)濃度的相對性統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明， anti-hSa-miR-29b的表達(dá)水平與上述管狀結(jié)構(gòu)的節(jié)點(diǎn)數(shù)呈顯著正相關(guān)。說明腫瘤細(xì)胞上清 中腫瘤細(xì)胞內(nèi)源表達(dá)的hsa-miR-29b被轉(zhuǎn)染后表達(dá)的anti-hsa-miR-29b拈抗后，收集的腫 瘤細(xì)胞上清更顯著的促進(jìn)了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC管狀結(jié)構(gòu)形成。結(jié)果顯示，hsa-miR-29b可抑制腫瘤細(xì)胞的促血管生成能力，且該抑制腫瘤細(xì)胞的 促血管生成能力的性能不具有腫瘤特異性。實(shí)施例2裸鼠成瘤及免疫組化實(shí)驗(yàn)2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染利用hvitrogen公司的轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine RNAi MAX轉(zhuǎn)染目的 RNA(hsa-miR-29b或NC)到肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞株LM6 (簡稱LM6，出自上海細(xì)胞所)，目的RNA 終濃度為50nM，培養(yǎng)4 后用胰酶消化并計(jì)數(shù)后按1 X IO7個(gè)/ml的濃度用PBS重懸。本實(shí) 施例中未標(biāo)明具體來源的試劑與材料均為市售標(biāo)樣。2. 2裸鼠成瘤選用5只5周齡的BALB/c裸鼠，在其兩只后腿分別皮下注射IX IO6恢復(fù) hsa-miR-29b或NC表達(dá)LM6腫瘤細(xì)胞。連續(xù)觀察并測量腫瘤的大小至1個(gè)月以上。完整剝 離所有裸鼠的腫瘤組織，按本領(lǐng)域常規(guī)方法制成石蠟切片4°C保存。2. 3免疫組化本實(shí)施例對步驟2. 2中得到的裸鼠腫瘤組織切片進(jìn)行免疫組化，利用特異性的 CD34抗體標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過顯色原理使被標(biāo)記的血管內(nèi)皮細(xì)胞顯色并使用顯微鏡觀察腫瘤組織切片中血管生成情況。同時(shí)按相同原理對人肝癌組織切片進(jìn)行免疫組化，觀察 人肝癌組織切片中的血管生成情況。上述人肝癌組織切片取自中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院標(biāo)本庫，人肝癌組織切片中 hsa-miRj9b的表達(dá)水平事先通過實(shí)時(shí)定量PCR(也稱為real time PCR)測定。免疫組化步驟為(1)預(yù)處理取出55 °C烤片lh，放于二甲苯中脫蠟兩次，每次IOmin ；依次用 100 %、95 %、90 %、80 %、70 %的乙醇洗一次，每步3min，后用雙蒸水洗!Bmin ；0. 3 %的雙氧 水處理lOmin，雙蒸水再洗3次，每次3min ；浸泡于修復(fù)液中，用微波爐進(jìn)行熱修復(fù)，室溫冷 卻半小時(shí)；用IXPBS洗三次，每次:3min ；(2)雜交染色用人或鼠特異性的-⑶34抗體進(jìn)行孵育，4°C過夜；恢復(fù)室溫，棄去 抗體液，用IXPBS洗三次，每次5min ；加入二抗，37°C半小時(shí)；用1 XPBS洗三次，每次5min ； 加入DAB顯色液進(jìn)行顯色，然后用蘇木精復(fù)染；(3)計(jì)數(shù)微血管密度(MVD)計(jì)數(shù)，先尋找血管最密集區(qū)，然后在100倍鏡下觀察 染成棕色的單個(gè)細(xì)胞或連續(xù)細(xì)胞叢，并以此計(jì)為一個(gè)血管，以5個(gè)視野的均數(shù)表示該標(biāo)本 的微血管密度。2. 4結(jié)果分析裸鼠成瘤以及對裸鼠腫瘤組織切片的免疫組化結(jié)果如圖3所示，恢復(fù) hsa-miR-29b表達(dá)的實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)形成的腫瘤生長速率明顯較低，體積較小 (見圖3A和圖;3B)；且實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織中形成的微血管密度相對于陰性對照組明顯較高， 腫瘤細(xì)胞表達(dá)的hsa-miR-29b濃度與微血管密度的相對統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，兩者呈顯著負(fù)相關(guān) (圖3C和圖3D)。類似地，對人肝癌組織切片的免疫組化結(jié)果如圖4所示，通過免疫組化標(biāo)記血管 內(nèi)皮細(xì)胞，可以發(fā)現(xiàn)hsa-miR-29b高表達(dá)的人肝癌組織切片的血管管徑明顯較小且血管密 度明顯較低(見圖4A)。人肝癌組織切片中hsa-miR-29b濃度與微血管密度的相對統(tǒng)計(jì)結(jié) 果顯示，兩者呈顯著負(fù)相關(guān)(見圖4B)。綜上所述，恢復(fù)hsa-miR-29b表達(dá)不僅可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力， 而且顯著抑制了腫瘤血管生成能力，從而可抑制腫瘤細(xì)胞通過血行途徑形成轉(zhuǎn)移瘤。
權(quán)利要求
1.一種小分子非編碼RNA，其特征在于序列如序列表<400>1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小分子非編碼RNA在制備抑制腫瘤細(xì)胞促血管生成藥物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征還在于所述腫瘤為實(shí)體瘤。
4.根據(jù)權(quán)利要去3所述的應(yīng)用，其特征還在于所述實(shí)體瘤選自原發(fā)性肝細(xì)胞瘤、肺巨 細(xì)胞瘤或結(jié)腸腺瘤。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小分子非編碼RNA在制備抗腫瘤血管生成藥物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述的腫瘤為實(shí)體瘤。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述的實(shí)體瘤選自原發(fā)性肝細(xì)胞瘤、肺巨 細(xì)胞瘤或結(jié)腸腺瘤。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小分子非編碼RNA在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述的腫瘤為實(shí)體瘤。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述的實(shí)體瘤選自原發(fā)性肝細(xì)胞瘤、肺 巨細(xì)胞瘤或結(jié)腸腺瘤。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小分子非編碼RNA在制備抗腫瘤血行轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其特征在于所述的腫瘤為實(shí)體瘤。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其特征在于所述的實(shí)體瘤選自原發(fā)性肝細(xì)胞瘤、肺 巨細(xì)胞瘤或結(jié)腸腺瘤。
全文摘要
本發(fā)明提供一種小分子非編碼RNA(該小分子非編碼RNA命名為hsa-miR-29b)及其應(yīng)用。本發(fā)明進(jìn)行了體外管形成實(shí)驗(yàn)和裸鼠成瘤及免疫組化實(shí)驗(yàn)，體外管形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明體外恢復(fù)hsa-miR-29b表達(dá)可顯著抑制腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的血管生成；裸鼠成瘤及免疫組化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明體內(nèi)恢復(fù)hsa-miR-29b表達(dá)可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力和腫瘤血管生成能力，從而抑制腫瘤血行轉(zhuǎn)移。因此，hsa-miR-29b可用于制備抑制腫瘤細(xì)胞促血管生成藥物、抗腫瘤血管生成藥物、抗腫瘤藥物和抗腫瘤血行轉(zhuǎn)移藥物。
文檔編號A61K48/00GK102146412SQ201110004598
公開日2011年8月10日 申請日期2011年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月11日
發(fā)明者周慧超, 莊詩美, 方堅(jiān)鴻 申請人:中山大學(xué)