專利名稱：Pdk3基因及其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因治療技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種TOK3基因及其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝癌的治療在過去20年里取得了很大的進(jìn)展，出現(xiàn)了一些局部非手術(shù)治療方案。例如，經(jīng)導(dǎo)管動脈內(nèi)化療栓塞(TACE)，是中晚期肝癌治療的重要手段，可使90%以上的肝癌患者受益；經(jīng)皮肝穿刺瘤內(nèi)無水乙醇治療(PEI)，也是常用的局部化療方法，對癌直徑小于3厘米的肝癌及門靜脈癌栓有一定療效。但是，由于目前肝癌的化療藥物基本沿用其他腫瘤的治療藥物，針對性較差，因此，總體療效不佳，迫切需要尋找新的作用靶點(diǎn)，研究和開發(fā)肝癌特異的新藥物，以提高化療的特異性和有效性。 蛋白激酶是由人類基因組中最大的一類基因所編碼的，其作用是通過將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至底物蛋白上，來調(diào)控各種蛋白的活性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及細(xì)胞生物學(xué)過程。目前已知的原癌基因中，大約有55%編碼蛋白激酶，其余的多數(shù)編碼可激活蛋白質(zhì)激酶或被激酶磷酸化的特異蛋白。制藥公司已認(rèn)識到了蛋白激酶抑制劑的重要性，正在積極研發(fā)新的蛋白激酶抑制劑，用于治療包括腫瘤在內(nèi)的各種疾病。丙酮酸鹽脫氫酶(TOH)復(fù)合物是一種細(xì)胞核內(nèi)編碼的線粒體多酶復(fù)合物，催化丙酮酸鹽完全轉(zhuǎn)化為acetyl-CoA and C0(2)，它提供了糖酵解與三羧酸循環(huán)之間的關(guān)鍵聯(lián)系，因此也是負(fù)責(zé)調(diào)控葡萄糖代謝的主要酶之一。PDH的酶活性受到磷酸化/去磷酸化的調(diào)控，磷酸化導(dǎo)致PDH的失活。PDK3(丙酮酸脫氫酶激酶，同工酶3)基因編碼的蛋白是三種丙酮酸鹽脫氫酶激酶之一，通過El alpha亞基的磷酸化抑制PDH復(fù)合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一種TOK3基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供三對TOK3基因的siRNAs，用于制備治療肝癌的藥物。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種TOK3基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。所述治療肝癌的藥物包括通過RNA干擾抑制TOK3基因表達(dá)的雙鏈核糖核酸(包括該雙鏈核糖核酸的不同修飾狀態(tài)及不同遞送方式)、DNA載體、腺病毒或腺相關(guān)病毒載體；能夠特異性抑制TOK3基因激酶活性的化合物、多肽或單克隆抗體。在本發(fā)明的另一方面，提供了三對用于制備治療肝癌藥物的TOK3基因的siRNAs，其中，第一對siRNA的正義鏈具有如SEQ ID NO 1所示的序列，反義鏈具有如SEQ ID NO 2所示的序列；第二對siRNA的正義鏈具有如SEQ ID NO 3所示的序列，反義鏈具有如SEQID NO :4所示的序列；第三對siRNA的正義鏈具有如SEQ ID NO :5所示的序列，反義鏈具有如SEQ ID NO 6所示的序列。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)證實(shí)，通過TOK3基因序列特異性siRNA干擾可以顯著抑制肝癌細(xì)胞的生長，因此，PDK3基因可作為肝癌治療藥物的靶基因，為肝癌的防治提供新的途徑。


圖I是實(shí)施例I的RNAi篩選步驟示意圖；圖2是實(shí)施例I的RNAi篩選數(shù)據(jù)處理過程圖；圖3是實(shí)施例I中，激酶siRNAs庫對四株肝癌細(xì)胞H印3B、Huh-7, MHCC-97H、MHCC-97L生長活性影響分布圖；圖4是實(shí)施例I中，通過對四株肝癌細(xì)胞H印3B、Huh-7、MHCC-97H、MHCC-97L分別確定5%可信區(qū)間和10%分析區(qū)間，獲得抑制、促進(jìn)細(xì)胞生長的siRNAs及對應(yīng)的激酶基因 的結(jié)果圖；圖5是實(shí)施例I中四株肝癌細(xì)胞H印3B、Huh-7、MHCC-97H、MHCC-97L全激酶組范圍內(nèi)RNAi對細(xì)胞活性影響的統(tǒng)計(jì)圖；圖6是實(shí)施例I的RNAi篩選體系鑒定干擾TOK3基因能夠抑制肝癌細(xì)胞H印3B、Huh-7、MHCC-97H的生長示意圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人,分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(NewYork Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例I全激酶組范圍內(nèi)RNAi篩選肝癌細(xì)胞生長必需激酶基因針對人類基因組上所有激酶及激酶相關(guān)基因的siRNAs庫通過商業(yè)化途徑獲得(Stealth RNAi Human Kinase Collection, Invitrogen, Catalog no. 12938-200)。每套Stealth RNAi Collection 由若干 96 孔板組成。2nmoles 的 Stealth RNAi 溶解在 100 U I的 IX RNA 退火 / 稀釋溶液中(IOmM Tris-HCl，pH 8. 0 ；20mM NaCl ；lmM EDTA, pH 8. 0)，終濃度為20 u Mo使用CellCounting Kit-8 (細(xì)胞活性檢測試劑盒，簡稱CCK-8)測定細(xì)胞活性，實(shí)驗(yàn)步驟如圖I所示，用美國BioTek酶標(biāo)儀測定吸光度，產(chǎn)生原始細(xì)胞活性數(shù)據(jù)，原始數(shù)據(jù)經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化、數(shù)據(jù)校正、Z值評估等步驟，如圖2所示，得到siRNA庫對肝癌細(xì)胞生長影響的數(shù)據(jù)(見圖3 6)。如圖6所示，siRNAs干擾TOK3基因?qū)λ闹旮伟┘?xì)胞生長活性的影響結(jié)果顯示RNA干擾TOK3基因能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞Huh-7、H印3B、MHCC-97H的生長。實(shí)施例2RNA干擾TOK3基因抑制肝癌細(xì)胞生長將構(gòu)建好的質(zhì)粒pSUPER質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞后48小時(shí)后抽提細(xì)胞株RNA，定量PCR鑒定RNA干擾的效果，確認(rèn)質(zhì)粒能夠發(fā)揮RNAi效應(yīng)后，與pcDNA3. I (質(zhì)粒質(zhì)量比5 : I)共轉(zhuǎn)染，將細(xì)胞重新接種于IOcm大盤中培養(yǎng)，同時(shí)培養(yǎng)液中加入新霉素G418進(jìn)行篩選培養(yǎng)4 6周，去除培養(yǎng)液，I XPBS漂洗兩遍，結(jié)晶紫染色后拍照計(jì)數(shù)。
實(shí)施例3免疫檢測I.抗原蛋白獲得從美國基因庫Genebank中獲得人TOK3基因的cDNA序列，通過PCR擴(kuò)增獲得編碼框，插入原核生物或真核生物表達(dá)載體中，表達(dá)TOK3蛋白，并按基因工程表達(dá)產(chǎn)物的純化體系純化蛋白。2.抗體制備可采用以下幾種方法制備抗體(I)細(xì)胞融合法用上述制備的TOK3蛋白免疫動物(包括兔子、山羊等)，獲得脾臟細(xì)胞，再與骨髓瘤細(xì)胞融合，并按常規(guī)單克隆抗體制備技術(shù)制備單克 隆抗體。(2)利用噬菌體表面展示庫，克隆免疫動物的脾臟IgG可變區(qū)并表達(dá)成基因工程單克隆抗體。(3)利用純化的蛋白免疫動物，制備多抗血清。3.檢測(I)用制備的抗體(多抗或單抗)，用組織化學(xué)方法進(jìn)行肝癌的病理檢測，陽性信號為肝癌。(2)取患者血清，用ELISA方法檢測，陽性反應(yīng)為肝癌可疑病人。(3)將TOK3抗體作為蛋白質(zhì)芯片的探針之一，用于多種腫瘤診斷。實(shí)施例4TOK3基因的小干擾核糖核酸(siRNA)針對TOK3基因mRNA序列，設(shè)計(jì)并體外化學(xué)合成三對siRNAs，對應(yīng)的靶序列分別如下sil-正義鏈CCGCAUCUCUUUCCGCAUGCUUAUU(SEQ ID NO: I)；sil-反義鏈AAUAAGCAUGCGGAAAGAGAUGCGG(SEQ ID NO 2)；si2-正義鏈AGAUCUGAAACUGUAUUCCAUGGAA(SEQ ID NO 3)；si2-反義鏈UUCCAUGGAAUACA⑶UUCAGAUCU(SEQ ID NO 4)；si3-正義鏈GCCUGAAGCCGAUGAUUGGAGCAAU(SEQ ID NO 5)；si3-反義鏈AUUGCUCCAAUCAUCGGCUUCAGGC(SEQ ID NO 6)；另外，設(shè)置無關(guān)序列作為陰性對照s i RNA :正義鏈5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’ (SEQ ID NO :7)；反義鏈5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3’ (SEQ ID NO :8)。在96孔板中每孔接種3 X IO3個(gè)Huh_7，H印3B，MHCC_97H和MHCC-97L細(xì)胞(無血清培養(yǎng)液)。待細(xì)胞密度達(dá)到40%左右時(shí)，利用脂質(zhì)體(LipOfectamine2000)轉(zhuǎn)染試劑，分別將上述3種siRNAs按終濃度50nmol/L轉(zhuǎn)染進(jìn)Huh_7、H印3B、MHCC_97H和MHCC-97L細(xì)胞中，4小時(shí)后換成含10%胎牛血清的DMEM。以24小時(shí)為I個(gè)檢測單位，培養(yǎng)7天，每天檢測I次該細(xì)胞密度。每孔待測細(xì)胞液中加IOy L CCK-8，37°C孵育I小時(shí)。利用酶標(biāo)儀在450nm波長下檢測其吸光度，以代表細(xì)胞存活能力，繪制生長曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明特異性干擾TOK3表達(dá)的siRNA能夠抑制肝癌細(xì)胞系Huh-7，H印3B，MHCC-97H的生長，肝癌細(xì)胞的存活率明顯低于對照組的細(xì)胞，說明人TOK3基因的表達(dá)下調(diào)能在一定程度上抑制肝癌細(xì)胞生長。
權(quán)利要求
1.ー種roK3基因及其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用，其特征在于所述roK3基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述治療肝癌的藥物包括通過RNA干擾抑制TOK3基因表達(dá)的雙鏈核糖核酸、DNA載體、腺病毒或腺相關(guān)病毒載體；能夠抑制TOK3蛋白激酶活性的化合物、多肽或單克隆抗體。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述雙鏈核糖核酸，還包括該雙鏈核糖核酸的不同修飾狀態(tài)或不同遞送方式。
4.用于制備治療肝癌藥物的ー對TOK3基因的siRNA，其特征在于該siRNA的正義鏈具有如SEQ ID NO 1所示的序列，反義鏈具有如SEQ ID NO 2所示的序列。
5.用于制備治療肝癌藥物的ー對TOK3基因的siRNA，其特征在于該siRNA的正義鏈具有如SEQ ID NO :3所示的序列，反義鏈具有如SEQ ID NO :4所示的序列。
6.用于制備治療肝癌藥物的ー對TOK3基因的siRNA，其特征在于該siRNA的正義鏈具有如SEQ ID NO :5所示的序列，反義鏈具有如SEQ ID NO :6所示的序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種PDK3基因及其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用，用于制備治療肝癌的藥物。本發(fā)明的PDK3基因及其表達(dá)產(chǎn)物可作為制備治療肝癌藥物的靶基因，為肝癌的治療提供新的途徑。
文檔編號A61K45/00GK102690868SQ20111006992
公開日2012年9月26日 申請日期2011年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月23日
發(fā)明者王群, 鄧慶, 韓澤廣 申請人:上海人類基因組研究中心