專利名稱：鈣激活氯通道ano1/tmem16a在診斷和治療前列腺癌中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鈣激活氯通道AN01/TMEM16A的新用途，尤其涉及鈣激活氯通道ANOl/ TMEM16A在制備診斷和治療前列腺癌的試劑或藥物中的用途，屬于鈣激活氯通道ANOl/ TMEM16A的醫(yī)藥用途領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鈣激活氯通道廣泛地存在于各種興奮性和非興奮性細(xì)胞上，在生理狀態(tài)下發(fā)揮多種重要功能，如調(diào)控細(xì)胞興奮性、收縮、細(xì)胞周期、分泌以及細(xì)胞轉(zhuǎn)移等等，它們對(duì)于維護(hù)組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)起到了至關(guān)重要的作用。離子通道這些重要作用主要是通過(guò)控制通過(guò)細(xì)胞的離子流、調(diào)節(jié)細(xì)胞體積以及產(chǎn)生膜電位來(lái)實(shí)現(xiàn)的。氯離子通道在控制細(xì)胞膜興奮性、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)以及調(diào)節(jié)細(xì)胞體積的過(guò)程中起到了重要的作用。在細(xì)胞進(jìn)行主動(dòng)吸收、胞吐、增殖以及分化過(guò)程中，有效抵擋細(xì)胞體積變化、維持體積恒定及內(nèi)穩(wěn)態(tài)是細(xì)胞存活的必要條件。前列腺癌或腺癌始發(fā)于腺上皮細(xì)胞，是男性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。然而其發(fā)病機(jī)制至今尚未明確。證據(jù)表明，改變鈣離子內(nèi)穩(wěn)態(tài)或使電壓門控離子通道表達(dá)上調(diào)可導(dǎo)致一些細(xì)胞發(fā)生癌變。AN01/TMEM16A是細(xì)胞膜上的鈣激活氯通道(其核苷酸序列為SEQ IDNo. 1所示，所編碼的蛋白的氨基酸序列為SEQ ID No. 2所示)。AN0/TMEM16家族在哺乳動(dòng)物中共有10 個(gè)成員，它們分別是TMEM16A-TMEM16J (ANO1-AN010)。AN0/TMEM16家族為8次跨膜通道，并且其N-端及C-端均位于胞內(nèi)。編碼ANOl通道的基因TMEM16A位于人類常染色體llql3。 迄今為止，尚未有文獻(xiàn)報(bào)道AN01/TMEM16A是前列腺癌的生物標(biāo)記物，可用于前列腺癌的診斷、預(yù)后和治療后預(yù)后的評(píng)估指標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供鈣激活氯通道AN01/TMEM16A的一種新的醫(yī)藥用途。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明首先通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AN01/TMEM16A與人前列腺癌密切相關(guān)，且隨著癌癥惡性度的增高，ANOl表達(dá)增高；進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AN01/TMEM16A可體外促進(jìn)人前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抑制AN01/TMEM16A的表達(dá)可有效抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖，說(shuō)明AN01/TMEM16A在前列腺癌的發(fā)展過(guò)程中起到了重要的作用。通過(guò)本發(fā)明的這一系列實(shí)驗(yàn)，證明鈣激活氯通道AN01/TMEM16A至少可具有以下幾方面的醫(yī)藥用途由于AN01/TMEM16A與人前列腺癌密切相關(guān)，可將其作為生物標(biāo)志物，用于診斷或檢測(cè)前列腺癌，也即是說(shuō)，可將AN01/TMEM16A制備成檢測(cè)或診斷前列腺癌的試劑，例如， 可將AN01/TMEM16A蛋白作為抗體制備成診斷或檢測(cè)前列腺癌的試劑盒，或者是將ANOl/TMEM16A基因制備成基因芯片用于診斷或檢測(cè)人前列腺癌。另外，由于隨著癌癥惡性度的增高，ANOl表達(dá)增高，可以將AN01/TMEM16A用于前列腺癌的預(yù)后和治療后預(yù)后的評(píng)估指標(biāo)。另外，本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抑制AN01/TMEM16A的表達(dá)可有效抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖，因此可將AN01/TMEM16A制備成基因藥物用于預(yù)防或治療人前列腺癌。例如，可通過(guò)RNA干擾方法，制備得到抑制AN01/TMEM16A表達(dá)的基因工程藥物，這些方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所習(xí)知。具體的，本發(fā)明首先通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在人前列腺癌細(xì)胞(PC-3)中，AN01/TMEM16A 的mRNA及蛋白表達(dá)水平均高于正常人前列腺上皮細(xì)胞(RWPE-I)。由此證明AN01/TMEM16A 與人前列腺癌密切相關(guān)；為了進(jìn)一步研究AN01/TMEM16A與人前列腺癌的相關(guān)性，本發(fā)明采用RNA干擾手段，檢測(cè)當(dāng)敲除人前列腺癌細(xì)胞PC-3中的AN01/TMEM16A時(shí)，其對(duì)PC-3細(xì)胞體外增殖、遷移、侵襲能力及裸鼠體內(nèi)成瘤的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將特異性靶向ANOl/ TMEM16A的shRNA(shRNA3)體外轉(zhuǎn)染人前列腺癌細(xì)胞PC-3時(shí)，發(fā)現(xiàn)敲除AN01/TMEM16A后， PC-3細(xì)胞增殖能力減弱。由此表明AN01/TMEM16A促進(jìn)人前列腺癌細(xì)胞增殖。本發(fā)明通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)以及利用Tranwell遷移小室分別檢測(cè)特異性敲除AN01/TMEM16A后對(duì)人前列腺癌細(xì)胞PC-3的遷移及侵襲能力的影響。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，相對(duì)于轉(zhuǎn)染Negative control shRNA組，轉(zhuǎn)染ANOl shRNA3后，PC-3細(xì)胞的遷移能力大大降低。S卩AN01/TMEM16A可促進(jìn)癌細(xì)胞遷移。本發(fā)明通過(guò)細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)(利用Transwell小室)檢測(cè)癌細(xì)胞侵襲能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相對(duì)于轉(zhuǎn)染Negative control shRNA組，轉(zhuǎn)染AN01shRNA3后，PC_3細(xì)胞的侵襲能力降低。由此可見(jiàn)AN01/TMEM16A亦可促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲。由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ANOl/ TMEM16A可體外促進(jìn)人前列腺癌細(xì)胞PC-3的增殖、遷移及侵襲能力。為了進(jìn)一步觀察ANO1 /TMEM16A與人前列腺癌的關(guān)系，本發(fā)明在動(dòng)物瘤體注射 ANOl shRNA進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，體內(nèi)結(jié)果表明，ANOl shRNA可減慢裸鼠腫瘤(前列腺癌細(xì)胞移植瘤)的生長(zhǎng)，此結(jié)果進(jìn)一步證明AN01/TMEM16A在前列腺癌的發(fā)展過(guò)程中起到了重要的作用。


圖IReal-time PCR及western檢測(cè)AN01/TMEM16A在人前列腺癌細(xì)胞中mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況結(jié)果。圖2AN01在正常人、前列腺增生病人和前列腺癌病人的前列腺組織中的表達(dá)結(jié)果；A為正常人前列腺組織，沒(méi)有檢測(cè)到ANOl表達(dá)；B為前列腺增生病人組織，同樣沒(méi)有 ANOl表達(dá)；而C則為前列腺癌病人組織染色結(jié)果。圖3正常人前列腺上皮細(xì)胞(RWPE-I)以及兩種前列腺癌細(xì)胞系(DU145和PC_3) 的ANOl全細(xì)胞電流實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖 43 段靶向 AN01/TMEM16A 的特異性 shRNA (shRNAl-3)對(duì) AN01/TMEM16A 的抑制效率試驗(yàn)結(jié)果。圖5敲除人前列腺癌細(xì)胞(PC-3)中AN01/TMEM16A對(duì)其體外增殖能力的影響試驗(yàn)結(jié)果。圖6細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)特異性敲除AN01/TMEM16A后對(duì)人前列腺癌細(xì)胞PC_3的遷移及侵襲能力影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
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圖7細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)(利用Transwel 1小室)用于檢測(cè)AN01/TMEM16A對(duì)癌細(xì)胞侵襲能力應(yīng)縣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖8瘤體注射ANOlshRNA后的影響腫瘤增殖的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)驗(yàn)例1AN01/TMEM16A與人前列腺癌的相關(guān)性實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)Real-time PCR及western檢測(cè)AN01/TMEM16A在人前列腺癌細(xì)胞中 mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況。為了檢測(cè)AN01/TMEM16A在人前列腺癌細(xì)胞中mRNA水平的表達(dá)情況，本實(shí)驗(yàn)分別提取正常人前列腺上皮細(xì)胞(RWPE-I)(購(gòu)自ATCC公司)以及人前列腺癌細(xì)胞(PC-3以及 DU145)(購(gòu)自ATCC公司)的全細(xì)胞RNACTrizol法)，然后應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司)將全細(xì)胞RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，進(jìn)而應(yīng)用SYBR ft~emix Ex TaqTM II kit (日本TAKARA 公司)進(jìn)行Real-Time PCR實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)。Real-Time PCR實(shí)驗(yàn)采用20ul體系95°C、30秒預(yù)變性；然后放大40個(gè)循環(huán)(95°C、5秒變性；60°C、34秒退火及延伸)。Real-Time PCR所需的引物分別為AN01/TMEM16A 正向引物為TCTGCTGGATGAAGTTTACGG ；ANOl/TMEM16A 反向引物為AGGCGACATAGAAGATGGGAG ；β -actin 正向引物為TGTTACCAACTGGGACGAC ；β -actin 反向引物為GGTGTTGAAGGTCTCAAACAT.為進(jìn)一步檢測(cè)AN01/TMEM16A在人前列腺癌細(xì)胞中蛋白水平的表達(dá)情況，本實(shí)驗(yàn)采用western檢測(cè)方法。首先分別提取正常人前列腺上皮細(xì)胞(RWPE-I)以及人前列腺癌細(xì)胞(PC-3以及DU145)的全細(xì)胞蛋白，繼而用BCA蛋白定量方法(試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司)將各組細(xì)胞蛋白進(jìn)行定量。進(jìn)行western實(shí)驗(yàn)時(shí)，上樣量為30ug。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中 AN01/TMEM16A抗體(兔抗人AN01/TMEM16A，購(gòu)自英國(guó)Abcam公司)稀釋倍數(shù)為1 1000 ； β -actin抗體(羊抗人β -actin購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司)稀釋倍數(shù)為1 500 ；二抗均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，且稀釋倍數(shù)為1 5000。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在人前列腺癌細(xì)胞PC_3(購(gòu)自ATCC公司)中， AN01/TMEM16A的mRNA及蛋白表達(dá)水平均高于正常人前列腺上皮細(xì)胞(RWPE-I)。由此證明 AN01/TMEM16A與人前列腺癌密切相關(guān)。為進(jìn)一步篩查ANOl在前列腺癌病人組織的表達(dá)情況，通過(guò)免疫組化的手段，分別檢測(cè)了 72例不同程度( Μ臨床分期I到IV期)的前列腺癌病人、16例前列腺增生病人、 以及5例正常人的前列腺組織中ANOl的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。由結(jié)果可知在正常人及前列腺增生病人的前列腺組織中均沒(méi)有檢測(cè)到ANOl表達(dá)，而前列腺癌病人組織中則有不同程度的ANOl表達(dá)。表1和表2分別是由免疫組化染色進(jìn)行評(píng)分、分析后得到的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。表1介紹了不同病人前列腺組織中ANOl表達(dá)情況。5例正常人組織中無(wú)一例檢測(cè)到ANOl表達(dá)。16
5例前列腺增生病人中有2例檢測(cè)到ANOl表達(dá)升高，陽(yáng)性率為12. 5%。而在檢測(cè)的72例前列腺癌病人中，有65例病人檢測(cè)到ANOl表達(dá)升高，陽(yáng)性率達(dá)到90. 3%。表2進(jìn)一步根據(jù) TW分期以及Gleason評(píng)分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)隨著TW分期以及Gleason評(píng)分的升高(即隨著前列腺癌惡性程度增高)，ANOl表達(dá)逐步增高。這就表明ANOl很可能成為前列腺癌的生物標(biāo)記物。表 權(quán)利要求
1.SEQ ID No. 1所示的鈣激活氯通道AN01/TMEM16A基因在制備診斷或檢測(cè)人前列腺癌的試劑中的用途。
2.SEQ ID No. 1所示的鈣激活氯通道AN01/TMEM16A基因在制備預(yù)防或治療人前列腺癌藥物中的用途。
3.按照權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于所述的藥物是基因工程藥物。
4.一種診斷或檢測(cè)人前列腺癌的試劑盒，其特征在于含有SEQ IDNo. 1所示的鈣激活氯通道AN01/TMEM16A基因。
5.SEQ ID似.2所示的鈣激活氯通道4而1八腿機(jī)64蛋白在制備診斷或檢測(cè)人前列腺癌的試劑中的用途。
6.SEQ ID似.2所示的鈣激活氯通道4而1八腿機(jī)64蛋白在制備預(yù)防或治療人前列腺癌藥物中的用途。
7.—種診斷或檢測(cè)人前列腺癌的試劑盒，其特征在于含有SEQ IDNo. 2所示的鈣激活氯通道AN01/TMEM16A蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了鈣激活氯通道ANO1/TMEM16A在診斷和治療前列腺癌中的用途。本發(fā)明首先通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ANO1/TMEM16A與人前列腺癌密切相關(guān)，且隨著癌癥惡性度的增高，ANO1表達(dá)增高；進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ANO1/TMEM16A可體外促進(jìn)人前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抑制ANO1/TMEM16A的表達(dá)可有效抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖，表明ANO1/TMEM16A在前列腺癌的發(fā)展過(guò)程中起到了重要的作用，可將ANO1/TMEM16A作為生物標(biāo)志物，用于診斷或檢測(cè)前列腺癌或用于前列腺癌的預(yù)后和治療后預(yù)后的評(píng)估指標(biāo)，還可將其制備成基因藥物用于治療人前列腺癌。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102154482SQ20111004106
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月16日
發(fā)明者劉雯, 王克威 申請(qǐng)人:北京大學(xué)