專利名稱：一株來源于婦女生殖道產細菌素的益生乳酸菌的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微生物技術領域，尤其涉及一株來源于婦女生殖道產細菌素的益生乳酸菌。
背景技術：
微生態(tài)是指正常微生物菌群與其周圍的生物和非生物環(huán)境條件相互作用構成的微觀生態(tài)系統(tǒng)。正常情況下微生態(tài)處于一個波動的狀態(tài)，微生物的種類和數量都不會發(fā)生質的變化。健康婦女陰道內存在著多種微生物，它們與宿主、環(huán)境之間構成了相互制約、相互協(xié)調、動態(tài)平衡的陰道微生態(tài)系統(tǒng)。當陰道這個系統(tǒng)平衡被破壞時，會出現由于陰道菌群失調引起的多種疾病，如細菌性陰道炎、霉菌性陰道炎、滴蟲性陰道炎等。目前治療陰道感染的措施主要是運用抗生素、滅滴靈、雌激素以及酸化陰道的制劑等來殺滅陰道內的病原微生物。值得注意的是，上述療法在某種程度上會抑制正常的菌群，引起致病菌或條件致病菌的過度繁殖，從而造成反復感染或多重感染，增加治療的的難度和成本。許多研究表明， 利用陰道正常微生態(tài)中的乳酸菌制成的制劑對陰道感染的預防和治療都具有良好的療效。乳酸菌在陰道微生態(tài)中發(fā)揮作用的機制推測為黏附上皮細胞，形成空間位阻，阻止病原菌初始黏附；分泌有機酸，主要是水解糖原產生的乳酸；產生細菌素抑制病原菌等。黏附是微生物與宿主相互關系的先決條件之一，是定植的第一步，是其發(fā)揮生物屏障功能的基礎。乳酸菌的黏附是由乳酸菌細胞壁中的脂磷壁酸、細菌表面蛋白等黏附素與宿主細胞表面的受體相結合的過程，并且在黏附的過程中還受到環(huán)境因素的影響。乳酸菌黏附后通過形成生物學屏障，或是通過分泌的有機酸或細菌素等起到抑制病原菌，維持機體健康的效果。陰道的酸性環(huán)境有利于乳酸菌發(fā)揮自身生物學效應，有利于其生長以及增強其與陰道上皮細胞受體結合的能力，從而增強對陰道上皮細胞的黏附。酸性環(huán)境也有利于維持乳酸菌產生細菌素類物質的活性。因此，利用乳酸菌產乳酸酸化陰道環(huán)境，恢復陰道微生態(tài)系統(tǒng)的生理特征，有利于乳酸菌的生長和發(fā)揮微生態(tài)調節(jié)的機能。乳酸菌產生多種抑菌物質，如細菌素、細菌素樣物質和表面活性物質。細菌素是細菌在伴隨著核糖體合成過程中產生的一類分泌到細胞外的小分子蛋白質或多肽代謝物，革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均可以產生細菌素，對同源以及近源的微生物，甚至對生活在同一個生態(tài)環(huán)境下其他種類的微生物也具有殺傷作用。一些細菌素如乳酸鏈球菌素nisinA 在酸性環(huán)境可發(fā)揮更強的殺菌作用。目前，從人體陰道分離的乳酸菌中，乳酸桿菌所占比例較大，而具有一定黏附作用的乳酸乳球菌則鮮見報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供一株來源于婦女生殖道產細菌素的益生乳酸菌。本發(fā)明提供的菌，其為乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcus lactis subsp.lactis)CV56，其保藏號為 CGMCC No. 4537。本發(fā)明的另一個目的是提供一種生產細菌素的方法。 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟發(fā)酵乳酸乳球菌乳酸亞種 (Lactococcuslactis subsp. lactis) CV56CGMCC No. 4537，收集發(fā)酵產物，即得到細菌素。所述發(fā)酵所用的培養(yǎng)基為優(yōu)化的MRS液體培養(yǎng)基，按照如下方法配制將酪蛋白胨10. O克；牛肉膏10. O克；酵母提取物5. O克；葡萄糖20. O克；乙酸鈉5. O克；檸檬酸氫二胺2. O克；吐溫801. OmL ；磷酸氫二鉀2. O克；七水硫酸鎂0. 58克；一水硫酸錳0. 25克； 加蒸餾水至1.0升，卩116.8。所述發(fā)酵的溫度為35°C _37°C，所述發(fā)酵的溫度具體為35°C、36°C或37°C。所述發(fā)酵時間為12h_16h，所述發(fā)酵時間具體為12h、14h或16h。所述的菌在制備抑菌產品中的應用也是本發(fā)明保護的范圍。所述抑菌體現在抑制革蘭氏陽性菌，所述革蘭氏陽性菌具體為表皮葡萄球菌 (Staphylococcus epidermidis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、黃色微球菌(Micrococcus f lavus)、月市炎鏈球菌(Streptococcuspenumoniae)、李斯特氏菌 (Listeriosis)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)禾口 / 或糞腸球菌(Enterococcus faecalis)0所述產品為藥物或菌劑。所述的菌在制備治療陰道感染產品中的應用也是本發(fā)明保護的范圍。所述產品為藥物或菌劑。菌株CV56于2011年1月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所， 郵編100101)，保藏號為CGMCC No. 4537，其分類命名為乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcus lactis subsp. lactis)。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明分離出一株新的乳酸乳球菌CV56，其可以分泌細菌素抑制陰道內相關病原菌，并且對陰道上皮細胞有一定的黏附作用，有利于其在陰道環(huán)境中的定植，并能產生乳酸降低陰道PH值，從而從多方面發(fā)揮陰道微生態(tài)環(huán)境的維護及益生作用。


圖1為乳酸乳球菌CV56生長曲線圖2為乳酸乳球菌CV56所產細菌素Tricine-SDS-PAGE電泳結果。圖3為乳酸乳球菌CV56所產細菌素質譜鑒定結果圖4為乳酸乳球菌CV56及乳酸乳球菌MG1363對宮頸癌上皮Hela細胞的黏附作用(1000X)
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、來源于婦女生殖道產細菌素的益生乳酸菌的分離、篩選及鑒定
一、菌株的分離篩選1、細菌的分離、純化將一次性無菌棉拭子伸 入陰道口 6cm深處，刮取樣本。立即放入裝有IOmL含 0. 5%蛋白胨的無菌生理鹽水中。充分攪拌，使棉拭子上的樣本完全溶解取出棉拭子，蓋上試管塞，2h內送實驗室分析。將樣本進行10倍梯度稀釋至10_6，充分混勻，取不同稀釋度各 100 μ L分別接種于改良MRS平板上，涂布均勻，置于37°C，厭氧培養(yǎng)48h。根據菌落形態(tài)， 挑取不同的單菌落，劃線分離于普通MRS平板上，37°C厭氧培養(yǎng)48h。重復上述劃線分離步驟，得到260株細菌純培養(yǎng)物。2、黃色微球菌抑菌實驗(1)將上述分離的260株菌接種于MRS液體培養(yǎng)基，37°C厭氧培養(yǎng)16h，取發(fā)酵液
上清液。(2)含指示菌的平板的制備用Sl固體培養(yǎng)基(胰蛋白胨8g，酵母提取物5g，葡萄糖5g,Na2HPO4 2g,NaCl 5g，吐溫201mL，瓊脂粉12g，加蒸餾水至1. 0升，pH為自然)平板培養(yǎng)Micrococcus flavusNCIB 8166菌株，挑取一環(huán)菌體于生理鹽水中，懸浮混勻，取0. 5mL 懸浮液加入融化的20mL固體瓊脂培養(yǎng)基中混勻，倒入Φ90πιπι的培養(yǎng)皿中，平放。(3)抑菌活性的測定用直徑7mm的打孔器在含目標菌的平板上打孔，每孔加入 30 μ 1各菌株的發(fā)酵液上清液，30°C培養(yǎng)16h，觀察抑菌圈，抑菌圈直徑大于IOmm認為有抑菌活性。結果為第56號菌株有明顯的抑菌活性，抑菌圈直徑為16mm，將第56號菌株命名為 CV56。3、分離株鏡檢將分離得到的CV56菌株取多菌落涂片，經革蘭氏染色后，在油鏡下檢查。結果為革蘭氏陽性菌。4、觸酶反應將上述分離的CV56菌株進行觸酶反應。觸酶即過氧化氫酶，能催化H2O2分解為水和氧氣。取一環(huán)純培養(yǎng)的細菌，涂于干凈的玻璃板上，然后在其上滴加一滴3%的H2O2，如果有氣泡產生則為陽性反應，否則為陰性。結果為陰性。5、乳酸測定(1)發(fā)酵液樣品預處理培養(yǎng)上述分離的CV56菌株，得到發(fā)酵液，取適量發(fā)酵液樣品5000r/min離心 lOmin，以除去菌體和碳酸鈣沉淀，取上清液適當稀釋，吸取稀釋液2mL于潔凈離心管中，力口入2mL鎢酸溶液，混勻，室溫(25°C )靜置，直至溶液中出現明顯絮狀物，lOOOOr/min離心 lOmin，取上清液置于IOmL潔凈離心管中，60°C水浴保溫30mi η左右，冷卻待用，即為待測液。(2)吸光度測定精確吸取5mL上述(1)得到的待測液于IOmLEP管中，加入0. 05g氫氧化鈣，混勻， 然后加入0. SmL 20% (質量百分含量)硫酸銅水溶液，迅速混勻，沸水浴3min，水浴冷卻， 3000r/min離心5min，取上清液0. 5mL入IOmLEP管中；加入6mL濃硫酸，混勻，沸水浴加熱5min，取出后冰水浴冷卻；加入1. 5%對羥基聯苯溶液0. 125mL，充分混勻，靜置15min ；置于沸水浴中加熱5min，冰水浴冷卻，以蒸餾水為參比液，在565nm處測吸收。(3)標準曲線的制作0. 5mg/mL乳酸標準液(精確稱取無水乳酸鋰53. 25mg,溶于50mL蒸餾水中，力口 0. 5mol/L硫酸10mL，后加蒸餾水定容至IOOmL)與發(fā)酵液同樣預處理后，取0. 15,0. 20、 0. 25,0. 30,0. 35,0. 40,0. 45,0. 50mL處理液，分別加進8支預先編號的試管，再用蒸餾水補足體積至5mL，按上述步驟操作，分別測定吸光度。以乳酸含量為橫坐標，吸光度為縱坐標作圖得到標準曲線。結果為CV56菌株產乳酸10. 3mg/mL。
二、菌株的鑒定1、CV56的生理生化鑒定1)油鏡和肉眼觀察CV56的個體形態(tài)、菌落形態(tài)、革蘭氏染色、孢子的形成。2)CV56的運動性用直針穿刺接種CV56菌于半固體MRS培養(yǎng)基內，置于37°C恒溫箱中培養(yǎng)18 24h。如培養(yǎng)物透過光目測只生長在接種的穿刺線上，邊緣十分清晰，則表示試驗菌無運動性。如培養(yǎng)物生長由穿刺線向四周呈云霧狀擴散，其邊緣模糊呈云霧狀，表示試驗菌有運動性。溶血性實驗將CV56菌接種于羊血平板上，用接種針在已接種過的血平板上扎 2 3處，使細菌被接種到瓊脂層深處，35°C孵育過夜。觀察結果在接種針穿刺過處，羊紅細胞完全溶解，形成無色透明區(qū)，為β溶血。羊紅細胞部分溶解或不溶解呈草綠色的環(huán)，為 α溶血。不溶解無溶血環(huán)為Y溶血。3)過氧化氫酶的活性(方法同上述的觸酶反應)。4)精氨酸脫羧酶實驗將CV56菌種分別接種到添加L-精氨酸的培養(yǎng)基試管和未加氨基酸的空白對照培養(yǎng)基試管中，37°C恒溫箱中培養(yǎng)18 24h，培養(yǎng)基呈紫色者為氨基酸脫羧酶試驗陽性；培養(yǎng)基呈黃色者為該項試驗陰性。5)葡萄糖產氣在液體MRS培養(yǎng)基內添加6g/L的瓊脂做成軟瓊脂柱。分裝試管， 高度4-5厘米。為便于觀察產酸情況，在培養(yǎng)基內加入1. 6g/100mL的溴甲酚紫1. 4mL指示齊U。用較大量的新鮮活力強的CV56菌種進行穿刺接種，置于37°C恒溫箱中培養(yǎng)18 24h， 培養(yǎng)基中指示劑變黃表示產酸，軟瓊脂柱內產生氣泡表示產氣。6)產過氧化氫將CV56菌接種在含有0. 25mg/mL四甲基聯苯胺及0. Olmg/mL辣根過氧化物酶的MRS固體培養(yǎng)基上，置于37°C恒溫箱中培養(yǎng)18 24h，待長出菌落后，將培養(yǎng)基置于空氣中暴露30分鐘，菌落由白色變?yōu)樗{色表明有過氧化氫產生，完全不變色為陰性。7)溫度敏感性將CV56菌液在60°C培養(yǎng)30分鐘，與未處理的對照組同時稀釋成適當濃度，吸ImL加到融化溫度達50度的15mL的MRS瓊脂培養(yǎng)中混勻使其凝固，置37°C孵育18 24h，取出進行菌落計數，每個平板菌落數乘稀釋倍數得到每mL中細菌數量。8)葡萄糖降解產物(方法與上述乳酸測定相同)。9)在不同培養(yǎng)條件的生長狀況在溫度為10°C、40°C、45°C下分別培養(yǎng)，在MRS液體培養(yǎng)基、含有4% NaCl的MRS液體培養(yǎng)基、含有6. 5% NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)，在PH值為9. 2的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
以上1) -9)的檢測結果具體見表1所示表1為CV56形態(tài)與生理學特性
權利要求
1.乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcuslactis subsp. lactis)CV56，其保藏號為CGMCC No.4537。
2.—種生產細菌素的方法，包括如下步驟發(fā)酵權利要求1所述的乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcus lactis subsp. lactis) CV56CGMCC No. 4537，收集發(fā)酵產物，即得到細菌素。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵的溫度為35°C _37°C，所述發(fā)酵的溫度具體為35°C、36°C或37°C。
4.根據權利要求2或3所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵時間為12h-16h。
5.根據權利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵時間為12h、14h或16h。
6.權利要求1所述的菌在制備抑菌產品中的應用。
7.根據權利要求7所述的應用，其特征在于所述抑菌體現在抑制革蘭氏陽性菌，所述革蘭氏陽性菌具體為表皮葡萄球菌 (Staphylococcus epidermidis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、黃色微球菌(Micrococcus flavus)、月市炎鏈球菌(Streptococcus penumoniae)、李其jf特氏菌(Listeria monocytogenes)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)禾口/ 或糞腸球菌 (Enterococcus faecalis)。
8.根據權利要求6或7所述的應用，其特征在于所述產品為藥物或菌劑。
9.權利要求1所述的菌在制備治療陰道感染產品中的應用。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于所述產品為藥物或菌劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株來源于婦女生殖道產細菌素的益生乳酸菌。本發(fā)明提供的一株來源于婦女生殖道產細菌素的益生乳酸菌，其為乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcuslactis subsp.lactis)CV56，其保藏號為CGMCC No.4537。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明分離出一株新的乳酸乳球菌CV56，其可以分泌細菌素抑制陰道內相關病原菌，并且對陰道上皮細胞有一定的黏附作用，有利于其在陰道環(huán)境中的定植，并能產生乳酸降低陰道pH值，從而從多方面發(fā)揮陰道微生態(tài)環(huán)境的維護及益生作用。
文檔編號A61K35/74GK102181383SQ20111004427
公開日2011年9月14日 申請日期2011年2月23日 優(yōu)先權日2011年2月23日
發(fā)明者滕坤玲, 蘆穎, 鐘瑾, 陳美玲, 高涌 申請人:中國科學院微生物研究所