專利名稱：B細胞惡性瘤和自身免疫病的免疫療法的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于治療B細胞相關的惡性瘤、尤其是漸進性非霍奇金氏淋巴瘤的免 疫治療方法。具體地，本發(fā)明涉及用于治療和診斷哺乳動物B細胞相關病、T細胞相關病或 自身免疫病的方法，所述方法是通過向所述哺乳動物給藥治療組合物實現(xiàn)的，其中并不進 行非放射性標記抗體的預先投藥。
背景技術：
B細胞淋巴瘤表達這樣的表面抗原，它們業(yè)已證明是用單克隆抗體(Mab)治療的 良好靶標。無論是單獨使用(裸抗體)或與化療聯(lián)合，抗體都可與毒素或與放射性核素綴 合用于放射性免疫治療(RAIT)。放射性標記的抗體在非標記抗體之后(KaminSki，M. S.等， J Clin. Oncol. 19 :3918-3928,2001)或與之一起(Press, 0. W.等，New Engl. J. Med. 329 1219-24,1993)給藥以改善劑量分布。多數(shù)研究者使用與非標記的鼠源或嵌合抗體相組合 的放射性標記的小鼠抗體。從毒理學角度的觀點看，認為放射性標記小鼠抗體是有利的， 這是因為與嵌合抗體相比其半衰期更短。具有更長半衰期的Mab提供放射性免疫綴合物 在血液和骨髓中更長的滯留時間，并且可能因此誘發(fā)更大的毒性。由于抗體本身幾乎不誘 發(fā)毒性，小鼠和嵌合標記抗體都被用來通過據(jù)稱是飽和機體內(nèi)正常細胞和組織上的抗原而 改善劑量分布(參見 Kaminski，美國專利 No. 5，595，721 ；Wiseman 等，Crit. Rev. Oncol. Hemato. 39 :181-194,2001)。單克隆抗體在癌癥靶向放射性治療(放射性免疫治療；RAIT)中的用途已在血液 病如非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)中產(chǎn)生了令人矚目的臨床效應。目前正研究新策略，以致力 于最小化循環(huán)放射性核素的系統(tǒng)毒性以及輻照對腫瘤的致敏。前者是通過預靶向進行的， 而后者是通過與放射性致敏藥的聯(lián)合治療進行的。見GoVindan，S.V等，Current Trends, Pharmaceutical Science and Technology Today 3 :90_98，2000。RAIT的抗腫瘤活性主要地是由于與抗體相連的放射性標記的相關放射能， 其發(fā)射持續(xù)呈指數(shù)規(guī)律漸減的低劑量等級的射線，表現(xiàn)出異質(zhì)的劑量沉積。有四種 放射性標記的抗體產(chǎn)品正朝商業(yè)化發(fā)展，以用于非霍奇金氏淋巴瘤的放射性免疫治 療。它彳Π 包括 131I-tositumomab(Bexxar )、9°Y-ibritumomab tiuxetan(Zevalin )、 9°Y-印ratuzumab (hLL2)和 131I-Lym_l。有關這些產(chǎn)品更詳細的綜述，見 Goldenberg，D. Μ.， Critical Reviews in Oncology/Hematology 39 :195-201,2001,禾口 Goldenberg, D. Μ., J. Nuc 1. Med. 43 :693-713, 2002。Bexxar (Corixa Corp. , Seattle, WA)禾口 Z e ν a 1 i η (I DE C-Y 2 B8 ; IDECPharmaceuticals, San Diego, CA)都是針對表達在正常和惡性B淋巴細胞表面上 的⑶20抗原的鼠源單克隆抗體(Mab)。Bexxar用作為I gGh鼠源Mab，添有冷性鼠源抗體，的鼠源抗體被標記，且產(chǎn)品中添加了人鼠嵌合的利妥希瑪(Rituxan ， IDEC-Genentech)。兩種產(chǎn)品都提供了治療前的冷性抗體投藥，以改善腫瘤靶向，這涉及輸 注1小時450mg非標記的Bexxar抗體，和輸注4-6小時450mg的利妥?，斶B同Zevalin0 兩種產(chǎn)品都表現(xiàn)出比裸抗體更高和更持久的效應，然而，它們也具有劑量限制的毒性，突出 地是骨髓中毒性。Zevalin經(jīng)食品和藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準用于治療復發(fā)性低級別 或轉(zhuǎn)化的B細胞非霍奇金氏淋巴瘤。在這些放射性標記抗-CD-20Mab之前必需投藥冷性 抗體，以使得良好的腫瘤定位成為可能。事實上，當牽涉到預先投藥時，特定腫瘤部位上111 銦-Zevalin的特異性定位數(shù)從78%跌至15%腫瘤攝入(Wiseman等，同前)。Epratuzumab (9°Y_印ratuzurnab)是針對抗-CD22 抗原的人源化 IgG1 抗體。該 抗原經(jīng)抗體結(jié)合后快速內(nèi)在化。業(yè)已報道裸抗體在濾泡以及彌漫性的大B細胞淋巴瘤 中 ^王見出功雙(Leonard, J. P.等，Epratuzumab (hLL2, Jfi -CD22 humanized monoclonal antibody)is an active andwell-tolerated therapy for refractory/relapsed diffuse large B-celInon-Hodgkin ' s lymphoma (NHL) · Blood (Suppl) 96 :578a[abstr. 2482]， 2000 ；Press, 0. W.等，Immunotherapy of Non-Hodgkin' s Lymphomas. Hematology(Am. Soc. Hemato. Educ. Program), p. 221-40，2001)。預期 Epratuzumab 不會引起人抗 _ 人抗體 (HAHA)，這使得它適合于反復投藥。小鼠親代抗體mLL2由131I標記，且已在多種亞型的B細 胞淋巴瘤中表現(xiàn)出功效(Linden，0.等 Clin. Cancer Res. 5 :3287s-3291s, 1999) 內(nèi)在化 后，131I標記的抗體被脫鹵化，且放射性核素由細胞中釋放出來。放射性金屬如釔經(jīng)內(nèi)在化 后保留在細胞內(nèi)(Siarkey，R. Μ·，等 Cancerlmmnunol. Immunother. 44 :179-88,1997)。90Y 較短的物理半衰期在某些程度上補償了印ratuzurnab較長的半衰期，并提供了其組合的合 理性。RAIT通常作為單次輸注給予。不過，分級途徑存在理論上的優(yōu)勢，因為分級將會 更好地處理吸收劑量的異質(zhì)性問題，如在0' Donoghue, J. A.，Dosimetric Principles of Targeted Radiotherapy,inRadioimmunotlerapy of Cancer,A. R. Fritzberg(編)，Marcel Dekker, Inc.，p. 1-20, New York, Basel, 2000中所概述的那樣。也有實驗數(shù)據(jù)支持治療效 應可通過將放射性標記抗體大的單次給藥分割成許多更小的給藥得以提高(Schlom，J.等 J. Natl. Cancer Inst. 82 :763-71,1990) 臨床上業(yè)已利用小鼠抗體研究了兩次輸注以及 多次輸注的途徑(DeNardo,G. L.，等 Cancer Biother. Radiopharm. 13 :239-54,1998 ；Vose, J. M.，等 J Clin. Oncol. 18 1316-23，2000)。業(yè)已報道了有關⑶22抗原表達的腫瘤內(nèi)可變性。在來自五個患者的新鮮腫瘤樣 品中，發(fā)現(xiàn)52-89%的淋巴瘤細胞具有抗-CD22 MAb HD6的抗原(I^ress，。.等Cancer Res. 49 :4906-12,1989)。使用遠程β -輻射源的RAIT的一個所謂的優(yōu)勢在于其在靶細胞 附近殺傷抗原陰性腫瘤細胞的能力。通過在治療前評估腫瘤細胞的抗原表達，人們能夠研 究此概念在使用抗-⑶22 90Y-標記的印ratuzurnab的RAIT設置下的臨床相關性。采取研究以驗證劑量分級的理論優(yōu)勢以及所發(fā)表的支持它的實驗數(shù)據(jù)。所述研究 旨在利用放射性標記的人源化抗體調(diào)查分級RAIT的可行性。發(fā)現(xiàn)在為放射劑量測定之目 的用IOOmg人源化⑶22 Mab,即由標記的印ratuzurnab預先投藥之后，隨后長達2_3 周每周一次高達7. 5mCi/m2劑量的9°Y標記的印ratuzurnab的分級劑量，產(chǎn)生了可耐受且有 效的放射性免疫治療(Linden 等，Cancer Biother Radiopharm 2002 ； 17 :490 [abstract47]。盡管這些臨床研究提示放射性免疫綴合物的分級療法是可行的，尚未與給藥的單次 高劑量放射性免疫綴合物就安全性和有效性進行過比較。由于用m^的首次“放射劑量 測定”劑量含有IOOmg抗體，且每次相繼注射也含有此裸抗體劑量，也不可能確定總計至少 300mg epratuzumab的這些劑量是否如引述的涉及⑶20抗體的其它研究中所提示的那樣， 也作預先投藥功效之用。因此，由這些研究不可判斷此類放射性免疫治療是否必需任何預 先投藥，特別是用CD22抗體的放射性免疫治療。我們現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明中并不象現(xiàn)有技術中所實施的那樣，使用預先投藥 以飽和正常組織和脾中的抗原性位點，這與其它發(fā)表的研究和Kaminski的美國專利 No. 5，595，721相反。無疑，此處公開的本發(fā)明證明無需象現(xiàn)有技術中所實施的那樣高抗體 預先投藥。發(fā)明概述因此，本發(fā)明的目的是提供用于治療哺乳動物疾病的方法，所述方法是通過給藥 治療組合物實現(xiàn)的，其中并不進行非放射性標記抗體、片斷或融合蛋白的預先投藥。本發(fā)明的目的也是不僅使上述方法給藥簡單易行，而且使藥物組合物本身保持治 療活性并具有相似的效應等級，而不會令較高劑量的裸抗體影響腫瘤。本發(fā)明的目的還是提供在治療攻擊形式的非霍奇金氏淋巴瘤中表現(xiàn)出更為有效 的效應的方法，這不同于現(xiàn)有技術所證明的僅在不活躍形式的淋巴瘤中表現(xiàn)出功效的方 法。根據(jù)本發(fā)明的實施方案，這些及其它目的是通過提供用于治療哺乳動物疾病的這 樣的方法實現(xiàn)的，所述方法包括同時或相繼地向所述哺乳動物給藥這樣的治療組合物，所 述治療組合物包括藥學上可接受的載體和至少一種綴合的抗體或其片斷，或者綴合的抗體 融合蛋白或其片斷，其中并不進行非放射性標記抗體、片斷或融合蛋白的預先投藥。任選地 與所述綴合的抗體、片斷或融合蛋白一起添加非綴合的抗體、片斷或融合蛋白，作為維持治 療以防腫瘤細胞靶逃逸。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及用于治療疾病如B細胞相關的惡性瘤的方法。 另外，它也可用于治療自身免疫病，以及T細胞相關的惡性瘤。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明綴合和非綴合的抗體、片斷和融合蛋白可靶 向于選自下組的抗原CD3、CD4、CD5、CD8、CDllc、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、 CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、la、HMI. 24、HLA-DR、 腱生蛋白、MUCl以及B細胞腫瘤相關抗原，包括血管內(nèi)皮抗原，如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) 和胎盤生長因子(PlGF)。在相關的支脈中，本發(fā)明綴合和/或非綴合的抗體、片斷或融合 蛋白可以是相同或不同的。另外，這些抗體可以是人源、鼠源、嵌合、類人靈長化或人源化 的。此外，這些抗體、片斷或融合蛋白可選自下組完整IgG、F(ab' )2、F(ab)2、Fab'、Fab、 scFvs、雙鏈抗體、三鏈抗體或四鏈抗體，并且可綴合于至少一種治療劑。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了如上文所述的方法，其中用一種或多種這樣的 抗體治療哺乳動物受試者例如人和家畜或?qū)櫸?，所述抗體綴合于選自下組的一種或多種治 療劑藥物、毒素、免疫調(diào)節(jié)劑、螯合劑、硼化合物、光敏劑和放射性核素。又在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述治療組合物包括所述抗體或抗體與免疫調(diào)節(jié) 劑組合的融合蛋白。所述融合抗體可包括針對不同抗原的抗體，以及針對同一抗原不同表位的抗體。本發(fā)明如此設想上述方法，其中綴合和非綴合的抗體是抗-CD22單克隆抗體，它 以每劑20-600毫克蛋白的劑量腸胃外給藥，更優(yōu)選每劑20-150毫克蛋白，并且最優(yōu)選每劑 20-100毫克蛋白。另外，所述哺乳動物可接受作為優(yōu)選每劑20-150毫克蛋白的重復腸胃外 劑量的所述抗-CD22抗體，并且更優(yōu)選每劑20-100毫克蛋白。重要的是意識到這樣的劑量 是作為實際治療劑量給予的，無論是用于改善靶向或是用于劑量測定之目的，都無需如以 前 Juweid 等，Clin. Cancer Res. 5 :3292s_3303s，1999 (其中 50mg 與或另一診斷同位 素綴合的CD22Mab的預先投藥是必需的)所實施的那樣需要任何預先投藥。這類研究中尚 未進行過嘗試來評估沒有預先投藥的方案下，所述具有不同蛋白劑量抗體的治療性放射免 疫綴合物直接見效的能力。在另一個優(yōu)選的實施方案中，用于治療哺乳動物疾病的方法包括向所述哺乳動物 給藥這樣的治療組合物，其包括藥學上可接受的載體和與至少一種靶抗原和治療劑相結(jié)合 的多特異性多價抗體、片斷或融合蛋白綴合物，其中并不進行非放射性標記抗體的預先投藥。又在另一個優(yōu)選的實施方案中，用于治療哺乳動物疾病的方法包括(a)向所述 哺乳動物給藥這樣的治療組合物，其包括與至少一種靶抗原相結(jié)合的多特異性多價抗體、 片斷或融合蛋白；(b)任選地包括清除劑，以允許所述組合物清除來自循環(huán)的非局限抗體； 和(c)向所述哺乳動物給藥藥學有效量的與所述多特異性多價抗體、片斷或融合蛋白結(jié)合 的治療綴合物，且其中并不進行非放射性標記抗體的預先投藥。本發(fā)明的其它目的、特點和優(yōu)勢將會因下列詳述的說明和所附的權利要求而變得 顯而易見。優(yōu)選實施方案的詳細說明除非另行指定，“一”或“一種”意味著“一種或多種”。1.定義在以下的說明中，使用了許多術語，并提供以下定義以促進對本發(fā)明的理解。非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)是指涉及淋巴結(jié)、脾、其它器官并且通常是骨髓的淋巴 瘤病家族。有至少30種不同類型的NHL。兩種常見類型為濾泡性(輕度或不活躍)和攻擊 性彌漫性大細胞(中度或高度)淋巴瘤。如本文所沭,抗體是指全長(即天然存在或通過正常的免疫球蛋白基因片斷重組 過程形成的)免疫球蛋白分子(如IgG抗體)或免疫球蛋白分子的免疫學活性(即特異性 結(jié)合)部分，象抗體片斷?？贵w片段是抗體的一部分，如F (ab ‘ )2、F(ab)2、Fab'、Fab、FV、sFV等。無論結(jié)構 如何，抗體片斷與被完整抗體所識別的同一抗原相結(jié)合。例如，抗-CD22單克隆抗體片斷與 CD22表位相結(jié)合。術語“抗體片斷”也包括任何合成或遺傳改造的蛋白，它們通過結(jié)合特異 性抗原形成復合物而象抗體那樣起作用。例如，抗體片斷包括分離的由可變區(qū)組成的片斷， 如由重鏈和輕鏈可變區(qū)組成的"Fv"片斷，其中輕鏈和重鏈可變區(qū)通過肽接頭相連的重組 單鏈多肽分子(“scFv蛋白”)，以及由模擬高變區(qū)的氨基酸殘基組成的最小識別單元。棵或冷件抗體一般是未與治療劑綴合(非綴合)的整個抗體。之所以這樣，是因 為抗體分子的Fc部分提供了效應器功能，如補體固定和ADCC(抗體依賴性細胞細胞毒)，該功能使得可能導致細胞裂解的機制運轉(zhuǎn)起來。不過，有可能Fc部分并非是治療功能所必需 的，而其它機制如細胞凋亡開始運行。裸抗體也是非放射性標記的抗體，其包括多克隆和單 克隆抗體，以及某些重組抗體，如靈長化類人、嵌合、人源化或人抗體。嵌合抗體是這樣的重組蛋白，其含有包括互補決定區(qū)(⑶Rs)在內(nèi)的源于一個物 種抗體(優(yōu)選為嚙齒動物抗體)的可變結(jié)構域，而該抗體分子的恒定結(jié)構域源于人抗體的 恒定結(jié)構域。對于獸醫(yī)應用，嵌合抗體的恒定結(jié)構域可源于其它物種的恒定結(jié)構域，如貓或 狗。人源化抗體是這樣的重組蛋白，其中將來自于一個物種抗體如嚙齒動物抗體的 CDRs從嚙齒動物抗體的重鏈和輕鏈可變鏈上轉(zhuǎn)移到人重鏈和輕鏈可變結(jié)構域之中。該抗體 分子的恒定結(jié)構域源于人抗體的恒定結(jié)構域。AS^是由轉(zhuǎn)基因小鼠獲得的抗體，該小鼠業(yè)已被“改造”以響應抗原刺激生產(chǎn) 特異性人抗體。在這種技術中，將人重鏈和輕鏈基因座的元件引入到衍生自這樣的胚胎干 細胞系的小鼠株系中，其含有內(nèi)源重鏈和輕鏈基因座的靶向破壞。該轉(zhuǎn)基因小鼠能夠合 成特異于人抗原的人抗體，并且該小鼠可用于生產(chǎn)分泌人抗體的雜交瘤。用于獲得來自 轉(zhuǎn)基因小鼠的人抗體的方法由Green等，Nature Genet. 7 :13(1994)、Lonberg等，Nature 368 :856(1994)以及Taylor等，ht. Immun. 6 :579 (1994)描述。也可通過基因或染色體 轉(zhuǎn)染法、以及噬菌體展示技術構建全人抗體，所有這些方法都是本領域公知的。例如參見 McCafferty等，Nature 348 =552-553(1990)關于由來自未免疫供體的免疫球蛋白可變結(jié) 構域基因庫在體外生產(chǎn)人抗體及其片斷。在這種技術中，將抗體可變結(jié)構域基因框內(nèi)克隆 到絲狀噬菌體的主要或次要外殼蛋白基因中，并作為功能性抗體片斷展示在噬菌體顆粒的 表面。由于該絲狀顆粒含有所述噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，基于所述抗體功能性質(zhì)的 選擇也導致編碼表現(xiàn)出那些性質(zhì)的抗體的基因的選擇。以這種方式，所述噬菌體模擬B細 胞的一些性質(zhì)。噬菌體展示能夠以多種形式進行，有關綜述，參見如Johnson和Chiswell， Current Opinifozl in Structural Biology3 :5564-571 (1993)。人抗體也可由在體外激活的B細胞產(chǎn)生。見美國專利No. 5，567，610和5，229，275， 特此將其全文并入作為參考。治療劑是與抗體成分分勘丨、同時或相繼地給藥、或綴合于抗體成分(即抗體或抗 體片斷、或亞片斷)的分子或原子，并且可用于疾病的治療。治療劑的實例包括抗體、抗體 片斷、藥物、毒素、核酸酶、激素、免疫調(diào)節(jié)劑、螯合劑、硼化合物、光敏劑或染料以及放射性 同位素。^MM是如在本發(fā)明中所定義的治療劑，當其存在時，其改變、抑制或刺激機 體的免疫系統(tǒng)。典型地，可用于本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)劑刺激免疫細胞增殖或在免疫應答級聯(lián) 中變得激活，例如巨噬細胞、B細胞和/或T細胞。免疫綴合物是抗體組分與治療劑或診斷劑的綴合物。所沭診斷劑可包括放射件或 非放射性標記、造影劑(例如用于磁共振成象、計算斷層分析或超聲)，且所述放射性標記 可以是發(fā)射Y、β、α、俄歇電子或正電子的同位素。表達載體是包含在宿主細胞中表達的基因的DNA分子。典型地，基因表達處于某 些調(diào)控元件的控制之下，包括組成型或誘導型啟動子、組織特異性調(diào)控元件和增強子。此種 基因被表述為是“可操作地連接于”所述調(diào)控元件。
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msi可以是含有克隆載體或表達載體的任何原核或真核細胞。該術語也包括 這樣的原核或真核細胞以及轉(zhuǎn)基因動物，它們業(yè)已被遺傳改造，從而在所述宿主細胞的染 色體或基因組中或者宿主細胞的細胞中含有所克隆的基因。合適的哺乳動物宿主細胞包括 骨髓瘤細胞，如SP2/0細胞和NSO細胞，以及中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、雜交瘤細胞系以及 可用于表達抗體的其它哺乳動物宿主細胞。同樣尤其可用于表達mAb及其它融合蛋白的是 在TO 0063403 A2中公開的人細胞系PER. C6，與常規(guī)的哺乳動物細胞系如CHO、COS、Vero、 Hela.BHK和SP2細胞系相比，其生產(chǎn)2到200倍更多的重組蛋白。具有修飾的免疫系統(tǒng)的 特定轉(zhuǎn)基因動物尤其可用于制備全人抗體。如本文所用，術語抗體融合蛋白是重組牛產(chǎn)的抗原結(jié)合分子，其中兩個或多個相 同或不同的單鏈抗體或者具有相同或不同特異性的抗體片斷區(qū)段被連接在一起。融合蛋白 的結(jié)合價預示著該融合蛋白對單鏈抗原或表位具有多少結(jié)合臂或位點，即單價、二價、三 價或多價?？贵w融合蛋白的多結(jié)合價意味著它能夠在與抗原的結(jié)合中利用多重相互作用， 從而增強對抗原結(jié)合的親抗原性。特異性預示著抗體融合蛋白能夠結(jié)合多少抗原或表位； 即單特異性、雙特異性、三特異性、多特異性。運用這些定義，天然抗體如IgG是雙價的，因 為它有兩個結(jié)合臂，但它是單特異性的，因為它結(jié)合一個表位。單特異性多價融合蛋白對表 位具有不止一個結(jié)合位點，但僅與一個表位結(jié)合，例如具有與同一抗原反應的兩個結(jié)合位 點的雙鏈抗體。所述融合蛋白可包括單個抗體組分，不同抗體組分的多價或多特異性組合， 或者同一抗體組分的多個拷貝。所述融合蛋白可額外包括抗體或抗體片斷和治療劑。適用 于此類融合蛋白的治療劑的實例包括免疫調(diào)節(jié)劑(“抗體-免疫調(diào)節(jié)劑融合蛋白”)和毒素 (“抗體-毒素融合蛋白”)。一種優(yōu)選的毒素包括核糖核酸酶(RNase)，優(yōu)選為重組RNase。多特異件抗體是能夠同時與具有不同結(jié)構的至少兩個靶標結(jié)合的抗體,如結(jié)合兩 個不同抗原、同一抗原上的兩個不同表位、或者半抗原和/或抗原或表位。一種特異性將 是針對B細胞、T細胞、髓細胞、血漿細胞和肥大細胞抗原或表位的。另一種特異性可以是 針對同一細胞類型上的不同抗原的，如CD3、CD4、CD5、CD8、CDllc,⑶14、⑶15、⑶19、⑶20、 CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、la、 HMI. 24、HLA-DR、腱生蛋白、MUCl以及B細胞腫瘤相關抗原，包括血管內(nèi)皮抗原，如VEGF和 P1GF。多特異性多價抗體是具有不止一個結(jié)合位點的構建體，且所述結(jié)合位點具有不同的 特異性。例如雙鏈抗體，其中一個結(jié)合位點與一種抗原反應，而另一個則與另一種抗原反 應。雙特異件抗體是能夠同時與具有不同結(jié)構的兩個靶標結(jié)合的抗體。雙特異性抗體 (bsAb)和雙特異性抗體片斷(bsFab)具有至少一個與例如B細胞、T細胞、髓細胞、血漿細 胞和肥大細胞抗原或表位特異性結(jié)合的臂，以及至少一個與帶有治療劑或診斷劑的可靶向 綴合物特異性結(jié)合的其它臂。許多雙特異性融合蛋白可利用分子改造生產(chǎn)。在一種形式中， 雙特異性融合蛋白是單價的，例如，由具有針對一種抗原的單個結(jié)合位點的scFv和具有針 對第二抗原的單個結(jié)合位點的Fab片斷組成。在另一種形式中，雙特異性融合蛋白是二價 的，例如，由具有針對一種抗原的結(jié)合位點的IgG和具有針對第二抗原的兩個結(jié)合位點的 兩個scFv組成。犬源化或貓源化抗體是這樣的重組蛋白，其中業(yè)R將嚙齒動物(或另一物種)單 克隆抗體的互補決定區(qū)從嚙齒動物(或另一物種)免疫球蛋白的重鏈和輕鏈可變結(jié)構域分別轉(zhuǎn)移到狗或貓免疫球蛋白的可變結(jié)構域中。類人靈長化抗體是這樣的重組蛋白，其中業(yè)已將類人靈長動物(如猴子)單克隆 抗體的互補決定區(qū)從嚙齒動物(或另一物種)免疫球蛋白的重鏈和輕鏈可變結(jié)構域轉(zhuǎn)移到 類人靈長動物免疫球蛋白的可變結(jié)構域中。家畜動物包括大動物如馬、牛、綿羊、山羊、美洲駝、羊駝和豬,以及寵物。在優(yōu)選的 實施方案中，家畜動物為馬。寵物包括作為寵物飼養(yǎng)的動物。這些主要地是狗和貓，盡管小嚙齒動物如豚鼠、倉 鼠、大鼠和雪貂也包括在內(nèi)，正象類人靈長動物如猴子那樣。在優(yōu)選的實施方案中，寵物是 狗或貓。術語“清除劑”是指結(jié)合靶向成分的結(jié)合位點的抗體，其中所述靶向成分可以是抗 體、抗原結(jié)合抗體片斷或非抗體靶向成分。在更為優(yōu)選的方法中，清除劑是單克隆抗體，為 第一步中所用綴合物的單克隆抗體的抗獨特型，如美國申請流水號No. 08/486，166中所述 的那樣。在另一個優(yōu)選的實施方案中，清除劑被多個糖殘基如半乳糖取代，這允許所述清除 劑能夠通過肝中的脫唾液酸糖蛋白受體很快地從循環(huán)中清除。2.包括嵌合、人源化和人抗體在內(nèi)的單克隆抗體的制備單克隆抗體(MAbs)是針對特定抗原的同種抗體群，且所述抗體僅包括一種類型 的抗原結(jié)合位點，并僅與抗原決定簇上的一個表位結(jié)合。針對特定抗原的嚙齒動物單克隆抗體可通過本領域技術人員公知的方法獲得。 例如，參見 Kohler 和 Milstein，Nature 256 :495 (1975)，以及 Coligan 等(編)，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, VOL. 1，第 2. 5. 1-2. 6· 7 頁(John Wiley & Sons 1991)[以下 稱作"Coligan"]。簡要地，單克隆抗體可這樣獲得，即用包括抗原的組合物注射小鼠，通 過移取血清樣品驗證抗體生產(chǎn)的存在，取出脾臟以獲得B淋巴細胞，使所述B淋巴細胞與骨 髓瘤細胞融合以產(chǎn)生雜交瘤，克隆所述雜交瘤，選擇產(chǎn)生針對所述抗原的抗體的陽性克隆， 培養(yǎng)產(chǎn)生針對所述抗原的抗體的所述克隆，并從所述雜交瘤培養(yǎng)物中分離所述抗體。MAbs可通過許多充分建立的技術從雜交瘤培養(yǎng)物中分離和純化。此類分離技 術包括蛋白A瓊脂糖親和層析，大小排阻層析，以及離子交換層析。例如，參見Coligan 第 2. 7. 1-2. 7. 12 頁及第 2. 9. 1-2. 9. 3.頁。也參見 Baines 等，“Purification of Immunoglobulin G(IgG), “ inMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 10, pages 79-104(TheHumana Press, Inc.1992)。在初次引起針對免疫原的抗體后，可對抗體進行測序并隨后通過重組技術制備。 鼠源抗體和抗體片斷的人源化和嵌合是本領域技術人員眾所周知的。例如，人源化單克隆 抗體是這樣產(chǎn)生的，即將小鼠互補決定區(qū)從小鼠免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變鏈上轉(zhuǎn)移到人 可變結(jié)構域中，然后取代鼠源對應物框架區(qū)中的人殘基。使用衍生自人源化單克隆抗體的 抗體組分避免了與鼠源恒定區(qū)免疫原性相關的潛在問題。例如，用于克隆鼠源免疫球蛋白可變結(jié)構域的一般技術由Orlandi等，Proc. Natl Acad. Sci. USA 86:3833(1989)的出版予以描述，特此將其全文并入作為參考。用于 構建嵌合抗體的技術是本領域技術人員眾所周知的。作為舉例，Leimg等，Hybridoma 13 469 (1994)描述了他們是如何通過將編碼抗-⑶22抗體LL2單克隆抗體Vk和Vh結(jié)構域的 DNA序列與相應的人κ和IgGji定區(qū)結(jié)構域組合生產(chǎn)LL2嵌合體的。該出版物也分別提供了 LL2輕鏈和重鏈可變區(qū)Vk和Vh的核苷酸序列。例如，用于生產(chǎn)人源化MAbs的技術由 Jones 等，Nature 321 :522(1986)，Riechmann 等，Nature 332 :323(1988)，Verhoeyen 等， Science 239 1534 (1988)，Carter 等，Proc. Natl Acad. Sci. USA 89 :4285 (1992)，Sandhu， Crit. Rev. Biotech. 12 :437(1992)以及 Singer 等，J. Immun. 150 :2844(1993)描述，特此將
其中每一篇都并入作為參考。嵌合抗體是這樣的重組蛋白，其含有包括源于一個物種動物如嚙齒動物抗體CDRs 在內(nèi)的可變結(jié)構域，而該抗體分子的其余部分即恒定結(jié)構域源于人抗體。因此，嵌合單克 隆抗體也可以通過用一個或多個不同的人FR替換嵌合mAb可變結(jié)構域中鼠源FR序列而 人源化。具體地，將小鼠CDRs從小鼠免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變鏈轉(zhuǎn)移到人抗體相應的 可變結(jié)構域之中。由于簡單地將小鼠⑶Rs轉(zhuǎn)移到人FRs中通常導致抗體親和力的下降 或者甚至喪失，可能需要附加的修飾以恢復鼠源抗體的原始親和力。這可通過用其鼠源 對應物替換FR區(qū)中的一個或多個某些人殘基實現(xiàn)，以獲得對其表位持有良好結(jié)合親和力 的抗體。例如，參見 Tempest 等，Biotechnology 9:266(1991)禾口 Verhoeyen 等，Science 239 :1534(1988)。此外，可通過⑶Rs的誘變提高人源化、嵌合及人MAbs對特定表位的親 和力，從而更低劑量的抗體可能象誘變前更高劑量的較低親和力MAb —樣有效。例如參見 W00029584Alo用于生產(chǎn)本發(fā)明抗體的另一種方法是通過在轉(zhuǎn)基因家畜的乳汁中生產(chǎn)。參見如 Colman, A.，Biochem. Soc. Symp. ,63 141-147，1998 ；美國專利 5，827，690，特此將兩篇都全 文并入作為參考。制備兩個DNA構建體，它們分別含有編碼成對免疫球蛋白重鏈和輕鏈的 DNA區(qū)段。將DNA區(qū)段克隆到含優(yōu)選在哺乳動物上皮細胞中表達的啟動子序列的表達載體 中。實例包括但不限于來自兔、奶牛和綿羊酪蛋白基因、奶牛α-乳球蛋白基因、綿羊β-乳 球蛋白基因以及小鼠乳清酸性蛋白基因的啟動子。優(yōu)選地，插入片斷在其3'側(cè)側(cè)接來自乳 腺特異性基因的同源基因組序列。這提供了多聚腺苷酰化位點和轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定序列。將所述 表達盒共注射到受精的哺乳動物卵的前核中，然后將其植入到受體雌獸的子宮之中，并使 之受孕。生產(chǎn)后，通過Southern分析篩選子代中兩種轉(zhuǎn)基因的存在。為使抗體存在，重鏈 和輕鏈基因都必需在同一細胞中同時表達。利用本領域公知的標準免疫學方法分析來自轉(zhuǎn) 基因雌獸的乳汁中抗體或抗體片斷的存在及功能。抗體可利用本領域公知的標準方法從乳 汁中純化。本發(fā)明的全人抗體，即人抗-⑶20 MAbs或者其它用于與人源化、嵌合或人 抗-⑶20抗體聯(lián)合治療的人抗體如抗-⑶19、抗-⑶22、抗-⑶21或抗-⑶23 MAbs可由轉(zhuǎn) 基因非人動物獲得。參見如Mendez等，Nature Genetics 15:146-156(1997)；美國專利 No. 5，633，425，特此將這兩篇都全文并入作為參考。例如，可從持有人免疫球蛋白基因座的 轉(zhuǎn)基因小鼠中回收人抗體。所述小鼠的體液免疫系統(tǒng)是通過失活內(nèi)源免疫球蛋白基因并引 入人免疫球蛋白基因座而被人源化的。人免疫球蛋白基因座極為復雜，且包括大量不連續(xù) 的區(qū)段，總計占據(jù)人基因組的幾乎0.2%。為確保該轉(zhuǎn)基因小鼠能夠生產(chǎn)足夠的抗體庫，必 需將大部分人重鏈和輕鏈基因座引入到小鼠基因組中。這是以始于在種系構型中含有人重 鏈或輕鏈免疫球蛋白基因座的酵母人工染色體(YACs)的形成的逐步過程實現(xiàn)的。由于每 一個插入物大小約為lMb，YAC的構建需要免疫球蛋白基因座重疊片斷的同源重組。介由含 YAC的酵母球芽與小鼠胚胎干細胞的融合，將一個含重鏈基因座，而一個含輕鏈基因座的兩個YACs單獨地引入到小鼠中。然后將胚胎干細胞克隆微注射到小鼠胚泡中。篩選所得的 嵌合雄獸通過其種系傳遞YAC的能力，并與鼠源抗體生產(chǎn)缺陷的小鼠進行育種。一種含有 人重鏈基因座而另一種含有人輕鏈基因座的兩種轉(zhuǎn)基因株系的育種，創(chuàng)建了響應免疫生產(chǎn) 人抗體的子代。此外，最近用于生產(chǎn)雙特異性mAbs的方法包括改造的具有額外的半胱氨酸殘 基的重組mAbs，從而它們比更為常見的免疫球蛋白同種型更加強烈、地交聯(lián)。參見如 FitzGerald 等，Protein Eng. 10(10) :1221_1225，1997。另一種途徑是改造連接了兩個或 多個不同單鏈抗體或具有所選的雙重特異性抗體片斷區(qū)段的融合蛋白。參見如Coloma等， Nature Biotech. 15 159-163，1997。許多雙特異性融合蛋白可利用分子工程產(chǎn)生。在一 種形式中，所述雙特異性融合蛋白是單價的，例如，由具有針對一種抗原的單個結(jié)合位點的 scFv和具有針對第二抗原的單個結(jié)合位點的Fab片斷組成。在另一種形式中，所述雙特異 性融合蛋白是二價的，例如，由具有針對一種抗原的結(jié)合兩個位點的IgG和具有針對第二 抗原的兩個結(jié)合位點的兩個scFv組成。連接了兩個或多個不同單鏈抗體或抗體片斷的雙特異性融合蛋白是以類似的方 式生產(chǎn)的?？衫弥亟M法生產(chǎn)融合蛋白。例如，可生產(chǎn)包含源于人源化單克隆抗-CD20抗 體的Fab片斷和源于鼠源抗-diDTPA的scFv的融合蛋白。柔性接頭如GGGS將所述scFv 連接于抗-CD20抗體重鏈的恒定區(qū)上。備選地，所述scFv可連接于另一人源化抗體輕鏈的 恒定區(qū)上。通過PCR反應將對于重鏈Fd與所述scFv框內(nèi)連接所必需的合適的接頭序列引 入到VL和VK結(jié)構域中。然后將編碼所述scFv的DNA片斷連到含編碼CHl結(jié)構域的DNA 序列的階段載體中。切下所得的scFv-CHl構建體，并連到含編碼抗-CD20抗體VH區(qū)的DNA 序列的載體中。所得的載體可用于轉(zhuǎn)染合適的宿主細胞，如哺乳動物細胞用于表達所述雙 特異性融合蛋白。此類雙價和雙特異性抗體的實例見于2002年8月1日遞交的美國專利申請 60/399，707,2002 年 3 月 1 日遞交的 60/360，229,2002 年 6 月 14 日遞交的 60/388，314 以 及2002年4月5日遞交的10/116，116，特此將它們?nèi)疾⑷胱鳛閰⒖肌?.抗體片斷的生產(chǎn)識別特定表位的抗體片斷可通過已知的技術產(chǎn)生。所述抗體片斷是抗體的抗原 結(jié)合部分，如如F(ab' )2、Fab'、Fab、Fv、sFv等。其它抗體片斷包括但不限于F(ab) ‘ 2 片斷，其可通過胃蛋白酶消化抗體分子生產(chǎn)，以及Fab'片斷，其可通過還原F(ab)' 2片斷 的二硫橋產(chǎn)生。備選地，可構建Fab'表達文庫(Huse等，1989，Science 246:1274-1281) 以允許快速且容易地鑒定具有期望特異性的單克隆Fab'片斷。本發(fā)明涵蓋抗體和抗體片 斷。單鏈Fv分子(scFv)包含VL結(jié)構域和VH結(jié)構域。所述VL和VH結(jié)構域結(jié)合以形 成靶結(jié)合位點。這兩個結(jié)構域進一步通過肽接頭(L)共價連接。scFv分子或者被表示為 VL-L-VH，如果VL結(jié)構域是所述scFv分子的N-端部分的話，或者被表示為VH-L-VL，如果VH 結(jié)構域是所述scFv分子的N-端部分的話。用于制備scFv分子和設計合適的肽接頭的方法 描述在美國專利 No. 4，704, 692、美國專利 No. 4，946，778、R. Raag 和 M. Whitlow, “ Single Chain Fvs. “ FASEB 9:73-80(1995)以及 R. Ε. Bird 和 B. W. Walker，Single Chain Antibody Variable Regions，TIBTECH9 :132-137 (1991)中。特此將這些參考文獻并入作為參考?？贵w片斷可通過全長抗體的蛋白水解或通過在大腸桿菌(E. coli)或另一宿主中 表達編碼該片斷的DNA制備?？贵w片斷可通過常規(guī)方法通過全長抗體的胃蛋白酶或木瓜蛋 白酶消化獲得。例如，抗體片斷可通過用胃蛋白酶酶切抗體生產(chǎn)，以提供表示為F(ab' )2 的5S片斷。該片斷可進一步使用硫醇還原劑切割，并且任選地使用因二硫鍵切割產(chǎn)生的巰 基的封閉基團，以生產(chǎn)3. 5S的Fab'單價片斷。備選地，利用木瓜蛋白酶酶切直接產(chǎn)生兩 個單價Fab片斷和一 Fc片斷。例如，這些方法由Goldenberg美國專利No. 4，036，945和 4，331，647及其中所含的參考文獻描述，特此將所述專利全文并入作為參考。同研，參見 Nisonoff φ, Arch Biochem. Biophys. 89 230 (1960) ；Porter, Biochem. J 73:119(1959)， Edelman 等，in METHODS IN ENZYM0L0GY, Volume 1，p. 422 (Academic Press 1967)以及 Coligan 第 2. 8. 1-2. 8. 10 頁和第 2. 10. _2· 10. 4 頁。另一種形式的抗體片斷是編碼單鏈互補決定區(qū)(CDR)的肽。CDR是抗體可變區(qū)中 在結(jié)構上與抗體與之結(jié)合的表位互補的區(qū)段，并且比可變區(qū)的其余部分更為可變。因此， ⑶R有時被稱之為高變區(qū)。一個可變區(qū)包含三個⑶Rs。⑶R肽可通過構建編碼目的抗體 CDR的基因獲得例如，此類基因通過利用聚合酶鏈式反應由抗體生產(chǎn)細胞的RNA合成可變 區(qū)來制備。例如，參見 Larrick 等，Methods :A Companion toMethods in Enzymology 2 106(1991) ；Courtenay-Luck,“ GeneticManipulation of Monoclonal Antibodies," in M0N0CL0NALANTIBODIES :PR0DUCTI0N，ENGINEERING AND CLINICALAPPLICATION, Ritter 等(編)，第 166-179 頁(Cambridge UniversityPress 1995)以及 Ward 等，“Genetic Manipulation and Expression ofAntibodies, “ in MONOCLONAL ANTIBODIES PRINCIPLES ANDAPPLICATIONS, Birch 等(編)，第 137-185 頁(ffiley-Liss, Inc. 1995)。也可以使用其它切割抗體的方法，例如分離重鏈以形成單價輕鏈-重鏈片斷，進 一步切割片斷，或者其它酶促、化學或基因技術，只要所述片斷結(jié)合被完整抗體所識別的抗 原即可。4.多特異性和多價抗體本文所述的具有相同特異性的抗體以及用于聯(lián)合治療的具有不同特異性的其它 那些抗體，也可制備為多特異性抗體(包括至少一個針對CD20表位或抗原的結(jié)合位點和至 少一個針對CD20上另一表位或另一抗原的結(jié)合位點)和多價抗體(包括多個針對同一表 位或抗原的結(jié)合位點)。本發(fā)明提供了雙特異性抗體或抗體片斷，其具有至少一個特異性結(jié)合靶向的細胞 標志的結(jié)合區(qū)，和至少另一個特異性結(jié)合可靶向綴合物的結(jié)合區(qū)。可靶向綴合物包括載體 部分，其包含或帶有至少一個被所述雙特異性抗體或抗體片斷的至少一個結(jié)合區(qū)所識別的 表位。許多重組方法可用于生產(chǎn)如上文所述的雙特異性抗體和抗體片斷。本發(fā)明也設想多價抗體。該多價靶結(jié)合蛋白是通過第一和第二多肽的結(jié)合構建 的。所述第一多肽包括第一單鏈Fv分子，共價連接于第一免疫球蛋白樣結(jié)構域，其優(yōu)選是 免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)結(jié)構域。所述第二多肽包括包括第二單鏈Fv分子，共價連接于第二 免疫球蛋白樣結(jié)構域，其優(yōu)選是免疫球蛋白重鏈可變區(qū)結(jié)構域。每一個所述第一和第二單 鏈Fv分子都形成了靶結(jié)合位點，且所述第一和第二免疫球蛋白樣結(jié)構域結(jié)合起來以形成第三靶結(jié)合位點。具有VL-L-VH構型(其中L為接頭)的單鏈Fv分子可與具有VH_L_VL構型的另 一單鏈Fv分子結(jié)合以形成二價二聚體。在這種情況下，第一 Fv分子的VL結(jié)構域和第二 Fv 分子的VH結(jié)構域結(jié)合以形成一個靶結(jié)合位點，而第一 Fv分子的VH結(jié)構域和第二 Fv分子 的VL結(jié)構域結(jié)合以形成另一個靶結(jié)合位點。本發(fā)明的另一個實施方案是雙特異性三價靶向蛋白，其包括非共價結(jié)合的兩個異 源多肽鏈以形成三個結(jié)合位點，其中兩個對一個靶標具有親和力，而第三個對半抗原具有 親和力，所述半抗原可制備并連接于載體上用作為診斷和/或治療劑。優(yōu)選地，所述結(jié)合蛋 白具有兩個相似的抗原結(jié)合位點和一個不同的抗原結(jié)合位點。所述雙特異性三價靶向劑具 有兩個不同的scFvs，一個scFv含有來自一個抗體的兩個Vh結(jié)構域，通過短接頭連接于另 一抗體的\結(jié)構域，而第二個scFv含有來自第一抗體的兩個\結(jié)構域，通過短接頭連接于 另一抗體的Vh結(jié)構域。用于產(chǎn)生來自V1^nt結(jié)構域的多價多特異性試劑的方法條件是由 宿主生物體中的DNA質(zhì)粒合成的個體鏈完全是由Vh結(jié)構域作^連)或完全是由\結(jié)構域 (Vl鏈)以這種方式構成的，從而可通過一個Vh鏈與一個\鏈的非共價結(jié)合生產(chǎn)任何多價 和多特異性的試劑。例如，為形成三價三特異性試劑，所述Vh鏈將包括三個Vh結(jié)構域的氨 基酸序列，每一個都來自具有不同特異性的抗體，通過具有可變長度的肽接頭接合起來，而 Vl鏈將包括互補的\結(jié)構域，通過類似于Vh鏈所用的肽接頭接合起來。由于抗體的Vh和 Vl結(jié)構域以反平行方式結(jié)合，本發(fā)明優(yōu)選的方法以Vh鏈的Vh結(jié)構域相反的次序安置\鏈 的八結(jié)構域。5.雙鏈抗體、三鏈抗體和四鏈抗體本發(fā)明的抗體也可用于制備功能性雙特異性單鏈抗體(bscAb)，也稱之為雙鏈抗 體，并且可利用重組方法在哺乳動物細胞中生產(chǎn)。參見如Mack等，Proc. Natl. Acad. Sci.， 92 :7021-7025，1995，特此并入。例如，bscAb是利用重組方法介由甘氨酸-絲氨酸接頭接合 兩個單鏈Fv片斷生產(chǎn)的。兩目的抗體的V輕鏈和V重鏈(Vh)結(jié)構域是利用標準PCR 方法分離的。然后將由各雜交瘤獲得的\和VhcDNA接合起來以在兩步融合PCR中形成單 鏈片斷。第一 PCR步驟引入(Gly4-Ser1)3接頭，而第二步驟將\和Vh擴增子接合起來。然 后將各單鏈分子克隆到細菌表達載體中。繼擴增后，切下單鏈分子中的一個，并亞克隆到含 第二單鏈目的分子的另一載體中。將所得的bscAb片斷亞克隆到真核表達載體中。功能性 蛋白的表達可通過將載體轉(zhuǎn)染到中國倉鼠卵巢細胞中獲得。以類似的方式制備雙特異性融 合蛋白。雙特異性單鏈抗體和雙特異性融合蛋白包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。例如，人源化、嵌合或人抗-CD22單克隆抗體可用于生產(chǎn)抗原特異性雙鏈抗體、三 鏈抗體和四鏈抗體。單特異性雙鏈抗體、三鏈抗體和四鏈抗體選擇性地結(jié)合靶向的抗原，并 且隨著分子上結(jié)合位點數(shù)目的增加，對靶細胞的親和力增大，并在期望位置上觀察到更長 的滯留時間。對于雙鏈抗體，利用了包括通過五氨基酸殘基接頭連接于人源化CD22Mab的 Vk多肽的人源化CD22MAb的Vh多肽的兩條鏈。每條鏈形成人源化CD22雙鏈抗體的一半。 在三鏈抗體的情況下，利用了包括不通過接頭連接于人源化CD22Mab的Vk多肽的人源化 ⑶22MAb的Vh多肽的三條鏈。每條鏈形成h⑶22三鏈抗體的三分之一。本文所述雙特異性雙鏈抗體優(yōu)選的用途是用于預靶向CD22陽性腫瘤，用于隨后 特異性遞送診斷或治療劑。這些雙鏈抗體選擇性地結(jié)合靶向的抗原，允許增大的親和力和
14期望位置上更長的滯留時間。而且，非抗原結(jié)合的雙鏈抗體被很快地從機體中清除，并且正 常組織的暴露被最小化。所述診斷和治療劑可包括同位素、藥物、毒素、細胞因子、激素、生 長因子、綴合物、放射性核素和金屬。例如，釓金屬被用于磁共振成像(MRI)。放射性核素 的實例有”1(J8F^8Gi67Gd 86Y、mh、131I、125I、123I、99mTC、94mTC、18f5Re、_Re、177LU、62CU、 “(^^(^^^^^、、、"^、、、!^『^。其它放射性核素作為診斷和治療劑也是可 獲得的，特別是處于60到4，OOOkeV能量區(qū)的那些。更為最近地，也業(yè)已報道過具有雙重特異性的四價串連雙鏈抗體(稱作tandab) (Cochlovius 等，Cancer Research (2000) 60 :4336-4341)。所述雙特異性 tandab 是兩個完 全相同的多肽的二聚體，各自含有兩不同抗體的四個可變結(jié)構域(VH1、VL1, VH2、Vj，它們在 自結(jié)合時以促進形成針對兩不同特異性中每一個的兩個潛在的結(jié)合位點的取向連接。6.綴合的多價和多特異性抗體在本發(fā)明的另一個實施方案中，是綴合的多價抗體。可將附加的氨基酸殘基添至 第一或第二多肽的N-或C-端。所述附加的氨基酸殘基可包括肽標簽、信號肽、細胞因子、 酶(例如前藥激活酶)、激素、肽毒素如假單胞菌外毒素、肽藥物、細胞毒性蛋白或其它功能 蛋白。如本文所用，功能蛋白是具有生物學功能的蛋白。在一個實施方案中，藥物、毒素、放射性化合物、酶、激素、細胞毒性蛋白、螯合劑、 細胞因子及其它功能性試劑可綴合于多價靶結(jié)合蛋白，優(yōu)選是通過共價連接到所述多價靶 結(jié)合蛋白氨基酸殘基的側(cè)鏈上，例如胺、羧基、苯基、硫醇或羥基基團。多種常規(guī)的接頭可用 于此目的，例如，二異氰酸酯、二異硫氰酸酯、二(羥基琥珀酰亞胺)酯、碳化二亞胺、馬來酰 亞胺-羥基琥珀酰亞胺酯、戊二醛等。試劑與所述多價蛋白的綴合優(yōu)選并不顯著影響蛋白 對其靶標的結(jié)合特異性或親和力。如本文所用，功能性試劑是具有生物學功能的試劑。優(yōu) 選的功能性試劑是細胞毒性劑。又在其它實施方案中，雙特異性抗體指導的治療劑或前藥向體內(nèi)靶標的遞送可與 放射性核素的雙特異性抗體遞送聯(lián)合，從而實現(xiàn)化學治療和放射性免疫治療的聯(lián)合。每一 種治療都可綴合于可靶向的綴合物并同時給藥，或者所述核素可作為第一可靶向綴合物的 一部分給予，而藥物在稍后的步驟中作為第二可靶向綴合物的一部分給予。在另一個實施方案中，細胞毒性劑可綴合于聚合物載體，且所述聚合物載體可隨 后綴合于所述多價靶結(jié)合蛋白。有關此法，參見Ryser等，Proc. Natl. Acad Sci. USA, 75 3867-3870 (1978)，美國專利No. 4，699，784和美國專利No. 4，046，722，特此將其并入作為 參考。綴合優(yōu)選并不顯著影響所述多價結(jié)合單比的結(jié)合特異性或親和力。7.類人靈長化、人源化、嵌合及人抗體用于治療和診斷的用途根據(jù)本發(fā)明，類人靈長化、人源化、嵌合及人單克隆抗體即本文所述的抗-CD20 MAbs及其它MAbs，適合用于治療方法和診斷方法中。因此，本發(fā)明設想單獨作為裸抗體給 藥本發(fā)明的類人靈長化、人源化、嵌合及人抗體，或者作為多模式治療根據(jù)投藥方案臨時性 地給藥，但并不與治療劑綴合。裸抗-CD20 MAbs的功效可通過用一種或多種其它裸抗體 補充裸抗體得以增強，即針對特定抗原的MAbs，如CD4、CD5、CD8、⑶14、⑶15、⑶19、⑶21、 CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、B7、 la、HMl. M、腱生蛋白、MUCl或HLA-DR，以及用抗血管生成抗體(如VEGF和PlGF抗體)連 同一種或多種抗-CD20免疫綴合物，或者用與包括藥物、毒素、免疫調(diào)節(jié)劑、激素、治療性放射性核素等在內(nèi)的治療劑綴合的針對所述這些抗原的抗體，連同一種或多種包括藥物、毒 素、免疫調(diào)節(jié)劑、激素、治療性放射性核素等在內(nèi)的治療劑，同時地或相繼地或根據(jù)處方的 投藥方案與所述MAbs —起給藥。優(yōu)選的B細胞抗原包括等同于人⑶19、⑶20、⑶21、⑶22、 ⑶23、⑶46、⑶52、⑶74、CD80和CD5抗原的那些。優(yōu)選的T細胞抗原包括等同于人CD4、 ⑶8和⑶25(IL-2受體)抗原的那些。HLA-DR抗原的等同物可用于治療B細胞和T細胞兩 種紊亂。特別優(yōu)選的B細胞抗原是等同于人⑶19、⑶22、⑶21、⑶23、⑶74、⑶80和HLA-DR 抗原的那些。特別優(yōu)選的T細胞抗原是等同于人⑶4、⑶8和⑶25抗原的那些。⑶46是癌 細胞表面上阻斷補體依賴性溶解(CDC)的抗原。此外，本發(fā)明設想給藥免疫綴合物用于B細胞淋巴瘤及其它疾病或紊亂的治療用 途。如本文所述的免疫綴合物是包含抗體組分和治療劑的分子，包括可能帶有所述治療劑 的肽。免疫綴合物保留了抗體組分的免疫反應性，也就是說，所述抗體成分在綴合后具有如 綴合前大約相同或稍微下降的結(jié)合同源抗原的能力。同樣，本發(fā)明設想給藥免疫綴合物用于髓樣白血病的治療用途，其中靶向的是 ⑶33、⑶45、⑶66及其它粒細胞相關抗原。廣泛多樣的治療試劑可有利地綴合于本發(fā)明的抗體。此處所述的治療劑是那些 也可用于與上文所述裸抗體分別地給藥的試劑。例如，治療劑包括化療藥物如長春花生物 堿類、蒽環(huán)類抗生素、表鬼白毒素類、紫杉醇類、抗代謝物、烷化劑、抗生素、Cox-2抑制劑、 抗有絲分裂劑、抗血管生成劑和細胞調(diào)亡劑，特別是阿霉素、氨甲喋呤、紫杉酚、CPT-11、喜 樹堿類、以及其它形式的這樣那樣的抗癌劑等。其它可用的用于制備免疫綴合物和抗體融 合蛋白的癌癥化療藥物包括氮芥類、烷基磺酸酯類、亞硝基脲類、三氮烯類、葉酸類似物、 C0X-2抑制劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物、鉬配位復合物，包括奧沙利鉬、激素等。合適的化 療劑描述在 REMINGTON' S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第 19 版(Mack Publishing Co., 1995)和 GOODMAN AND GILMAN' STHE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS，第 7 版 (MacMillan Publishing Co.，1985)以及這些出版物的修訂版中。其它合適的化療劑如實 驗性藥物是本領域技術人員公知的。另外，有螯合劑如DTPA、D0TA、TETA或NOTA或合適的肽，其上可綴合可檢測標記 物如熒光分子，或者細胞毒性劑如重金屬或放射性核素。例如，治療上可用的免疫綴合物 可通過將光敏劑或染料綴合于抗體組分上獲得。熒光組合物如熒光色素及其它發(fā)色團，或 者染料如對可見光敏感的卟啉，業(yè)已通過將合適的光線引導到病變處而用于檢測和治療病 變。在治療中，這已被稱為光輻射、光線療法或光動力學療法(Jori等(編)，PH0T0DYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND0THER DISEASES(Libreria Progetto 1985) ；van den Bergh, Chem. Britain 22:430(1986))。而且，單克隆抗體業(yè)已與光活化染料偶聯(lián)用于實現(xiàn)光線療 法。Mew 等，J. Immunol 130:1473(1983)；同作者，CancerRes. 45 :4380 (1985) ；Oseroff 等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 :8744(1986)；同作者，Photochem. Photobiol. 46 83 (I987)； Hasan 等，ProgClin. Biol. Res. 288 471 (1989) ；Tatsuta 等，Lasers Surg Med. 9 422(1989) ；Pelegrin等，Cancer 67:2529(1991)。然而，這些早期的研究并未包括內(nèi)窺鏡 治療應用的用途，特別是抗體片斷或亞片斷的使用。從而，本發(fā)明設想了包含光敏劑或染料 的免疫綴合物的治療用途。毒素如假單胞菌外毒素也可絡合于或構成本發(fā)明抗-CD20抗體抗體融合蛋白的治療劑部分。在此類綴合物或其它融合蛋白的制備中適合采用的其它毒素包括篦麻毒素、 相思豆毒素、核糖核酸酶(RNase)、DNase I、葡萄球菌腸毒素_A、美洲商陸抗病毒蛋白、多 花白樹毒蛋白、白喉毒素、假單胞菌外毒素和假單胞菌內(nèi)毒素。例如，參見I^stan等，Cell 47 :641(1986)和 Goldenberg，CA-A Cancer Journalfor Clinicians 44:43(1994)。適合 用于本發(fā)明的另外的毒素是本領域技術人員公知的，并在美國專利6，077，499中公開，特 此將其全文并入作為參考。免疫調(diào)節(jié)劑如細胞因子也可綴合于或構成抗體融合蛋白的治療劑部分，或者與本 發(fā)明的人源化抗-CD20或其它淋巴瘤抗體一起給藥。用于本發(fā)明的合適的細胞因子包括但 不限于干擾素和白介素，如下文所述。8.免疫綴合物的制備本發(fā)明的任何抗體或抗體融合蛋白可與一種或多種治療劑綴合。一般地，是一種 治療劑連接于各抗體或抗體片斷，但不止一種治療劑可連接于同一抗體或抗體片斷上。本 發(fā)明的抗體融合蛋白包括兩個或多個抗體或其片斷，且構成該融合蛋白的每個抗體可含有 一治療劑。另外，抗體融合蛋白的一個或多個抗體可連接有不止一種治療劑。此外，所述治 療劑無需相同，但是可以是不同的治療劑。例如，人們可將藥物和放射性同位素連接于同一 融合蛋白。尤其是，IgG可用131I放射性標記，并連接到藥物上?？蓪⑺?31I摻入到所述 IgG的酪氨酸中，并將藥物連接于IgG賴氨酸的ε氨基上。也可將所述治療劑連接于還原 的SH基團，以及糖側(cè)鏈。本發(fā)明的雙特異性抗體可用于預靶向方法，并提供了向受試者遞送兩種治療劑的 優(yōu)選方式。美國流水號No. 09/382，186公開了利用雙特異性抗體預靶向的方法，其中所述 雙特異性抗體由125I標記，并遞送給受試者，接著是由99Ic標記的二價肽。所述遞送導致 出色的有關125I和99mTc的腫瘤/正常組織比，從而證明了兩種診斷性放射性同位素的實用 性?？衫靡阎委焺┑娜我饨M合標記所述抗體和抗體融合蛋白。所述mAb綴合物抗體組 分的結(jié)合特異性、所述治療劑或診斷劑的功效、以及所述抗體Fc部分的效應器活性，可通 過所述綴合物的標準試驗確定。治療劑可介由二硫鍵的形成連接在還原抗體組分的鉸鏈區(qū)。作為備選方案，可利 用雜雙功能交聯(lián)接頭將此類肽連接于所述抗體組分，如N-琥珀酰3-(2-吡啶二硫代)丙 酸酯(SPDP)。Yu等，Int. J. Cancer 56 :244(1994)。用于此類綴合的一般技術是本領域眾 所周知的。參見如 Wong，CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING(CRC Press, 1991) ；Upeslacis 等，"Modification of Antibodies by ChemicalMethods," in MONOCLONAL ANTIBODIES PRINCIPLES ANDAPPLICATIONS, Birch 等(編)，第 187-230 頁 (ffiley-Liss, Inc.,1995) ；Price, " Production and Characterization of Synthetic Peptide-DerivedAntibodies, “ in MONOCLONAL ANTIBODIES PRODUCTION， ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION，Ritter 等(編)，第 60-84頁(Cambridge University Press, 1995)。備選地，所述治療劑可介由糖成分追合作抗體的Fc區(qū)之中。所述糖基團可用于增 大結(jié)合于硫醇基團的同一肽的荷載，或者所述糖成分可用于結(jié)合不同的肽。介由抗體糖成分將肽綴合于抗體組分的方法是本領域技術人員眾所周知的。例 如，參見 Shih 等，Int. J Cancer 41 :832(1988) ；Shih 等，Int. J. Cancer 46:1101(1990)； 以及Siih等，美國專利No. 5，057，313，特此將它們?nèi)咳牟⑷胱鳛閰⒖肌Ｒ话惴椒ㄉ婕笆咕哂醒趸遣糠值目贵w組分與具有至少一個游離胺官能團且荷載了多個肽的載體聚合 物反應。所述反應產(chǎn)生了最初的希夫堿(亞胺)鏈鍵，這可通過還原為仲胺穩(wěn)定化，以形成 終綴合物。如果用作為免疫綴合物抗體組分的抗體是抗體片斷，則Fc區(qū)消失。不過，有可能 向全長抗體或抗體片斷的輕鏈可變區(qū)中引入糖成分。例如，參見Leung等，J. Immunol. 154 5919(1995) ；Hansen 等，美國專利 No. 5，443，953 (1995)，Leung等，美國專利 No. 6，254，868， 特此將它們?nèi)咳牟⑷胱鳛閰⒖肌＠盟龈脑斓奶浅煞诌B接所述治療或診斷劑。9.藥學上可接受的載體所述待遞送給受試者的類人靈長化、人源化、嵌合或人放射性標記抗體可僅由 mAb、免疫綴合物、融合蛋白組成，或者可包括一種或多種藥學上合適的載體、一種或多種附 加成分、或者這些物質(zhì)的某些組合。本發(fā)明的免疫綴合物抗體可根據(jù)制備藥學上可用組合物的已知方法配制，由此 所述免疫綴合物或裸抗體在混合物與藥學上合適的載體混合。無菌磷酸緩沖鹽溶液是 藥學上合適載體的一個實例。其它合適的載體是本領域技術人員眾所周知的。例如，參 見 Ansel 等，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERYSYSTEMS,第 5 版(Lea & Febiger 1990)，和 Gennaro (編)，REMINGTON' S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第 18 版 (MackPublishing Company 1990)，以及它們的修訂版?？膳渲票景l(fā)明的免疫綴合物和裸抗體用于腸胃外應用，如靜脈內(nèi)給藥，例如介由 丸劑注射和連續(xù)輸注。注射用制劑可提供為單位劑量的形式，例如，在安瓿瓶中，和在多劑 量容器中，添有防腐劑。所述組合物可采取諸如懸液、溶液或處于油或水性載體中的乳劑形 式，并且可含有配制劑如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。備選地，所述活性成分可以是散劑 形式，以在用前與合適的載體如無菌無熱原的水重構?？刹捎昧硗獾闹扑幏椒ㄒ钥刂浦委熜跃Y合物或裸抗體的作用持續(xù)時間。緩釋劑 可通過使用聚合物絡合或吸收所述免疫綴合物或裸抗體制備。例如，生物可相容的聚合物 包括聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)基質(zhì)以及硬脂酸二聚體和癸二酸的聚酸酐共聚物基質(zhì)。 Sierwood等，Bio/technology 10:1446(1992)。免疫綴合物或抗體由此基質(zhì)的釋放速率 取決于所述免疫綴合物或抗體的分子量、基質(zhì)內(nèi)免疫綴合物、抗體的量、以及分散顆粒的大 小。Saltzman等，Biophys. J. 55 :163(1989) ；Sherwood等，同上。其它固體劑量形式在描 述在 Ansel 等，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERYSYSTEMS，第 5 版(Lea & Febiger 1990)，和 Gennaro (編)，REMINGTON' S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第 18 版 (MackPublishing Company 1990)以及它們的修訂版中。所述免疫綴合物、抗體融合蛋白或裸抗體也可皮下或者甚至通過其它腸胃外路徑 向哺乳動物給藥。而且，所述給藥可以是通過連續(xù)輸注或者通過單次或多個丸劑。一般而 言，人用給藥的免疫綴合物、融合蛋白或裸抗體的劑量將根據(jù)諸如患者的年齡、體重、身高、 性別、一般醫(yī)學狀況和以前的病史的因素而變。典型地，期望為受體提供劑量在從大約Img/ kg到20mg/kg范圍內(nèi)的免疫綴合物、抗體融合蛋白或裸抗體作為單次靜脈內(nèi)輸注，盡管視 情形而定，也可給藥更低或更高的劑量。該劑量可視需要而重復，例如，每周一次共4-10 周，優(yōu)選每周一次共8周，并且更優(yōu)選每周一次共4周。也可以不太頻繁地給予，例如每隔 一周持續(xù)數(shù)月。所述劑量可通過多種腸胃外路徑給予，并適當?shù)卣{(diào)整劑量和日程。
出于治療目的，向哺乳動物給藥治療有效量的免疫綴合物、融合蛋白或裸抗體。本 發(fā)明合適的受試者通常是人，盡管也考慮非人動物受試者。如果所給藥的量具有生理學顯 著意義的，則抗體制劑被表述為是以“治療有效量”給藥的。如果其存在導致受體哺乳動物 生理學上可檢測的變化，則該制劑具有生理學顯著意義。尤其是，如果其存在激發(fā)了抗腫瘤 應答或緩和了自身免疫病狀態(tài)的體征和癥狀，則本發(fā)明的抗體制劑具有生理學顯著意義。 生理學顯著意義的功效也可以是在受體哺乳動物中激發(fā)體液和/或細胞免疫應答。10.治療方法本發(fā)明設想使用本發(fā)明的抗體作為用于治療疾病如B細胞相關惡性病、T細胞惡 性病或另一淋巴瘤類型的主要組合物。另外，它也可用于治療自身免疫病。尤其是，本文所 述的組合物尤其可用于治療多種自身免疫病以及不活躍形式的B細胞淋巴瘤、攻擊形式的 B細胞淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病、急性淋巴細胞白血病、以及瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白 血癥、多發(fā)性骨髓瘤。同樣，可治療T細胞病如T細胞白血病或蕈樣肉芽腫病。例如，人源化 抗-CD22抗體組分和免疫綴合物可用于治療不活躍和攻擊形式的兩種非霍奇金氏淋巴瘤。 自身免疫病選自下組急性特發(fā)性血小板減少性紫癜、慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜、皮肌 炎、西登哈姆氏舞蹈病、重癥肌無力、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、狠瘡性腎炎、風濕熱、多腺綜合癥、大 皰類天皰瘡、糖尿病、亨-舍二氏紫癜、鏈球菌感染后的腎炎、結(jié)節(jié)性紅斑、Takayasu' s動 脈炎、愛迪生氏病、類風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、結(jié)節(jié)病、潰瘍性結(jié)腸炎、多形紅斑、IgA 腎病、結(jié)節(jié)性多發(fā)動脈炎、強直性脊柱炎、古德帕斯徹氏綜合征、血栓閉塞性脈管炎、干燥綜 合癥、原發(fā)性膽汁性肝硬變、橋本氏甲狀腺炎、甲狀腺毒癥、硬皮病、慢性活動性肝炎、多肌 炎/皮肌炎、多軟骨炎、尋常性天皰瘡、眶壞死性肉芽腫病、膜性腎病、肌萎縮性側(cè)索硬化、 脊髓癆、巨細胞性動脈炎/多肌痛、惡性貧血、快速漸進性血管球性腎炎、牛皮癬和纖維性 肺泡炎。用于治療的組合物含有至少一種單獨的或與其它抗體聯(lián)合的人源化、嵌合或人單 克隆抗體，如其它人源化、嵌合或人抗體、治療劑或免疫調(diào)節(jié)劑。尤其是，也設想與全人抗體 的聯(lián)合治療，且是通過如上文所述的方法生產(chǎn)的。綴合于相同或不同表位或抗原的抗體也可與一個或多個本發(fā)明的抗體混合。 例如，人源化、嵌合或人綴合抗-CD22抗體可與另一類人靈長化、人源化、嵌合或人綴合 抗-CD22混合，而類人靈長化、人源化、嵌合或人綴合抗-CD22抗體可與抗-CD22免疫綴合 物混合。備選地，可與不同的淋巴瘤相關抗體進行各種這樣的混合，如上文所述的那樣。類 人靈長化、人源化、嵌合或人CD22抗體與毒素或免疫調(diào)節(jié)劑的融合蛋白，或者至少兩個不 同B細胞抗體的融合蛋白(如⑶20和⑶22 mAb)也可用于本發(fā)明之中。許多不同的抗體 混合物，靶向與B細胞或其它淋巴瘤或自身免疫病相關的至少兩個不同的抗原，如上文早 已列舉的那樣，可構建為與治療劑或免疫調(diào)節(jié)劑部分綴合，或者僅僅是與另一治療劑如細 胞毒性藥物混合，或者具有射線。如本文所用，術語“免疫調(diào)節(jié)劑”包括細胞因子，干細胞生長因子，淋巴毒素，如腫 瘤壞死因子(TNF)，和造血生長因子，例如白介素(如白介素-I(IL-I)、IL-2、IL_3、IL-6、 IL-10、IL-12和IL-18)，集落刺激因子(如粒細胞集落刺激因子(G-CSF)和粒細胞巨噬細 胞集落刺激因子(GM-CSF))，干擾素(如干擾素α、β和Y)，命名為“Si因子”的干細胞 生長因子，促紅細胞生成素以及促血小板生成素。合適的免疫調(diào)節(jié)劑成分的實例包括IL-2、
19IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、干擾素-y、TNF- α等。備選地，受試者可接受綴合的抗-CD20 抗體和單獨給藥的細胞因子，其可在裸或綴合的抗-CD20抗體給藥之前、同時或之后給藥。 如前文所討論的那樣，所述抗-CD22抗體也可綴合于免疫調(diào)節(jié)劑。所述免疫調(diào)節(jié)劑也可綴 合于雜交抗體或雜交抗體片斷或亞片斷(單鏈結(jié)合蛋白或sFv' s)，它們包括與不同抗原 結(jié)合的一個或多個抗體或亞片斷。本發(fā)明的多模式治療還包括用綴合的抗-CD22抗體免疫治療，補充給藥融合蛋白 形式的或作為免疫綴合物的抗-⑶20、抗-⑶19、抗-⑶21、抗-⑶74、抗-⑶80、抗-⑶23、 抗-CD46或HLA-DR(包括不變鏈)抗體。這些抗體包括多克隆、單克隆、靈長化類人、嵌合、 人或人源化抗體，其識別這些抗原決定簇上的至少一個表位?？?⑶19和抗-⑶22抗體是 本領域技術人員公知的。例如，參見Ghetie等，CancerRes. 48 :2610 (1988) ；Helcman等， Cancer Immunol, hnynunother. 32 :364(1991) ；Longo, Curr. Opin. Oncol. 8 :353(1996)以 及美國專利No. 5，798，554和6，187，287，特此全文并入作為參考。在另一種形式的多模式治療中，受試者接受綴合的抗體和/或免疫綴合物，聯(lián)合 標準的癌癥化療。例如，“CVB" (1. 5g/m2環(huán)磷酰胺、200-400mg/m2依托泊甙和150_200mg/ m2亞硝脲氮芥)是用于治療非霍奇金氏淋巴瘤的方案。Patti等，Eur. J. Haematol. 51 18 (199 。其它合適的化療方案組合是本領域技術人員眾所周知的。例如，參見Freedman 等，“Non-Hodgkin' s Lymphomas, “ in CANCER MEDICINE，第 2 卷，第 3 版，Holland 等(編)，第2(^8-2068頁(Lea & Febiger 1993)。作為舉例說明，用于治療中度非霍奇金 氏淋巴瘤(NHL)的第一代化療方案包括C-MOPP(環(huán)磷酰胺、長春新堿，甲基芐胼和脫氫可 的松)以及CHOP(環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新堿和脫氫可的松)?？捎玫牡诙煼桨甘?m-BACOD(氨甲喋呤、博萊霉素、阿霉素、環(huán)磷酰胺、長春新堿、地塞米松和甲酰四氫葉酸)， 而合適的第三代方案是MACOP-B(氨甲喋呤、阿霉素、環(huán)磷酰胺、長春新堿、脫氫可的松、博 萊霉素和甲酰四氫葉酸)。另外可用的藥物包括丁酸苯酯和薯司他丁-1。在優(yōu)選的多模式 治療中，化療藥物和細胞因子都與根據(jù)本發(fā)明的抗體、免疫綴合物或融合蛋白共給藥。所述 細胞因子、化療藥物以及抗體或免疫綴合物可以任何次序或一起給藥?？捎米鳛橹委焺?、基本上由于粒子發(fā)射而衰減的放射性核素包括但不限于 Ac-225、Ρ-32、Ρ-33、k-47、Fe-59、Cu-64、Cu-67、k-75、As-77、Sr-89、Υ-90、Mo-99、Rh-105、 Pd-109、Ag-lll、1-125、1-131、Pr-142、Pr-143、Pm-149、Sm-153、Tb-161、Ho-166、Er-169、 Lu-177、Re-186、Re-188、Re-189、Ir-194、Au-198、Au-199、Pb-211、Pb-212 和 Bi-213。可 用的β -粒子發(fā)射核素的最大衰減能優(yōu)選為20-5，OOOkeV,更優(yōu)選為100-4，OOOkeV,并且最 優(yōu)選為 500-2，500keVo可用作為治療劑、基本上由于俄歇發(fā)射粒子而衰減的放射性核素包括但不限于 Co-58, Ga-67, Br-80m, Tc-99m, Rh-103m, Pt-109, In-Ill、Sb-119、1-125、Ho-161、0s_189m 和Ir-192。這些放射性核素的最大衰減能優(yōu)選小于l，000keV，更優(yōu)選小于IOOkeV,并且最 優(yōu)選小于70keV。可用作為治療劑、基本上由于α-粒子的產(chǎn)生而衰減的放射性核素包括但不限 于Dy-152、At-211、Bi—212、Ra—223、Rn—219、Po—215、Bi—211、Ac—225、Fr—221、At—217、 Bi-213和Fm-255。可用的α -粒子發(fā)射放射性核素的衰減能優(yōu)選為2，000-9，OOOkeV，更優(yōu) 選為 3，000-8，OOOkeV,并且最優(yōu)選為 4，000-7，OOOkeV0
可用于基于種子俘獲操作的療法的放射性核素包括但不限于B-10、Gd-157和 U-235。本發(fā)明的實施方案可進一步通過詳細顯示本發(fā)明方方面面的實施例舉例說明。這 些實施例舉例說明了本發(fā)明的具體要素，而不應當闡釋為限制其范圍。實施例抗體Epratuzumab 為人源化的 LL2 抗體，并由 Immunomedics Inc.，MorrisPlains, NJ 研發(fā)。人源化過程用人IgG1序列替換了約95%的鼠源Ig序列。Epratuzumab —經(jīng)結(jié)合 于 CD22 抗原的 B 表位就被內(nèi)在化(Stein，R.等，Cancer Immunol. Imnaunother. 37(5) 四3-8，1993)，該表位對應于第三 Ig結(jié)構域(Kehrl，J. H. B6 CD22 Workshop Panel Report, in LeubocyteTyping V. White Cell Differentiation Antigens. , S. F. Schlossman (編)· Oxford University Press，p. 523-5，1995)。在5分鐘之后觀察到體外內(nèi)在化，并報道在5 小時后發(fā)生多達 50%抗原的再表達(Shih, L. B. ^ Int JCancer 56(4) =538-45,1994) AMitiK -CD20 hA20 ^lkBfi Immunomedics, Inc. ， MorrisPlains, NJfF胃。 該Mab結(jié)合CD20，并與嵌合抗-CD20 MAb利妥?，斚喾?，它是比嵌合形式具有更少鼠源蛋白 的CDR移植MAb。所述hA20MAb具有IgGl ( κ )恒定區(qū)和與印ratuzumab CD22人源化MAb 相同的人V框架區(qū)。將hA20的CDR移植VH和Vk鏈的基因插入到基于DHFR擴增表達系統(tǒng) 的pdHL2質(zhì)粒載體中，并轉(zhuǎn)染到Sp2/0鼠骨髓瘤細胞系中以產(chǎn)生hA20生產(chǎn)克隆。分子表征 證明hA20在其CDRs中類似于利妥希瑪，除了在VH區(qū)中有一個氨基酸的差異以外。然而， 由于包含更多的人構建體，hA20的VH和Vk框架區(qū)中存在著差異。該hA20抗體似乎競爭 利妥希瑪對多種淋巴瘤細胞的結(jié)合，并且具有與利妥?，斚嗨频慕怆x常數(shù)，以及相似的體 外和體內(nèi)抗表達CD20的人淋巴瘤細胞系的效應。非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)的治療呈IV期彌漫性大細胞NHL的66歲老人，在前兩年給予的3療程化療之后復發(fā)。向 他給予兩次wY-DOTAipratuzumab (依照Govinden標記，同前)注射的劑量，相隔一周，每 次通過靜脈內(nèi)輸注給藥7.5mCi/m2 9°Y連同總劑量30mg的抗體蛋白。六周后，他的頸淋巴結(jié) 和他的脾腫大似乎已顯著減小，且患者癥狀上得到改善，并返回專職工作。由于他并未完全 緩解，制定了涉及印ratuzumab (360mg/m2)和hA20 (250mg/m2)聯(lián)合的繼續(xù)治療，隔周給予， 總計4次輸注，然后12周之后重復所述聯(lián)合抗體治療療程。在結(jié)束裸CD22和CD20抗體聯(lián) 合的第二治療療程后三個月，通過放射線掃描或骨髓生檢，患者無疾病跡象，因而認為是完 全應答。在3個月后的下一個評價中，他仍處于疾病的完全緩解之中。T細胞白血病的治療向?qū)υ谇暗幕燁B固且具有晚期T細胞白血病的患者給予與20mCi 9°Y_D0TA綴合 的50mg抗-CD25人源化Mab的輸注，一周后接著給予劑量為200mg/m2的CD25 Mab (抗-TAC 人源化抗體)輸注。四周后，他的血液計數(shù)和骨髓生檢顯示了疾病的部分緩解。頑固性類風濕性關節(jié)炎的治療患者呈嚴重晚期類風濕性關節(jié)炎，影響了許多關節(jié)，但尤其是他的膝蓋，現(xiàn)對化療 頑固，用劑量為10mCi/m2由9°Y標記的總計50mg的⑶4和⑶20人源化Mabs混合物單次輸 注治療。兩周后，向他給予由IOOmg⑶4和250mg⑶20抗體組成的裸人源化抗體劑量，并在兩周后再這樣重復一次。緩和感覺到其關節(jié)炎的緩解，特別是膝蓋，并且4周后，能夠更好 地步行甚至是爬樓梯，其醫(yī)師幾乎沒記錄關節(jié)炎癥。三個月后，重復該治療療程，涉及一次 放射性標記抗體混合物的輸注，接著是兩次裸CD4和CD20抗體的輸注，并在6周后重新評 價患者。醫(yī)師注意到顯著的改善，從而患者見證了僅最小的疼痛和其肢體頗為更佳的運動 性。盡管前述內(nèi)容涉及特定的優(yōu)選實施方案，人們將會理解本發(fā)明并不局限于此。本 領域普通技術人員將會想到可對所公開的實施方案進行各種改進，并且此類改進旨在落入 本發(fā)明由如下實施方案所定義的范圍之內(nèi)。特此將本說明書中所引述的所有出版物和專利申請及專利全文并入作為參考。
權利要求
1.治療組合物在制造用于治療哺乳動物疾病的藥物中的用途，所述治療組合物包括藥 學上可接受的載體和至少一種綴合抗體或其片斷，或綴合抗體融合蛋白或其片斷，其中并 不進行非放射性標記抗體的預先投藥，且其中向所述哺乳動物同時地或相繼地給藥所述治 療組合物。
2.權利要求1的用途，其中任選地與所述綴合抗體或其所述片斷或者所述綴合抗體融 合蛋白或其所述片斷一起添加非綴合抗體或片斷或者非綴合抗體融合蛋白或其片斷。
3.權利要求1或2的用途，其中所述綴合和非綴合的抗體、抗體融合蛋白或其片斷靶向 于選自下組的抗原CD3、CD4、CD5、CD8、CDllc、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、 CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD 126、MUCl、腱生蛋白、 la、HMI. 24, HLA-DR以及腫瘤相關抗原。
4.權利要求1或2的用途，其中所述綴合和非綴合的抗體、抗體融合蛋白或其片斷靶向 于選自下組的抗原⑶20、⑶22和⑶74。
5.權利要求3的用途，進一步包括向所述哺乳動物同時或相繼給藥這樣的治療組合 物，所述治療組合物包括藥學上可接受的載體和至少一種抗體、抗體融合蛋白或其片斷，其 中所述抗體、所述抗體融合蛋白或其所述片斷綴合于至少一種治療劑。
6.權利要求5的用途，其中任選地與所述綴合抗體、綴合抗體融合蛋白或其所述片斷 一起添加非綴合抗體、抗體融合蛋白或其片斷。
7.權利要求5或6的用途，其中所述綴合和非綴合的抗體、抗體融合蛋白或其片斷靶向 于選自下組的抗原CD3、CD4、CD5、CD8、CDllc、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、 CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD 126、MUCl、腱生蛋白、 la、HMI. 24, HLA-DR以及腫瘤相關抗原。
8.權利要求1的用途，其中所述疾病是B細胞相關病、T細胞相關病或自身免疫病。
9.權利要求8的用途，其中所述B細胞相關病是不活躍形式的B細胞淋巴瘤、攻擊形式 的B細胞淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病、急性淋巴細胞白血病、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血 癥或多發(fā)性骨髓瘤。
10.權利要求9的用途，其中所述B細胞相關病是非霍奇金氏淋巴瘤。
11.權利要求1的用途，其中所述綴合和非綴合的抗體是抗-CD22單克隆抗體。
12.權利要求1的用途，其中所述綴合和非綴合的抗體是人源化LL2單克隆抗體。
13.權利要求12的用途，其中所述人源化LL2抗體由釔-90放射性標記。
14.權利要求11的用途，其中所述抗-CD22單克隆抗體是人的。
15.權利要求1的用途，其中所述綴合抗體是以每劑20-600毫克蛋白的劑量腸胃外給 藥的。
16.權利要求1的用途，其中所述綴合抗體是以每劑20-150毫克蛋白的劑量腸胃外給 藥的。
17.權利要求1的用途，其中所述綴合抗體是以每劑20-100毫克蛋白的劑量腸胃外給 藥的。
18.權利要求11的用途，其中所述哺乳動物接受作為每劑20-150毫克蛋白的重復腸胃 外劑量的所述抗-CD22單克隆抗體。
19.權利要求11的用途，其中所述哺乳動物接受作為每劑20-100毫克蛋白的重復腸胃外劑量的所述抗-CD22單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及B細胞惡性瘤和自身免疫病的免疫療法，特別是用于治療和診斷哺乳動物B細胞相關病、T細胞相關病或自身免疫病的方法，所述方法是通過向所述哺乳動物同時或相繼給藥包括藥學上可接受的載體和至少一種綴合抗體的治療組合物進行的，其中并不進行非放射性標記抗體的預先投藥。
文檔編號A61P5/00GK102133410SQ201110065849
公開日2011年7月27日 申請日期2003年12月31日 優(yōu)先權日2002年12月31日
發(fā)明者D·M·戈登伯格, H·漢森 申請人:免疫醫(yī)療公司