專利名稱：聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶類似物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)及制藥領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明涉及一種酶活保留率高、免疫原性低、半衰期長并可多次反復(fù)用藥的聚こニ醇化犬源尿酸氧化酶類似物及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明是發(fā)明名稱為“人源化尿酸氧化酶”(申請?zhí)?00910191240. 3)發(fā)明專利的延伸。
背景技術(shù)：
背景部分的陳述并不是對 現(xiàn)有技術(shù)的全盤接受，相反，它反映了本發(fā)明人對進(jìn)行此項發(fā)明時的技術(shù)情況的主觀評價和解釋。這些解釋可能包括本發(fā)明人自己的、迄今為止尚未透露的對現(xiàn)有技術(shù)的洞悉。而這些洞悉本身并不是現(xiàn)有技術(shù)的一部分。高尿酸血癥是ー種因嘌呤代謝過多而引起的疾病。人體內(nèi)的嘌呤經(jīng)過一系列代謝，最終形成的產(chǎn)物為尿酸。當(dāng)血液尿酸濃度超過70mg/L時，便可引起高尿酸血癥，根據(jù)其發(fā)病機(jī)理及持續(xù)時間的不同，它又可被細(xì)分為急性高尿酸血癥和慢性高尿酸血癥。急性高尿酸血癥是血液腫瘤及其治療中的ー種常見并發(fā)癥。血液腫瘤放化療后可引起由細(xì)胞溶解增多和嘌呤代謝物釋放導(dǎo)致體內(nèi)尿酸濃度急劇升高，引起急性高尿酸血癥，嚴(yán)重時可導(dǎo)致急性腎衰竭(Hershfield M S. Cecil Textbook ofMedicine (20th) · 1508-1515.)。血液月中瘤是嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一。常見的血液腫瘤主要包括各類白血病、多發(fā)性骨髓瘤以及惡性淋巴瘤。慢性高尿酸血癥是人體內(nèi)嘌呤代謝紊亂導(dǎo)致的慢性代謝類疾病，而痛風(fēng)則是ー種由慢性高尿酸血癥進(jìn)ー步發(fā)展而形成的疾病，并因尿酸結(jié)晶沉積到軟組織導(dǎo)致急性或慢性病變。痛風(fēng)的主要臨床表現(xiàn)是反復(fù)發(fā)作的關(guān)節(jié)炎和(或)腎病變；同時血尿酸水平長期增高可使尿酸以結(jié)晶形式沉積于結(jié)締組織，先形成肉芽腫，后逐漸形成痛風(fēng)石(NancyJ G, Susan J K, Edna S, John S S et al. Arthritis Res Ther. 2005. 8 (I) :R12)。近 20余年來，隨著人類生活水平的提高，慢性高尿酸血癥/痛風(fēng)的患病率不斷攀升。英國流行病學(xué)調(diào)查顯示，痛風(fēng)患病率從1990年的I. 19%增至1999年的1.4% (Wallace K，RiedelA,Joseph-Ridge N, Wortmann R. JRheumatol. 2004. 31 :1582-1587.)。2008 年我國山東沿海的調(diào)查結(jié)果顯示高尿酸血癥患者占總?cè)丝诘?3. 19%，而痛風(fēng)的患病率高達(dá)I. 14% (MiaoZ, Li C，Chen Y, et al. J Rheumatol. 2008 ；35 :1859-1864)。該類疾病已成為危害人類健康的重要疾病。本質(zhì)上，高尿酸血癥是人在進(jìn)化過程中尿酸氧化酶的基因突變失活的結(jié)果，突變在人尿酸氧化酶基因編碼序列中引入提前終止密碼子(Wu X，Lee C C，Muzny D M，CaskeyC T. Proc Natl Acad Sci USA. 1989. 86 :9412-9416)，人類因此而不能自身合成活性尿酸氧化酶，從而導(dǎo)致嘌呤分解代謝終止于尿酸(Wu X，Muzny D M，Lee C C，Caskey C T. J MolEvol. 1992. 34 :78-84)。在非人類靈長目動物和其他哺乳動物的肝過氧化物酶體中的活性尿酸氧化酶可將溶解性低的尿酸鹽( llmg/dl)轉(zhuǎn)變?yōu)橐兹艿哪蚰宜? 147mg/dl)后，由腎臟更有效的排泄(ffortmann R L, Kelley W N. Kelley，s textbook of rheumatology(6th). 2001. 1339-1376)。目前國際上已上市的尿酸氧化酶類藥物有2002年FDA批準(zhǔn)上市的由法國Sanofi公司生產(chǎn)的重組黃曲霉來源尿酸氧化酶(Rasburicase) (Bosly A, SonetA, Pinkerton C R, McCowage G, Bron D, Sanz M A, Van den Berg H. Cancer. 2003. 98 1048-54)。由啤酒酵母發(fā)酵純化的重組黃曲霉尿酸氧化酶藥物Rasburicase可用于由腫瘤化療引起的嚴(yán)重高尿酸血癥的短期治療，其治療高尿酸血癥療效較別嘌醇顯著。然而，由于黃曲霉來源的尿酸氧化酶與推測出的無活性人源尿酸氧化酶的同源性低于40% (Lee CC，Wu X，Gibbs RA, Cook R G, Muzny D M, Caskey C T.Science. 1988. 239 :1288-1291)，多次給藥后70%病人體內(nèi)產(chǎn)生抗體，在產(chǎn)生抗尿酸氧化酶抗體的患者體內(nèi)，黃曲霉尿酸氧化酶的功效迅速減小，并且發(fā)生了嚴(yán)重變應(yīng)性反應(yīng)(Navolanic P M，Pui C-H, Larson RA, etal. Leukemia. 2003. 17 :499-514)。用聚こニ醇(PEG)對蛋白進(jìn)行共價修飾，證明能用來降低蛋白免疫原性、增加蛋白溶解度并延長蛋白的半衰期(Veronese FM, Pasut G. Drug Discov Today. 2005 ; 10 :1451-458)。目前FDA已批準(zhǔn)了多種PEG修飾重組蛋白藥物上市。PEG要和目標(biāo)分子結(jié)合， 需對PEG分子一端或兩端進(jìn)行活化，根據(jù)要連接分子的特性來選擇活化所需的功能基團(tuán)。用于PEG共價修飾蛋白質(zhì)的連接基團(tuán)可以是任何生物相容的連接基團(tuán)。常見的生物相容的連接基團(tuán)包括酷基、酰胺基、酰亞胺基、氨基甲酸酯基、琥珀酰亞胺基(例如琥珀酰亞胺基琥珀酰酯(SS)、琥珀酰亞胺基丙酸酯(SPA)、琥珀酰亞胺基羧甲基化物(SCM)、琥珀酰亞胺基琥珀酰胺(SSA)或N-羥基-琥珀酰亞胺(NHS)、環(huán)氧基、氧羰基咪唑基、硝基苯基團(tuán)(例如硝基苯碳酸鹽(NPC)或三氯苯碳酸鹽(TPC))、組氨酸基團(tuán)或伯胺。活化后的PEG理論上可以和蛋白質(zhì)中主要的氨基酸如賴氨酸、半胱氨酸、組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸等反應(yīng)，反應(yīng)可以在N端，也可以在C端，但以和賴氨酸和N端的基團(tuán)反應(yīng)最常見。研究人員自19世紀(jì)70年代末即開始了 PEG修飾尿酸氧化酶研究，Nihimura和Tsuji等人分別用氰尿酰氯活化的5kDa PEG修飾劑對單假絲酵母來源尿酸氧化酶進(jìn)行修飾，但是當(dāng)修飾率達(dá)到20% -30%時，酶活保留率均降低至50%以下，均無法在充分保留酶活的情況下進(jìn)一步降低其免疫原性(NishimuraH, Ashihara Y, MatsushimaA, Inada Y,Enzyme. 1979. 24 :261-264.Tsuji J-I, Hirose K, Kashara E,Naitoh M,Yamamoto I.Int JImmunopharmacoI. 1985. 7 :725-730.)。先前的研究人員還研究了 PEG化的尿酸氧化酶對在人體內(nèi)的反應(yīng)。Davis等人將來源于單假絲酵母的尿酸氧化酶與分子量為5kDa的PEG結(jié)合，偶聯(lián)物注射到五名試驗者身上后，試驗者血清中的尿酸氧化酶濃度降低到了檢測不出的水平，四星期后再次注射后，用靈敏度相對不高的凝膠擴(kuò)散方法沒有檢測到尿酸氧化酶的抗體(Davis F F, Abuchowshi A, Karp D. J Pharmacol Exp Ther. 1981. 219 :352-354.)。由上可知，PEG化的尿酸氧化酶在人體內(nèi)是安全的，并且具備一定的效果，但是由于他們使用的尿酸氧化酶的高抗原性，以及當(dāng)時使用的PEG試劑本身存在不足，使得這些制備物在長期安全性和有效性方面存在隱患。隨著第二代高分子量分枝狀PEG的出現(xiàn)，人們對PEG修飾尿酸氧化酶進(jìn)行了新的探索。美國Duke大學(xué)和Savient公司在得到重組豬-狒狒尿酸氧化酶以后，用IOkDa mPEG-NPC對尿酸氧化酶的賴氛酸殘基進(jìn)行修飾(Pegloticase) (Michael H, SusanJ. K. 2006. US7056713B1)，當(dāng)每個亞基偶聯(lián)9條PEG后，酶活能保持75%以上，而且動物實驗表明其已基本消除了免疫原性(Sherman MR, Saifer MG,Perez-Ruiz F. Adv Drug DelivRev. 2008. 60 :59-68)。Pegloticase已于2010年9月14日得到FDA批準(zhǔn)正式上市，可用于難治性痛風(fēng)的長期治療出個月)。但是，90%的臨床試驗者產(chǎn)生了抗-Pegloticase抗體，而且該藥只能用于靜脈推注。潛在的免疫原性和給藥途徑的不便，將降低慢性痛風(fēng)患者長期治療的依從性。美國的Phoenix藥物公司同樣進(jìn)行了 PEG修飾尿酸氧化酶的藥物開發(fā)研究(EnsorC M，Clark M A, Holtsberg F W. 2005. US 6913915B2)，他們修飾的尿酸氧化酶為單假絲酵母尿酸氧化酶；優(yōu)選的PEG材料是mPEG-SC和mPEG_SPA，平均分子量為20KD ;修飾的位點(diǎn)同樣是賴氨酸殘基，每個蛋白偶聯(lián)18-22個PEG鏈，修飾后的尿酸氧化酶保持了 75%的活性，在小鼠體內(nèi)的半衰期達(dá)到了 3天,遠(yuǎn)長于未修飾尿酸氧化酶的4小時(Bomalaski J S,Holtsberg F W，Ensor C M, Clark MA. J Rheumatol. 2002，29 :1942-1949)。該 PEG 修飾的尿酸氧化酶于2001年開始臨床研究，但I(xiàn)期臨床結(jié)果顯示給藥后體內(nèi)藥效減弱，因此終止于 I 期臨床(Bolmalaski J S, Goddard D H, Grezlak D, et al. Arthritis Rheum. 2002,46 S141)。
到目前為止，在世界范圍內(nèi)，還沒有商業(yè)化的具有適當(dāng)長半衰期，能在長期治療中安全使用而無免疫原性的尿酸氧化酶產(chǎn)品。人源尿酸氧化酶基因因突變而失去活性，成為假基因。如果將其改造，恢復(fù)其降解尿酸的酶活性，必能降低外源尿酸氧化酶在人體中的免疫原性。但人源尿酸氧化酶基因在進(jìn)化過程中，由于缺乏選擇壓力，累積了部分有害錯義突變，很難找出并更正所有突變以恢復(fù)其尿酸氧化酶活性。微生物尿酸氧化酶的高活性和哺乳動物尿酸氧化酶的低免疫原性，使得這兩大來源的尿酸氧化酶成了目前開發(fā)應(yīng)用的長效尿酸氧化酶的研究熱點(diǎn)。PEG修飾雖然可以降低微生物來源尿酸氧化酶免疫原性，但是仍然未能有效消除在人體內(nèi)的免疫反應(yīng)，國外開發(fā)的PEG修飾重組微生物尿酸氧化酶(如Phenix Inc.和EnzonInc.)均終止了長期治療慢性痛風(fēng)的臨床研究。相反的,在哺乳動物尿酸氧化酶研究方面，杜克大學(xué)(Duke University)和山景公司(SavientInc.)開發(fā)的PEG修飾類似豬源尿酸氧化酶研究已成功上市。這表明尿酸氧化酶蛋白同源性仍然是影響PEG修飾后蛋白免疫原性的重要因素。為了進(jìn)一步提高尿酸氧化酶蛋白同源性，本發(fā)明人以與人源化尿酸氧化酶同源性更高、酶比活性更高的犬源尿酸氧化酶為基礎(chǔ)進(jìn)行了人犬嵌合尿酸氧化酶研究，已經(jīng)分別申報國家專利(申請?zhí)?00910191240. 3)與國際專利(申請?zhí)朠CT/CN2010/071020)。本發(fā)明在上述專利設(shè)計的犬源尿酸氧化酶類似物基礎(chǔ)之上進(jìn)行了PEG修飾研究，g在提供新一代長效重組尿酸氧化酶，在保留高酶活的同時，延長體內(nèi)半衰期、降低免疫原性，適用于腫瘤化療引起的急性高尿酸血癥和代謝紊亂導(dǎo)致的高尿酸血癥及慢性痛風(fēng)的治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供新型的犬源尿酸氧化酶類似物的聚こニ醇偶聯(lián)物。該偶聯(lián)物涉及的犬源尿酸氧化酶類似物蛋白包括但不局限于天然犬源尿酸氧化酶蛋白和含有部分犬源和人源尿酸氧化酶氨基酸序列的嵌合蛋白及突變體蛋白。本發(fā)明的另一目的是提供制備上述聚こニ醇化犬源尿酸氧化酶類似物的方法。該方法包括制備四聚體含量高于95. 0%的尿酸氧化酶蛋白、PEG修飾和修飾后蛋白的純化。本發(fā)明的另一目的是提供上述聚こニ醇化犬源尿酸氧化酶類似物的應(yīng)用。該偶聯(lián)物可用于預(yù)防和/或治療血液腫瘤化療導(dǎo)致的急性高尿酸血癥和代謝紊亂導(dǎo)致的高尿酸血癥及慢性痛風(fēng)。在本發(fā)明的第一方面，用于PEG偶聯(lián)的犬源尿酸氧化酶類似物均來源于申請?zhí)枮?00910191240. 3的中國發(fā)明專利。它包括犬源尿酸氧化酶蛋白(SEQ ID No :1)和含有部分犬源和人源尿酸氧化酶氨基酸序列的嵌合蛋白及其突變體蛋白。其中含有部分犬源和人源尿酸氧化酶氨基酸序列的嵌合蛋白的N端前240個氨基酸為犬源尿酸氧化酶蛋白第1-240位氨基酸，剩下的64個氨基酸為人源尿酸氧化酶的第241-304位氨基酸(SEQ ID No 2);其中含有部分犬源和人源尿酸氧化酶氨基酸序列的嵌合蛋白的突變體蛋白包括但不局限于下述具有2-5種突變的突變體蛋白(各突變用三聯(lián)體表示字母-數(shù)字-字母，其中的數(shù)字表示突變氨基酸的位置，數(shù)字前的字母對應(yīng)突變設(shè)計的氨基酸，數(shù)字后的字母表示用于置換數(shù)字前氨基酸的氨基酸)S246T-S248G-R249Q(SEQ ID No :3)、L245H-A252E-I253M(SEQ ID No 4);上述犬源尿酸氧化酶蛋白和含有部分犬源和人源尿酸氧化酶氨基酸序列的嵌合蛋白及其突變體蛋白的N端可截短I至9個氨基酸序列(SEQ IDNo :5)，C端可截短I至3個氨基酸序列(SEQ ID No :6)。在本發(fā)明的第二方面，用于對犬源尿酸氧化酶類似物進(jìn)行PEG修飾的位點(diǎn)包括但不局限于尿酸氧化酶蛋白中N端的α氨基和賴氨酸殘基的ε氨基。更優(yōu)的，PEG修飾位點(diǎn)為賴氨酸殘基的ε氨基。犬源尿酸氧化酶類似物通過氨酯鍵、仲胺鍵或酰胺鍵與PEG的活性基團(tuán)進(jìn)行共價連接。更優(yōu)的，犬源尿酸氧化酶類似物通過酰胺鍵與PEG的活性集團(tuán)進(jìn)行共價連接。PEG的連接基團(tuán)包括但不局限于琥珀酰亞胺基、硝基苯、酰胺基、酰胺亞基、胺基甲酸酯基、醛基、組氨酸基團(tuán)。更優(yōu)的，PEG的連接基團(tuán)為琥珀酰亞胺基基團(tuán)和硝基苯基團(tuán)。更優(yōu)的，PEG的連接基團(tuán)為琥珀酰亞胺基丙酸酯(SPA)和硝基苯碳酸鹽(NPC)。其中聚こニ醇的封閉基團(tuán)包括但不限于單甲氧基、こ氧基、丙氧基、丁氧基、半乳糖或葡萄糖等。更優(yōu)的，聚こニ醇的封閉基團(tuán)為單甲氧基。聚こニ醇可以是支鏈的或直鏈的。更優(yōu)的，聚こニ醇為直鏈。聚こニ醇的平均分子量約為平均分子量約為lkDa-40kDa。更優(yōu)的，聚こニ醇的平均分子量為5kDa_20kDa。更優(yōu)的，聚こニ醇的平均分子量為5kDa。每個犬源尿酸氧化酶類似物単體平均偶聯(lián)2-15個聚こニ醇分子。更優(yōu)的，每個尿酸氧化酶単體上偶聯(lián)的聚こニ醇鏈的數(shù)量為4-12個。更優(yōu)的，每個尿酸氧化酶單體上偶聯(lián)的聚こニ醇鏈的數(shù)量為6-11個。在本發(fā)明的第三方面，用于制備上述犬源尿酸氧化酶類似物的聚こニ醇偶聯(lián)物。用于制備修飾前尿酸氧化酶四聚體的方法包括但不局限于分子篩層析、離子交換層析。更優(yōu)的，制備修飾前尿酸氧化酶四聚體的方法為陰離子交換層析。偶聯(lián)反應(yīng)中犬源尿酸氧化酶類似物與聚こニ醇修飾劑的摩爾比為I : 40 I : 200。更優(yōu)的，犬源尿酸氧化酶類似物與聚こニ醇修飾劑的摩爾比為I : 120 I : 160。偶聯(lián)反應(yīng)體系為碳酸鹽緩沖液，其pH范圍為8. 0-11.0，離子強(qiáng)度范圍為10-200mmol/L。更優(yōu)的，碳酸鹽緩沖的pH范圍為9. 5-10. 5，離子強(qiáng)度范圍為50-150mmol/L。采用的色譜層析法和/或超濾法，分離聚こニ醇化犬源尿酸氧化酶類似物，包括而不限于分子篩層析、離子交換層析、疏水層析、切向流超濾。更優(yōu)的，分離純化聚こニ醇化犬源尿酸氧化酶類似物的方法為分子篩層祈。
在本發(fā)明的第四方面，提供了ー種含有上述犬源尿酸氧化酶類似物的聚こニ醇偶聯(lián)物的藥物組合物及其應(yīng)用。該藥物組合物中含有有效劑量的選自權(quán)利要求1-18的任一偶聯(lián)物和一種藥學(xué)上可接受的載體，可用于預(yù)防和/或治療血液腫瘤化療導(dǎo)致的急性高尿酸血癥和代謝紊亂導(dǎo)致的高尿酸血癥及慢性痛風(fēng)。血液腫瘤包括但不局限于白血病、多發(fā)性骨髓瘤以及惡性淋巴瘤。高尿酸血癥及慢性痛風(fēng)的主要癥狀包括但不局限于尿酸性腎病和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。該藥物組合物的給藥途徑包括但不局限于靜脈注射、皮下注射、肌肉注射和腹腔注射或吸入霧狀制劑。更優(yōu)的，該藥物組合物的給藥途徑為靜脈注射和皮下注射。未修飾四聚體尿酸氧化酶的分子量一般為140kDa，而分子量大于IOOkDa的蛋白分子即可有效的激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)。Phenix公司研發(fā)的20kDa mPEG修飾單假絲酵母來源尿酸氧化酶在2000年I期臨床時由于高免疫原性而終止了其臨床研究(BolmalaskiJ S, Goddard D H, Grezlak D, et al. Arthritis Rheum. 2002,46 :S141)。目前已上市的Pegloticase 為 IOkDa mPEG 修飾，修飾后蛋白的分子量為 540kDa(Sherman MR, SaiferMG, Perez-Ruiz F. Adv Drug Deliv Rev. 2008. 60 :59-68),這可能導(dǎo)致了 Pegloticase在臨床階段仍然顯示出了高免疫原性。而且，注射Pegloticase后產(chǎn)生抗體主要是針對 Pegloticase的PEG部分，因此，利用更小分子量的5kDa mPEG進(jìn)行修飾可能會降低針對PEG的抗體的產(chǎn)生進(jìn)而降低整個PEG修飾尿酸氧化酶的免疫原性。Pegloticase在I期臨床時曾進(jìn)行了皮下注射的研究，但是由于其在注射部位釋放緩慢并產(chǎn)生了注射部位刺激反應(yīng)，因此 Savient 公司終止了 Pegloticase 皮下注射的研究(GansonN J,Kelly S J, ScarlettE, Sundy J S, Hershfield M S. Arthritis Res Ther. 2006. 8 :R12)。利用更小的 5kDa mPEG進(jìn)行修飾可能會增加藥物在注射部位的吸收速度，減少注射部位的刺激反應(yīng)，并提高皮下注射的生物利用度。因此，在本發(fā)明的具體實施方案中，利用已經(jīng)被用在多個已上市PEG修飾蛋白藥物的5kDa mPEG進(jìn)行犬源尿酸氧化酶類似物的修飾研究?；钚阅蛩嵫趸甘撬木垠w蛋白，尿酸氧化酶蛋白家族中大約三分之ー的氨基酸是強(qiáng)疏水性氛基酸(Colloc' h N, Poupon A, Momon J P. Proteins. 2000. 39 :142-154),因此理論上講四聚體蛋白間容易聚集形成八聚體及更大的聚合體。目前已經(jīng)公開的微生物來源尿酸氧化酶晶體X衍射實驗中已經(jīng)證實了八聚體形式尿酸氧化酶的存在(Retailleau P，Colloc' h N, Civares D,et al. Acta Crystallogr. , Sect. D. 2005. 61 :218-229. ) 美國FDA的專家認(rèn)為分子量超過IOOkDa的分子即可有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)(Rosenberg，AS.AAPS J. 2006. 8 :E501-507.)，而四聚體尿酸氧化酶蛋白的分子量已經(jīng)達(dá)到140kDa，未修飾尿酸氧化酶多聚體將具有更高的免疫原性。本發(fā)明人曾嘗試Phenyl或Butyl等疏水相互作用層析和黃嘌呤親和層析等方法，但均無法有效分離不同聚集形式犬源尿酸氧化酶類似物蛋白，這說明活性尿酸氧化酶四聚體及多聚體的疏水性質(zhì)無明顯差異，這種聚集并非疏水聚合所致，且上述多聚體均為活性尿酸氧化酶形式；本發(fā)明人試驗了離子相互作用層析，在本發(fā)明該方面的一個優(yōu)選實施方案中，利用高分辨率的Source 15Q填料可有效分離不同聚集形式犬源尿酸氧化酶類似物蛋白洗脫四聚體尿酸氧化酶蛋白所需的離子強(qiáng)度低于洗脫多聚體所需的離子強(qiáng)度，這表明在相同緩沖條件下，多聚體犬源尿酸氧化酶類似物蛋白聚集后掩蓋了部分堿性氨基酸，進(jìn)而使其等電點(diǎn)下移，在相同堿性環(huán)境下負(fù)電荷帶電量高于四聚體蛋白。更優(yōu)的，根據(jù)未修飾四聚體和多聚體尿酸氧化酶之間離子性質(zhì)的差異利用陰離子交換層析的方法制備的四聚體尿酸氧化酶含量高于95.0%。5kDa PEG修飾尿酸氧化酶研發(fā)的最大瓶頸問題為對蛋白進(jìn)行充分修飾時酶活損失過快，進(jìn)而失去了其有效性(Chen R H, Abuchowski A, Van Es T, Palczuk N C, DavisF F. Biocheim Biophys Acta. 1981. 660 :293-298)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，四聚體尿酸氧化酶含量高于95.0%的尿酸氧化酶經(jīng)5kDa PEG飽和修飾后，酶活保留率高于85%。在本發(fā)明該方面的ー個具體實施方案中，本發(fā)明人比較了不同多聚體含量的四聚體修飾后酶活保留情況，將四聚體尿酸氧化酶含量為10. 8%的尿酸氧化酶蛋白進(jìn)行修飾后,酶活保留率僅為71.7%，將四聚體尿酸氧化酶含量高于95.0%的尿酸氧化酶蛋白進(jìn)行修飾后，酶活保留率高于85. 0%，這表明多聚體尿酸氧化酶蛋白含量的增加是5kDa PEG修飾尿酸氧化酶活性損失過大的原因。除去多聚體尿酸氧化酶不僅可消除產(chǎn)生潛在免疫原性的隱患，還可增加5kDa PEG修飾后酶活保留率，克服了 5kDa PEG修飾尿酸氧化酶研發(fā)的最大瓶頸問題。常用的蛋白PEG修飾位點(diǎn)包括N末端α -氨基修飾、賴氨酸ε -氨基修飾、半胱氨酸巰基修飾、C末端羧基修飾等。由于活性四聚體尿酸氧化酶蛋白分子量高達(dá)140kDa，其他激素和細(xì)胞因子常用的N、C末端定點(diǎn)修飾無法降低其免疫原性，而犬源尿酸氧化酶類似物蛋白中僅含有4個游離巰基，每個單體理論上最多僅能偶聯(lián)4個PEG分子，仍然無法達(dá)到 上述要求，因此僅能對犬源尿酸氧化酶類似物蛋白的Lys進(jìn)行非定點(diǎn)修飾。由于尿酸氧化酶分子較大，在本發(fā)明該方面的一個實施方案中，將不同修飾比例的犬源尿酸氧化酶類似物免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)只有當(dāng)每個單體偶聯(lián)6個以上的PEG才能充分降低未修飾蛋白免疫原性。更優(yōu)的，每個尿酸氧化酶單體上偶聯(lián)的聚こニ醇鏈的數(shù)量為6-11個。PEG 一般通過氨酯鍵、仲胺鍵或酰胺鍵與尿酸氧化酶蛋白中賴氨酸殘基的氨基連接。更優(yōu)的，利用酰胺鍵將PEG與蛋白進(jìn)行共價連接。更優(yōu)的，利用琥珀酰亞胺基將PEG與蛋白進(jìn)行共價連接。琥珀酰亞胺基包括但不限于琥珀酰亞胺基琥珀酸酷(SS)、琥珀酰亞胺基碳酸酯(SC)、琥珀酰亞胺基丙酸酯(SPA)、琥珀酰亞胺基丁酸酯(SBA)、琥珀酰亞胺基甲酸酷(SCM)、琥珀酰亞胺基琥珀酰胺(SSA)或N-羥基ー琥珀酰亞胺(NHS)。琥珀酰亞胺基丙酸酯(SPA)與琥珀酰亞胺基碳酸酯(SC)、琥珀酰亞胺基琥珀酰胺(SSA)和N-羥基-琥珀酰亞胺(NHS)等相比，在水溶液中的穩(wěn)定性更強(qiáng)，連接效率更高。在本發(fā)明的ー個優(yōu)選實施方案中，利用琥珀酰亞胺基丙酸酯(SPA)將犬源尿酸氧化酶類似物賴氨酸殘基的ε-氨基與5kDa PEG進(jìn)行共價連接。PEG是通過環(huán)氧化物環(huán)上的氫氧根離子的親電進(jìn)攻引發(fā)的環(huán)氧こ烷的負(fù)離子開環(huán)聚合而成的(Roberts M J, Bentley M D, Harris J M. Adv Drug Deliv Rev. 2002. 54 459-476.)，這種陰離子介導(dǎo)的聚合反應(yīng)在兩端均會殘余ー個羥基。如不對其一端進(jìn)行封閉，在下一歩活化過程中，兩端羥基均可偶聯(lián)活性基團(tuán)，進(jìn)而形成雙功能修飾劑，導(dǎo)致兩個或多個蛋白發(fā)生交聯(lián)形成更大分子量偶聯(lián)物，帶來額外的免疫原性(Veronese FM. Biomaterials. 2001. 22 :405-417)。如將一端的羥基進(jìn)行封閉，即可得到蛋白質(zhì)修飾時最常用的單甲氧基聚こニ醇(Monomethoxy PEG)mPEG ;另一端未封閉的羥基可以跟不同的活性基團(tuán)反應(yīng)，進(jìn)而對蛋白質(zhì)分子中不同的基團(tuán)進(jìn)行修飾。在本發(fā)明的具體實施方案中，PEG試劑均為一端封閉的單功能試劑。聚こニ醇的封閉基團(tuán)包括但不限于單甲氧基、こ氧基、丙氧基、丁氧基、半乳糖或葡萄糖等。在本發(fā)明該方面的一個優(yōu)選實施方案中，聚こニ醇的封閉基團(tuán)為已經(jīng)被成功用在多個已上市PEG修飾蛋白藥物的安全性得到充分證明的單甲氧基?；钚曰鶊F(tuán)為琥珀酰亞胺基丙酸酯(SPA)的PEG修飾劑與蛋白偶聯(lián)的常規(guī)pH范圍為 7. 0-9. O (Roberts M J, Bentley M D, Harris J M. Adv Drug Deliv Rev. 2002. 54 459-476.)。為了進(jìn)一步提高犬源尿酸氧化酶類似物的溶解性、増加可用的犬源尿酸氧化酶類似物蛋白賴氨酸殘基修飾位點(diǎn)和修飾的專ー性，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，將pH調(diào)整至9. 0-11. O可使PEG試劑充分專ー的與犬源尿酸氧化酶類似物蛋白賴氨酸殘基的氨基偶聯(lián)，而不與犬源尿酸氧化酶類似物蛋白N端的α-氨基反應(yīng)。更優(yōu)的，修飾的pH范圍為9. 5-10. 5。在該pH范圍內(nèi)常用的偶聯(lián)反應(yīng)體系包括但不局限于磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液和碳酸鹽緩沖液，為了進(jìn)一步維持犬源尿酸氧化酶類似物的溶解性，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，選用碳酸鹽作為偶聯(lián)反應(yīng)的緩沖體系。常用的碳酸鹽緩沖液的濃度范圍為10-200mmol/L，為了增加5kDa修飾劑的修飾效率，在本發(fā)明的ー個優(yōu)選實施方案中，選用50-150mmol/L作為碳酸鹽緩沖的工作濃度。為了進(jìn)一步增加犬源尿酸氧化酶類似物蛋白偶聯(lián)的PEG的數(shù)量，可用的偶聯(lián)反應(yīng)中犬源尿酸氧化酶類似物與聚こニ醇修飾劑的摩爾比為I : 40 I : 160。更優(yōu)的，偶聯(lián)反應(yīng)中犬源尿酸氧化酶類似物與聚こニ醇修飾劑的摩爾比為I : 120 I : 160。
修飾后蛋白常用的純化方法包括而不限于分子篩層析、離子交換層析、疏水層析、切向流超濾。本發(fā)明人經(jīng)過系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)多位點(diǎn)5kDPEG修飾后不僅未修飾蛋白的免疫原性充分降低，而且犬源尿酸氧化酶類似物蛋白的離子性質(zhì)、疏水性質(zhì)等也被充分覆蓋，很難與常規(guī)的離子交換層析填料、疏水層析填料及反相作用填料結(jié)合。在本發(fā)明該方面的一個優(yōu)選實施方案中，利用分子篩層析可有效將修飾后蛋白與未修飾蛋白及修飾過程中副產(chǎn)物分離。經(jīng)該方法純化的修飾后犬源尿酸氧化酶類似物蛋白經(jīng)RP-HPLC和SEC-HPLC檢測后，純度均高于99.0%。本發(fā)明所涉及的PEG修飾犬源尿酸氧化酶類似物為臨床藥用制劑的有效成分，該制劑包括但不限干稀釋劑、穩(wěn)定劑、防腐剤、溶解劑、乳化剤、佐劑和載體等。I)稀釋液磷酸鹽、醋酸鹽Tris-Hcl等緩沖液；2)pH值和離子強(qiáng)度；3)去污劑和溶解劑山梨醇、Tween-20, Tween-80 ；4)充填劑乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇。有效成分的有效劑量是指考慮到表觀分子量和病人體重、年齡等因素的有效治療或預(yù)防劑量。在本發(fā)明的ー個優(yōu)選實施方案中，制劑中用到的稀釋液為10-20mM, ρΗ7· 4-9.0 ;溶解劑為O. 004% -O. 04%Tween-20 ;充填劑為4% -5%的甘露醇。本發(fā)明所涉及的給藥步驟包括但不局限于靜脈注射、皮下注射、肌肉注射和腹腔注射或吸入霧狀制劑。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，在與人同源性更高的食蟹猴體內(nèi)注射5kDa mPEG修飾犬源尿酸氧化酶類似物后清除半衰期可達(dá)到134. 3h，這表明mPEG-rCU蛋白注射到人體內(nèi)后半衰期同樣可大于I周，可實現(xiàn)1_2周注射一次的預(yù)期。而且，皮下注射的生物利用度高于60%，這表明在人體試驗時可將皮下注射作為ー個備選注射途徑，這將提高病人長期治療時的依從度。本發(fā)明所涉及的包含有PEG修飾犬源尿酸氧化酶類似物有效成分的藥物組合物可用于預(yù)防和/或治療血液腫瘤化療導(dǎo)致的急性高尿酸血癥和代謝紊亂導(dǎo)致的高尿酸血癥及慢性痛風(fēng)。血液腫瘤包括但不局限于白血病、多發(fā)性骨髓瘤以及惡性淋巴瘤。高尿酸血癥及慢性痛風(fēng)的主要癥狀包括但不局限于尿酸性腎病和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。血液尿酸濃度升高是高尿酸血癥最基本的診斷特征。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，選用體內(nèi)缺乏尿酸氧化酶同樣以尿酸為最終產(chǎn)物的正常雞作為實驗動物評價了 5kDa mPEG修飾犬源尿酸氧化酶類似物降低血液尿酸作用。結(jié)果表明，正常雞對照組血液尿酸濃度一直穩(wěn)定在220 μ m/L ;注射5kDamPEG修飾犬源尿酸氧化酶類似物后，雞體內(nèi)血液尿酸濃度可在3_5天內(nèi)穩(wěn)定在50 μ m/L以下，而未修飾犬源尿酸氧化酶類似物注射I天內(nèi)，血液尿酸濃度僅降至130 μ m/L左右，其后逐漸恢復(fù)正常。5kDa mPEG修飾犬源尿酸氧化酶類似物顯示了良好的降低血液尿酸濃度的效果。
尿酸性腎病是高尿酸血癥的常見病癥，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，利用自由喂食酵母粉與注射低濃度尿酸鈉結(jié)晶的方法成功在大鼠體內(nèi)構(gòu)造了尿酸性腎病動物模型，并評價了 5kDa mPEG修飾犬源尿酸氧化酶類似物對尿酸性腎病的預(yù)防作用。結(jié)果顯示，給藥組體內(nèi)尿酸濃度可穩(wěn)定在80 μ m以內(nèi)，肌酐明顯降低(P < O. 05)，表明供試品對高尿酸血癥造成的腎臟損傷有一定保護(hù)作用。組織病理結(jié)果顯示，與模型對照組比較，聚こニ醇化犬源尿酸氧化酶類似物組綜合評分均明顯降低(P < O. 001)，表明給藥后動物腎臟損害明顯減輕，提示聚こニ醇化犬源尿酸氧化酶類似物對高尿酸引起的大鼠腎臟損傷有較好的預(yù)防作用。痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是高尿酸血癥導(dǎo)致的另ー常見病癥，但是到目前為止，還沒有準(zhǔn)確評價痛風(fēng)藥物對痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎治療作用的動物模型。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，利用向家兔膝關(guān)節(jié)周徑注射尿酸鈉結(jié)晶混懸液的方法成功構(gòu)造了痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型，并評價了 5kDa mPEG修飾犬源尿酸氧化酶類似物對痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的治療作用。實驗結(jié)果證明，模型組動物注射尿酸鈉結(jié)晶后，關(guān)節(jié)腫脹明顯，6h時達(dá)到高峰；給藥后24h，腫脹度可恢復(fù)至與空白組類似，提示注射5kDamPEG修飾犬源尿酸氧化酶類似物可明顯降低尿酸鈉結(jié)晶導(dǎo)致的關(guān)節(jié)腫脹。本發(fā)明的5kDa PEG修飾犬源尿酸氧化酶類似物與未修飾尿酸氧化酶相比具有更低的免疫原性和更好的穩(wěn)定性；與PEG修飾微生物來源尿酸氧化酶相比具有更低的潛在的免疫原性；與其他10-20kDaPEG修飾犬源尿酸氧化酶類似物相比具有更高的皮下注射生物利用度和更低的免疫原性。本發(fā)明提供的PEG制備方法可進(jìn)ー步提高修飾后尿酸氧化酶蛋白酶活保留率，提高修飾位點(diǎn)的專ー性和均一性，提高修飾蛋白的純度。本發(fā)明提供的藥物組合物可有效降低血液尿酸濃度、預(yù)防尿酸性腎病、治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，可用于預(yù)防和/或治療血液腫瘤化療導(dǎo)致的急性高尿酸血癥和代謝紊亂導(dǎo)致的高尿酸血癥及慢性痛風(fēng)。至此已對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)描述，參照以下實例能夠?qū)χ懈宄睦斫猓鰧嵗齼H為說明目的而并不g在對本發(fā)明進(jìn)行限制。


附圖I :修飾前犬源尿酸氧化酶類似物SEC-HPLC分析圖。其中圖A為O. lmmol/LNaCI洗脫組分，四聚體含量量高于95. 0%，圖B為O. 3mmol/LNaCl洗脫組分四聚體尿酸氧化酶蛋白含量為14. 5%。圖中A為四聚體蛋白，B為八聚體蛋白，C為多聚體蛋白。附圖2 :不同比例的PEG修飾的犬源尿酸氧化酶類似物SDS-PAGE電泳圖。其中泳道I為未修飾蛋白，泳道2為I : 40比例修飾蛋白，泳道3為I : 80比例修飾蛋白，泳道4為I : 120比例修飾蛋白，泳道5為I : 160比例修飾蛋白，泳道6為蛋白marker。圖中PEG修飾的犬源尿酸氧化酶類似物蛋白因遷移率變慢而比理論值偏大。附圖3 :聚こニ醇化犬源尿酸氧化酶類似物純度分析圖。其中圖A為RP-HPLC色譜圖，圖B為SEC-HPLC分析圖。附圖4 :聚こニ醇化犬源尿酸氧化酶類似物N端測序圖。
附圖5 :聚こニ醇化犬源尿酸氧化酶類似物Maldi-tof分析圖。附圖6 :聚こニ醇化犬源尿酸氧化酶類似物降低正常雞血尿酸作用分析圖。其中■為對照組； 為未修飾犬源尿酸氧化酶類似物組；▼為聚こニ醇化犬源尿酸氧化酶類似物組。附圖7 :聚こニ醇化犬源尿酸氧化酶類似物對家兔急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎治療作用分析圖。其中·為空白對照組； 為模型對照組；▲為聚こニ醇化犬源尿酸氧化酶類似物組。附圖8:聚こニ醇化犬源尿酸氧化酶類似物食蟹猴藥代動力學(xué)曲線。其中·為靜脈給藥；籲為皮下給藥。
具體實施方式
實例I.聚こニ醇化犬源尿酸氧化酶類似物的修飾條件本實例所涉及的犬源尿酸氧化酶類似物是采用基因工程技術(shù)獲得的含有部分犬源和人源尿酸氧化酶氨基酸序列的嵌合蛋白的突變體蛋白(SEQ ID NO :5，以下實例中聚こニ醇化犬源尿酸氧化酶類似物均指此序列編碼蛋白)，SDS-PAGE純度及RP-HPLC純度均高于 95. 0%。取SourCel5Q陰離子交換層析填料，裝入層析柱，用洗脫液(2M NaCl2 O. 2mol/LNa2CO3-NaHCO3 緩沖、pH = 10. 3)沖洗 5 個柱體積再生后，用平衡液(O. 2moI/LNa2CO3-NaHCO3緩沖、PH= 10. 3)平衡。將上述純化后樣品勻速上樣，上樣結(jié)束后再用平衡液平衡至電導(dǎo)穩(wěn)定。用含有O. Immol/L、0. 2mmol/L、0. 3mmol/L NaCl的洗脫液進(jìn)行梯度洗脫,根據(jù)280nm吸收值強(qiáng)弱收集吸收峰，并進(jìn)行SEC-HPLC檢測。如附圖I所示，O. Immol/LNaCI洗脫組分四聚體尿酸氧化酶蛋白含量高于95. 0%,0. 3mmol/LNaCl洗脫組分四聚體尿酸氧化酶蛋白含量為14. 5%。將上述純化后犬源尿酸氧化酶類似物蛋白超濾濃縮至4. Omg/ml，在pH = 10. 3的
O.lmol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖中按照摩爾比 I : 40，I : 80，I 120，I 160 補(bǔ)入干粉 5kDamPEG-SPA，4°C反應(yīng)4h。反應(yīng)結(jié)束后分別取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，確定聚こニ醇化犬源尿酸氧化酶類似物的修飾率。實驗結(jié)果表明(附圖2):修飾比例為I : 40-1 80可使每個尿酸氧化酶單體偶聯(lián)2-6個5kDa mPEG;修飾比例為I : 120-1 160可使每個尿酸氧化酶單體偶聯(lián)6-11個5kDa mPEG。將四聚體尿酸氧化酶蛋白含量分別為高于95. 0%和14. 5%的犬源尿酸氧化酶類似物蛋白超濾濃縮至4. Omg/ml,在pH = 10. 3的0. lmol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖中按照摩爾比I : 120，補(bǔ)入干粉5kDa mPEG_SPA，4°C反應(yīng)4h。反應(yīng)結(jié)束后分別取樣進(jìn)行酶活保留率測定，確定未修飾尿酸氧化酶多聚體蛋白對酶活保留率的影響。由于尿酸在292nm處有特征吸收峰，產(chǎn)物在此波長范圍內(nèi)無吸收峰，而不同的尿酸濃度對應(yīng)不同的吸光值，并且呈線性變化。隨著尿酸被尿酸氧化酶降解，定時檢測293nm處吸光度的減少量確定酶活在比色杯中加入3mL 37°C預(yù)熱溶于pH = 8. 6硼酸緩沖液的IOOum尿酸溶液；再加入IOul適度稀釋的酶液并混勻，連續(xù)測定292nm處吸光度變化；根據(jù)公式C = A/ ε L(其中C為尿酸濃度，A為反應(yīng)體系292nm處吸光值，ε為尿酸摩爾消光系數(shù),L為比色杯光程)計算尿酸降解濃度，并計算酶活.在37°C、pH8.6時，毎分鐘轉(zhuǎn)化Iu mol尿酸為尿囊素的酶量定義為ー個活性單位(U)。如表所示，四聚體尿酸氧化酶蛋白含量高于95. 0%的犬源尿酸氧化酶類似物蛋白修飾后酶活保留率為87. 7%，而四聚體尿酸氧化酶蛋白含量為14. 5%的犬源尿酸氧
化酶類似物蛋白修飾后酶活保留率僅為71.7%。未修飾尿酸氧化酶多聚體可顯著降低5kDa
PEG修飾后蛋白的酶活保留率，而將該多聚體除去后，酶活保留率可高于85. O %。
PEG修飾犬源尿酸氧化酶類PEG修飾犬源尿酸氧化酶類
權(quán)利要求
1.聚乙二醇(PEG)化犬源尿酸氧化酶類似物，其中犬源尿酸氧化酶類似物為天然犬源尿酸氧化酶和含有部分犬源和人源尿酸氧化酶氨基酸序列的嵌合蛋白及突變體蛋白，聚乙二醇的平均分子量約為lkDa-40kDa，每個尿酸氧化酶單體平均偶聯(lián)2_15個聚乙二醇分子。
2.如權(quán)利要求I所述的犬源尿酸氧化酶類似物，包括但不局限于天然犬源尿酸氧化酶和含有部分犬源和人源尿酸氧化酶氨基酸序列的嵌合蛋白及突變體蛋白。
3.如權(quán)利要求2所述的嵌合蛋白，其N端前240個氨基酸為犬源尿酸氧化酶蛋白第1-240位氨基酸，剩下的64個氨基酸為人源尿酸氧化酶的第241-304位氨基酸。
4.如權(quán)利要求2所述的突變體蛋白，其特征在于將天然犬源尿酸氧化酶和權(quán)利要求3所述的嵌合蛋白經(jīng)一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有相同活性的突變蛋白。
5.如權(quán)利要求4所述的突變體蛋白，其特征在于它選自下述具有2-5種突變的突變體蛋白，各突變用三聯(lián)體表示字母-數(shù)字-字母，其中的數(shù)字表示突變氨基酸的位置，數(shù)字前的字母對應(yīng)突變設(shè)計的氨基酸，數(shù)字后的字母表示用于置換數(shù)字前氨基酸的氨基酸S246T-S248G-R249QL245H-A252E-1253M
6.如權(quán)利要求2-4所述的尿酸氧化酶蛋白，其N端可截短I至9個氨基酸序列，其C端可截短I至3個氨基酸序列。
7.如權(quán)利要求I所述的偶聯(lián)物，其中連接基團(tuán)通過氨酯鍵、仲胺鍵或酰胺鍵與尿酸氧化酶蛋白中N端和賴氨酸殘基的氨基連接。
8.如權(quán)利要求I所述的偶聯(lián)物，其中聚乙二醇的連接基團(tuán)包括但不限于琥珀酰亞胺基、硝基苯、酰胺基、酰胺亞基、胺基甲酸酯基、醛基、組氨酸基團(tuán)。
9.如權(quán)利要求8所述的偶聯(lián)物，其中聚乙二醇的活性基團(tuán)琥珀酰亞胺基包括但不限于琥珀酰亞胺基琥珀酸酯(SS)、琥珀酰亞胺基碳酸酯(SC)、琥珀酰亞胺基丙酸酯(SPA)、琥珀酰亞胺基丁酸酯(SBA)、琥珀酰亞胺基甲酸酯(SCM)、琥珀酰亞胺基琥珀酰胺(SSA)或N-羥基-琥珀酰亞胺(NHS)。
10.如權(quán)利要求8所述的偶聯(lián)物，其中連接基團(tuán)硝基苯基團(tuán)包括但不限于硝基苯碳酸鹽(NPC)或三氯苯碳酸鹽(TPC)。
11.如權(quán)利要求I所述的偶聯(lián)物，其中聚乙二醇的封閉基團(tuán)包括但不限于單甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、半乳糖或葡萄糖等。
12.如權(quán)利要求11所述的偶聯(lián)物，其中聚乙二醇的封閉基團(tuán)為單甲氧基基團(tuán)。
13.如權(quán)利要求I所述的偶聯(lián)物，其中聚乙二醇可以是支鏈的或直鏈的。
14.如權(quán)利要求I所述的偶聯(lián)物,其中聚乙二醇的平均分子量約為5kDa-20kDa。
15.如權(quán)利要求14所述的偶聯(lián)物，其中聚乙二醇的平均分子量約為5kDa。
16.如權(quán)利要求I所述的偶聯(lián)物，其中每個尿酸氧化酶單體上偶聯(lián)的聚乙二醇鏈的數(shù)量為4-12個。
17.如權(quán)利要求16所述的偶聯(lián)物，其中每個尿酸氧化酶單體上偶聯(lián)的聚乙二醇鏈的數(shù)量為6-11個。
18.如權(quán)利要求1-17所述的哺乳動物來源尿酸氧化酶的聚乙二醇偶聯(lián)物的制備方法，包括以下步驟(1)采用色譜層析法制備四聚體含量高于95.0%的四聚體尿酸氧化酶，其色譜層析法包括而不限于分子篩層析、離子交換層析。
(2)偶聯(lián)反應(yīng)中哺乳動物來源尿酸氧化酶與聚乙二醇修飾劑的摩爾比為I: 40 I : 160 ;偶聯(lián)反應(yīng)體系為碳酸鹽緩沖液，其pH范圍為8. 0-11.0,離子強(qiáng)度范圍為10-200mmol/Lo (3)采用的色譜層析法和/或超濾法，分離聚乙二醇化哺乳動物來源尿酸氧化酶，包括而不限于分子篩層析、離子交換層析、疏水層析、切向流超濾。
19.如權(quán)利要求1-18所述的哺乳動物來源尿酸氧化酶的聚乙二醇偶聯(lián)物的藥物組合物，其中含有有效劑量的選自權(quán)利要求1-18的任一偶聯(lián)物和一種藥學(xué)上可接受的載體。
20.如權(quán)利要求I所述的哺乳動物來源尿酸氧化酶的聚乙二醇偶聯(lián)物的應(yīng)用，其特征在于其用于預(yù)防和/或治療血液腫瘤化療導(dǎo)致的急性高尿酸血癥和代謝紊亂導(dǎo)致的高尿酸血癥及慢性痛風(fēng)。
21.如權(quán)利要求20所述的應(yīng)用，其中給藥步驟包括但不局限于靜脈注射、皮下注射、肌肉注射和腹腔注射或吸入霧狀制劑。
22.如權(quán)利要求20所述的應(yīng)用，其中血液腫瘤包括但不局限于白血病、多發(fā)性骨髓瘤以及惡性淋巴瘤。
23.如權(quán)利要求20所述的應(yīng)用，其中高尿酸血癥及慢性痛風(fēng)的主要癥狀包括但不局限于尿酸性腎病和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。
全文摘要
聚乙二醇(PEG)化犬源尿酸氧化酶類似物，其中犬源尿酸氧化酶類似物為天然犬源尿酸氧化酶和含有部分犬源和人源尿酸氧化酶氨基酸序列的嵌合蛋白及突變體蛋白，聚乙二醇的平均分子量約為1kDa-40kDa，每個尿酸氧化酶單體平均偶聯(lián)2-15個聚乙二醇分子。制備上述聚乙二醇(PEG)共價修飾的哺乳動物來源尿酸氧化酶的方法可使酶活保留率高于85.0％，純度高于95.0％。按本發(fā)明方法得到的聚乙二醇(PEG)共價修飾的犬源尿酸氧化酶類似物及其藥物組合物可用于預(yù)防和/或治療血液腫瘤化療導(dǎo)致的急性高尿酸血癥和代謝紊亂導(dǎo)致的高尿酸血癥及慢性痛風(fēng)。
文檔編號A61K38/44GK102634492SQ20111003730
公開日2012年8月15日 申請日期2011年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月14日
發(fā)明者張淳, 楊黎, 梅翔, 羅華, 胡春蘭, 范開, 馬雪豐 申請人:重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司