專利名稱：一種抗egfr人源化抗體l2-h3及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗EGFR人源化抗體L2-H3及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
表皮生長(zhǎng)因子受體(印idemic growth factor receptor, EGFR)是表皮生長(zhǎng)因子基因(erbB)家族的一員，在約30%的人體腫瘤中過度表達(dá)，尤其是非小細(xì)胞型肺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌和結(jié)直腸癌等。國(guó)內(nèi)外許多研究表明，針對(duì)EGFR的抗體可有效地在胞外通過阻斷配體的結(jié)合來實(shí)現(xiàn)對(duì)EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制，對(duì)多種由EGFR過度表達(dá)或/和突變所引起的人體腫瘤，尤其是頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(80% 100%)，結(jié)直腸癌(25% 77%)， 非小細(xì)胞型肺癌(40% 80%)等有較好的療效。表皮生長(zhǎng)因子受體成為目前研究較深入且倍受關(guān)注的腫瘤治療靶點(diǎn)之一，應(yīng)用基因工程研制抗EGFR的單克隆抗體，成為腫瘤免疫治療的研究熱點(diǎn)之一。2004、2006年，美國(guó)FDA先后批準(zhǔn)了針對(duì)EGFR的鼠-人嵌合抗體西妥昔單抗 (cetuximab)和全人抗體帕尼單抗(panitumumab)，用于結(jié)直腸癌治療；2005年，抗EGFR的人源化抗體尼莫珠單抗(nimotuzumab)獲得了我國(guó)藥監(jiān)局(SFDA)批準(zhǔn)的一類新藥證書，目前正在進(jìn)行Π/ΙΙΙ期臨床試驗(yàn)。鼠源單抗在人體應(yīng)用中可產(chǎn)生人抗鼠抗體反應(yīng)，從而影響其功能的發(fā)揮。采用基因工程技術(shù)改造的鼠-人嵌合抗體可大幅度減弱鼠單抗的免疫原性、延長(zhǎng)抗體在體內(nèi)的半衰期并可借助人免疫球蛋白Fc段介導(dǎo)免疫調(diào)理及ADCC效應(yīng)，進(jìn)而增強(qiáng)抗體的生物學(xué)效應(yīng)，但該嵌合抗體結(jié)合抗原的能力低于鼠源抗體98. %。大量臨床前及臨床試驗(yàn)均已證實(shí)西妥昔單抗單藥及聯(lián)合化療/放療具有較好的療效，但簡(jiǎn)單CDR移植往往會(huì)引起抗原抗體親和力的下降；帕尼單抗是采用轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)制備的全人抗體，與嵌合抗體和人源化抗體相比，人源序列接近100%，大大增強(qiáng)了抗體靶親和力，但該抗體具有鼠糖基化模式、半衰期短和超敏反應(yīng)更多等缺點(diǎn)。尼莫珠單抗則通過對(duì)抗EGFR鼠源單抗進(jìn)行人源化改造獲得了人源化抗體，并把抗體的輕、重鏈基因分別連接至不同的表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)，由于輕重鏈表達(dá)存在較大差異，往往導(dǎo)致完整抗體分子表達(dá)水平極低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種抗體及其編碼基因。本發(fā)明所提供的抗體，由輕鏈和重鏈構(gòu)成，所述重鏈由重鏈可變區(qū)和重鏈恒定區(qū)連接而成；所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO :3中第1-145位所示；所述重鏈恒定區(qū)為人源抗體IgGl的重鏈恒定區(qū)；所述輕鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。上述抗體的重鏈的氨基酸序列具體可如SEQ ID NO 3所示。上述抗體的輕鏈的編碼基因?yàn)槿缦翴)、II)或III)所示I)其核苷酸序列如SEQ ID NO 2中第85-7 位所示或SEQ ID NO 2中第9-7 位所示；II)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼所述輕鏈的DNA分子；
III)與I)限定的DNA序列具有70%以上的同源性且編碼所述輕鏈的DNA分子；上述抗體的重鏈的編碼基因?yàn)槿缦?)、2)或3)所示1)其核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述重鏈的DNA分子；3)與1)限定的DNA序列具有70%以上的同源性且編碼所述重鏈的DNA分子。含有上述任一所述編碼基因的重組載體、重組菌、重組細(xì)胞或表達(dá)盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述重組載體具體可為按照包括如下步驟的方法制備得到的重組表達(dá)載體將所述輕鏈的編碼基因沿著從Nhe I酶切位點(diǎn)至EcoR I酶切位點(diǎn)的方向插在載體pIRES的Nhe I和EcoR I酶切位點(diǎn)間，得到重組載體，記作中間重組載體；將所述重鏈的編碼基因沿著從 Xba I酶切位點(diǎn)至Not I酶切位點(diǎn)的方向插在所述中間重組載體的)(ba I和Not I酶切位點(diǎn)間，得到的重組載體即為目的重組表達(dá)載體。上述重組細(xì)胞具體可為將上述重組表達(dá)載體導(dǎo)入出發(fā)細(xì)胞得到的重組細(xì)胞；其中，所述出發(fā)細(xì)胞為四31~細(xì)胞。制備上述任一所述抗體的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。制備上述任一所述抗體的方法可包括如下步驟培養(yǎng)上述重組細(xì)胞，收集上清液， 即得到所述抗體。在培養(yǎng)重組細(xì)胞的過程中，所述抗體的輕鏈和抗體的重鏈分別表達(dá)，抗體的輕鏈和抗體的重鏈自組裝成為所述抗體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種抑制表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制劑。本發(fā)明所提供的抑制表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制劑，其活性成分為上述抗體、上述編碼基因、上述重組載體、上述重組菌、上述重組細(xì)胞和/或上述表達(dá)盒。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種抑制腫瘤細(xì)胞侵襲的抑制劑。本發(fā)明所提供的抑抑制腫瘤細(xì)胞侵襲的抑制劑，其活性成分為上述抗體、上述編碼基因、上述重組載體、上述重組菌、上述重組細(xì)胞和/或上述表達(dá)盒。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種預(yù)防和/或治療腫瘤的產(chǎn)品。本發(fā)明所提供的預(yù)防和/或治療腫瘤的產(chǎn)品，其活性成分為上述抗體、上述編碼基因、上述重組載體、上述重組菌、上述重組細(xì)胞和/或上述表達(dá)盒。上述抑制劑或產(chǎn)品中，所述腫瘤為結(jié)腸癌；所述腫瘤細(xì)胞為SW480細(xì)胞。上述抗體、上述編碼基因、上述重組載體、上述重組菌、上述重組細(xì)胞和/或上述表達(dá)盒在制備抑制表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制劑中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述抗體、上述編碼基因、上述重組載體、上述重組菌、上述重組細(xì)胞和/或上述表達(dá)盒在制備抑制腫瘤細(xì)胞侵襲的抑制劑中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述抗體、上述編碼基因、上述重組載體、上述重組菌、上述重組細(xì)胞和/或上述表達(dá)盒在制備預(yù)防和/或治療腫瘤產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述應(yīng)用中，所述腫瘤為結(jié)腸癌；所述腫瘤細(xì)胞為SW480細(xì)胞。本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種蛋白質(zhì)片段及其編碼基因。本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)片段的氨基酸序列如SEQ ID NO 3中第1_145位所示；
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本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)片段的編碼基因?yàn)槿缦耡)、b)或c)所示a)其核苷酸序列如SEQ ID NO 4中第1-435位所示；b)在嚴(yán)格條件下與a)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白質(zhì)片段的DNA分子；c)與a)限定的DNA序列具有70%以上的同源性且編碼所述蛋白質(zhì)片段的DNA分子。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明抗體具有良好的抗原結(jié)合活性和抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)遷移侵襲能力；而國(guó)外市場(chǎng)上常見抗EGFR人-鼠嵌合抗體西妥昔單抗的親和力1. ΙΧΚ^Μ。本發(fā)明的人源化抗體能更好與EGFR結(jié)合，從而保證了其抗腫瘤效應(yīng)。本發(fā)明制備抗體的方法， 能夠同時(shí)表達(dá)輕鏈和重鏈，使輕鏈和重鏈的表達(dá)比例更接近1 1，產(chǎn)生更高比率的相互匹配雙鏈抗體。綜上所述，本發(fā)明抗體及其制備方法在預(yù)防和/或治療腫瘤的領(lǐng)域?qū)⒂袕V闊的應(yīng)用前景。


圖1輕鏈基因、重鏈可變區(qū)基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖。圖2含有本發(fā)明抗體的表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3本發(fā)明抗體的還原型SDS-PAGE檢測(cè)。圖4本發(fā)明抗體的免疫印記分析。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。pIRES雙表達(dá)載體購(gòu)自Clontech公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為631605 ;pMD18_T表達(dá)載體購(gòu)自 Takara Bio Company，產(chǎn)品目錄號(hào)為:D504 CA.載體pIRES-Anti-⑶20在文獻(xiàn)“《抗⑶20嵌合抗體的表達(dá)和活性檢測(cè)》，中國(guó)生物工程雜志(china biotechnology), 2005, 25 (7) :34-39. ”中公開過，公眾可從中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所獲得。實(shí)施例1、抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)編碼基因的獲得根據(jù)計(jì)算機(jī)模擬，以鼠-人嵌合抗體西妥昔單抗氨基酸序列為模板，對(duì)其鼠源FR 表面基因進(jìn)行人源化改造而設(shè)計(jì)合成輕鏈氨基酸序列和重鏈“可變區(qū)+重鏈恒定區(qū)1”的氨基酸序列。本發(fā)明抗體由輕鏈L2和重鏈H3構(gòu)成；重鏈H3由重鏈可變區(qū)(VH)、重鏈恒定區(qū)1 (CHl)、鉸鏈區(qū)、重鏈恒定區(qū)2 (CH2)和重鏈恒定區(qū)3 (CH3)組成(H3 = VH+CHl+hinge+CH2+CH3)。將本發(fā)明抗體記作 L2-H3。輕鏈L2 氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示；編碼基因序列如SEQ ID NO 2中第 85-726位所示；重鏈H3 氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示；編碼基因序列如SEQ ID NO 4所示；SEQ ID NO :3中第1-145位氨基酸為重鏈可變區(qū)(VH)，第146-243位氨基酸為重鏈恒定區(qū)1 (CHl)，第244-258位氨基酸為鉸鏈區(qū)(hinge)，第259-369位氨基酸為重鏈恒定區(qū)2 (CH2)，第370-475位氨基酸為重鏈恒定區(qū)3 (CH3)。
SEQ ID NO 4中第1_435位核苷酸為重鏈可變區(qū)(VH)，第436-7 位核苷酸為重鏈恒定區(qū)1 (CHl)，第730-739位核苷酸為剪接供體，第740-1117位核苷酸為內(nèi)含子1，第 1118-1162位核苷酸為鉸鏈區(qū)(hinge)，第1163-1280位核苷酸為內(nèi)含子2，第1281-1613位核苷酸為重鏈恒定區(qū)2 (CH2)，第1614-1710位核苷酸為內(nèi)含子3，第1711-2031位核苷酸為重鏈恒定區(qū)3 (CH3)，第2032-2230位核苷酸為內(nèi)含子4。重鏈Hl的“可變區(qū)+恒定區(qū)1” 編碼基因序列如SEQ ID NO 5所示。輕鏈L2的編碼基因由人工合成得到(即人工合成SEQ ID NO 2中第9_7四位核苷酸)。重鏈H3的“恒定區(qū)2+恒定區(qū)3”的編碼基因(即SEQ ID NO :4中第730-2230位核苷酸)可人工合成得到，也可酶切載體pIRES-Anti-⑶20得到。重鏈H3的“可變區(qū)+恒定區(qū)1”的編碼基因可由人工合成得到，也可按照如下方法得到人工合成SEQ ID NO :5所示編碼基因。以人工合成的SEQ ID NO :5所示編碼基因?yàn)槟０?，采用重疊PCR方法，由引物1、2、3、4、5、6擴(kuò)增，得到重鏈H3的“可變區(qū)+恒定區(qū)1”的編碼基因；1和3是一對(duì)引物，4和5是一對(duì)引物，6和2是一對(duì)引物，各擴(kuò)增出一個(gè)片段(命名為A、B、C)，然后，將擴(kuò)增出的A、B、C混合為模板，以1和2引物擴(kuò)增出目的重鏈H3 “可變區(qū)+恒定區(qū)1”編碼基因。1 :5，-gtgtctagagccgccaccatggactgga-3‘ (Xba I) ； (SEQ ID NO 6)2:5，-gKgatccacttacctgttgctttct-3‘ (BamH I) ； (SEQ ID NO 7)3 5，-atccactcaagtctttgtccaggggcctgtcgcacccagtggacgccgtagttagtcaggctgaatccag-3， ；(SEQ ID NO :8)4 5，-gagtggatgggagtgatctggagtggtggtaacactgactacaacacccccttcactagcagagtcacc-3，。(SEQ ID NO :9)5 5' -gaccagggttccctggccccagtaggcgaactcgtagtcgtaataagtcagggctctcgcacag-3' (S EQ ID NO 10)6 5' -cctactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagcctccaccaagggcccatcg-3' (SEQ ID NO :11).將得到的各基因進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果與預(yù)期大小一致，輕鏈L2的片段大小約為720bp，重鏈H3的“可變區(qū)+恒定區(qū)1”的編碼基因大小約為729bp (圖1)。M.相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；A 泳道1為輕鏈L2的編碼基因；B 泳道1為重鏈Hl的“可變區(qū)+恒定區(qū)1”基因、泳道3為重鏈H3的“可變區(qū)+恒定區(qū)1”基因。將獲得的輕鏈編碼基因和重鏈H3的“可變區(qū)+恒定區(qū)1”編碼基因分別克隆入 PMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Dffia，挑取單克隆、提取質(zhì)粒并測(cè)序鑒定。結(jié)果表明，pMD18_T 載體中插入了 SEQ ID NO 2中第9-7 位(即輕鏈編碼基因)核苷酸所示DNA，將該重組載體記作pMD18-T/L2。pMD18-T載體中插入了 SEQ ID NO 4中第1-7 位(即重鏈H3的 “可變區(qū)+恒定區(qū)1 ”編碼基因)核苷酸所示DNA，將該重組載體記作pMDIS-T/VH+CHI。
實(shí)施例2、抗體的表達(dá)與純化一、重組表達(dá)載體的構(gòu)建將重組載體pMD18-T/L2和pIRES雙表達(dá)載體分別用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶(Nhe I 和EcoR I)酶切，瓊脂糖凝膠電泳后，回收純化目的片段；將輕鏈基因片段L2與載體片段混勻，在連接試劑的作用下，16°C反應(yīng)12h。轉(zhuǎn)化大腸桿菌Dffia，挑單克隆、提取質(zhì)粒并測(cè)序鑒定，結(jié)果在載體PlRES的Nhe I和EcoR I酶切位點(diǎn)間(沿著從Nhe I酶切位點(diǎn)至EcoR I 酶切位點(diǎn)的方向)插入了 SEQ ID NO 2中第9-7 位核苷酸所示輕鏈編碼基因，表明構(gòu)建的重組載體正確，記作重組表達(dá)載體PIRES/L2。以pIRES/L2為模板，用)(ba I和Not I酶切，回收質(zhì)粒大片段，記作片段1 ；以 PMD18-T/VH+CH1為模板，用Xba I和BamH I酶切，回收729bp左右的片段(即重鏈H3的 “可變區(qū)+恒定區(qū)1”片段)，記作片段2 ；以pIRES-Anti-⑶20為模板，用BamH I和Not I 酶切，回收1502bp左右片段(即含有“重鏈恒定區(qū)2+恒定區(qū)3”片段)，記作片段3 ；將片段1、2和片段3連接，得到重組載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Dffia，挑單克隆、提取質(zhì)粒并測(cè)序鑒定。 結(jié)果表明，在載體PlRES的)(ba I和Not I酶切位點(diǎn)間(沿著從)(ba I至Not I的方向) 插入了 SEQ ID NO 4所示重鏈編碼基因，在載體pIRES的EcoR I和Nhe I酶切位點(diǎn)間(沿著從Nhe I至EcoR I的方向)插入了 SEQ ID NO 2中第9-7 位核苷酸所示輕鏈編碼基因，在輕鏈編碼基因和重鏈編碼基因之間為IRESanternal ribosome entry site，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列，IRES能獨(dú)立地招募核糖體對(duì)重鏈mRNA進(jìn)行翻譯)。將陽(yáng)性重組表達(dá)載體記作 PIRES/L2/H3 (圖 2)。二、載體轉(zhuǎn)化及抗體的表達(dá)細(xì)胞093Τ人胚腎T細(xì)胞)購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心(又稱美國(guó)模式菌種收集中心，ATCC)，產(chǎn)品目錄號(hào)為 CRL-11268 ；Lipofectamine 2000 購(gòu)自 hvitrogen 公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為12566014 ；HyQSFM4CH0培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為SH30518. 02 ； rProtein A層析柱購(gòu)自GE公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為17-5079-01。將細(xì)胞按IX 106/ml分別接種于直徑為IOcm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中裝有含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37°C、5% CO2孵箱，培養(yǎng)。取5 μ g步驟一中得到的質(zhì)粒 PIRES/L2/H3轉(zhuǎn)染細(xì)胞，具體操作參照Lipofectamine 2000的試劑說明。得到重組細(xì)胞 293T-pIRES/L2/H30將重組細(xì)胞^3T-pIRES/L2/H3用無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)6 他后吸出無血清培養(yǎng)基，代之以HyQSFM4CH0培養(yǎng)基。相同條件下繼續(xù)共培養(yǎng)84h，間隔1 收取一次細(xì)胞上清，用ELISA法初步檢測(cè)抗體的表達(dá)。擴(kuò)大轉(zhuǎn)染體系，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清4 5L，調(diào)pH 至6. O 7. 0，用0. 45 μ m濾膜過濾，再用rProtein A層析柱純化抗體，具體操作參見產(chǎn)品說明書。ELISA法用于檢測(cè)未知抗原的雙抗體夾心法1.包被用0. 05M PH9. O碳酸鹽包被緩沖液將抗體(一抗為山羊抗人IgG)稀釋至蛋白質(zhì)含量為1 lOyg/ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0. lml，4°C過夜。次日， 棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡(jiǎn)稱洗滌，下同)。2.加樣加一定稀釋的待檢樣品0. Iml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37°C孵育1 小時(shí)。然后洗滌。(同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔(未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞上清)及陽(yáng)性對(duì)照孔(西妥昔單抗注射液(Erbitux)，進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)S20050095。德國(guó)默克公司，產(chǎn)品批號(hào):7667201o )。3.加酶標(biāo)抗體(二抗為山羊抗人IgG-HRP (山羊抗人IgG-辣根過氧化物酶))于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0. Iml0 37°C孵育0. 5 1小時(shí)，洗滌。4.加底物液顯色于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0. Iml, 37°C 10 30分鐘。5.終止反應(yīng)于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0. 05ml。6.結(jié)果判定可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“ + ”、“-”號(hào)表示。也可測(cè)OD值 在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD 值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2. 1倍，即為陽(yáng)性。試劑(1)包被緩沖液(PH9. 6 0. 05M 碳酸鹽緩沖液)=Na2CO3 1. 59 克，NaHC032. 93 克，加蒸餾水至1000ml。(2)洗滌緩沖液(PH7. 4 PBS) 0. 15M =KH2PO4 0. 2 克，Na2HPO4 · 12H20 2. 9 克，NaCl 8.0 克，KCl 0. 2 克，Tween-20 0. 05% 0. 5ml，加蒸溜水至 1000ml。(3)稀釋液牛血清白蛋白(BSA)O. 1克加洗滌緩沖液至IOOml或以羊血清、兔血清等血清與洗滌液配成5 10%使用。(4)終止液(2M H2S04)蒸餾水178. 3ml，逐滴加入濃硫酸(98% )21. 7ml。磷酸鈉鹽緩沖液(結(jié)合緩沖液)用作ftOteinA純化的結(jié)合緩沖液。配制方法為-M IM Na2HPO4 57. 7ml和IM NaH2PO4 42. 3ml混勻，即為0. IM pH7. 0的磷酸鈉鹽緩沖液 100ml，再用蒸餾水稀釋至20mM備用。檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(洗脫緩沖液)用作ftOteinA純化的洗脫緩沖液。配制方法為取0. IM檸檬酸186ml和0. IM檸檬酸鈉14ml混勻，即為0. 1Μ、ρΗ3· 0的檸檬酸鹽緩沖液200ml。用rProtein A層析柱純化抗體純化介質(zhì)=HiiTrap rProtein A FF，5ml，購(gòu)自GE 公司，目錄號(hào)17-5079-01，詳細(xì)使用說明書請(qǐng)參閱其公司提供的說明書。操作1)清洗，用IM NaOH和ddH20先后清洗管道，將小濾器用0. IM NaOH煮沸IOmin后再用ddH20浸泡1 2min ；2)設(shè)定程序，連接rProtein A親和層析柱；3)用20mM結(jié)合緩沖液(pH7. 0)平衡層析柱；4)將已制備好的細(xì)胞上清以1 2ml/min的流速上樣；細(xì)胞上清制備以12000g 離心15分鐘，取出上清，經(jīng)過0. 22um硝酸纖維素濾膜過濾除菌。5)上樣將要結(jié)束時(shí)用IM洗脫緩沖液(pH3. 0)洗脫目的蛋白；6)收集洗脫液(即目的蛋白)，用Trise堿(pH9. 0)將其pH調(diào)至7. 0，電泳檢測(cè)；7)按步驟1)清洗管道和小濾器。三、蛋白檢測(cè)
山羊抗人IgG-HRP抗體購(gòu)自Sigma公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為(046K4801)；山羊抗鼠 IgGl 購(gòu)自 SBA(Southern Biotechnology Associates, Inc.)，產(chǎn)品目錄號(hào)為(1010-05)；SDS-PAGE 取15 μ 1洗脫液(即抗體溶液)在12%凝膠上進(jìn)行還原SDS-PAGE電泳，用考馬斯亮蘭R-250染色。結(jié)果顯示，純化所得抗體的重鏈與輕鏈的相對(duì)分子質(zhì)量分別為25Χ103、 50 X IO3 (圖3)，與預(yù)期結(jié)果一致。圖3中，泳道1-4表示本發(fā)明抗體L2-H3，泳道5表示陽(yáng)性對(duì)照西妥昔單抗。免疫印跡分析另取洗脫液在12%凝膠上進(jìn)行非還原SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，取出膜用封閉液(含有5%脫脂奶粉的1XPBST)在室溫封閉2h，用1 5000 稀釋的羊抗人IgG-HRP抗體與之孵育池(室溫)，再用1 XPBST洗膜3次。最后用ECL顯色，用X線片進(jìn)行曝光。圖4中，泳道1表示陽(yáng)性對(duì)照西妥昔單抗；泳道2-5表示本發(fā)明抗體 L2-H3。免疫印記(12%)分析表明，該抗體可與山羊抗人IgG特異性結(jié)合。但是也出現(xiàn)了部分與抗人IgG 二抗反應(yīng)的一些非特異雜交帶(包括商品化的西妥昔單抗)，這可能是純化中有部分非全長(zhǎng)的重鏈片段混合所至。但是上述結(jié)果不影響抗體親和力的評(píng)價(jià)。上述抗體均不與山羊抗鼠IgGl反應(yīng)。由于本抗體的輕鏈和重鏈在一個(gè)表達(dá)載體上，成比例表達(dá)，自動(dòng)組成含兩條輕鏈和重鏈的完整抗體。四、蛋白表達(dá)量按照步驟一和二中方法獲得表達(dá)抗體L2-H3的細(xì)胞培養(yǎng)上清4 5L，用rProtein A層析柱純化抗體，檢測(cè)抗體在細(xì)胞中的表達(dá)量，結(jié)果為0. 3μ g/ml洗脫液。實(shí)施例3、抗體的功能一、Biacore檢測(cè)抗體與抗原的結(jié)合能力Sensor Chip CM5 購(gòu)自 BD 公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為 Br-1000-14 ;BD BioCoat Matrigel Invasion Chamber 購(gòu)自 BD 公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為 354480.
EGFR蛋白購(gòu)自Sigma公司，產(chǎn)品目錄號(hào)E2645-500UN。用Biacore3000設(shè)備測(cè)定抗體與EGFR的親和力。配制不同pH值(4. 0，4. 5，5. 0 和5. 5)的10mmol/L NaAc稀釋EGFR蛋白，在CM5芯片上做預(yù)濃縮，選擇最適pH值的NaAc 稀釋蛋白。將純化的抗體(即實(shí)施例2中步驟二得到的洗脫液)共價(jià)偶聯(lián)于CM5傳感芯片上，流動(dòng)相為HBS-EP (ρΗ7· 4)，流速20 μ 1/min,取五種濃度的抗體(0，10. 55,21. 1,42. 2和 84. 4nmol/L)與EGFR蛋白結(jié)合親和力的檢測(cè)。親和力用BiaCOre3000附帶軟件計(jì)算。同時(shí)以西妥昔單抗為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。結(jié)果顯示抗體對(duì)抗原EGFR具有良好的結(jié)合活性，親和力為1.58父10_1。西妥昔單抗的親和力為1. 1X10—1。結(jié)果表明本發(fā)明人源化抗體保持了親本良好的結(jié)合活性，克服了鼠源抗體的不良反應(yīng)，具有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值。二、腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)SW480細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心(又稱美國(guó)模式菌種收集中心，ATCC)，產(chǎn)品目錄號(hào)為(ATCC Number :CCL-2^ )；西妥昔單抗抗體購(gòu)自德國(guó)默克里昂制藥公司(原產(chǎn)地英文商品名ERBITUX ；原產(chǎn)地英文藥品名=Cetuximab ；中文參考商品譯名愛必妥；分子結(jié)構(gòu)名西妥昔單抗；產(chǎn)地國(guó)家德國(guó)；生產(chǎn)廠家德國(guó)默克里昂制藥公司)。用RPMI1640培養(yǎng)基(購(gòu)自hvitrogen公司，目錄號(hào)為31800-022)培養(yǎng)SW480細(xì)胞。用無血清RPMI1640培養(yǎng)基水化侵襲室(invasion chamber)，孵育2h (37°C，5% CO2)。 棄無血清 RPMI1640，在侵襲室(BD BioCoat Matrigel Invasion Chamber 購(gòu)自 BD 公司， 產(chǎn)品目錄號(hào)為354480)的孔室加入750 μ 1 RPMI1640 (含10%血清)；在插入(insert)室中加入475 μ 1 RPMI 1640(含血清)，然后向其中加入25μ1消化的SW480細(xì)胞(細(xì)胞數(shù)> 105/500 μ 1)，最后分別向插入室中加入陰性對(duì)照PBS和本發(fā)明抗體，每個(gè)樣品均有兩個(gè)復(fù)孔，抗體終濃度均為lOOng/ml。孵育24h后，將未能穿透侵襲盒基底膜的細(xì)胞用無菌棉簽擦去；穿透基底膜的細(xì)胞固定、染色、室溫晾干后，光鏡計(jì)數(shù)。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理在100倍顯微鏡下計(jì)算每個(gè)插入室中樣品的相應(yīng)3組細(xì)胞數(shù)。運(yùn)用 SPSS12. 0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，將本發(fā)明抗體與人IgG組比較。若結(jié)果為P < 0. 05，兩種處理效果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。t檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示(表1)人IgG組與本發(fā)明抗體組的P值小于0. 01，抗EGFR抗體與對(duì)照組人IgG組相比，差異顯著，對(duì)SW480腫瘤細(xì)胞的侵襲具有顯著的抑制作用。表1、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)的t檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種抗體，由輕鏈和重鏈構(gòu)成，所述重鏈由重鏈可變區(qū)和重鏈恒定區(qū)連接而成；所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO 3中第1-145位所示；所述重鏈恒定區(qū)為人源抗體IgGl的重鏈恒定區(qū)；所述輕鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于所述抗體的重鏈的氨基酸序列如SEQID NO 3所示。
3.權(quán)利要求1或2所述抗體的編碼基因；或，所述輕鏈的編碼基因?yàn)槿缦翴)、II)或III)所示I)其核苷酸序列如SEQID NO 2中第85-7 位所示或SEQ ID NO 2中第9-7 位所示；II)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼所述輕鏈的DNA分子；III)與I)限定的DNA序列具有70%以上的同源性且編碼所述輕鏈的DNA分子；或，所述重鏈的編碼基因?yàn)槿缦?)、幻或幻所示1)其核苷酸序列如SEQID NO 4所示；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述重鏈的DNA分子；3)與1)限定的DNA序列具有70%以上的同源性且編碼所述重鏈的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求3所述編碼基因的重組載體、重組菌、重組細(xì)胞或表達(dá)盒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為按照包括如下步驟的方法制備得到的重組表達(dá)載體將所述輕鏈的編碼基因沿著從Nhe I酶切位點(diǎn)至EcoR I 酶切位點(diǎn)的方向插在載體PlRES的Nhe I和EcoR I酶切位點(diǎn)間，得到重組載體，記作中間重組載體；將所述重鏈的編碼基因沿著從)(ba I酶切位點(diǎn)至Not I酶切位點(diǎn)的方向插在所述中間重組載體的)(ba I和Not I酶切位點(diǎn)間，得到的重組載體即為目的重組表達(dá)載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組細(xì)胞，其特征在于所述重組細(xì)胞是將權(quán)利要求5所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入出發(fā)細(xì)胞得到的重組細(xì)胞；和/或，所述出發(fā)細(xì)胞為W3T細(xì)胞。
7.制備權(quán)利要求1或2所述抗體的方法，包括如下步驟培養(yǎng)權(quán)利要求6所述重組細(xì)胞，收集上清液，即得到權(quán)利要求1或2所述抗體。
8.一種抑制表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制劑、一種抑制腫瘤細(xì)胞侵襲的抑制劑或一種預(yù)防和/或治療腫瘤的產(chǎn)品，其活性成分為權(quán)利要求1或2中所述抗體、權(quán)利要求 3所述編碼基因、權(quán)利要求4或5中所述重組載體、權(quán)利要求4所述重組菌、權(quán)利要求4或6 中所述重組細(xì)胞和/或權(quán)利要求4中所述表達(dá)盒；和/或，所述腫瘤為結(jié)腸癌；所述腫瘤細(xì)胞為SW480細(xì)胞。
9.權(quán)利要求1或2中所述抗體、權(quán)利要求3所述編碼基因、權(quán)利要求4或5中所述重組載體、權(quán)利要求4所述重組菌、權(quán)利要求4或6中所述重組細(xì)胞和/或權(quán)利要求4中所述表達(dá)盒在制備抑制表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制劑中的應(yīng)用；權(quán)利要求1或2中所述抗體、權(quán)利要求3所述編碼基因、權(quán)利要求4或5中所述重組載體、權(quán)利要求4所述重組菌、權(quán)利要求4或6中所述重組細(xì)胞和/或權(quán)利要求4中所述表達(dá)盒在制備抑制腫瘤細(xì)胞侵襲的抑制劑中的應(yīng)用；權(quán)利要求1或2中所述抗體、權(quán)利要求3所述編碼基因、權(quán)利要求 4或5中所述重組載體、權(quán)利要求4所述重組菌、權(quán)利要求4或6中所述重組細(xì)胞和/或權(quán)利要求4中所述表達(dá)盒在制備預(yù)防和/或治療腫瘤產(chǎn)品中的應(yīng)用；和/或，所述腫瘤為結(jié)腸癌；所述腫瘤細(xì)胞為SW480細(xì)胞。
10. 一種蛋白質(zhì)片段及其編碼基因；所述蛋白質(zhì)片段的氨基酸序列如SEQ ID NO 3中第1-145位所示； 所述蛋白質(zhì)片段的編碼基因?yàn)槿缦耡)、b)或c)所示a)其核苷酸序列如SEQID NO 4中第1-435位所示；b)在嚴(yán)格條件下與a)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白質(zhì)片段的DNA分子；c)與a)限定的DNA序列具有70%以上的同源性且編碼所述蛋白質(zhì)片段的DNA分子。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗EGFR人源化抗體L2-H3及其編碼基因與應(yīng)用。該抗體由輕鏈和重鏈構(gòu)成，所述重鏈由重鏈可變區(qū)和重鏈恒定區(qū)連接而成；所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO3中第1-145位所示；所述重鏈恒定區(qū)為人源抗體IgG1的重鏈恒定區(qū)；所述輕鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明抗體具有良好的結(jié)合活性和抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)遷移能力；而國(guó)外市場(chǎng)上常見抗EGFR人-鼠嵌合抗體西妥昔單抗的親和力1.1×10-9M。本發(fā)明的人源化抗體能更好與EGFR結(jié)合，從而保證了其抗腫瘤效應(yīng)。本發(fā)明制備抗體的方法，能夠同時(shí)表達(dá)輕鏈和重鏈，使輕鏈和重鏈的表達(dá)比例更接近1∶1，產(chǎn)生更高比率的相互匹配雙鏈抗體。綜上所述，本發(fā)明抗體及其制備方法在預(yù)防和/或治療腫瘤的領(lǐng)域?qū)⒂袕V闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102153650SQ20111002964
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月27日
發(fā)明者戴維·威孚, 曹誠(chéng), 米歇爾·瑞奇韋茲, 靳彥文 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所