專利名稱：一種病毒類疫苗的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為一種源自哺乳動物體細(xì)胞的病毒類疫苗的純化方法，將源自上游的病毒收獲液進(jìn)行濃縮、溶解和分離等處理，獲得形態(tài)較為統(tǒng)一的含抗原成分的溶解液，再對溶解的病毒抗原進(jìn)行層析純化處理，工藝中還包括滅活處理。這種純化工藝可以獲得較高的抗原回收率的同時，也可以獲得較高的抗原純度以降低疫苗對人體的副作用。
背景技術(shù)：
很多病毒可以引起人類疾病并具有傳染性，如肺炎、肝炎、流行性感冒、手足口病等。預(yù)防這些傳染性疾病的有效、經(jīng)濟(jì)的手段之一是進(jìn)行疫苗預(yù)防接種。病毒性疫苗通過嚴(yán)格的制備工藝，如病毒培養(yǎng)和抗原純化等步驟生產(chǎn)出來。制備工藝的產(chǎn)能水平、效率和質(zhì)量保證等往往決定著疫苗產(chǎn)品帶來的經(jīng)濟(jì)和社會效益。流行性感冒可引起多種呼吸道疾病，全球范圍內(nèi)每年約有300-500萬人口患流感類疾病，因流感致死的人數(shù)也在25萬-50 萬人。在我國，流感及其并發(fā)癥所造成的死亡率僅次于心臟病、腫瘤和心血管病。預(yù)防流感的最有效、最經(jīng)濟(jì)的手段是進(jìn)行流感疫苗的預(yù)防接種。傳統(tǒng)的流感疫苗是通過雞胚培育流感病毒，再經(jīng)過純化滅活和裝配等工序生產(chǎn)的。成套的雞胚系流感疫苗工藝在近60年里一直是世界范圍內(nèi)成熟且唯一的流感疫苗的生產(chǎn)方法。因為工藝技術(shù)本身并不復(fù)雜也一直未有大的改進(jìn)，生產(chǎn)的流感疫苗在世界各地得到了廣泛的使用，其有效性和安全性也獲得了廣泛的認(rèn)可，多年的統(tǒng)計數(shù)據(jù)證實了季節(jié)性流感疫苗的接種有效的預(yù)防和降低了人群中流感及并發(fā)癥的發(fā)病率。然而，在2004年爆發(fā)H5N1禽流感和2009年爆發(fā)HlNl甲型流感的背景下，流感疫苗供不應(yīng)求，世界性的產(chǎn)能不足以及生產(chǎn)時間過長突顯了傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝已經(jīng)不能滿足新的全球市場變化和新的生物制品安全要求。突出的矛盾集中表現(xiàn)在以下幾個方面I.季節(jié)性流感疫苗的需求不斷增加；全球流感疫苗市場規(guī)模巨大，并且呈每年遞增的趨勢。為了降低世界范圍內(nèi)的流感疫病致死率，從80年代開始，很多國家都增加了流感疫苗的接種率，尤其是針對高危人群(嬰幼兒和老年人)的保護(hù)力度；然而流感疫苗的產(chǎn)量并沒有同速提升。2.疫苗供應(yīng)鏈脆弱；雖然流感疫苗的需求量不斷增加，市場不斷擴(kuò)大，歐美大型的疫苗生產(chǎn)商卻遇到了產(chǎn)能瓶頸。由雞胚生產(chǎn)的流感疫苗受到了越來越嚴(yán)格的行業(yè)監(jiān)管(如cGMP的規(guī)定)的限制，突出體現(xiàn)在從養(yǎng)雞場的監(jiān)管到合格雞蛋的篩選的各個環(huán)節(jié)中。到了 90年代末，美國市場上兩家大型流感疫苗廠商相繼退出了市場；到2002年僅剩下3家，在2004-2005年度，美國Powderjec公司因為產(chǎn)品質(zhì)量問題，其生產(chǎn)超過3千萬劑的季節(jié)性流感疫苗被迫停止銷售，但是由于制作流感疫苗所需的雞蛋無法得到及時補充，市場上的流感疫苗數(shù)量驟減。同年，席卷全球的禽流感疫情使得流感疫苗需求量大增，直接導(dǎo)致了市場供不應(yīng)求的局面。這次教訓(xùn)促使美國政府乃至全球加大研發(fā)力度，尋求較傳統(tǒng)工藝更可靠的新生產(chǎn)技術(shù)。3.大流行流感疫情的突襲
隨著禽流感疫情在亞洲和其他地區(qū)的不斷出現(xiàn)，人患高致病性禽流感風(fēng)險的增力口，世衛(wèi)組織的多數(shù)專家認(rèn)為禽流感病毒從畜傳染人到人傳染人的轉(zhuǎn)變只是時間問題。由于禽流感病毒對家禽的致死率極高，傳統(tǒng)雞胚生產(chǎn)的流感疫苗所需的雞蛋供應(yīng)源受到威脅，因此在大流行流感爆發(fā)時的疫苗供應(yīng)受到很大挑戰(zhàn)。此外，根據(jù)美國BARDA的數(shù)據(jù)顯示，用傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)出HlNl首支甲流疫苗的平均時間為21-24周，疫苗大規(guī)模供應(yīng)市場的時間明顯晚于甲流疫情的爆發(fā)高峰，并不能有效的控制疫情。2009年中國疫苗企業(yè)創(chuàng)造了生產(chǎn)首支甲流疫苗87天的全球最快速度，然而由于產(chǎn)能不足等原因，大規(guī)模的接種遲到一個多月才得以展開。傳統(tǒng)工藝在面對大流行流感疫情時突出的產(chǎn)能和產(chǎn)速問題，促使流感疫苗企業(yè)在面對大流行流感前不能再依靠一種生產(chǎn)技術(shù)，相對更可靠、更靈活、更快速的新工藝技術(shù)成了近幾年世衛(wèi)組織和歐美等國家支持的重點。這種新工藝技術(shù)的突出代表之一是基于哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和純化技術(shù)開發(fā)的第二代流感疫苗制備工藝，較傳統(tǒng)雞胚工藝的優(yōu)勢主要體現(xiàn)在四個方面靈活性，可靠 性，時效性和可持續(xù)發(fā)展。靈活性由于生產(chǎn)流感病毒的哺乳動物細(xì)胞在密封的生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，疫苗劑量可以通過增加或減少生物反應(yīng)器的數(shù)量或者容積來實現(xiàn)，可操作性強；細(xì)胞種可以長期保存在體積小的容器中，用存方便，保證細(xì)胞的培養(yǎng)可以隨時進(jìn)行；生產(chǎn)操作全部在廠房中進(jìn)行，受到外界的影響小。可靠性細(xì)胞的培養(yǎng)和增殖具有同源性，細(xì)胞間的差異小，對于病毒的繁殖、純化、雜質(zhì)去除都有穩(wěn)定的保障；密閉的生物反應(yīng)器有效的避免了外源雜質(zhì)的污染，更符合藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(如cGMP標(biāo)準(zhǔn))，對疫苗產(chǎn)品質(zhì)量有更好的保障。相較傳統(tǒng)雞胚生產(chǎn)工藝，由于雞蛋個體間的差異大，導(dǎo)致質(zhì)量控制難度大，產(chǎn)品質(zhì)量的可靠性不如細(xì)胞系流感疫苗好。此外，雞胚流感疫苗有明顯的不適宜接種人群，尤其指對雞蛋中物質(zhì)(如卵清蛋白)過敏的人。時效性一般來說，細(xì)胞系流感疫苗生產(chǎn)工藝的時間較雞胚類的短。對于大流行流感疫情，更短的生產(chǎn)周期可以使疫苗供應(yīng)市場的時間早于大流感爆發(fā)的高峰，更有效的在第一時間保護(hù)人群；對于季節(jié)性流感，較短的生產(chǎn)周期為世衛(wèi)組織贏得了更多的時間來分析判斷下一冬季可能流行的流感病毒株種類，相應(yīng)的疫苗產(chǎn)品的針對性更強，保護(hù)效果更好。從細(xì)胞中可有效分離的毒株種類較從雞胚中分離的更廣、變異性更小。在遇到禽流感時，由于對家禽的高致死率，蛋源的供應(yīng)和在雞胚中病毒的培育都受到?jīng)_擊，然而通過哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)禽流感疫苗的方法不受影響。此外，不能在雞胚中有效分離的H3N2類毒株有超過65%的可以有效的從細(xì)胞中分離?？沙掷m(xù)發(fā)展細(xì)胞系生產(chǎn)工藝的不斷優(yōu)化對于新一代技術(shù)的研發(fā)和應(yīng)用具有積極推動作用。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和純化技術(shù)的發(fā)展可以促進(jìn)下一代以基因技術(shù)為基礎(chǔ)的流感疫苗的研發(fā)和應(yīng)用；此外，傳統(tǒng)雞胚工藝占用的社會資源(如土地資源、物流和人員監(jiān)管等)和產(chǎn)生的生物廢棄物較細(xì)胞系流感疫苗多，可持續(xù)性差。細(xì)胞系流感疫苗的制備工藝還在不斷的優(yōu)化中，其中需要解決的一個問題是較低的血凝素產(chǎn)量。根據(jù)試驗觀察，病毒收獲液中的含抗原成分呈現(xiàn)出多種形態(tài)，比如 單一完整病毒顆粒 多數(shù)病毒顆粒的聚集體 病毒顆粒和細(xì)胞殘骸的連接體 病毒殘片或不完整病毒顆粒 游離的抗原蛋白或者其聚集體在下游純化的步驟中，由于每個步驟的分離原理不同，導(dǎo)致了不同形態(tài)的含抗原成分在多重步驟后的明顯損失，因此抗原回收率較低，直接影響了整體工藝的經(jīng)濟(jì)效益。此次發(fā)明提供一種純化方法，可以解決上述問題，提高抗原回收率和純度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為一種源自哺乳動物體細(xì)胞培養(yǎng)的病毒性疫苗的純化方法。首先將源自上游的病毒收獲液進(jìn)行濃縮和溶解處理使病毒收獲液的成分呈現(xiàn)溶解部分和非溶解部分，再將兩部分分離并保留病毒收獲液中的溶解部分，然后對其中的溶解劑進(jìn)行吸附去除處理，獲得形態(tài)較為統(tǒng)一的含抗原成分的溶解液，用層析法純化溶解液中的抗原成分以獲取較高抗原純度和其回收率的抗原收獲液，然后對抗原收獲液進(jìn)行滅活處理。本發(fā)明涉及的病毒收獲液是從哺乳動物體細(xì)胞中培養(yǎng)產(chǎn)生的，如MDCK狗腎細(xì)胞和Vero猴腎細(xì)胞，可以在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，本發(fā)明所述病毒可以在細(xì)胞中增殖，如源自季節(jié)性、大流行前或大流行的流感病毒A和B亞型毒株?？乖且呙缰写龠M(jìn)免疫效果的成分，比如流感病毒的表面抗原血凝素、神經(jīng)氨酸苷酶和/或離子通道M2蛋白。所述的溶解處理方法是加入至少一種溶解劑，有效的將抗原蛋白從不同形態(tài)的含抗原成分中游離溶解，使其與非溶解物質(zhì)(含大部分雜質(zhì))分離，溶解后的抗原蛋白形態(tài)較為統(tǒng)一，雜質(zhì)較少，易于下游的層析純化。本發(fā)明涉及病毒收獲液的預(yù)處理步驟。收獲液中可以含有供細(xì)胞生長的微載體，也可以是懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，不含微載體。預(yù)處理的方法可以包括向病毒收獲液中加入鹽，如NaCl (濃度1M-10M)，也可以不加入，以及低速離心，建議控制在2_10分鐘，轉(zhuǎn)速200g_4000g內(nèi)，或者澄清過濾(例如靜置5分鐘左右后除去沉淀物)，將絕大部分含有抗原的成分與大型固體物質(zhì)(例如細(xì)胞、大型細(xì)胞殘骸和/或微載體)分離。預(yù)處理后的病毒收獲液可以通過超濾進(jìn)行濃縮。超濾可以選用截流分子量在50-500KD范圍內(nèi)的過濾膜，濾膜表面積在30-500cm2范圍內(nèi)，濃縮倍數(shù)建議在8-15倍之間。將絕大多數(shù)含抗原成分與水以及小分子分離。濃縮后的病毒收獲液體積小、抗原濃度高等特點有利于溶解步驟的進(jìn)行(例如溶解劑用量少)和抗原含量的檢測。溶解步驟包含加入一種陽離子溶解劑，如十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，建議在加入這種溶解劑之前，先期加入一種無離子溶解劑，如聚山梨酯-80 (Polysorbate-80 (PB-80))，使病毒收獲液在溶解后的成分呈現(xiàn)溶解部分和非溶解部分。在溶解過程中一些溶解條件對抗原回收率和雜質(zhì)回收率(抗原純度)具有顯著影響，因此研究和鑒別這些溶解條件對回收率影響的方法也包括在本發(fā)明中。所述的溶解條件及數(shù)值初始范圍為、
# PB-80 濃度300 μ g/ml 到 1000 μ g/ml?！?PB-80溶解時間0. 5小時到3小時。· PB-80溶解時溫度4攝氏度到室溫。 病毒收獲液濃縮倍數(shù)1. 5倍到10倍?！?CTAB 濃度900 μ g/ml 到 3000 μ g/ml?！?CTAB溶解時間0· 5小時到14小時。 · CTAB溶解時溫度4攝氏度到室溫。溶解后將溶解液做低溫高速分離處理，轉(zhuǎn)速建議控制在80，000g-120, OOOg范圍內(nèi)，溫度在4-10攝氏度內(nèi)；保留含有抗原成分的上清液，即病毒收獲液中的溶解部分。陽離子溶解劑，如CTAB，如果較長期和抗原混合，可能對其產(chǎn)生破壞作用，所以本發(fā)明還涉及一種可去除CTAB溶解劑的方法。所述的溶解劑CTAB的去除，可以通過向上清液加入吸附劑，比如Amberlite XAD4，經(jīng)過充分混合，建議在混合后14小時內(nèi)將吸附劑過濾，可以使用孔徑為5微米的過濾網(wǎng)，獲得的液體即為形態(tài)較為統(tǒng)一的抗原溶解液。溶解液可以進(jìn)一步的純化，也可以在低溫中冷凍保存待用。本發(fā)明還涉及評估所述溶解條件對抗原回收率和雜質(zhì)回收率影響的量化方法，通過調(diào)控一些溶解條件數(shù)值使相應(yīng)回收率得到顯著優(yōu)化。在溶解條件數(shù)值初始范圍內(nèi)，單一的溶解條件或者多重溶解條件互作后對抗原回收率和雜質(zhì)回收率的影響可以通過軟件進(jìn)行評估，如運用試驗設(shè)計軟件(Design of Experiment)把選定的溶解條件與抗原回收率或雜質(zhì)回收率組成矩陣按照一定標(biāo)準(zhǔn)建立數(shù)學(xué)模型，這些標(biāo)準(zhǔn)是單一溶解條件的數(shù)值初始范圍及其范圍內(nèi)所選定具體值和數(shù)量(參見實施例3)?？煽康哪Ｐ涂梢蕴峁┰囼炈钄?shù)量和每組試驗對應(yīng)溶解條件選定的具體值，最后將每組試驗得到的數(shù)據(jù)，如抗原回收率和雜質(zhì)回收率，輸入到對應(yīng)的矩陣中，軟件根據(jù)數(shù)學(xué)模型鑒別出對相關(guān)回收率有統(tǒng)計學(xué)顯著影響(P值<0. I)的因子，包括單一的溶解條件，或者多重溶解條件的互作。這些溶解條件在試驗范圍內(nèi)對相關(guān)回收率的影響可以通過模型構(gòu)建的趨勢圖來量化(參見附圖1-5)。所述分析方法可以用于評估上述溶解條件對流感病毒A和B亞型毒株抗原血凝素回收率和雜質(zhì)回收率的影響并通過制作的趨勢圖來量化，方便在溶解步驟對血凝素回收率和血凝素純度進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化。本發(fā)明涉及的層析法包括離子交換層析法和/或親疏水性層析法。純化的對象包括按照上述步驟溶解了的病毒抗原(抗原溶解液)，例如流感病毒A和B亞型流感病毒抗原。離子交換層析法離子交換層析法建議使用陰離子交換柱,例如CIM QA Monolithic Column和Capto Q Column。一些層析純化的條件對抗原回收率和抗原純度具有顯著影響,這些條件包括 平衡緩沖液導(dǎo)電率、pH值?；n純化原料導(dǎo)電率、pH值。 上柱原料量抗原量。 洗脫液導(dǎo)電率、pH值。平衡緩沖液建議使用由KH2PO4和Na2HPO4配成的緩沖液，也可以使用例如Tris鹽酸等緩沖液。平衡緩沖液的導(dǎo)電率(離子強度)建議控制在3ms/cm-12ms/cm的范圍內(nèi)，pH值控制在7. 0-8. 5范圍內(nèi)。需要時，注射用水可作為稀釋劑。按照上述溶解步驟獲得的抗原溶解液(純化原料)的pH值一般在7. 8-8. 5的范圍內(nèi)，導(dǎo)電率一般在12ms/cm-16ms/cm的范圍內(nèi)。根據(jù)層析柱填料對純化原料中抗原的承載能力，上柱的抗原量一般控制在100 μ g-1000 μ g每Iml填料容積的范圍內(nèi)。洗脫液導(dǎo)電性的應(yīng)用范圍和順序一般是從下限為平衡緩沖液導(dǎo)電率的水平到上限為1M-2M NaCl鹽溶液相當(dāng)?shù)膶?dǎo)電率水平。根據(jù)上述條件對源自A亞型流感病毒(例如A/California/07/2009/X-179A型毒株)的抗原溶解液進(jìn)行陰離子交換層析純化處理，對收集的洗脫抗原峰進(jìn)行血凝素含量、 全蛋白含量、DNA含量、神經(jīng)氨酸苷酶、牛血清白蛋白含量的測定，獲得的效果如下 血凝素回收率較純化原料可以達(dá)到60%以上。 全蛋白的水平可以達(dá)到小于240μ g/ΙΟΟμ g血凝素?！?DNA的水平可以達(dá)到小于20ng/100 μ g血凝素。 神經(jīng)氨酸苷酶存在。 牛血清白蛋白水平可以小于lOOng/lOOy g血凝素。其中，全蛋白含量、DNA含量、神經(jīng)氨酸苷酶和牛血清白蛋白含量均達(dá)到歐盟相關(guān)細(xì)胞系流感疫苗的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。親疏水性層析法親疏水性層析法建議使用層析柱含有苯基、丁基、辛基等集團(tuán)的填料,例如CIMBlC4 A-I Monolithic Column和Capto Phenyl Column。一些層析純化的條件對抗原回收率和抗原純度具有顯著影響，這些條件包括 平衡緩沖液鹽濃度、pH值?！ぜ兓消}濃度、pH值。 上柱原料量抗原量。 洗脫液鹽濃度、pH值。平衡緩沖液建議使用由硫酸銨、KH2PO4和Na2HPO4配成的緩沖液。平衡緩沖液硫酸銨的濃度建議控制在IM -3M的范圍內(nèi)，pH值控制在7. 0-8. 5范圍內(nèi)。按照所述溶解步驟獲得的抗原溶解液(純化原料)的pH值一般在7. 8-8. 5的范圍內(nèi)。根據(jù)層析柱填料對純化原料中抗原的承載能力，上柱的抗原量一般控制在100 μ g-1000 μ g每Iml填料容積的范圍內(nèi)。洗脫液鹽濃度的應(yīng)用范圍和順序一般是從上限為平衡緩沖液鹽濃度的水平到下限為洗脫液O. IM鹽濃度的水平。根據(jù)上述條件對源自A和B亞型流感病毒(例如A/California/07/2009/X_179A型毒株和B/Malaysia/2506/2004型毒株)的抗原溶解液分別進(jìn)行親疏水性層析純化處理，對收集的洗脫抗原峰進(jìn)行血凝素含量、全蛋白含量、DNA含量、神經(jīng)氨酸苷酶、牛血清白蛋白含量的測定，獲得的效果如下 血凝素回收率較純化原料均可以達(dá)到60%以上。
全蛋白的水平均可以達(dá)到小于240μ g/ΙΟΟμ g血凝素。· DNA的水平均可以達(dá)到小于20ng/100 μ g血凝素。 神經(jīng)氨酸苷酶存在。 牛血清白蛋白水平可以小于lOOng/lOOy g血凝素。其中，全蛋白含量、DNA含量、神經(jīng)氨酸苷酶、牛血清白蛋白含量均達(dá)到歐盟相關(guān)細(xì)胞系流感疫苗的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明還涉及評估上述層析條件在建議范圍內(nèi)對抗原回收率和雜質(zhì)回收率影響的量化方法。具體的方法如上述對溶解條件的評估方法所述一致，可以用于上述層析條件對流感病毒A和B亞型毒株抗原血凝素回收率和雜質(zhì)回收率的影響并通過制作的趨勢圖來量化，方便在層析純化步驟對血凝素回收率和血凝素純度進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化。此外，根據(jù)本發(fā)明 中所述的濃縮條件，即超濾膜截流分子量、濾膜表面積和濃縮倍數(shù)，通過上述評估方法也可以用于量化濃縮條件在建議范圍內(nèi)對抗原回收率和雜質(zhì)回收率的影響。抗原收獲液可以通過加入最終含O. 1% (體積比)的丙內(nèi)酯進(jìn)行滅活處理，或者加入相同濃度的甲醛。滅活處理也可以針對病毒收獲液或抗原溶解液進(jìn)行。綜上所述，源自A和B亞型流感病毒的抗原溶解液可以通過層析法得到有效純化，這種方法可以通過陰離子交換層析法或親疏水性層析法或上述兩種層析法的結(jié)合使用來實現(xiàn)。針對A和B亞型流感病毒抗原的純化效果做如下總結(jié) 抗原溶解液的血凝素回收率較病毒收獲液可達(dá)85%以上。 層析純化后的血凝素回收率較抗原溶解液可達(dá)60%以上。 從病毒回收液到層析純化后的整體血凝素回收率可達(dá)50%以上。 層析純化后全蛋白的水平可達(dá)到小于240 μ g/100 μ g血凝素。 層析純化后DNA的水平可達(dá)到小于20ng/100 μ g血凝素。 在整個純化過程中神經(jīng)氨酸苷酶存在。 層析純化后牛血清白蛋白的水平達(dá)到小于100ng/100 μ g血凝素。


圖I :溶解條件“收獲液濃縮倍數(shù)”與“CTAB濃度”對A/California/7/2009/X_179A型流感病毒抗原溶解液血凝素回收率影響的趨勢圖。此圖中其它三個溶解條件值為PB-80濃度:900 μ g/ml ；CTAB溶解時間0. 5小時=CTAB溶解時溫度4°C。圖2 :溶解條件“收獲液濃縮倍數(shù)”與“CTAB濃度”對B/Brisbane/60/2008型流感病毒抗原溶解液血凝素回收率影響的趨勢圖。此圖中其它三個溶解條件值為PB-80濃度900 μ g/ml ；CTAB溶解時間3小時；CTAB溶解時溫度4°C。圖3 :溶解條件“收獲液濃縮倍數(shù)”與“CTAB濃度”對A/California/7/2009/X_179A型流感病毒抗原溶解液全蛋白回收率影響的趨勢圖。此圖中其它三個溶解條件值為PB-80濃度900 μ g/ml ；CTAB溶解時間0. 5小時；CTAB溶解時溫度4°C。圖4 :溶解條件“收獲液濃縮倍數(shù)”與“CTAB濃度”對B/Brisbane/60/2008型流感病毒抗原溶解液全蛋白回收率影響的趨勢圖。此圖中其它三個溶解條件值為PB-80濃度900 μ g/ml ；CTAB溶解時間3小時；CTAB溶解時溫度4°C。圖5 :溶解條件“收獲液濃縮倍數(shù)”與“CTAB濃度”對B/Brisbane/60/2008型流感病毒抗原溶解液DNA回收率影響的趨勢圖。此圖中其它三個溶解條件值為PB-80濃度900 μ g/ml ；CTAB溶解時間3小時；CTAB溶解時溫度4°C。圖6 :強陰離子交換層析純化A/California/7/2009/X-179A型流感抗原溶解液的層析譜圖。圖7 :含苯基集團(tuán)的親疏水性層析純化A/California/7/2009/X_179A型流感毒株抗原溶解液的層析譜圖。圖8 :含苯基集團(tuán)的親疏水性層析純化B/Brisbane/60/2008型流感毒株抗原溶解液的層析譜圖。為了清楚的說明本發(fā)明，現(xiàn)結(jié)合如下實施例進(jìn)行詳細(xì)說明，但這些實施例僅僅是對本發(fā)明的示例性描述，并不能解釋為對本專申請的限制。
具體實施例方式實施例I :流感病毒侵染MDCK細(xì)胞后病毒收獲液的預(yù)處理和濃縮I)預(yù)處理A亞型流感毒株(A/California/7/2009/X_179A型)或者B亞型流感毒株(B/Brisbane/60/2008型和B/Malaysia/2506/2004型)侵染并在MDCK細(xì)胞中增殖后獲取了病毒收獲液，在4攝氏度條件下，300g離心2分鐘或者3200g離心8分鐘，吸取上清液。2)濃縮將上清液用截流分子量為300KDa、表面積為150cm2的超濾膜進(jìn)行濃縮8-12倍，濃縮液存于4攝氏度條件下待用。實施例2 :溶解條件的建立在A/California/7/2009/X_179A型流感病毒的溶解試驗中，選擇的5個溶解條件及相應(yīng)測定值或范圍# PB-80 濃度300 μ g/ml 到 900 μ g/ml。 收獲液濃縮倍數(shù)1.5倍到4. 8倍?！?CTAB 濃度900 μ g/ml 到 3000 μ g/ml?！?CTAB溶解時間0. 5小時至Ij 14小時?！?CTAB溶解時溫度室溫和4攝氏度。選擇以上5個溶解條件的目的是研究它們對血凝素回收率、全蛋白回收率、DNA回收率和神經(jīng)氨酸苷酶的影響。借助試驗設(shè)計軟件對上述5個溶解條件和血凝素回收率和全蛋白回收率進(jìn)行數(shù)學(xué)建模，目的是用較少的試驗數(shù)據(jù)有效模擬和評估上述溶解條件在單一和多重互作下對回收率的影響。所述的溶解條件和回收率的矩陣由32組試驗組成，即5個溶解條件的14種可選值和未知的血凝素回收率和全蛋白回收率。根據(jù)32組試驗數(shù)據(jù)計算出相應(yīng)血凝素回收率和全蛋白回收率并輸入到矩陣中，通過模型模擬5個溶解條件對回收率的影響并評估和鑒別對回收率有重要影響的溶解條件。矩陣中5個溶解條件的具體數(shù)值和試驗組數(shù)量可見表I。表lA/California/7/2009/X_179A型流感病毒溶解條件的可選值和對應(yīng)的試驗
組數(shù)量。
權(quán)利要求
1.一種源自哺乳動物體細(xì)胞培養(yǎng)的病毒性疫苗的純化方法，所述方法包括如下步驟將源自上游的病毒收獲液進(jìn)行濃縮和溶解處理使病毒收獲液的成分呈現(xiàn)溶解部分和非溶解部分，再將兩部分分離并保留病毒收獲液中的溶解部分，然后對其中的溶解劑進(jìn)行吸附去除處理，獲得形態(tài)較為統(tǒng)ー的抗原溶解液，用層析法純化溶解液中的抗原成分以獲取較高抗原純度和其回收率的抗原收獲液，然后對抗原收獲液進(jìn)行滅活處理。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述濃縮通過低速離心和超濾法和/或澄清過濾進(jìn)行。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述溶解處理通過加入至少ー種溶解劑進(jìn)行。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于，所述溶解處理通過加入選自如下的溶解劑進(jìn)行陽離子溶解劑、無離子溶解劑和雙離子溶解劑。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述將兩部分分離的方法通過高速離心進(jìn)行，吸取上清液，即為病毒收獲液中的溶解部分。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述溶解部分含有病毒抗原和少量的雜質(zhì)，非溶解部分含有大量雜質(zhì)和極少的病毒抗原或者不含有病毒抗原。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述吸附去除處理通過加入和過濾吸附劑。
8.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述層析法通過選自如下的純化方法進(jìn)行離子交換層析法、親疏水性層析法、親合層析法、液相-液相層析法和分子篩層析法。
9.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述滅活處理通過加入甲醛或者丙內(nèi)酯進(jìn)行。
10.如權(quán)利要求1-9中任一項所述的方法，其中所述較高抗原純度和其回收率通過鑒別和優(yōu)化純化步驟中對抗原純度和回收率有重要影響的參數(shù)進(jìn)行。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述有重要影響的參數(shù)包括濃縮步驟里的截流分子量、濃縮倍數(shù)和濾膜表面積；溶解步驟里的溶解劑濃度、溶解時間、溶解時溫度和病毒收獲液濃縮倍數(shù)；層析步驟里的緩沖劑鹽濃度、洗脫液鹽濃度、PH值和上柱抗原量。
12.如權(quán)利要求10和11所述的方法，其中所述鑒別和優(yōu)化的方法還包括對多個參數(shù)和抗原純度和抗原回收率通過軟件進(jìn)行建模，依據(jù)試驗數(shù)據(jù)模擬評估參數(shù)在単一或者多重互作下對抗原純度和回收率的影響。
13.如權(quán)利要求10-12中任一項所述的方法，所述的方法還包括構(gòu)建趨勢圖來量化多個參數(shù)在単一或者多重互作下對抗原純度和回收率的影響。
14.如權(quán)利要求1-13中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物體細(xì)胞選自MDCK狗腎細(xì)胞和Veix)猴腎細(xì)胞。
15.如權(quán)利要求1-14中任一項所述的方法，其中所述病毒性疫苗來自RNA病毒。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述RNA病毒是源自季節(jié)性、大流行前或大流行的流感病毒。
17.如權(quán)利要求1-16中任一項所述的方法，其中所述病毒抗原來自流感病毒，即血凝素蛋白和/或神經(jīng)氨酸苷酶和/或離子通道M2蛋白。
18.如權(quán)利要求1-17中任一項所述的方法，其中所述抗原回收率是血凝素回收率抗原純度包括全蛋白含量、DNA含量、牛血清白蛋白對血凝素的比率。
19.如權(quán)利要求1-18中任一項所述的方法，所述方法還包括將鹽或鹽溶液加入所述病毒收獲液中。
20.如權(quán)利要求1-19中任一項所述的方法，所述方法還包括對病毒收獲液或溶解液的滅活處理。
全文摘要
本發(fā)明為一種源自哺乳動物體細(xì)胞的病毒類疫苗的純化方法，將源自上游的病毒收獲液進(jìn)行濃縮、溶解和分離等處理，獲得形態(tài)較為統(tǒng)一的含抗原成分的溶解液，再對溶解的病毒抗原進(jìn)行層析純化處理，工藝中還包括滅活處理。這種純化工藝可以獲得較高的抗原回收率的同時，也可以獲得較高的抗原純度以降低疫苗對人體的副作用。
文檔編號A61K39/12GK102690334SQ20111006665
公開日2012年9月26日 申請日期2011年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月21日
發(fā)明者王一丁 申請人:王一丁