專利名稱：一種靶向lin28基因的干擾小分子rna及其抗膠質(zhì)瘤增殖的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種靶向LIN^基因的干擾小分子RNA及其抗膠質(zhì)瘤增殖的用途。
背景技術(shù)：
LiM8最早在線蟲中發(fā)現(xiàn)控制發(fā)育時(shí)段的異?；颉４罅康难芯勘砻?，LiM8和 Lin28B在發(fā)育和疾病領(lǐng)域有廣泛而重要的作用。在人類纖維母細(xì)胞被誘導(dǎo)為多功能干細(xì)胞的過程中，LiM8是四個(gè)關(guān)聯(lián)誘導(dǎo)因子之一，在誘導(dǎo)分化過程發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn) Lin28和Lin28B的表達(dá)在多種癌中激活，他們的過表達(dá)常誘導(dǎo)細(xì)胞形狀的改變。已有研究揭示在胚胎細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞再分化、發(fā)育和癌癥的探索過程中LiM8都具有重要的生物學(xué)作用。LiM8基因?qū)δ[瘤細(xì)胞的增殖方面的研究，在國內(nèi)外尚未見諸報(bào)道。腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的原發(fā)性腦腫瘤，起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。由于惡性腦膠質(zhì)瘤具有生長(zhǎng)迅速，侵襲性強(qiáng)，手術(shù)后容易復(fù)發(fā)，病死率高等的特點(diǎn)，盡管包括手術(shù)切除術(shù)，放療以及化療在內(nèi)的腦膠質(zhì)瘤綜合治療水平在不斷提高，但其總體療效仍不理想。患上多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(WHO IV級(jí))的病人的平均存活時(shí)間僅僅為12-15個(gè)月，而患上間變性星形細(xì)胞瘤(WHO III級(jí))的病人的平均存活時(shí)間為2-5年。因此，尋找有效的腦膠質(zhì)瘤治療方法仍是神經(jīng)外科領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)。LI擬8是一種高度保守的RNA結(jié)合蛋白 (RBP)，在線蟲和高等物種中有著復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制和表達(dá)方式，對(duì)微小RNA表達(dá)的調(diào)節(jié)、骨髂肌及心肌分化、腫瘤形成、多潛能誘導(dǎo)等多種發(fā)育的重要事件中起關(guān)鍵作用。近年來，多項(xiàng)研究顯示，LIN28在多種腫瘤中起到關(guān)鍵的作用，并且有研究認(rèn)為L(zhǎng)I擬8可能是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育的重要的原癌基因。RNA干擾(RNA interference,RNAi)是指由雙鏈RNA介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)與其序列同源的mRNA發(fā)生特異性降解，從而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象，這是一種轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種靶向LIN^基因干擾小分子RNA。本發(fā)明的目的之二在于提供該干擾小分子RNA的制備方法。本發(fā)明的目的之三在于提供該干擾小分子RNA的應(yīng)用。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種用于抗膠質(zhì)瘤增殖的干擾小分子RNA，其特征在于該基因?yàn)镾EQ NO. 1所示的堿基序列。一種制備上述的用于抗膠質(zhì)瘤增殖的干擾小分子RNA的方法，其特征在于該方法的具體步驟為根據(jù)MAGic載體設(shè)計(jì)的具體要求，設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)于LiM8基因388-406位，即 GGT GAG ACA TGG AAT CCA T的shRNA的寡核苷酸序列，各為58bp，送華大基因研究中心進(jìn)行合成；所述的shRNA的寡核苷酸序列為SEQ NO. 1
Sense: 5' -CCG GGG TGA GAC ATG GAA TCC ATT TCA AGA GA ATG GAT TCC ATG TCT CAC CTT TTT TG-3'
Anti-sense: 5，-MT TCA MA MG GTG AGA CAT GGA ATC CAT TCT CTT GAA ATG GAT TCC ATG TCT CAC C-3'；
根據(jù)MAGic載體設(shè)計(jì)的具體要求，將設(shè)計(jì)的shRNA的寡核苷酸序列引物和MAGic質(zhì)粒進(jìn)行連接，得到用于抗膠質(zhì)瘤增殖的干擾小分子RNA。一種上述的用于抗膠質(zhì)瘤增殖的干擾小分子RNA在制備抗膠質(zhì)瘤增殖的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明設(shè)計(jì)對(duì)抗膠質(zhì)瘤增殖有關(guān)聯(lián)的基因的RNAi，并應(yīng)用膠質(zhì)瘤細(xì)胞模型研究其對(duì)抗膠質(zhì)瘤增殖的用，為RNAi在膠質(zhì)瘤的治療應(yīng)用提供了一種新方法。


圖1為shRNA的寡核苷酸序列引物和Pmm^質(zhì)粒的連接圖。圖2 Lin28下調(diào)抑制了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖；感染LiM8干擾病毒3天為dayl，圖中U251-pLVT148為L(zhǎng)iM8干擾病毒。
具體實(shí)施例方式
一、膠質(zhì)瘤細(xì)胞的培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251細(xì)胞系培養(yǎng)于37°C，5%C02恒溫培養(yǎng)箱。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰酶消化脫壁，之后加入適量培養(yǎng)液并反復(fù)吹打以混勻細(xì)胞；將得到的細(xì)胞懸液移入15ml離心管中，1500rpm離心!Bmin ；去上清；用5ml無菌1 XPBS將細(xì)胞懸起，吹打混勻；加約Iml細(xì)胞懸液于裝有5ml新鮮培養(yǎng)基的新培養(yǎng)瓶中，放入37°C，5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，約2天左右傳代1次(主要查看細(xì)胞有無鋪滿培養(yǎng)瓶)。二、人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的分離取人腦膠質(zhì)瘤手術(shù)標(biāo)本，浸入4°C的KRBB溶液 (Krebs-Ringer碳酸氫鹽緩沖液)中.清洗二次，然后將標(biāo)本剪成小塊，轉(zhuǎn)移至盛有5mL 消化酶液的三角瓶中，于恒溫?fù)u床中37 °C保溫，搖床轉(zhuǎn)速lOOr/min，每IOmin玻璃管反復(fù)吹打一次，放置30min。將該懸液離心500-1000rpm，5min,最后剩下為膠質(zhì)瘤細(xì)胞. 用細(xì)胞培養(yǎng)液懸起沉淀，在黑背景的顯微鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)到呈圓形的膠質(zhì)瘤細(xì)胞。三、LIN28-RNAi質(zhì)粒的設(shè)計(jì)和感染 1. LIN28-RNAi質(zhì)粒的設(shè)計(jì)
根據(jù)MAGic載體設(shè)計(jì)的具體要求，設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)于LI擬8基因388-406位，即GGT GAG ACA TGG AAT CCA T的shRNA的寡核苷酸序列，各為58bp，送華大基因研究中心進(jìn)行合成； 所述的shRNA的寡核苷酸序列序列為 SEQ NO. 1
Sense: 5' -CCG GGG TGA GAC ATG GAA TCC ATT TCA AGA GA ATG GAT TCC ATG TCT CAC CTT TTT TG-3'
Anti-sense: 5，-MT TCA MA MG GTG AGA CAT GGA ATC CAT TCT CTT GM ATG GAT TCC ATG TCT CAC C-3'；
根據(jù)MAGic中載體設(shè)計(jì)的具體要求，將設(shè)計(jì)的LIN28 -RNAi的干擾片段和MAGic質(zhì)粒連接，參見圖1，然后感染進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞。圖1為MAGic質(zhì)粒原理的圖解，使用基于RNA的CMV啟動(dòng)子和優(yōu)化的終止子，從而在靶細(xì)胞內(nèi)可以精確地形成小分子干擾RNA(shRNA)。shRNA 的表達(dá)質(zhì)粒是一個(gè)預(yù)切好的備用載體。通過質(zhì)粒上攜帶的篩選標(biāo)記，進(jìn)行哺乳動(dòng)物細(xì)胞的共轉(zhuǎn)染，可建立shRNA表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系。通過兩個(gè)MAGic的質(zhì)粒各自與正義的DNA插入片段及反義的DNA插入片段相連接，便可介導(dǎo)shRNA的產(chǎn)生?；蛘邌蝹€(gè)質(zhì)粒與一個(gè)具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA插入片段相連接，也可介導(dǎo)shRNA的產(chǎn)生。無論哪種方法，首先必須合成兩段互補(bǔ)的DNA片段。而CMV啟動(dòng)子則控制著shRNA的生成(參附圖1)。對(duì)于需要進(jìn)行干擾的目的基因，選擇一段靶序列為A2GN17C的DNA片段(靶序列的正義序列)，其GC含量接近 30-50% ο2. LI擬8-RNAi質(zhì)粒的感染
感染前一天，用0. 25%trpsin消化IOcm培養(yǎng)皿中匯合率達(dá)到85%左右的U373-MG細(xì)胞lmin，然后吹打制備單細(xì)胞懸液，使細(xì)胞懸液終密度達(dá)到3X IO5 cells/ml細(xì)胞。用該細(xì)胞懸液鋪M孔板；每孔鋪500ul，細(xì)胞貼壁24h后，用pLVT148病毒以M0I=20的濃度感染 U373-MG細(xì)胞。感染24h對(duì)U373-MG細(xì)胞進(jìn)行換液操作，并以每孔hlO3 cells/well的密度將U373-MG細(xì)胞傳代到5塊96孔板中，從3rfd開始檢測(cè)細(xì)胞增殖的變化，如圖2。四、實(shí)驗(yàn)分組與檢測(cè)指標(biāo)
正常對(duì)照組膠質(zhì)瘤細(xì)胞，培養(yǎng)液為膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)液；
RNAi組感染過LIN28-RNAi的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，培養(yǎng)液為膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)液。膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的檢測(cè)將感染后的各組細(xì)胞懸液置于37 5% C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5d后，以每孔hlO3 cells/well的密度將U251細(xì)胞鋪到5塊96孔板中，從6thd 開始采用MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)U251細(xì)胞增殖的變化。如圖2。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
感染過LIN28-RNAi干擾質(zhì)粒的膠質(zhì)瘤的細(xì)胞增殖從第三天開始生長(zhǎng)趨勢(shì)和對(duì)照相比呈現(xiàn)抑制趨勢(shì)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過RNAi技術(shù)下調(diào)膠質(zhì)瘤中的LI擬8表達(dá)抑制了膠質(zhì)瘤的增殖。
權(quán)利要求
1.一種靶向LIN^基因的干擾小分子RNA及其抗膠質(zhì)瘤增殖的用途，其特征在于該基因?yàn)镾EQ NO. 1所示的堿基序列。
2.一種制備根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于抗膠質(zhì)瘤遷移的干擾小分子RNA的方法，其特征在于該方法的具體步驟為根據(jù)MAGic載體設(shè)計(jì)的具體要求，設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)于LIN^基因 388-406位，即GGT GAG ACA TGG AAT CCA T的shRNA的寡核苷酸序列，各為58bp，送華大基因研究中心進(jìn)行合成；所述的shRNA的寡核苷酸序列序列為SEQ NO. 1: Sense: 5'-CCG GGG TGA GAC ATG GAA TCC ATT TCA AGA GA ATG GAT TCC ATG TCT CAC CTT TTT TG-3'Anti-sense: 5，-MT TCA MA MG GTG AGA CAT GGA ATC CAT TCT CTT GM ATG GAT TCC ATG TCT CAC C-3'；依據(jù)pMAGic載體設(shè)計(jì)的要求，將設(shè)計(jì)的shRNA序列和MAGic質(zhì)粒進(jìn)行連接，得到用于抗膠質(zhì)瘤遷移的干擾小分子RNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于抗膠質(zhì)瘤增殖的干擾小分子RNA及其在制取抗膠質(zhì)瘤增殖藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種靶向LIN28基因干擾小分子RNA及其抗膠質(zhì)瘤遷移的用途。該干擾小分子RNA為SEQNO.1所示的堿基序列。本發(fā)明設(shè)計(jì)對(duì)抑制膠質(zhì)瘤增殖有作用的基因的干擾小分子RNA，應(yīng)用膠質(zhì)瘤細(xì)胞模型研究其對(duì)膠質(zhì)瘤增殖的抑制作用，為膠質(zhì)瘤的基因治療提供了一種新方法。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102181445SQ20111006744
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月21日
發(fā)明者夏清梅, 殷珊, 潘謳東, 車麗花, 陳國澤, 黃紅軍 申請(qǐng)人:上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司