專利名稱：一種抑制肺癌細(xì)胞生長的峨?yún)⑻崛∥锛捌渌幱糜猛镜闹谱鞣椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體說是對肺癌細(xì)胞具有明顯抑制作用的石油醚峨?yún)⒉课?提取物，及其制備方法和對肺癌防治方面的用途。
背景技術(shù)：
肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，按病理類型可分為小細(xì)胞肺癌(small cell 1 μ ng cancer SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell 1 μ ng cancer NSCLC)，其中 NSCLC占80%，它嚴(yán)重影響人類生命健康，目前已成為世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫 瘤之一。肺癌常規(guī)治療方法包括外科治療、放射治療、化學(xué)治療、中醫(yī)藥治療、中西醫(yī)結(jié)合治 療、靶向治療等。在我國，傳統(tǒng)的中醫(yī)療法在肺癌的綜合治療中發(fā)揮獨特的作用。中醫(yī)認(rèn)為 肺癌的病因多為虛、瘀、痰、毒四個方面，其中以虛為本，痰瘀毒邪為標(biāo)。病位在肺，常累及脾 腎。中醫(yī)治療肺癌在緩解臨床癥狀、提高生活質(zhì)量、延長生存期等方面具有優(yōu)勢，中藥配合 現(xiàn)代治療如放化療可以發(fā)揮減毒增效作用。采用辨證與辨病相結(jié)合，從藥用植物和中藥中提取分離抗癌活性成分或活性部 位，從而研制中藥新藥、新劑型，是近年來肺癌治療研究的熱點之一。經(jīng)國家批準(zhǔn)的中藥新 藥、中藥復(fù)方成藥制劑有金復(fù)康口服液、肺瘤平膏等國家中藥三類新藥。從單味中藥中提取 有效成分制成可供靜脈使用的中藥抗癌藥有康萊特注射液(從薏苡仁中提取)、欖香烯注 射液(從莪術(shù)中提取)、鴉膽子乳劑、嗎特靈注射液(從苦參中提取)、威麥寧膠囊(從野蕎 麥根中提取)等，臨床用于肺癌治療均顯示了一定的療效。峨?yún)thriscy s sylvestris(L. )Hoffm.，傘形科峨?yún)僦参?，與峨蕊、雪磨芋，歷 來被人們認(rèn)為是峨眉山的三大特產(chǎn)而聞名遠近，中醫(yī)認(rèn)為峨?yún)⒂醒a中益氣，祛瘀消腫，補肺 平喘的作用。藥理作用研究提示峨?yún)⒕哂性鰪姍C體免疫、抗癌、抗病毒、抗炎、抗過敏以及健 脾益氣、活血化瘀等作用。有文獻報道從峨?yún)⒏刑崛〕鲆环N具有抗腫瘤活性的有效成分， 結(jié)構(gòu)研究表明是去氧鬼臼毒素(峨?yún)?nèi)酯)，對人體子宮頸腺癌傳代細(xì)胞系的作用具有生物 活性，而對肺癌的作用尚無文獻報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種峨?yún)⒉课惶崛∥?，要求方法簡便合理。本發(fā)明的目的還 在于，研究上述提取物的藥用活性，為抑制肺癌細(xì)胞A549和H460藥物提供新的藥用來源。本發(fā)明的目的是通過如下措施來實現(xiàn)的
峨?yún)⑻崛∥锿ㄟ^以下方法制備，將峨?yún)⑶袛啵鬯槌杉?xì)小顆粒，過20目篩，烘干，用8倍 體積量的80%乙醇浸泡M h，利用閃式提取器，對(1)步驟的浸泡體系間斷提取間斷提取 共3分鐘，抽濾，得到濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，得到浸膏。再用石油醚萃取，得到石油醚 部位提取物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑。本發(fā)明提取物的制備工藝簡便合理，可得到一種峨?yún)?部位提取物。本發(fā)明的實驗中應(yīng)用MTT比色法觀察到峨?yún)⑹兔烟崛∥飳Ψ伟┘?xì)胞A549和H460的生長具有明顯抑制作用，且抑制率與濃度呈明顯的效應(yīng)關(guān)系，隨著藥物濃度的增加， 細(xì)胞存活率不斷下降。用倒置顯微鏡觀察到，經(jīng)峨?yún)⑹兔烟崛∥锾幚矸伟┘?xì)胞A549和 H460后，癌細(xì)胞生長受到明顯抑制。不同濃度的峨?yún)⑹兔烟崛∥镒饔糜贏549和H460細(xì) 胞，24h后用DAPI染色，熒光下可見細(xì)胞核發(fā)生明顯皺縮和斷裂。國內(nèi)關(guān)于峨?yún)⒒瘜W(xué)成分和抗腫瘤作用方面的研究，文獻報道較少，尤其是對肺癌 的作用未見報道。本發(fā)明所獲峨?yún)⑻崛∥飳Ψ伟┑姆乐畏矫娴挠猛?。本發(fā)明提取物的制備 工藝簡便合理，可得到石油醚部位提取物，并可對肺癌細(xì)胞A549和H460的生長有明顯抑制 作用，通過進一步研究石油醚提取物對肺癌細(xì)胞A549和H460的作用機理，發(fā)現(xiàn)其對以上兩 種癌細(xì)胞凋亡有明顯誘導(dǎo)作用。以下的實驗和實施方式也表明本發(fā)明所述提取物對肺癌細(xì) 胞A549和H460癌細(xì)胞凋亡有明顯誘導(dǎo)作用，該提取物可作為藥用活性成分制備對肺癌具 有防治作用的藥物。


圖1不同濃度峨?yún)⑹兔烟崛∥飳Ψ伟┘?xì)胞A549和H460生長的抑制作用效果圖。圖2不同濃度石油醚提取物處理后細(xì)胞形態(tài)(X400)圖。
具體實施例方式
一、峨?yún)⑻崛∥锏闹苽?br> 將峨?yún)⑶袛啵鬯槌杉?xì)小顆粒，過20目篩，烘干，用8倍體積量的80%乙醇浸泡Mh， 利用閃式提取器(河南金鼎科技有限公司JHBE-50，額定功率1. 8KW)，在15000r/min轉(zhuǎn)數(shù) 下間斷提取達3分鐘，抽濾，得到濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，得到浸膏。再用石油醚萃取， 得到石油醚部位提取物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，得到部位提取物浸膏，使用前用RPMI1640 調(diào)整至實驗所需濃度，DMSO (濃度<0. 05%)助溶備用。二、醫(yī)學(xué)觀察 1實驗材料
1.1細(xì)胞人肺癌細(xì)胞株A549和H460購置于四川大學(xué)華西國家重點實驗室。1.2藥品與試劑RPMI 1640和胰蛋白酶均采用Gibco進口分裝；MTT購自寶信生 物有限公司。峨?yún)嬈徸杂谒拇ㄊ《朊忌绞邢缮街兴庯嬈?，?jīng)本院宋良科副教授鑒 定為四川峨眉山產(chǎn)傘形科峨?yún)僦参锒雲(yún)nthrisc μ s sylvestris (L.)Hoffm的干燥塊 根；其余試劑均采用分析純。1.3主要儀器CO2恒溫孵箱(3110型，美國Thermo公司)、細(xì)胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶(美 國Coster公司)、酶標(biāo)儀(Elx-800型，美國Bio-Tek公司)、離心機(L420型，長沙湘儀離心 機有限公司)、倒置相差顯微鏡(日本索尼公司)、熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)、超凈工作 臺(BSW-880，江蘇蘇凈集團有限公司)、閃式提取器(河南金鼎科技有限公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (上海亞榮生化儀器廠)。2實驗方法
2. 1 細(xì)胞株培養(yǎng)將肺癌細(xì)胞A549和H460接種于含10%新生牛血清的RPMI1640培 養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，37°C、5%C02、飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，每2 d換液傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長 期細(xì)胞用于實驗。2. 2石油醚提取物對肺癌細(xì)胞AM9、H460增殖抑制作用的檢測取
對數(shù)生長期細(xì)胞接種于對孔培養(yǎng)板內(nèi)，2X104 / mL個細(xì)胞/孔。細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的峨?yún)⑹兔烟崛∥?，共設(shè)7個藥物濃度梯度，分別為1. 25,2. 5、5、10、20、40、80μ g / μ L。每個濃度3個復(fù)孔，每孔體積500 μ L，培養(yǎng)48 h后，每孔加入lmg/mL MTT工作液 500 yL，37°C放置4 h，棄上清，每孔加入500 μ L 0. 4%酸化異丙醇，220 r / min搖床震 蕩5min溶解結(jié)晶，經(jīng)充分震蕩后，吸取200 μ L至96孔酶標(biāo)板于全自動酶標(biāo)儀檢測570 nm 波長處的各孔吸光度(0D值)，0. P/oDMSO作為陰性對照，根據(jù)0. 1% DMSO值繪制曲線，比較 不同濃度峨?yún)⑹兔烟崛∥飳?個細(xì)胞株增殖的影響。細(xì)胞增殖抑制率(%) = (I"藥物組平均OD值/對照組平均OD值)X 100%
2.3 DAPI染色將潔凈無菌蓋玻片置于6孔板內(nèi)，種入細(xì)胞培養(yǎng)過夜，使為60% 80%。設(shè)對照組、2. 5yg / yL,5yg / μ L峨?yún)⑹兔烟崛∥锝M(AM9)和對照組、1. 25 Ug / yL,2.5yg / μ L峨?yún)⑹兔烟崛∥锝M(H460)，分別繼續(xù)培養(yǎng)M h，吸棄廢液，然后 用4%多聚甲醛固定細(xì)胞爬片35min，IxPBS沖洗3次，每次2min，加入2 mL DAPI染色液，染 色15min，IxPBS沖洗兩次，取出爬片用封片液封片，熒光顯微鏡可檢測到呈藍色的細(xì)胞核。 激發(fā)波長在350 nm左右，發(fā)射波長在460 nm左右。2. 4統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS13. 0軟件進行數(shù)據(jù)分析，各組數(shù)據(jù)以 7 士s表示，實驗組及對照組比較用單因素方差分析。實驗結(jié)果
3. 1峨?yún)⑹兔烟崛∥飳Ψ伟┘?xì)胞A549和H460生長的抑制作用 采用MTT比色法 檢測峨?yún)⑹兔烟崛∥飳Ψ伟┘?xì)胞A549和H460
生長的抑制作用，結(jié)果表明，(1.25 80) yg / μ L的峨?yún)⑹兔烟崛?物對體外培養(yǎng)的人肺癌細(xì)胞Α549和Η460的增殖呈明顯抑制作用，并 且隨著藥物濃度的升高，細(xì)胞存活率不斷下降，峨?yún)⑹兔烟崛∥飳?肺癌細(xì)胞Η460的抑制作用比對細(xì)胞Α549明顯。經(jīng)計算得出，峨?yún)⑹?油醚部位提取物對肺癌細(xì)胞Α549和Η460的IC5tl分別為6. 13 Ug / μ L和 0. 97 μ g/ μ L。見圖 1。3.2峨?yún)⑹兔烟崛∥飳Ψ伟┘?xì)胞A549和H460凋亡的影響倒置顯微鏡 觀察到，經(jīng)峨?yún)⒉煌课惶崛∥锾幚? 后，肺癌細(xì)
胞A549和H460的生長明顯受到抑制，細(xì)胞體積縮小，連接消失，與 周圍的細(xì)胞脫離，細(xì)胞由梭形變成圓形細(xì)胞脫落，浮懸于培養(yǎng)液中。熒光顯微鏡觀察到，經(jīng)峨?yún)⑹兔烟崛∥锾幚?4h后，肺癌細(xì)胞A549 和H460生長明顯受到抑制，熒光增加，有明顯的細(xì)胞核斷裂和皺縮， 隨劑量增加，細(xì)胞凋亡現(xiàn)象越明顯，見圖2。
本實驗應(yīng)用MTT比色法觀察到1. 25-80 μ g / μ L的峨?yún)⑹兔巡课惶崛∥飳Ψ伟?細(xì)胞Α549和Η460的生長具有明顯抑制作用，結(jié)果提示峨?yún)⑹兔烟崛∥飳Ψ伟┘?xì)胞Α549 和Η460的抑制作用的IC5tl值分別為6. 13 Ug / μ L和0. 97 Ug / μ L,且抑制率與濃度 呈明顯的效應(yīng)關(guān)系，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞存活率不斷下降。用倒置顯微鏡觀察到，經(jīng) 峨?yún)⑹兔巡课惶崛∥锾幚矸伟┘?xì)胞Α549和Η460后，癌細(xì)胞生長明顯受到抑制，細(xì)胞體積 縮小，連接消失，與周圍的細(xì)胞脫離，細(xì)胞由梭形變成圓形細(xì)胞脫落，浮懸于培養(yǎng)液中。不同 濃度的峨?yún)⑹兔烟崛∥镒饔糜讦?49和Η460細(xì)胞，24 h后用DAPI染色，熒光下可見細(xì)胞核發(fā)生明顯皺縮和斷裂。 綜上所述，峨?yún)⑹兔烟崛∥飳Ψ伟┘?xì)胞A549和H460的生長確有明顯抑制作用， 通過進一步研究石油醚提取物對肺癌細(xì)胞A549和H460的作用機理，發(fā)現(xiàn)其對以上兩種癌 細(xì)胞凋亡有明顯誘導(dǎo)作用。這為峨?yún)⒖狗伟┑难芯刻峁┝藢嶒炓罁?jù)。
權(quán)利要求
1.一種抑制肺癌細(xì)胞生長的峨?yún)⑻崛∥?，其特征在于所述的提取物通過以下方法制 備(1)將峨?yún)⑶袛?，粉碎成?xì)小顆粒，過20目篩，烘干，用8倍體積量的80%乙醇浸泡24h ； (2)利用閃式提取器，對(1)步驟的浸泡體系間斷提取，抽濾，得濾液；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶 劑，得峨?yún)⒔?；C3)用石油醚萃取浸膏，濃縮后，得到石油醚部位提取物。
2.權(quán)利要求1所述之抑制肺癌細(xì)胞生長的峨?yún)⑻崛∥锏挠猛?，其特征在于以峨?yún)⑹?油醚提取物為藥用活性成分制備對肺癌細(xì)胞A549和H460產(chǎn)生抑制作用的藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種對肺癌細(xì)胞具有明顯抑制作用的峨?yún)⑹兔巡课惶崛∥锛捌渌幱糜猛荆龅奶崛∥锿ㄟ^以下方法制備將峨?yún)⑶袛?，粉碎成?xì)小顆粒，過20目篩，烘干，用8倍體積量的80%乙醇浸泡24h，利用閃式提取器，對(1)步驟的浸泡體系間斷提取，抽濾，得到濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，得到浸膏。再用石油醚萃取，得到石油醚部位提取物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑。本發(fā)明提取物的制備工藝簡便合理。本發(fā)明還公開了以峨?yún)⑹兔烟崛∥餅樗幱没钚猿煞种苽鋵Ψ伟┓乐嗡幬锏挠猛?，所述活性提取物對肺癌?xì)胞A549和H460癌細(xì)胞凋亡有明顯誘導(dǎo)作用，可作為藥用活性成分制備藥物。
文檔編號A61K36/23GK102125588SQ201110058789
公開日2011年7月20日 申請日期2011年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月4日
發(fā)明者萬軍, 吳曉青, 唐靜, 李娜, 涂顯琴, 耿耘, 蔣合眾, 馬超英, 高雅蓉, 魏屹 申請人:西南交通大學(xué)