專(zhuān)利名稱(chēng)：芋螺毒素類(lèi)似物Glu-Con-G[1-13]、設(shè)計(jì)合成方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種芋螺毒素類(lèi)似物、其設(shè)計(jì)合成方法及用途。
背景技術(shù)：
芋螺屬于軟體動(dòng)物門(mén)，腹足綱，芋螺科(Conidae)，多數(shù)棲息在熱帶海洋的淺海水域，因外形呈圓錐形或芋頭狀而得名，表面常有各色花紋，殼口窄長(zhǎng)。芋螺是比較年輕的生物，化石記錄證明芋螺屬最早出現(xiàn)于始新世(Eocene)，中生代(mesozoic)時(shí)期海洋捕食性軟體動(dòng)物菊石的消失客觀促進(jìn)了芋螺的第一次大規(guī)模的物種形成。芋螺的第二次大規(guī)模的輻射始于中新世(Miocene)，基本上持續(xù)到現(xiàn)在(Terlau and Olivera，2004)。芋螺具有強(qiáng)大的自然進(jìn)化能力，全球有約700種芋螺，芋螺是海洋無(wú)脊椎動(dòng)物中進(jìn)化最成功的生物之一。芋螺雖然種類(lèi)很多，但它們都是食肉動(dòng)物，靠毒液來(lái)捕食。芋螺毒液是芋螺捕食與防御的主要武器，它是由許多單一毒肽組成的雞尾酒樣的混合毒素，稱(chēng)為芋螺毒素(Conotoxin)。芋螺毒素通常是由7 41個(gè)氨基酸殘基組成的小分子多肽，大多富含半胱氨酸，具有高度保守的二硫鍵骨架。與蜘蛛、蝎、蛇、?？仍S多動(dòng)物的毒素比較 (40 80個(gè)氨基酸左右)，芋螺毒素的肽鏈短的多，富含二硫鍵，分子結(jié)構(gòu)更為緊密，生物活性更高。大多數(shù)芋螺毒素均有單一的mRNA編碼，原始的翻譯產(chǎn)物是一種特定的多肽前體， 約為70 100個(gè)氨基酸殘基，經(jīng)蛋白酶水解后得到成熟肽。這些成熟肽分別選擇性地作用于鈣、鈉、鉀離子通道，或者乙酰膽堿、NMDA、5-羥色胺等受體，許多已經(jīng)成為神經(jīng)生理學(xué)研究的工具藥。二十世紀(jì)八十年代初，美國(guó)猶他大學(xué)(University of Utah)的Olivera實(shí)驗(yàn)室最早開(kāi)展了芋螺毒素全面系統(tǒng)研究工作。芋螺毒素按照其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)(前體肽中N端高度保守的信號(hào)肽區(qū)和C端的二硫鍵骨架)可分為不同的超家族。至今已分離得到的芋螺毒素有近千種。數(shù)十種芋螺毒素已申請(qǐng)美國(guó)專(zhuān)利。他們?cè)谀承┘膊≡\斷和受體研究中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，有的已用于臨床研究或被FDA正式批準(zhǔn)為治療新藥，用作特異通道或受體鑒定診斷試劑和鎮(zhèn)痛藥。在神經(jīng)藥理學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。芋螺睡眠肽(Conantokin，Con)是一類(lèi)較特殊的芋螺毒素，是芋螺毒素超家族中的一個(gè)成員家族。該家族迄今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個(gè)成員，但對(duì)芋螺睡眠肽-G(Con-G)、芋螺睡眠肽-T(Con-T)、芋螺睡眠肽-R(Con-R)、芋螺睡眠肽-L(Con-L)研究的較多。這四個(gè)毒素肽序列上顯示了高度同源性，除了 Con-R有一個(gè)二硫鍵外，其他三個(gè)肽均不含二硫鍵，而芋螺毒素超家族中其他成員一般均含有二硫鍵。這四個(gè)肽序列中都含有Y-羧基谷氨酸(Gla)， 能夠結(jié)合二價(jià)金屬離子。與金屬離子結(jié)合時(shí)，他們的空間構(gòu)象均呈現(xiàn)高比例的-螺旋結(jié)構(gòu)。 這四種毒素都是選擇性的NMDA受體非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，在實(shí)驗(yàn)幼鼠身上可引起睡眠樣癥狀。 研究發(fā)現(xiàn)人的NMDA受體參與一系列神經(jīng)系統(tǒng)的病理過(guò)程，如阿爾茨海默癥、癲癇、中風(fēng)等， 動(dòng)物試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)芋螺睡眠肽對(duì)治療上述病癥有較好的療效。芋螺睡眠肽-G(Con-G)是1984年美國(guó)猶他大學(xué)(University ofUtah)的 Olivera 小組從芋螺Conus geographus中分離得到的第一個(gè)Conantokins家族成員，它最初以前體
3肽(Con-G原始肽)的形式出現(xiàn)，其氨基酸序列為MHLYTYLYLLVPLVTFHLILGTGTLDDGGALTER RSADATALKAEPVLLQKSAARSTDDNGKDRLTQMKRILKQRGNKARGE γ Y LQ Y NQ γ LIR γ KSNGKR, N 端的信號(hào)肽和插入?yún)^(qū)域?yàn)?0個(gè)氨基酸，序列保守，C端為成熟肽，前體肽通過(guò)翻譯后加工成為成熟肽(Con-G成熟肽)，其氨基酸序列為GEy YLQyNQyLIRyKSN = (I)在蛋白酶的作用下前體肽的Arg8°與Gly81之間發(fā)生裂解，Gly81成為成熟肽的Gly1殘基；(2)在維生素K的作用下前體肽的大部分Glu殘基羰基化為Gla。Con-G由17個(gè)氨基酸組成，其最保守的氨基酸殘基包括N末端的Gly-Gla序列、Glaici-Gla14以及最后一個(gè)Gla前的Arg殘基。Con-G為親水肽，呈酸性，與Con-T、Con-R相比，Con-G酸性最高。在未結(jié)合金屬離子時(shí)，Con-G呈現(xiàn)一種無(wú)規(guī)則的結(jié)構(gòu)，但當(dāng)結(jié)合Ca2+、Mg2+等金屬離子后，Con-G的空間構(gòu)想變成從N端到C端的-螺旋結(jié)構(gòu)，其比例可高達(dá)85% (25°C )，這主要是由于Con-G的四個(gè)帶負(fù)電殘基Gla3-Gla7-Glaici-Gla14位于分子的同一面，相互之間的靜電斥力使之幾乎無(wú)法形成-螺旋結(jié)構(gòu)，金屬離子與Gla的螫合正好起到電力中和作用，使原來(lái)排斥的負(fù)電殘基Gla空間上相互靠近，從而能轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定的-螺旋結(jié)構(gòu)。用肽C端逐個(gè)截去氨基酸的方法發(fā)現(xiàn)Con-G最短有生物活性序列長(zhǎng)度是 Con-G[l-13]，其氨基酸序列為GE y y LQ y NQ y LIR,表明對(duì)生物活性有影響的殘基位于這些序列內(nèi)。N端的四個(gè)保守殘基即Gly1、Glu2, Gla3、Gla4被認(rèn)為對(duì)芋螺睡眠肽的生物活性起非常重要的作用，第五位殘基對(duì)芋螺睡眠肽的抑制活性和亞基選擇性非常重要，Gln9對(duì) Con-G的抑制活性是必不可少的，Gla7, Gla10, Gla14是金屬離子的結(jié)合位點(diǎn)，但和抑制活性無(wú)關(guān)，第12位殘基被認(rèn)為參與了和NMDA受體的相互作用。研究已知，在腦動(dòng)脈阻塞的小鼠梗塞模型中，Con-G能有效縮小梗塞范圍，有效抑制缺血性腦損傷引起的受損腦細(xì)胞中c-f0S、bax、bcl-2基因的大量表達(dá)，具有較強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)作用。文獻(xiàn)報(bào)道，芋螺睡眠肽可用于癲癇的治療，以減輕癲癇的發(fā)作頻率和程度，且對(duì)神經(jīng)受損引起的痛覺(jué)超敏有很強(qiáng)的抑制作用。芋螺睡眠肽還可用于藥物依賴(lài)的治療，本實(shí)驗(yàn)室已初步證明Con-G可以抑制嗎啡誘導(dǎo)的精神依賴(lài)和軀體依賴(lài)。由于Gla為非天然氨基酸，難以通過(guò)常規(guī)的生物表達(dá)或化學(xué)合成獲得。除此之外， Con-G還存在肽鏈過(guò)長(zhǎng)、分子量過(guò)大、難以通過(guò)血腦屏障的缺陷，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)只能通過(guò)鞘內(nèi)注射的方法注射藥物，臨床應(yīng)用時(shí)具有較大的局限性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首先要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種較Con-G肽鏈短、分子量小的芋螺毒素類(lèi)似物Glu-Con-G [1-13]，其氨基酸序列從N端到C端為GEEELQENQELIR，分子量為1588。所述GlU-Con-G[l-13]的C端可以是被酰胺化的C端，其氨基酸序列從N端到C 端為GEEELQENQELIRX，χ表示酰胺化。由于采用本發(fā)明的上述技術(shù)方案，本發(fā)明首先用天然氨基酸Glu將Con-G的Gla3、 Gla4、Gla7、Gla1Q、Gla14 替換，得到 Glu-Con-G 的氨基酸序列為GEEELQENQELIREKSN(如序列表SEQ NO :4所示)，其在一定程度上改善了 Gla殘基的難以獲得的缺陷，進(jìn)一步地，將其序列C端4個(gè)氨基酸截掉，即得到Glu-Con-G[1-13]的氨基酸序列為GEEELQENQELIR(如序列表SEQ NO 5所示)，本發(fā)明所提供的GlU-Con-G[l-13]保持原有活性，即仍對(duì)嗎啡精神依賴(lài)和軀體依賴(lài)有一定的干預(yù)作用，但更易于人工合成，且分子量更小，分子量?jī)H為1588，而Con-G和Glu-Con-G的分子量分別為2洸5. 19、2044. 14。本發(fā)明另一個(gè)所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供芋螺毒素類(lèi)似物GlU-Con-G[l-13]的合成方法。為此，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案它包括以下步驟(1)、利用同源模建的方法，以PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中ID為2A5S的參考蛋白為模板，利用 Modeller 8v2進(jìn)行NR2B亞基的同源模建；(2)、采用鑲嵌在 hsight II package version 2005 (AccelrysTM he.)中的 ZDOCK模塊，進(jìn)行Con-G與NR2B亞基對(duì)接；(3)、選取與活性數(shù)據(jù)相符合的構(gòu)象運(yùn)用Charmml9力場(chǎng)進(jìn)行能量?jī)?yōu)化；(4)、通過(guò)NACCESS軟件計(jì)算NR2B受體與Con-G作用前后蛋白質(zhì)表面溶劑可及性 ASA 的變化AASAi = ASA^B-ASAiN—G ；(5)、計(jì)算受體NR2B亞基與配體Con-G之間重要氨基酸相互作用形成的氫鍵位點(diǎn)和長(zhǎng)短，得到Con-G的重要氨基酸；(6)、保持Con-G重要氨基酸，剔除或替換非重要氨基酸以及非天然氨基酸，保持多肽原來(lái)三維結(jié)構(gòu)、與受體結(jié)合方式，構(gòu)建Con-G類(lèi)似物Glu-Con-G[1-13]；(7)、采用固相合成和分離純化的化學(xué)方法合成GlU-Con-G[l-13]。由于采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明可以計(jì)算機(jī)模擬、計(jì)算和預(yù)算配體分子與受體生物大分子之間的關(guān)系，設(shè)計(jì)和優(yōu)化配體分子的方法，使設(shè)計(jì)出的新分子具有合理性，大大減少了所篩選的化合物的數(shù)目加快了藥物研究與開(kāi)發(fā)的周期，明顯的優(yōu)于傳統(tǒng)的廣泛藥理篩選和先導(dǎo)化合物優(yōu)化的方法。本發(fā)明另一個(gè)所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供芋螺毒素類(lèi)似物GlU-Con-G[l-13]在制備對(duì)嗎啡精神依賴(lài)和軀體依賴(lài)有干預(yù)作用的藥物中的用途，以及在制備對(duì)鎮(zhèn)痛有一定療效的藥物中的用途。本發(fā)明所提供的芋螺毒素類(lèi)似物GlU-Con-G[l-13]具有抑制嗎啡誘導(dǎo)小鼠條件性位置偏愛(ài)(Conditioned Place Preference,CPP)的作用，其最佳鎮(zhèn)痛率為嗎啡的702倍。因此，本發(fā)明所述的此種類(lèi)似物GlU-Con-G[l-13]可作為抗嗎啡成癮藥以及高效鎮(zhèn)痛藥物。


圖 1NR2B 與同源蛋白 1Y20 (NRl 的 PDB ID)、2A5S (NR2A 的 PDB ID)和 (NR3A 的PDB ID)進(jìn)行序列比對(duì)圖。圖2Con-G和NR2B亞基作用模型圖。虛線表示氫鍵，紫色字母代表Con-G氨基酸， 桔黃色字母代表NR2B的氨基酸。圖3NR2B亞基和Con-G的Connolly表面圖。NR2B亞基和Con-G相互作用的氨基酸用不同顏色標(biāo)出。箭頭表示作用位置。圖4Con G、Glu_Con G、Glu_Con G[l_13]抑制嗎啡誘導(dǎo)小鼠CPP表達(dá)的結(jié)果圖。* P <0.01表示與生理鹽水組相比存在差異，其數(shù)據(jù)表示為均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差。M-C表示Con-G 組，M-G 表示 Glu-Con-G 組，M-13 表示 Glu-Con-G[1-13]組。圖5為Glu-Con-G[1-13]與生理鹽水組、嗎啡組、ConG組軀體依賴(lài)試驗(yàn)結(jié)果比較圖。與生理鹽水組比較，<0.05，<0.01，*〃p <0.001 ；與嗎啡組相比較， #p <0.05，##p < 0. 01 ；與 ConG 組相比較，腳ρ <0.001，；Δ ρ < 0. 05，ΔΔ ρ < 0. 01，ΔΔΔρ< 0. 001。圖6為Glu-Con-G[1-13]與生理鹽水組、嗎啡組、ConG組福爾馬林實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較圖。與生理鹽水組比較，<0.05，<0.01，*〃p <0.001 ；與嗎啡組相比較， flP < 0. 05，##p < 0.01,腳ρ < 0. 001 ；與 ConG 組相比較，Δρ < 0. 05，ΔΔρ < 0·01，ΔΔΔρ < 0. 001。圖7 為 0. 5h、lh、l. 5h、2h、2. 5h 時(shí)刻 Glu-Con-G[l_13]與生理鹽水組、嗎啡組、 ConG組熱板實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。實(shí)施例一序列比對(duì)、同源模建和分子對(duì)接序列比對(duì)、同源模建NMDA受體NR2B亞基共有1484個(gè)氨基酸，谷氨酸受體結(jié)合區(qū)為404-802 (Si D404-N543, S2 :Κ670_Η802)。同源模建使用軟件 Modeller 8v2,并用 Charmml9 立場(chǎng)對(duì)模建的結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化。NR2B亞基004-802)的序列從NCBI上得到，根據(jù)序列通過(guò) BLAST(PSI-BLAST)搜尋NR2B的同源蛋白，選擇同源性較高的參考蛋白2A5S、1Y20、1S50 和2F34，然后進(jìn)行序列比對(duì)。確定參考蛋白2A5S，將比對(duì)序列和參數(shù)輸入計(jì)算機(jī)，利用 Modeller 8v2進(jìn)行NR2B亞基的同源模建。Modeller 8v2程序可以模建多個(gè)目的結(jié)構(gòu)，根據(jù)空間結(jié)構(gòu)和能量最小原則選出較優(yōu)蛋白進(jìn)行下一步優(yōu)化。模建目的蛋白后，采用Charmmig 立場(chǎng)對(duì)模建結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化處理。結(jié)構(gòu)優(yōu)化時(shí)，先加5nm水層，然后進(jìn)行300步的共軛梯度法能量極小化計(jì)算，再進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，動(dòng)力學(xué)模擬溫度為300K。對(duì)每個(gè)構(gòu)象進(jìn)行300步的最陡下降法和300步共軛梯度法優(yōu)化后，選擇能量最低的構(gòu)象作為模建的最終結(jié)構(gòu)。利用 UCLA-DOE 服務(wù)器上的 Verify 3D、Errat plots 程序和 Cambridge RAMPAGE 服務(wù)器上的 Ramachandran plots程序?qū)δ＝ńY(jié)果進(jìn)行合理性檢測(cè)。分子對(duì)接利用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)研究Con-G與NR2B亞基的相互作用情況，Con-G的三維結(jié)構(gòu)來(lái)自于PDB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)庫(kù)。研究分子之間相互作用采用ZDOCK程序。蛋白對(duì)接采用鑲嵌在 Insight II package version 2005 (AccelrysTM Inc.)中的 ZDOCK 牛莫雙。ZDOCK 運(yùn)算前，輸入同源模建的受體分子結(jié)構(gòu)，再輸入配體多肽Con-G的PDB結(jié)構(gòu)(Broolchaven Protein Data Bank)，然后進(jìn)行ZDOCK運(yùn)算。選取打分最高的50個(gè)構(gòu)象進(jìn)行RDOCK運(yùn)算。 再?gòu)闹羞x取與活性數(shù)據(jù)相對(duì)符合的構(gòu)象運(yùn)用Charmml9力場(chǎng)進(jìn)行能量?jī)?yōu)化。通過(guò)NACCESS 軟件計(jì)算NR2B受體與Con-G作用前后蛋白質(zhì)表面溶劑可及性(ASA)變化AASAi = ASAiNE2B-ASAiNR2B-Con-G。分子設(shè)計(jì)根據(jù)分子對(duì)接結(jié)果得到復(fù)合物結(jié)合模型，通過(guò)觀察受體NR2B亞基與配體Con-G 相互作用的幾何模型與結(jié)構(gòu)特征，計(jì)算它們之間重要氨基酸相互作用形成的氫鍵位點(diǎn)和長(zhǎng)短，構(gòu)效關(guān)系研究結(jié)果得到，E2、Gla4、L5、Q9和112為Con-G必須氨基酸，根據(jù)上述信息對(duì) Con-G進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾或改造，盡量保持Con-G重要氨基酸，有條件地剔除或替換非重要氨基酸以及非天然氨基酸，盡量保持多肽原來(lái)三維結(jié)構(gòu)、與受體結(jié)合方式，構(gòu)建Con-G類(lèi)似物， 得到 Glu-Con-G [1-13]。通過(guò)序列比對(duì)(見(jiàn)圖1)、同源模建和分子對(duì)接(圖2、圖3)，形成Con-G和NR2B亞基的復(fù)合物。復(fù)合物接觸面對(duì)接結(jié)果顯示Con-G與NR2B亞基相互作用的殘基，一共形成了七對(duì)氫鍵，氫鍵長(zhǎng)度都在3A之內(nèi)(見(jiàn)表1)(氫鍵作用主要存在于蛋白質(zhì)分子中相距較近的極性原子O、N、S等原子之間，一般在3.2A以?xún)?nèi))。表1NR2B亞基與Con-G的氫鍵作用。
權(quán)利要求
1.芋螺毒素類(lèi)似物GlU-Con-G[l-13]，其氨基酸序列從N端到C端為序列表SEQNO 5 所示序列，分子量為1588。
2.如權(quán)利要求1所述的芋螺毒素類(lèi)似物Glu-Con-G[1-13]，其特征為其C端被酰胺化， 氨基酸序列從N端到C端為GEEELQENQEURX，x表示酰胺化。
3.如權(quán)利要求1所述的芋螺毒素類(lèi)似物GlU-Con-G[l-13]的設(shè)計(jì)合成方法，其特征它包括以下步驟(1)、利用同源模建的方法，以參考蛋白2A5S為模板，利用Modeller8v2軟件進(jìn)行NR2B 亞基的同源模建；(2)、將Con-G與NR2B亞基對(duì)接；(3)、選取與活性數(shù)據(jù)相符合的構(gòu)象運(yùn)用Charmmig力場(chǎng)進(jìn)行能量?jī)?yōu)化；(4)、通過(guò)NACCESS軟件計(jì)算NR2B受體與Con-G作用前后蛋白質(zhì)表面溶劑可及性ASA 的變化AASAi = ASA^B-ASA^lg，i表示氨基酸殘基序號(hào)；(5)、計(jì)算受體NR2B亞基與配體Con-G之間重要氨基酸相互作用形成的氫鍵位點(diǎn)和長(zhǎng)短，得到Con-G的重要氨基酸；(6)、保持Con-G重要氨基酸，剔除或替換非重要氨基酸以及非天然氨基酸，保持多肽原來(lái)三維結(jié)構(gòu)、與受體結(jié)合方式，構(gòu)建Con-G類(lèi)似物Glu-Con-G[1-13]；(7)、采用固相合成和分離純化的化學(xué)方法合成GlU-Con-G[l-13]。
4.權(quán)利要求1或2所述的芋螺毒素類(lèi)似物GlU-Con-G[l-13]在制備對(duì)嗎啡精神依賴(lài)和軀體依賴(lài)有干預(yù)作用的藥物中的用途。
5.權(quán)利要求1或2所述的芋螺毒素類(lèi)似物GlU-Con-G[l-13]在制備對(duì)鎮(zhèn)痛有一定療效的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明用天然氨基酸Glu將Con-G的Gla3、Gla4、Gla7、Gla10、Gla14替換，得到一種較Con-G肽鏈短、分子量小的芋螺毒素類(lèi)似物Glu-Con-G[1-13]。本發(fā)明在一定程度上改善了Gla殘基的難以獲得的缺陷，本發(fā)明所提供的Glu-Con-G[1-13]保持原有活性，即仍對(duì)嗎啡精神依賴(lài)和軀體依賴(lài)有一定的干預(yù)作用，但更易于人工合成，且分子量更小，分子量?jī)H為1588，而Con-G和Glu-Con-G的分子量分別為2265.19、2044.14。
文檔編號(hào)A61K38/10GK102167730SQ20111003339
公開(kāi)日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2011年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月29日
發(fā)明者任展宏, 周晚玲, 徐艷蘭, 朱永平, 王 華, 許潔瓊, 諶程, 錢(qián)玲玲, 陳翔 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)