專利名稱：淡水魚(yú)氣單胞菌二聯(lián)滅活疫苗及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及二聯(lián)滅活疫苗，具體涉及一種淡水魚(yú)嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌二聯(lián)滅活疫苗及制備方法。
背景技術(shù)：
淡水魚(yú)類細(xì)菌性出血病又稱細(xì)菌性出血性敗血癥、暴發(fā)性出血病、出血性腹水病等，是危害淡水養(yǎng)殖魚(yú)類最為嚴(yán)重的傳染病之一，危害的魚(yú)類主要有鰱、鳙、鯽、鯉、魴、鯪、 鰻、鱖等魚(yú)類。該病發(fā)病急，危害的淡水魚(yú)種類多，危害魚(yú)的規(guī)格范圍大，流行面積廣，流行季節(jié)長(zhǎng)，給淡水養(yǎng)殖業(yè)造成較為嚴(yán)重的損失。該病病原主要是氣單胞菌屬UaroM^M)的嗜水氣單胞菌U hydrophila )和溫和氣單胞菌(A sobria )，其廣泛存在于淡水、污水及土壤。具有廣泛的致病性，感染包括冷血?jiǎng)游镌趦?nèi)的多種動(dòng)物，引致敗血癥或皮膚潰瘍等局部感染，是水生動(dòng)物尤其是魚(yú)類最常見(jiàn)的致病菌。疫苗是預(yù)防疾病的有效手段，能刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生抗體，可使魚(yú)類特異抵御病原的攻擊，在提高魚(yú)類特異性免疫水平的同時(shí)亦能增強(qiáng)機(jī)體抗不良應(yīng)激的能力，作為符合環(huán)境友好和可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的病害防控措施，已成為國(guó)際現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)規(guī)范內(nèi)容之一。目前我國(guó)魚(yú)用疫苗獲得新獸藥證書(shū)的只有 3項(xiàng)，水產(chǎn)動(dòng)物的細(xì)菌類疫苗發(fā)明專利大多數(shù)涉及單苗及其實(shí)驗(yàn)室制備方法，而對(duì)淡水魚(yú)類危害最大的氣單胞菌聯(lián)合疫苗及其工廠化制備方法還未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于為了克服單一滅活苗只針對(duì)一種病原菌的缺點(diǎn)，提供一種二聯(lián)疫苗以達(dá)到一次施用可以同時(shí)抵御兩種病原菌的效果，疫苗通過(guò)浸泡、注射或拌和飼料投喂均可方便施用。本發(fā)明所述的淡水魚(yú)氣單胞菌二聯(lián)滅活疫苗，包括以下滅活抗原組合物嗜水氣單胞菌培養(yǎng)物滅活液和溫和氣單胞菌培養(yǎng)物滅活液。根據(jù)本發(fā)明所述的淡水魚(yú)氣單胞菌二聯(lián)滅活疫苗的進(jìn)一步特征，所述嗜水氣單胞菌培養(yǎng)物滅活液占50%，其中細(xì)菌濃度不少于25億cfu/ml ；所述溫和氣單胞菌培養(yǎng)物滅活液，占50%，其中細(xì)菌濃度不少于25億cfu/ml。本發(fā)明還提供了所述的淡水魚(yú)氣單胞菌二聯(lián)滅活疫苗的工廠化制備方法，其特征在于將嗜水氣單胞菌培養(yǎng)物滅活液和溫和氣單胞菌培養(yǎng)物滅活液按1:1的比例混合均勻，無(wú)菌灌裝，即得到淡水魚(yú)氣單胞菌二聯(lián)滅活疫苗成品。根據(jù)本發(fā)明所述的淡水魚(yú)氣單胞菌二聯(lián)滅活疫苗的工廠化制備方法，包括以下步驟
a.一級(jí)種子制備嗜水氣單胞菌菌種或溫和氣單胞菌菌種接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，28°C培養(yǎng)，24小時(shí)，挑菌苔接種營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，28°C，搖瓶培養(yǎng)18小時(shí)，制備一級(jí)種子液；
b.二級(jí)種子制備將一級(jí)種子液接種50L發(fā)酵罐，培養(yǎng)基為產(chǎn)毒素培養(yǎng)基J8°C， 30-60L/min的通氣量，攪拌通氣培養(yǎng)10-16小時(shí)，制備二級(jí)種子液；c.制苗菌液培養(yǎng)將二級(jí)種子液接種500L發(fā)酵罐，培養(yǎng)基為產(chǎn)毒素培養(yǎng)基J8°C， 150-200L/min的通氣量，攪拌通氣培養(yǎng)10-14小時(shí)，得到制備疫苗的菌液，活菌數(shù)50億 cfu/ml以上為合格；
d.滅活菌液加入0.35%甲醛液，37°C，滅活M小時(shí)，進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)和甲醛殘留檢驗(yàn)合格，得到嗜水氣單胞菌培養(yǎng)物滅活液或溫和氣單胞菌培養(yǎng)物滅活液；
e.配苗分別將兩種細(xì)菌培養(yǎng)物滅活液按1:1的比例輸入配苗罐，罐內(nèi)混合液攪拌均
勻；
f.分裝無(wú)菌條件下進(jìn)行分裝、軋蓋、得到淡水魚(yú)氣單胞菌二聯(lián)滅活疫苗成品。本發(fā)明中的淡水魚(yú)氣單胞菌二聯(lián)滅活疫苗工廠化制備工藝成熟，成本不高。疫苗可通過(guò)浸泡、注射、拌和飼料投喂等方式施用，免疫鰱、鳙、鯽、鯉、魴、鯪、鰻、鱖等淡水養(yǎng)殖魚(yú)類，免疫效果良好，可有效預(yù)防嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌引起的淡水魚(yú)類出血性敗血癥，減少預(yù)防性抗生素類漁藥的使用。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明不限于下述實(shí)施例。實(shí)施例一淡水魚(yú)氣單胞菌二聯(lián)滅活疫苗的工廠化制備 1、一級(jí)種子制備
把保存在冰箱的菌種(嗜水氣單胞菌株、溫和氣單胞菌株)取出，接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂(培養(yǎng)基配方見(jiàn)附錄)，培養(yǎng)M小時(shí)，用接種棒挑菌苔接營(yíng)養(yǎng)瓊脂，培養(yǎng)M小時(shí)，接種營(yíng)養(yǎng)肉湯(培養(yǎng)基配方見(jiàn)附錄)300ml/瓶，10瓶，放搖床200rmp/min，28°C，培養(yǎng)18小時(shí)，得到 3L—級(jí)種子。本實(shí)施例選擇的菌種為嗜水氣單胞菌菌株YYK090901，分離自鳙魚(yú)腎臟；溫和氣單胞菌菌株LYK090702，分離自鰱魚(yú)腎臟；目前菌種均保存在中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所魚(yú)病室。2、二級(jí)種子制備
按配方配制的20L產(chǎn)毒素培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方見(jiàn)本說(shuō)明書(shū)附錄)，加入到50L發(fā)酵罐， 121°C , 20分鐘滅菌，培養(yǎng)基冷卻后，將3L —級(jí)種子液接種發(fā)酵罐，28 V，通氣量40L/min， 250rmp/min，攪拌培養(yǎng)12小時(shí)，得到二級(jí)液體種子。3、制備疫苗的菌液培養(yǎng)
按配方配制的180L產(chǎn)毒素培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方見(jiàn)本說(shuō)明書(shū)附錄)，加入到500L發(fā)酵罐， 121°C, 20分鐘滅菌，培養(yǎng)基冷卻后，將純粹及合格的二級(jí)種子接入發(fā)酵罐，發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)液溫度為280C，無(wú)菌空氣流量10. 5M3/小時(shí)(175L/min), 200 rmp /min培養(yǎng)菌液12小時(shí)，培養(yǎng)結(jié)束后無(wú)菌采樣，進(jìn)行純粹和活菌數(shù)檢測(cè)(參照《中華人民共和國(guó)獸藥典》二 00五年版第三部)，活菌數(shù)需達(dá)到50億CFU/mL以上為合格菌液。4、滅活
將合格菌液通過(guò)管道輸送到滅活罐，無(wú)菌操作加入甲醛液，甲醛最終濃度為0. 35%，以 37°C滅活，滅活M小時(shí)，期間每隔4小時(shí)攪拌一次，滅活好的菌液冷卻至1 5°C之間，進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)和甲醛殘留檢驗(yàn)(參照《中華人民共和國(guó)獸藥典》二 00五年版第三部)。5、配苗分別將兩種細(xì)菌的合格滅活液按1 :1的比例輸入配苗罐，罐內(nèi)混合液攪拌均勻。6、分裝
無(wú)菌條件下進(jìn)行分裝、軋蓋，得到淡水魚(yú)氣單胞菌二聯(lián)滅活疫苗成品。經(jīng)測(cè)定，所得的淡水魚(yú)氣單胞菌二聯(lián)滅活疫苗中，嗜水氣單胞菌培養(yǎng)物滅活液占 50%，其中細(xì)菌濃度不少于25億cfu/ml ；溫和氣單胞菌培養(yǎng)物滅活液，占50%，其中細(xì)菌濃度不少于25億cfu/ml ο實(shí)施例二.淡水魚(yú)氣單胞菌二聯(lián)滅活疫苗的免疫效果
將健康鯽魚(yú)(30-50g/尾)隨機(jī)分成三組，每組100尾。第一組為注射免疫組，每尾腹腔注射實(shí)施例一所制備的淡水魚(yú)氣單胞菌二聯(lián)滅活疫苗0. Iml ；第二組為浸泡免疫組， 先將實(shí)驗(yàn)魚(yú)在l%NaCL溶液中浸泡3-5min，然后在10倍稀釋的二聯(lián)疫苗液中充氣浸泡 10-15min ；第三組為對(duì)照組。水溫為22-26 °C。在免疫28d后，分別用2倍LD50劑量的嗜水氣單胞菌菌株YYK090901和溫和氣單胞菌菌株LYK090702(嗜水氣單胞菌菌株YYK090901 分離自鳙魚(yú)腎臟，溫和氣單胞菌菌株LYK090702分離自鰱魚(yú)腎臟，目前菌種保存在中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所魚(yú)病室)，腹腔注射感染試驗(yàn)魚(yú)，并飼養(yǎng)觀察7天，記錄各組試驗(yàn)魚(yú)的發(fā)病和死亡情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，注射免疫組對(duì)菌株YYK090901、LYK090702的相對(duì)免疫保護(hù)率分別為84%、89%，浸泡組分別為57%、59% (見(jiàn)表1)。 表1 二聯(lián)苗免疫的效果
權(quán)利要求
1.一種淡水魚(yú)氣單胞菌二聯(lián)滅活疫苗，其特征在于，所述疫苗包括以下滅活抗原組合物嗜水氣單胞菌培養(yǎng)物滅活液和溫和氣單胞菌培養(yǎng)物滅活液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的淡水魚(yú)氣單胞菌二聯(lián)滅活疫苗，其特征在于所述嗜水氣單胞菌培養(yǎng)物滅活液占50%，其中細(xì)菌濃度不少于25億cfu/ml ；所述溫和氣單胞菌培養(yǎng)物滅活液，占50%，其中細(xì)菌濃度不少于25億cfu/ml。
3.如權(quán)利要求1所述的淡水魚(yú)氣單胞菌二聯(lián)滅活疫苗的工廠化制備方法，其特征在于，包括以下步驟a.一級(jí)種子制備嗜水氣單胞菌菌種或溫和氣單胞菌菌種接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，28°C培養(yǎng)二4小時(shí)，挑菌苔接種營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，28°C，搖瓶培養(yǎng)18小時(shí)，制備一級(jí)種子液；b.二級(jí)種子制備將一級(jí)種子液接種50L發(fā)酵罐，培養(yǎng)基為產(chǎn)毒素培養(yǎng)基J8°C， 30-60L/min的通氣量，攪拌通氣培養(yǎng)10-16小時(shí)，制備二級(jí)種子液；c.制苗菌液培養(yǎng)將二級(jí)種子液接種500L發(fā)酵罐，培養(yǎng)基為產(chǎn)毒素培養(yǎng)基J8°C， 150-200L/min的通氣量，攪拌通氣培養(yǎng)10-14小時(shí)，得到制備疫苗的菌液，活菌數(shù)50億 cfu/ml以上為合格；d.滅活菌液加入0.35%甲醛液，37°C，滅活M小時(shí)，進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)和甲醛殘留檢驗(yàn)合格，得到嗜水氣單胞菌培養(yǎng)物滅活液或溫和氣單胞菌培養(yǎng)物滅活液；e.配苗分別將兩種細(xì)菌培養(yǎng)物滅活液按1:1的比例輸入配苗罐，罐內(nèi)混合液攪拌均勻；f.分裝無(wú)菌條件下進(jìn)行分裝、軋蓋、得到淡水魚(yú)氣單胞菌二聯(lián)滅活疫苗成品。
全文摘要
本發(fā)明涉及二聯(lián)滅活疫苗，具體涉及一種淡水魚(yú)嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌二聯(lián)滅活疫苗及制備方法。本發(fā)明所述的一種淡水魚(yú)氣單胞菌二聯(lián)滅活疫苗，包括以下滅活抗原組合物嗜水氣單胞菌培養(yǎng)物滅活液和溫和氣單胞菌培養(yǎng)物滅活液。本發(fā)明還提供了所述的淡水魚(yú)氣單胞菌二聯(lián)滅活疫苗的工廠化制備方法，其特征在于將嗜水氣單胞菌培養(yǎng)物滅活液和溫和氣單胞菌培養(yǎng)物滅活液按1:1的比例混合均勻，無(wú)菌灌裝，即得到淡水魚(yú)氣單胞菌二聯(lián)滅活疫苗成品。本發(fā)明克服了單一滅活苗只針對(duì)一種病原菌的缺點(diǎn)，提供的二聯(lián)疫苗可達(dá)到一次施用可以同時(shí)抵御兩種病原菌的效果，疫苗通過(guò)浸泡、注射或拌和飼料投喂均可方便施用。
文檔編號(hào)A61P31/04GK102366629SQ201110025849
公開(kāi)日2012年3月7日 申請(qǐng)日期2011年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月25日
發(fā)明者任燕, 劉禮輝, 吳淑勤, 潘厚軍, 王慶, 石存斌, 賴迎迢, 陶家發(fā) 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所