專利名稱：羊膜復(fù)合角膜緣干細(xì)胞膜片的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于眼角膜緣干細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及到一種羊膜復(fù)合角膜緣干細(xì)胞膜片的制備方法。
背景技術(shù)：
角膜上皮細(xì)胞來自于角膜緣部位的干細(xì)胞，正常角膜緣是維持正常眼表功能的關(guān)鍵。角膜緣受損后，使損傷區(qū)干細(xì)胞功能缺陷或數(shù)量不足，會引起結(jié)膜上皮長入角膜表面， 角膜新生血管生成，進(jìn)一步引起角膜瘢痕等嚴(yán)重癥狀，使視力明顯下降甚至喪失。而通過移植補(bǔ)充一定數(shù)量的干細(xì)胞是目前最有效的治療方法之一。角膜緣移植由于受到材料來源限制和術(shù)后免疫排斥等難題的制約，培養(yǎng)的角膜緣干細(xì)胞移植成為眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn)。在以角膜緣干細(xì)胞缺乏或功能障礙為特征的疾病治療過程中，培養(yǎng)的角膜緣干細(xì)胞移植術(shù)已成為眼科研究的一個新的發(fā)展方向。培養(yǎng)的角膜緣干細(xì)胞移植部分解決了供體不足的問題，它的臨床應(yīng)用將為眼表疾病的治療開辟廣闊前景，具有深遠(yuǎn)意義。目前常用的用于移植的角膜緣干細(xì)胞培養(yǎng)方法主要由兩種，一種是將羊膜平鋪于細(xì)胞培養(yǎng)器皿或載玻片表面，其獲得的細(xì)胞膜片移植前需要從培養(yǎng)器皿上揭取下來，非常容易揭破，影響臨床使用，同時應(yīng)用此方法無法與飼養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)，也會導(dǎo)致干細(xì)胞數(shù)量的丟失，影響移植后的效果；另一種方法是將羊膜用乳膠圈固定于嵌入式培養(yǎng)板小室(transwell或insert)中，但此方法在培養(yǎng)后期會因為羊膜松弛而造成培養(yǎng)上皮復(fù)層不均勻的缺點(diǎn)，而大大影響臨床手術(shù)治療的效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種羊膜復(fù)合角膜緣干細(xì)胞膜片的嵌套式培養(yǎng)方法，以彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明的制備方法如下首先，按照常規(guī)方法制備5. OcmX 5. Ocm尺寸的去上皮無菌羊膜片，再將上述得到的羊膜片的上皮面向下置于聚丙乙烯材料制成的套筒的端面上， 用嵌入式培養(yǎng)小室扣在套筒的羊膜片上，即制成羊膜嵌套式培養(yǎng)模具；然后用絲裂霉素C 處理小鼠胚胎成纖維細(xì)胞后，再消化接種到細(xì)胞培養(yǎng)用的6孔板中制備小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層，將上述制好的羊膜嵌套式培養(yǎng)模具放置入鋪有上述飼養(yǎng)層的6孔板的孔內(nèi)，最后用中性蛋白酶、0. 25%胰酶/0. 02% EDTA消化而制備角膜緣干細(xì)胞細(xì)胞懸液，并接種于羊膜上皮面，每套培養(yǎng)模具接種2. 0-3. 0 X IO5個角膜緣干細(xì)胞，培養(yǎng)10日后長滿角膜緣干細(xì)胞即可用，即制得羊膜復(fù)合角膜緣干細(xì)胞膜片。使用時，將套筒從嵌入式培養(yǎng)小室中取出，輕輕將羊膜復(fù)合角膜緣干細(xì)胞膜片取下即可用于臨床角膜緣干細(xì)胞移植手術(shù)。本發(fā)明以眼庫剩余角膜環(huán)為原材料，培養(yǎng)制備羊膜復(fù)合角膜緣干細(xì)胞膜片，用于角膜緣干細(xì)胞缺乏或功能障礙為特征的疾病移植治療中。本發(fā)明的羊膜嵌套式培養(yǎng)模具應(yīng)用于制備羊膜復(fù)合角膜緣干細(xì)胞膜片，相比以往羊膜平鋪法和乳膠圈羊膜固定法，本發(fā)明的嵌套式培養(yǎng)具有如下優(yōu)點(diǎn)羊膜培養(yǎng)面很平，可使角膜緣干細(xì)胞復(fù)層更為均勻，臨床應(yīng)用方便且羊膜不易破裂。


圖1、羊膜嵌套式培養(yǎng)模具基本結(jié)構(gòu)示意圖。其中，1嵌入式培養(yǎng)板小室，2套筒，3羊膜片。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明以眼庫剩余角膜環(huán)為原材料，制備成了羊膜為基底膜的羊膜復(fù)合角膜緣干細(xì)胞膜片，具有角膜緣干細(xì)胞的特性，用于角膜緣干細(xì)胞缺乏或功能障礙為特征疾病的移植治療中。本發(fā)明的制備方法一、羊膜嵌套式培養(yǎng)模具的制備如圖1，按照常規(guī)方法制備5. OcmX 5. Ocm尺寸的去上皮無菌羊膜片3，將該羊膜片 3上皮面朝上平鋪于6孔培養(yǎng)板中；將上述得到的羊膜片3上皮面向下置于聚丙乙烯材料制成的套筒2的端面上，用嵌入式培養(yǎng)小室1扣在套筒2的羊膜片3上，即制成羊膜嵌套式培養(yǎng)模具。其中所用套筒2外徑24mm，高16mm。二 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的制備用0.01mg/ml絲裂霉素C溶液處理貼壁的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，37°C孵育2小時； 用IOml PBS磷酸鹽緩沖液仔細(xì)清洗細(xì)胞后；加Iml 0. 25%胰酶/0. 02% EDTA，37°C孵育 3-5分鐘；加9ml含血清的DMEM培養(yǎng)液中止消化，吹打細(xì)胞；離心收集細(xì)胞，棄上清，用IOml 含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞；細(xì)胞計數(shù)，以2. 5 X IO4細(xì)胞/cm2的細(xì)胞密度接種細(xì)胞到6孔培養(yǎng)板中，37°C培養(yǎng)過夜使其貼壁，即制備成小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層。三、角膜緣干細(xì)胞懸液制備將眼庫來源的角膜環(huán)放入盛有含100單位/ml青霉素和鏈霉素抗生素的無血清 DMEM培養(yǎng)液中浸泡，沖洗，再放入2. 4單位/ml中性蛋白酶(Dispase)中，37°C消化1小時； 從Dispase中取出角膜環(huán)，浸入0. 25%胰酶/0. 02% EDTA中消化2分鐘，用含100單位/ ml青霉素和鏈霉素抗生素的PBS磷酸鹽緩沖液洗2次，移入含DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，上皮面朝上，實(shí)體顯微鏡下撕取角膜緣上皮組織，用培養(yǎng)基反復(fù)沖洗撕取的角膜緣上皮組織， 收集在15ml離心管中；1500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，小心去除上清，加0.5ml 0.25%胰酶 /0. 02% EDTA37°C消化角膜緣上皮組織20-30分鐘后，加含10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，離心5min，小心去除上清，使用含血清及牛轉(zhuǎn)鐵蛋白、霍亂毒素等添加因子的培養(yǎng)基混勻，計數(shù)細(xì)胞，即制得角膜緣干細(xì)胞懸液。四、將上述步驟一制備的羊膜嵌套式培養(yǎng)模具放置入鋪有上述步驟二制備的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的6孔板中，再將上述步驟三制備的角膜緣干細(xì)胞細(xì)胞懸液接種于羊膜3上皮面，放置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每套培養(yǎng)模具接種2. 0-3. OX IO5個角膜緣干細(xì)胞，培養(yǎng)10日后長滿角膜緣干細(xì)胞即可用，即制得羊膜復(fù)合角膜緣干細(xì)胞膜片。實(shí)施例1按照常規(guī)方法制備5. OcmX 5. Ocm尺寸的去上皮無菌羊膜片3，將羊膜片3上皮面朝上平鋪于6孔培養(yǎng)板中；將上述得到的羊膜片3上皮面向下置于聚丙乙烯材料制成的外徑24mm，高16mm的套筒2的端面上，用嵌入式培養(yǎng)小室1扣在套筒2的羊膜片3上，制成羊膜嵌套式培養(yǎng)模具。按照常規(guī)方法在6孔板板孔中制備小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層，將羊膜嵌套式培養(yǎng)模具放置在飼養(yǎng)層上面。取眼庫剩余新鮮角膜環(huán)兩個，放入盛有內(nèi)加無血清含100單位/ml青霉素和鏈霉素抗生素的DMEM培養(yǎng)液中浸泡，沖洗，再放入含2. 4單位/ ml中性蛋白酶的培養(yǎng)皿中37°C消化1小時；從中性蛋白酶中取出組織塊，浸入0. 25%胰酶 /0. 02% EDTA消化2分鐘后用含100單位/ml青霉素和鏈霉素抗生素的PBS磷酸鹽緩沖液洗2次，移入含DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，上皮面朝上，實(shí)體顯微鏡下用鑷子刮下角膜緣上皮組織，用培養(yǎng)基反復(fù)沖洗撕取的角膜緣組織，收集在15ml離心管中；1500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘；小心去除上清，加0. 5ml 0. 25%胰酶/0. 02% EDTA 37°C消化20-30分鐘后，加含10% 胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化；離心5min，小心去除上清，使用含血清及牛轉(zhuǎn)鐵蛋白、霍亂毒素等添加因子的培養(yǎng)基混勻，計數(shù)3X IO5個細(xì)胞，接種于放置在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上的羊膜嵌套式培養(yǎng)模具的羊膜片3上皮面上，10日后角膜緣干細(xì)胞長滿可用，即制得羊膜復(fù)合角膜緣干細(xì)胞膜片。使用時，將套筒3從嵌入式培養(yǎng)小室1中取出，輕輕將羊膜復(fù)合角膜緣干細(xì)胞膜片取下即可用于臨床角膜緣干細(xì)胞移植手術(shù)。
權(quán)利要求
1.一種羊膜復(fù)合角膜緣干細(xì)胞膜片的制備方法，其特征在于將羊膜嵌套式培養(yǎng)模具放置入鋪有小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的6孔板的孔內(nèi)，再用消化法制備角膜緣干細(xì)胞細(xì)胞懸液，并接種于上述羊膜嵌套式培養(yǎng)模具的羊膜片( 上皮面，每套培養(yǎng)模具接種 2. 0-3. OX IO5個角膜緣干細(xì)胞，培養(yǎng)10日后長滿角膜緣干細(xì)胞即得到羊膜復(fù)合角膜緣干細(xì)胞膜片。
2.如權(quán)利要求1所述的羊膜復(fù)合角膜緣干細(xì)胞膜片的制備方法，其特征在于上述羊膜嵌套式培養(yǎng)模具是按照常規(guī)方法制備5. OcmX 5. Ocm尺寸的去上皮無菌羊膜片(3)，再將上述得到的羊膜片(3)的上皮面向下置于聚丙乙烯材料制成的套筒O)的端面上，用嵌入式培養(yǎng)小室(1)扣在套筒O)的羊膜片( 上，即制成羊膜嵌套式培養(yǎng)模具。
全文摘要
一種羊膜復(fù)合角膜緣干細(xì)胞膜片的制備方法。首先制備去上皮無菌羊膜片，再將上述得到的羊膜片的上皮面向下置于聚丙乙烯材料制成的套筒的端面上，用嵌入式培養(yǎng)小室扣在套筒的羊膜片上，即制成羊膜嵌套式培養(yǎng)模具；將該培養(yǎng)模具放置入鋪有小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的6孔板的孔內(nèi)，最后用消化法制備角膜緣干細(xì)胞細(xì)胞懸液并接種于羊膜片的上皮面上，每套培養(yǎng)模具接種2.0-3.0×105個角膜緣干細(xì)胞，培養(yǎng)10日后即得到羊膜復(fù)合角膜緣干細(xì)胞膜片。相比以往羊膜平鋪法和乳膠圈羊膜固定法，本發(fā)明制備的羊膜復(fù)合角膜緣干細(xì)胞膜片的羊膜培養(yǎng)面很平坦，且角膜緣干細(xì)胞復(fù)層均勻，特別是具有臨床應(yīng)用方便羊膜不易破裂的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號A61L27/38GK102166374SQ20111003663
公開日2011年8月31日 申請日期2011年2月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月3日
發(fā)明者史偉云, 周慶軍, 楊玲玲, 王瑤, 謝立信 申請人:山東省眼科研究所