專利名稱：一種誘導(dǎo)陰道β防御素2分泌的促進劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種β防御素2分泌的促進劑。而且，本發(fā)明還涉及一種β防御素 2分泌促進劑的制備方法。
背景技術(shù)：
β -防御素2是陰道最主要的抗菌肽，具有可誘導(dǎo)表達(dá)的特點，通常情況下微量表 達(dá)，但在受到致病因子刺激時，防御素2表達(dá)量迅速提高，進而發(fā)揮粘膜保護功能。近 年研究結(jié)果表明，婦女陰道分布著大量防御素，參與其天然免疫防御機制，G—和G+、白假絲 酵母菌、TNF-a、IL-I β、雌激素等可促進β -防御素2在生殖系統(tǒng)上皮細(xì)胞中的表達(dá)。對 于β-防御素2的誘導(dǎo)性表達(dá)的研究可能給治療陰道感染性疾病帶來了新的思路，在人工 合成防御素尚存在技術(shù)、價格上的種種難題而不能有重大突破時，提取乳桿菌有效成分，研 制無毒、安全的微生物成分制成的免疫制劑以刺激β-防御素2在陰道粘膜局部的高表達(dá)， 來達(dá)到預(yù)防和治療陰道感染性疾病的目的可能是一個可行的方法。經(jīng)檢索，乳桿菌細(xì)胞壁成分的陰道粘膜β防御素2分泌的促進劑應(yīng)用，目前尚無 報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種誘導(dǎo)陰道β防御素2分泌的促進劑，它的主要成分是乳桿 菌細(xì)胞壁成分。本發(fā)明的另一個目的是提供該陰道β防御素2分泌的促進劑的應(yīng)用。本方法的具體步驟是從乳桿菌菌體中通過熱水提取有生物活性的粗多糖、去蛋 白、除鹽、柱層析純化和冷凍干燥。本發(fā)明具體工藝步驟如下1、乳桿菌發(fā)酵其菌體濃縮本發(fā)明所涉及到的乳桿菌包括嗜酸乳桿菌、保加利亞 乳桿菌、德氏乳桿菌。將乳桿菌種子液接入已經(jīng)滅菌后的每IOOml培養(yǎng)基中含有大豆蛋 白胨 1-1. 5g，魚胨 1-1. 5g，葡萄糖 2g，牛肉膏 0. 5-2g，酵母膏 0. 5_2g，K2HPO4 0. 2-0. 6g。經(jīng) 35-38。C厭氧發(fā)酵后，再經(jīng)離心濃縮即獲得乳桿菌菌體濃縮物。2、細(xì)胞破壁將該乳桿菌菌體濃縮物加蒸餾水或生理鹽水(1 3-1 5)，使用高 壓細(xì)胞破碎機操作壓力IOOMPa左右以高壓破碎菌體細(xì)胞壁。(3)將經(jīng)步驟( 破碎菌體細(xì)胞壁，PBS洗滌6次后取沉淀物，加入10倍的4% SDS 室溫孵育、過夜溶解細(xì)菌；(4)將經(jīng)步驟C3)菌體樣品，PBS洗滌10次后去掉細(xì)胞碎片和SDS，棄去上清液，依 次用250μ g/ml DNase I、RNase、胰蛋白酶孵育去除乳桿菌上所有連念物(各37°C X4h， PBS洗2次)，棄去上清液；(5)取經(jīng)步驟(3)的沉淀物濕重約20g加入60ml PBS置于乙醇中超聲處理2h (頻 率25次/min，超聲IOs停5s)，超速低溫離心機離心Ih ；(6)純化將經(jīng)步驟(5)沉淀物，真空冷凍干燥，得層析純?nèi)闂U菌細(xì)胞壁成分。
本發(fā)明的有益效果傳統(tǒng)的β -防御素2表達(dá)誘導(dǎo)劑為葡萄球菌、大腸埃希菌和一些厭氧菌以及前炎 癥因子如脂多糖、IL-Ιβ和TNF-α，這些誘導(dǎo)因子往往是機體的炎癥反應(yīng)，不具有實際應(yīng) 用價值，本發(fā)明β防御素2分泌的促進劑為乳桿菌細(xì)胞壁成分，使用上安全，是一種頗具應(yīng) 用潛力的防治細(xì)菌陰道感染的制劑。
具體實施例方式實施例1 1、乳桿菌發(fā)酵其菌體濃縮本發(fā)明所涉及到的乳桿菌包括嗜酸乳桿菌、保加利亞 乳桿菌、德氏乳桿菌。將乳桿菌種子液接入已經(jīng)滅菌后的每IOOml培養(yǎng)基中含有大豆蛋 白胨 1-1. 5g，魚胨 1-1. 5g，葡萄糖 2g，牛肉膏 0. 5-2g，酵母膏 0. 5_2g，K2HPO4 0. 2-0. 6g。經(jīng) 35-38。C厭氧發(fā)酵后，再經(jīng)離心濃縮即獲得乳桿菌菌體濃縮物。2、細(xì)胞破壁將該乳桿菌菌體濃縮物加蒸餾水或生理鹽水(1 3 1 5)，使用 高壓細(xì)胞破碎機操作壓力IOOMPa左右以高壓破碎菌體細(xì)胞壁。(4)將經(jīng)步驟( 破碎菌體細(xì)胞壁，PBS洗滌6次后取沉淀物，加入10倍的4% SDS 室溫孵育、過夜溶解細(xì)菌；(4)將經(jīng)步驟C3)菌體樣品，PBS洗滌10次后去掉細(xì)胞碎片和SDS，棄去上清液，依 次用250μ g/ml DNase I、RNase、胰蛋白酶孵育去除乳桿菌上所有連念物(各37°C X4h， PBS洗2次)，棄去上清液；(5)取經(jīng)步驟(3)的沉淀物濕重約20g加入60ml PBS置于乙醇中超聲處理2h (頻 率25次/min，超聲IOs停5s)，超速低溫離心機離心Ih ；(6)純化將經(jīng)步驟( 沉淀物，真空冷凍干燥，得層析純?nèi)闂U菌細(xì)胞壁成分。實施例2確認(rèn)促進β -防御素2分泌的試驗為了評價乳桿菌細(xì)胞壁成分的促進進β -防御素2分泌的效果，以IRC小鼠為被 檢驗對象，進行下列試驗。1.實驗分組及處理將50只IRC小鼠隨機分成5組乳桿菌細(xì)胞壁成分 (Lactobacillus Cell Wall Extract, LCWE)處理組采用微量加樣器取200 μ 1，小鼠陰道 內(nèi)給藥LCWE (5mg/L、20mg/L和100mg/L)，1次/天，連續(xù)處理5天；陰性對照組小鼠陰道注 射等量生理鹽水，陽性對照組小鼠陰道注射等量的大腸埃希菌EPEC104菌液(3X IO9CFU/ ml) ο2.采集檢測標(biāo)本陰道接種處理后第3天處死小鼠，取出陰道組織，部分留作陰道 菌群分析評價、部分陰道組織錫箔紙包好，凍存于-70°C冰箱，留作熒光定量PCR和Western blot檢測。3.小鼠陰道組織β -防御素2mRNA的表達(dá)結(jié)果采用實時熒光定量PCR檢測小鼠陰道組織β-防御素2mRNA表達(dá)量的變化，結(jié)果 生理鹽水組β -防御素2mRNA表達(dá)量極低，大腸埃希菌組能顯著誘導(dǎo)陰道組織β -防御素 2mRNA的表達(dá)。小鼠陰道組織β-防御素2mRNA表達(dá)水平隨陰道接種乳桿菌細(xì)胞壁成分 (Lactobacillus Cell Wall Extract,LCWE)濃度水平的提高而增加的變化趨勢，即從接種 5mg/L濃度LCWE處理組開始，其相對表達(dá)量開始提高，100mg/L濃度LCWE處理組其表達(dá)量
4達(dá)到最高。4.小鼠陰道組織β -防御素2的蛋白表達(dá)結(jié)果Western blot結(jié)果生理鹽水組小鼠陰道組織中未檢測到β _防御素2蛋白表達(dá)， 而100mg/L濃度LCWE處理組和大腸埃希菌組出現(xiàn)特異性條帶，100mg/L濃度LCWE處理組可 以顯著誘導(dǎo)小鼠陰道組織防御素2蛋白表達(dá)。提示LCffE對小鼠陰道組織β-防御素 2的表達(dá)有誘導(dǎo)作用，而且與LCWE的濃度有關(guān)。經(jīng)20mg/L含有乳桿菌細(xì)胞壁成分的誘導(dǎo)陰道組織β防御素2分泌的促進劑陰道 處理后，陰道β防御素2活性開始提高，14天時，活性達(dá)到最大值，比對照組高出3倍多，之 后開始下降二8天時經(jīng)處理的陰道β防御素2活性仍然高于對照組。
權(quán)利要求
1.一種誘導(dǎo)陰道β防御素2分泌的促進劑，它的活性成分為乳桿菌細(xì)胞壁成分。
2.一種誘導(dǎo)陰道β防御素2分泌的促進劑的制備方法如下(1)乳桿菌發(fā)酵及其菌體濃縮將乳桿菌種子液接入已經(jīng)滅菌后的每IOOml培養(yǎng) 基中含有大豆蛋白胨1-1. 5g,魚胨1-1. 5，葡萄糖2g，牛肉膏0. 5-2g，酵母膏0. 5_2g， K2HPO4O. 2-0. 6g。經(jīng)35-38°C厭氧發(fā)酵后，再經(jīng)離心濃縮即獲得乳桿菌菌體濃縮物。(2)細(xì)胞破壁將該乳桿菌菌體濃縮物加蒸餾水或生理鹽水(1 3-1 5)，使用高壓 細(xì)胞破碎機操作壓力IOOMPa左右以高壓破碎菌體細(xì)胞壁。(3)將經(jīng)步驟( 破碎菌體細(xì)胞壁，PBS洗滌6次后取沉淀物，加入10倍的4%SDS室 溫孵育、過夜溶解細(xì)菌；(4)將經(jīng)步驟(3)菌體樣品，PBS洗滌10次后去掉細(xì)胞碎片和SDS，棄去上清液，依次用 250 μ g/ml DNase I、RNase、胰蛋白酶孵育去除乳桿菌上所有連念物(各37°C X4h，PBS 洗2次)，棄去上清液；(5)取經(jīng)步驟(3)的沉淀物濕重約20g加入60mlPBS置于乙醇中超聲處理2h(頻率 25次/min，超聲IOs停5s)，超速低溫離心機離心Ih ；(6)純化將經(jīng)步驟( 沉淀物，真空冷凍干燥，得層析純?nèi)闂U菌細(xì)胞壁成分。
3.權(quán)利要求1說述的一種誘導(dǎo)陰道β防御素2分泌的促進劑，其特征在于乳桿菌為嗜 酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、德氏乳桿菌中的一種或多種。
4.一種誘導(dǎo)陰道β防御素2分泌的促進劑的應(yīng)用，其特征在于經(jīng)20mg/L含有乳桿 菌細(xì)胞壁成分的誘導(dǎo)小鼠陰道組織β防御素2分泌的促進劑陰道處理后，陰道β防御素 2活性開始提高，14天時，活性達(dá)到最大值，比對照組高出3倍多，之后開始下降，28天時經(jīng) 處理的小鼠陰道β防御素2活性仍然高于對照組。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)陰道β防御素2分泌的促進劑。本發(fā)明所提供的誘導(dǎo)陰道β防御素2分泌促進劑，它的活性成分為乳桿菌細(xì)胞壁成分。β-防御素2具有廣譜的抗菌活性，獨特的抗菌機理，不受傳統(tǒng)抗生素耐藥菌株影響。無毒、安全的微生物成分制成的陰道β防御素2分泌的促進劑以刺激β-防御素2在陰道粘膜局部的高表達(dá)，來達(dá)到預(yù)防和治療陰道感染性疾病的目的可能是一個可行的方法。
文檔編號A61P15/02GK102125584SQ20111003852
公開日2011年7月20日 申請日期2011年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月31日
發(fā)明者劉佳明, 樓永良 申請人:溫州醫(yī)學(xué)院