專利名稱：一種豬瘟亞單位疫苗復合免疫佐劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于豬瘟亞單位抗原肌注免疫的復合佐劑，屬于生物技術領域， 專用于提高豬瘟亞單位疫苗的免疫效果。
背景技術：
豬瘟(Classical Swine i^ever)是由豬瘟病毒引起豬的一種急性熱性傳染病，該病傳染性強，病死率高，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成重大經濟損失。世界動物衛(wèi)生組織將它列入A類 16種動物傳染病之一。豬瘟病毒只有一個血清型。豬群對豬瘟的免疫力與中和抗體一致，以體液免疫為主。免疫母豬可通過初乳將抗體傳給仔豬，并使其獲得一定的被動免疫力，可以持續(xù)1-2個月。母源抗體對豬瘟弱毒疫苗的免疫有一定的干擾作用。我國從1956年起就廣泛應用兔化弱毒疫苗進行豬群的預防接種，取得了顯著的效果。但是免疫豬群仍時有豬瘟發(fā)生，豬群先天性感染或發(fā)生免疫抑制導致免疫失敗是重要原因之一。目前尚沒有方法區(qū)分商品豬群的弱毒疫苗接種和野毒感染，因此一些發(fā)達國家禁止使用弱毒疫苗進行豬瘟的預防。近年來，歐洲一些國家研制的豬瘟病毒E2蛋白亞單位疫苗顯示出良好的應用前景。盡管基因工程亞單位疫苗由于安全性好、受母源抗體干擾小、能夠配套試劑盒區(qū)分疫苗免疫和野毒感染等優(yōu)點具有廣闊的應用前景，但是基因工程亞單位抗原免疫原性相對較弱、抗體應答慢，為了更好的激發(fā)豬體的免疫系統(tǒng)，使其對豬瘟病毒有足夠的抵抗力， 有必要尋求安全高效的方法提高基因工程亞單位疫苗的免疫活性。目前提高亞單位疫苗免疫活性的方法不僅限于疫苗抗原的改進，選擇合適的免疫佐劑來刺激免疫系統(tǒng)，增強動物免疫系統(tǒng)對抗原物質的攝取、加工和遞呈等免疫應答也是一個重要的途徑。一個理想的免疫佐劑應該特異性輔助疫苗抗原激活免疫系統(tǒng)，同時不會對動機體產生副作用。α干擾素是動物機體遭受病原感染時產生的一種具有抗病毒和免疫調節(jié)功能的細胞因子。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，IFN-α在動物的先天性免疫向獲得性免疫的發(fā)展中起著十分重要的作用。一方面抑制病原的增殖與傳播，另一方面刺激抗原遞呈細胞的分化和成熟、 激活淋巴免疫細胞，如提高NK細胞的殺傷活性、巨噬細胞的吞噬活性等，從而建立高效的病原或抗原特異性獲得性免疫應答。國外近期研究發(fā)現(xiàn)與單獨免疫流感疫苗相比，一定劑量的α干擾素配合流感疫苗免疫小鼠可顯著提高血清中特異性IgG2 α和IgA的水平，并對10倍致死劑量流感病毒的攻擊產生完全的免疫保護，而單獨流感疫苗免疫小鼠的保護率近有60%。但是α干擾素在動物機體中的半衰期較短，難以發(fā)揮較為持續(xù)的免疫刺激作用，免疫佐劑效果有時不夠穩(wěn)定。氫氧化鋁佐劑是以4. 5nmX2. 2nmX IOnm存在的纖維狀粒子，這種粒子聚集后以松散的1-10 μ m大小的形式存在。抗原與氫氧化鋁佐劑的吸附作用主要是依靠靜電引力、 疏水作用和配體交換。因此，氫氧化鋁佐劑與干擾素和抗原蛋白等配合后不會引起活性蛋白的變性和失活，從而發(fā)揮協(xié)同增強的免疫調節(jié)功能。

發(fā)明內容
針對以上所述，本發(fā)明提供了一種豬瘟亞單位疫苗的復合免疫佐劑，用于與豬瘟亞單位抗原配合，通過肌注免疫提高豬瘟亞單位疫苗的免疫原性，增強豬體免疫系統(tǒng)對豬瘟抗原的免疫應答，更安全、高效的預防豬瘟的發(fā)生。為達到以上目的，本發(fā)明采用了以下技術方案一種豬瘟亞單位疫苗的復合免疫佐劑，該復合免疫佐劑由重組豬α干擾素和氫氧化鋁佐劑配合而成，每頭份豬瘟亞單位疫苗中重組豬α干擾素的含量為IX 10 ;所述的重組豬α干擾素是通過重組DNA技術將豬 α干擾素基因在各種表達系統(tǒng)中高效表達產生的具有抗病毒活性的豬α干擾素蛋白；復合免疫佐劑綜合了氫氧化鋁佐劑顆?；忈屪饔煤拓iα干擾素的免疫調節(jié)作用。采用以上技術方案后，本發(fā)明具有以下有益效果復合免疫佐劑可顯著增強仔豬對豬瘟Ε2蛋白抗原的免疫應答；復合免疫佐劑顯著提高豬瘟Ε2蛋白抗原頸部肌注免疫仔豬后產生的豬瘟特異性中和抗體水平；復合免疫佐劑可顯著增強豬瘟Ε2蛋白抗原免疫豬體后產生的免疫記憶。


圖1為本發(fā)明復合免疫佐劑對豬瘟亞單位疫苗單次免疫誘導抗體消長的影響。圖2為本發(fā)明復合免疫佐劑對豬瘟亞單位疫苗初免和二免后產生中和抗體水平的影響。圖3為本發(fā)明復合免疫佐劑對豬瘟亞單位疫苗接種豬免疫記憶的影響。
具體實施例方式本發(fā)明一種豬瘟亞單位疫苗復合免疫佐劑，該復合免疫佐劑由重組豬α干擾素和氫氧化鋁佐劑配合而成，每頭份豬瘟亞單位疫苗中重組豬α干擾素的含量為IX 10 。所述的重組豬α干擾素是通過重組DNA技術將豬α干擾素基因在表達系統(tǒng)中所表達產生的具有抗病毒活性的豬α干擾素蛋白。1、重組豬α干擾素的制備參照文獻[周國棟.豬α干擾素在畢赤酵母中的分泌表達及其免疫佐劑功能.南京農業(yè)大學碩士論文，2006]的方法發(fā)酵獲得重組豬α干擾素，通過50kDa濾膜除去大分子雜質，再經5kDa濾膜超濾除鹽濃縮后用無菌生理鹽水稀釋為107U/mL。2、氫氧化鋁佐劑的制備取5%硫酸鋁溶液250ml，在強烈攪拌下加入5%氫氧化鈉溶液100ml，用生理鹽水離心洗滌沉淀2次，再懸入生理鹽水中使達250ml。免疫接種時，取適量氫氧化鋁佐劑加等體積抗原即可免疫。3、重組豬瘟亞單位抗原的制備參照文獻[(1)徐學清，曹瑞兵，蔡梅紅，任雪楓，周斌，陳溥言.豬瘟病毒E2蛋白A/D抗原域在畢赤酵母中的表達.西北農林科技大學學報(自然科學版).2005，33 (3) 11-15.和(2)徐學清，鄭其升，曹瑞兵，蘇小運，陳溥言.豬瘟病毒E2蛋白B/C抗原區(qū)基因在畢赤酵母中的表達與鑒定.中國生物工程雜志.2004，M (9) :53-57.]的方法發(fā)酵獲得豬瘟病毒E2蛋白A/D抗原和B/C抗原蛋白，分別通過50kDa濾膜除去大分子雜質，再經5kDa 濾膜超濾除鹽濃縮，用無菌生理鹽水稀釋配置豬瘟亞單位抗原，豬瘟病毒E2蛋白A/D抗原和B/C抗原蛋白含量均為0. 5mg/mL。4、復合免疫佐劑豬瘟亞單位疫苗的制備將上述氫氧化鋁佐劑、重組豬α干擾素和重組豬瘟Ε2蛋白抗原生理鹽水按 5:1: 4的比例混合、配勻。ImL佐劑疫苗中含有豬瘟病毒Ε2蛋白A/D抗原和B/C抗原蛋白各200 μ g和重組豬α干擾素106U。根據附圖所示，本發(fā)明將11頭(一窩)30日齡仔豬隨機分成4組，豬瘟細胞苗組 (A)、無佐劑豬瘟亞單位疫苗組(B)、復合免疫佐劑豬瘟亞單位疫苗組(C)各3頭，生理鹽水對照組(D)2頭。無佐劑豬瘟亞單位疫苗的抗原蛋白含量與復合免疫佐劑豬瘟亞單位疫苗相等，系用生理鹽水配制。與在35日齡分別在耳后頸部肌注疫苗或生理鹽水2mL;3周后各組加強免疫一次，免疫疫苗與劑量與初免相同；初免后7周各組均用商品化豬瘟細胞苗三免。各組仔豬分別在初免后0、3、5、7和9周采血樣化驗。本發(fā)明復合免疫佐劑豬瘟亞單位疫苗免疫效果測定細胞微量病毒中和試驗檢測豬瘟中和抗體，采用固定病毒量，稀釋血清的方法。血清樣品經56°C滅活30分鐘后過濾除菌，用PBS倍比稀釋。在96孔細胞板上將50 μ L各稀釋度的血清樣品與50 μ L 200 TCID50 的豬瘟病毒混合，在37°C作用lh，每個血清稀釋度重復2孔。加入IOOyL IXlO4個H(15 細胞37°C繼續(xù)培養(yǎng)72h。應用豬瘟單克隆抗體進行間接免疫熒光法檢測細胞中的豬瘟病毒。能夠完全中和病毒的血清樣品最大稀釋度即為中和抗體效價。試驗結果(表1)顯示試驗豬為規(guī)?；i場的商品仔豬，在35日齡時部分仔豬體內存在低水平的豬瘟中和抗體。初免后3周無免疫佐劑豬瘟亞單位疫苗免疫組的3頭豬均沒有產生中和抗體；復合免疫佐劑豬瘟亞單位疫苗免疫組的3頭仔豬均有豬瘟中和抗體的升高，但與商品化豬瘟細胞苗免疫組類似，中和抗體的水平還較低；二免疫后三組接種疫苗的仔豬均出現(xiàn)豬瘟中和抗體水平的提高，復合免疫佐劑豬瘟亞單位疫苗免疫組仔豬的豬瘟中和抗體水平顯著高于無佐劑疫苗組，但略低于商品化豬瘟細胞苗免疫組。在一免后9 周，各疫苗接種組仔豬在豬瘟疫苗活毒的刺激下，中和抗體水平顯著提高，復合免疫佐劑豬瘟亞單位疫苗免疫組產生了類似商品化豬瘟細胞苗的免疫記憶，豬瘟中和抗體提升幅度顯著高于無佐劑疫苗組。結果表明，復合免疫佐劑可促進豬體對豬瘟亞單位抗原的免疫應答， 產生更高效的抗原免疫記憶。兔體發(fā)熱保護試驗模型評價豬瘟亞單位疫苗的免疫保護效果豬瘟病毒兔化弱毒株(HCLV)又稱C株，是石門株豬瘟病毒在兔體長期傳代的致弱株。HCLV對兔體沒有致病性，但在首次靜脈接種48_%h后可引起兔的特征性發(fā)熱，二次接種不會再引起典型熱；如果接種HCLV被試驗豬血清中的豬瘟抗體中和，則接種兔體不會引起發(fā)熱，再次攻毒后發(fā)生典型熱。中國獸藥監(jiān)察所常用兔體發(fā)熱保護試驗作為判定試驗豬瘟疫苗有效性的動物模型。取二免后2周的豬血清進行兔體攻毒保護試驗，取用生理鹽水1 16稀釋的血清樣品500 μ L與等體積的含100倍兔體反應熱的HCLV在室溫(15_25°C )作用lh，靜脈接種 2月齡清潔級大白兔，每他測一次直腸溫度，高于40°C判定為發(fā)熱。在兔體溫度恢復正常后用100倍兔體反應熱的HCLV第二次攻毒，記錄體溫檢測數據。
表1豬血清樣品中豬瘟中和抗體滴度檢測結果
權利要求
1.一種豬瘟亞單位疫苗復合免疫佐劑，其特征在于該復合免疫佐劑由重組豬α干擾素和氫氧化鋁佐劑配合而成，每頭份豬瘟亞單位疫苗中重組豬α干擾素的含量為1 XlOfiUtj
2.根據權利要求1所述的一種豬瘟亞單位疫苗復合免疫佐劑，其特征在于所述的重組豬α干擾素是通過重組DNA技術將豬α干擾素基因在表達系統(tǒng)中所表達產生的具有抗病毒活性的豬α干擾素蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種豬瘟亞單位疫苗復合免疫佐劑，該復合免疫佐劑由重組豬α干擾素和氫氧化鋁佐劑配合而成，每頭份豬瘟亞單位疫苗中重組豬α干擾素的含量為1×106U；所述的重組豬α干擾素是通過重組DNA技術將豬α干擾素基因在各種表達系統(tǒng)中高效表達產生的具有抗病毒活性的豬α干擾素蛋白；復合免疫佐劑綜合了氫氧化鋁佐劑顆?；忈屪饔煤拓iα干擾素的免疫調節(jié)作用。
文檔編號A61K39/39GK102188702SQ20111002349
公開日2011年9月21日 申請日期2011年1月14日 優(yōu)先權日2011年1月14日
發(fā)明者吳雙, 左偉勇, 曹瑞兵, 朱善元, 楊海峰, 洪偉鳴, 王健, 王安平, 王永娟, 黃文強 申請人:左偉勇, 曹瑞兵, 朱善元