專利名稱：調(diào)節(jié)消化道蛋白表達(dá)的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及消化道蛋白的可調(diào)節(jié)產(chǎn)生，更具體地說(shuō)，涉及消化道內(nèi)分泌細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)型生產(chǎn)降低葡萄糖的因子。
背景技術(shù)：
肽和蛋白憑借其構(gòu)象多能性和功能特異性已用于治療許多疾病，包括糖尿病、血友病、癌癥、心血管疾病、感染性疾病和關(guān)節(jié)炎(Russell C. S.& Clarke L.A.Clin Gent 55(6) :389(1999) ；Ryffel B. Biomedenviron Sci 10:65(1997) ；Koths K. Curr Opin Biotechnol 6:681(1995) ；Buckel P. Trends Pharmacol Sci 17:450(1996))。目前，已獲批準(zhǔn)的生物工程藥物超過(guò)2/3是系統(tǒng)性蛋白藥物。隨著近來(lái)功能基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和基因工程領(lǐng)域的發(fā)展，越來(lái)越多的蛋白藥物正在進(jìn)入生物制藥市場(chǎng)。最初，由動(dòng)物組織或人血清純化蛋白藥物?；诘鞍椎乃幬锿ㄟ^(guò)若干發(fā)展階段進(jìn)入了目前的臨床應(yīng)用狀態(tài)。例如，生物制藥廠現(xiàn)在使用基因工程酵母和細(xì)菌生產(chǎn)重組人蛋白(Scopes R. K. BiotechnolAppl Biochem 23:197(1996))。這種開拓性技術(shù)克服了困擾第一代蛋白藥物的健康風(fēng)險(xiǎn)和缺點(diǎn)，并因此改善了蛋白的治療能力。但是，盡管具有這些優(yōu)勢(shì)，蛋白質(zhì)作為治療劑廣泛應(yīng)用仍然受困于難以純化活性形式的重組蛋白和高成本的生產(chǎn)過(guò)程(Berthold W. & Walter J. Biologicals 22:135(1994) ；Scopes R. K. Biotechnol Appl Biochem 23:197(1996))。另外，蛋白藥物進(jìn)入機(jī)體還面臨阻礙。在口服使用時(shí)，蛋白藥物易被胃腸道酶降解(Wang W. J Drug Target 4:195(1996) ；Woodley J. F. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 11 :61 (1994))。已探明的其它蛋白傳遞途徑包括輸液泵(Bremer等，PharmBiotechnol 10 239(1997))、經(jīng)皮傳遞(Burkoth T. L. Crit Rev Ther DrugCarrier Syst 16:331(1999))、 微囊化(Cleland J. L. Pharma BiotechnollO :1 (1997))和吸入(Gonda I. J Pharm Sci 89 940(2000))。目前，用針注射皮下和靜脈給藥是傳遞蛋白治療劑的備選途徑。不幸的是，這種傳遞方式不理想，因?yàn)榈鞍诐舛冉?jīng)常不能保持在治療范圍內(nèi)或者不能提供適宜的傳遞動(dòng)力學(xué)。而且，蛋白藥物有效治療通常需要頻繁地用針注射，可能引起局部反應(yīng)和不適，因此導(dǎo)致患者順應(yīng)性差(Jorgensen J. T. J Pediatr Endocrinol7 :175(1994))。各種因素限制了許多藥物的治療應(yīng)用，并最終妨礙了其商業(yè)化潛力。因此，鑒定新的蛋白治療劑傳遞方法是理所當(dāng)然的。已使用將特異性治療蛋白編碼基因插入到機(jī)體細(xì)胞中的方法解決疾病治療中的前述傳遞問(wèn)題。這種方法稱作基因治療，很有希望成為蛋白傳遞的新方向。采用這種方法可將機(jī)體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為‘生物反應(yīng)器’，生產(chǎn)足夠量的治療蛋白，并因此解除了對(duì)頻繁用針注射的需要。目前，基因治療可以分類為兩個(gè)基本方法(Drew J.& MartinL-A，載于Lemoine N. R.(主編)Understanding Gene Therapy. Springer-Verlag, New York,第 1 章1-10 頁(yè) (1999))。第一種方法叫做體內(nèi)基因治療，是以允許位于活體宿主中的細(xì)胞吸收的形式引入基因。例如，將一種治療基因包裝到病毒(如反轉(zhuǎn)錄病毒、腺伴隨病毒或腺病毒)基因組中。
4然后將含有所述治療基因的重組病毒引入到活體生物中，并使其感染生物體細(xì)胞。通過(guò)此感染過(guò)程，病毒將其含所述治療基因的基因組摻入到宿主細(xì)胞的基因組結(jié)構(gòu)中。結(jié)果，感染細(xì)胞表達(dá)所述治療基因。第二種方法涉及將遺傳物質(zhì)體外轉(zhuǎn)移到取自宿主生物的細(xì)胞。在基因成功摻入到細(xì)胞基因組后，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞植回到宿主中。該基因轉(zhuǎn)移方法叫做活體外基因治療。體內(nèi)和活體外基因治療都向醫(yī)師提供了加入或修飾治愈疾病的特定基因的手段 (Friedmann T.載于Friedmann T(主編)，人類基因治療的發(fā)展，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 第 1 章1_20 頁(yè)(1999))。正研究該技術(shù)對(duì)大范圍疾病的臨床應(yīng)用，所述疾病包括癌癥、心血管疾病、代謝疾病、神經(jīng)退行性疾病、免疫疾病和其它遺傳或后天病(Friedmann T.，載于Friedmarm T (主編)，人類基因治療的發(fā)展， Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor :第 1 章1-20 頁(yè)(1999)； Drew J & Martin L A.,載于Lemoine N. R.(主編)Understanding Gene Therapy. Springer-Verlag,New York，第1章1-10頁(yè)(1999))。在將眾多蛋白編碼基因通過(guò)基因治療方法引入到細(xì)胞中后，已經(jīng)獲得了穩(wěn)定治療濃度的蛋白。但是，對(duì)于某些疾病，需要調(diào)節(jié)性傳遞治療蛋白。例如，用于糖尿病患者的胰島素替代療法實(shí)際上需要在進(jìn)餐時(shí)給予適量胰島素。同樣，可通過(guò)膳食依賴性釋放達(dá)到食欲抑制劑的最佳效用。因此，為傳遞所述治療蛋白，優(yōu)選由信號(hào)或刺激物(如膳食)觸發(fā)的釋放系統(tǒng)。非常適于定時(shí)傳遞的一種特別疾病是糖尿病，該病是一種胰腺β細(xì)胞產(chǎn)生的胰島素缺乏(1型)或不足(2型)引起的消耗性代謝疾病(Unger,R. H.等，Williams Textbook of Endocrinology Saunders，Philadelphia(1998))。β 細(xì)胞是特化的內(nèi)分泌細(xì)胞,生產(chǎn)和儲(chǔ)存胰島素，用于在進(jìn)食后釋放(Miodes等，J. Cell. Biol. 105 145 (1987))，而胰島素是一種促進(jìn)葡萄糖由血液轉(zhuǎn)移至需要葡萄糖組織的激素。糖尿病患者必須經(jīng)常監(jiān)測(cè)血糖水平，許多患者需要每日多次注射胰島素才能生存。然而，這些患者幾乎不能通過(guò)胰島素注射獲得理想的血糖水平(Turner，R. C.等，JAMA 281 :2005(1999))。而且，長(zhǎng)期胰島素水平升高可能產(chǎn)生有害的副作用，例如低血糖休克和機(jī)體胰島素反應(yīng)脫敏。因此，糖尿病患者還會(huì)出現(xiàn)遠(yuǎn)期并發(fā)癥，例如心血管疾病、腎病、失明、神經(jīng)損傷和傷口愈合失調(diào)(UK Prospective Diabetes Study (UKPDS)Group, Lancet 352,837(1998)) 基因治療提供了一種實(shí)現(xiàn)治療肽(例如治療糖尿病的胰島素)生理性傳遞的有前途的方法(Leibowitz, G. & Levinev, F. Diabetes Rev. 7 :124(1999))。代用細(xì)胞表達(dá)摻入的基因，加工和儲(chǔ)存編碼蛋白，并以可調(diào)節(jié)方式分泌胰島素，由此治療糖尿病。通過(guò)將胰島素生產(chǎn)和改變機(jī)體營(yíng)養(yǎng)需求結(jié)合在一起控制血漿胰島素水平還減輕了與胰島素注射相關(guān)的副作用。因此，需要控制蛋白質(zhì)釋放，以獲得對(duì)糖尿病和其它人類疾病的有效治療。本發(fā)明滿足了這種需要，并具有相關(guān)優(yōu)勢(shì)。發(fā)明概述本發(fā)明部分基于產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的消化道細(xì)胞，這些細(xì)胞在葡萄糖作用下產(chǎn)生胰島素。 存在于動(dòng)物消化道中的轉(zhuǎn)化葡萄糖反應(yīng)性細(xì)胞能夠分泌生理水平的胰島素，恢復(fù)糖尿病動(dòng)物的正常葡萄糖穩(wěn)態(tài)。因此，消化道內(nèi)分泌細(xì)胞是活體外或體內(nèi)治療性引入蛋白編碼核酸的合適靶位，動(dòng)物在信號(hào)或刺激物(例如營(yíng)養(yǎng)物)作用下產(chǎn)生所述蛋白有利于治療。本發(fā)明因此提供產(chǎn)生粘膜細(xì)胞和包括粘膜細(xì)胞的組合物的方法，所述粘膜細(xì)胞應(yīng)答于營(yíng)養(yǎng)物生產(chǎn)蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，一種方法包括在允許粘膜細(xì)胞轉(zhuǎn)化的條件下使該粘膜細(xì)胞與含表達(dá)控制元件的多核苷酸接觸，該表達(dá)控制元件與蛋白編碼核酸有效連接；并鑒定以營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)方式生產(chǎn)所述蛋白的細(xì)胞轉(zhuǎn)化體，由此獲得應(yīng)答于營(yíng)養(yǎng)物生產(chǎn)蛋白的粘膜細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一種組合物包括分離或培養(yǎng)的生產(chǎn)營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)蛋白的粘膜細(xì)胞，其中包含與所述蛋白編碼核酸有效連接的表達(dá)控制元件的轉(zhuǎn)基因使所述蛋白表達(dá)。本發(fā)明因此還提供治療患病或有患病風(fēng)險(xiǎn)患者的方法，所述疾病可通過(guò)組織生產(chǎn)蛋白治療。在一個(gè)實(shí)施方案中，一種方法包括將一種或多種應(yīng)答于營(yíng)養(yǎng)物生產(chǎn)蛋白的粘膜細(xì)胞以疾病治療有效量植入組織中。代表性的可植入組織包括粘膜組織(例如胃腸道)和非粘膜組織(例如肝臟、胰腺或肌肉)。本發(fā)明包括的粘膜細(xì)胞包括營(yíng)養(yǎng)反應(yīng)性細(xì)胞，所述細(xì)胞增加所述蛋白的表達(dá)(例如通過(guò)營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)表達(dá)控制元件)或分泌(例如在信號(hào)或刺激物(即“促分泌素”)作用下分泌合成蛋白。營(yíng)養(yǎng)物包括天然和非天然的可攝食化合物，例如糖、脂肪、碳水化合物或淀粉、氨基酸或多肽、甘油三酯、維生素、礦物質(zhì)或纖維素。營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)元件包括消化道內(nèi)分泌啟動(dòng)子， 例如葡萄糖依賴性促胰島素多肽(GIP)啟動(dòng)子。營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)元件包括其功能變異體(例如點(diǎn)突變)或全長(zhǎng)調(diào)節(jié)元件的功能亞序列(缺失序列)。與蛋白編碼核酸有效連接的表達(dá)控制元件還可包括一種載體(例如病毒載體)。本發(fā)明包括的粘膜細(xì)胞得自患者例如哺乳動(dòng)物(例如人)、胃腸道組織或器官或衍生自消化道來(lái)源的培養(yǎng)細(xì)胞系?？色@得粘膜細(xì)胞的代表性組織包括胃腸道、大腸或小腸 (空腸、十二指腸)、胃、食道、口頰或口腔組織。粘膜細(xì)胞還包括那些可以或適于在粘膜部位(mucosum)中生長(zhǎng)的細(xì)胞，即便時(shí)間很短。粘膜細(xì)胞色括內(nèi)分泌細(xì)胞或非內(nèi)分泌細(xì)胞、K 細(xì)胞、干細(xì)胞、L細(xì)胞、S細(xì)胞、G細(xì)胞、I細(xì)胞、Mo細(xì)胞、Gr細(xì)胞和腸內(nèi)分泌細(xì)胞。本發(fā)明組合物和方法包括治療性蛋白，如胰島素、瘦素、GLP-U GLP-2、縮膽囊素、 胰高血糖素拮抗劑、(ihre 1 in、生長(zhǎng)激素、凝血因子或抗體。本發(fā)明因此還提供治療患病或有患病風(fēng)險(xiǎn)的患者的方法，所述疾病可通過(guò)在粘膜組織生產(chǎn)治療性蛋白治療。在一個(gè)實(shí)施方案中，一種方法包括將已用多核苷酸(例如與所述治療性蛋白編碼核酸有效連接的表達(dá)控制元件)轉(zhuǎn)化的患者粘膜細(xì)胞與誘導(dǎo)產(chǎn)生疾病治療有效量蛋白的營(yíng)養(yǎng)物接觸。本發(fā)明方法和組合物可治療的疾病包括高血糖病(例如胰島素依賴性和非依賴性糖尿病或空腹血糖水平超過(guò)110mg/dl)、肥胖或體重過(guò)重。本發(fā)明因此還提供動(dòng)物遺傳模型。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種在粘膜組織產(chǎn)生治療性蛋白(例如胰島素)的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。一方面，由粘膜組織中存在的轉(zhuǎn)基因使天生無(wú)此能力的動(dòng)物粘膜組織生產(chǎn)治療性蛋白，所述轉(zhuǎn)基因包括含與所述蛋白編碼核酸有效連接的表達(dá)控制元件的多核苷酸，其中動(dòng)物粘膜組織應(yīng)答于營(yíng)養(yǎng)物生產(chǎn)所述蛋白。一方面， 所述蛋白包括胰島素。因此，可使轉(zhuǎn)基因動(dòng)物不易產(chǎn)生高血糖病。因此，可使患高血糖病或具有患高血糖病風(fēng)險(xiǎn)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物葡萄糖減少或不大可能出現(xiàn)高血糖。另一方面，所述動(dòng)物為小鼠(例如糖尿病或高血糖或肥胖小鼠)。再另一方面，賦予表達(dá)能力的表達(dá)控制元件包括營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)元件、其功能變異體或其功能亞序列。再另一方面，所述表達(dá)控制元件包括葡萄糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如葡萄糖依賴性促胰島素多肽(GIP)啟動(dòng)子?？墒顾鰟?dòng)物的胃腸道、腸道、胃表達(dá)蛋白。可分離應(yīng)答于營(yíng)養(yǎng)物生產(chǎn)胰島素的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的細(xì)胞和組織。表達(dá)蛋白并還可以分離的細(xì)胞包括K細(xì)胞、干細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞或非內(nèi)分泌細(xì)胞。下文的附圖和說(shuō)明描述了本發(fā)明一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案的細(xì)節(jié)。由說(shuō)明書和附圖以及權(quán)利要求可清楚看出本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)勢(shì)。


圖1顯示在腫瘤衍生的腸內(nèi)分泌細(xì)胞STC-I中由GIP啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的綠色熒光蛋白 (GFP)表達(dá)。左圖顯示樣品的亮光視野細(xì)胞。右圖借助于可鑒定GFP表達(dá)細(xì)胞的熒光觀察同一視野。選擇熒光細(xì)胞簇并培養(yǎng)擴(kuò)增，以產(chǎn)生K細(xì)胞系GTC-1。圖2是STC-I和GTC-I細(xì)胞的GIP mRNA代表性RNA印跡分析，顯示GTC-I是高度富集的生產(chǎn)GIP的K細(xì)胞。圖3是構(gòu)建用于表達(dá)人胰島素的K細(xì)胞的GIP/Ins質(zhì)粒的示意圖。它含有有效連接至GIP啟動(dòng)子(約2. 51Λ的GIP基因5'調(diào)節(jié)序列)的人胰島素基因的基因組序列。3 個(gè)外顯子以實(shí)心框表示(El、2和3)。標(biāo)示了用于RT-PCR檢測(cè)胰島素原mRNA的引物位置。 顯示了 HindIII(H)、PvuII(P)和XhoI (X)位點(diǎn)。標(biāo)明了起始密碼子(ATG)和終止密碼子的位置。圖4顯示腫瘤衍生的K細(xì)胞表達(dá)人胰島素和胰島素原加工酶。上圖顯示人胰島 (H)和用GIP/Ins質(zhì)粒轉(zhuǎn)染(T)或未轉(zhuǎn)染(UT)的GTC-I細(xì)胞的cDNA的RT-PCR分析。用 (+)或不用(_)反轉(zhuǎn)錄酶制備樣品。下圖顯示GTC-I細(xì)胞和β細(xì)胞系(INS-I)表達(dá)的蛋白質(zhì)原轉(zhuǎn)化酶PC1/3和PC2的免疫印跡分析。箭頭表示PC1/3同種型(64和82kD)和PC2同種型(66和75kD)的預(yù)測(cè)產(chǎn)物大小。圖5顯示于培養(yǎng)基中檢測(cè)到的用GIP/Ins構(gòu)建物轉(zhuǎn)染⑴或未轉(zhuǎn)染(UT)的GTC-I 細(xì)胞的人胰島素和C肽水平。胰島素和C肽分別用空心和實(shí)心條柱表示。圖6顯示葡萄糖對(duì)GIP/Ins質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的GTC-I細(xì)胞分泌胰島素的刺激作用。圖7顯示在小鼠十二指腸切片中葡糖激酶(GK，紅色)和GIP(綠色)共表達(dá)。圖8顯示轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的基因組DNA印跡和PCR鑒定。小鼠編號(hào)標(biāo)示于上方。圖9顯示在具有GIP/Ins構(gòu)建物的轉(zhuǎn)基因小鼠中K細(xì)胞定向表達(dá)人胰島素。上圖顯示人胰島、對(duì)照十二指腸(小鼠)和轉(zhuǎn)基因小鼠組織中表達(dá)的人胰島素基因的代表性RNA 印跡分析。下圖顯示人胰島(H)、小鼠胰島(M)和兩種轉(zhuǎn)基因小鼠的十二指腸樣品(D)的 cDNA的RT-PCR分析，該分析使用人或小鼠特異性胰島素原引物。樣品在存在(+)或不存在反轉(zhuǎn)錄酶㈠下制備。0表示無(wú)DNA，而M表示標(biāo)記物。圖10顯示轉(zhuǎn)基因小鼠胃(左圖)和十二指腸(中圖)切片的人胰島素免疫組織化學(xué)染色結(jié)果。箭頭表示人胰島素免疫反應(yīng)細(xì)胞。右圖顯示在與胰島素(INS，綠色)和 GIP(紅色)特異性抗血清共染色后經(jīng)免疫熒光顯微鏡檢查同一動(dòng)物的十二指腸切片。圖IlA顯示膳食調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因小鼠消化道K細(xì)胞產(chǎn)生人胰島素。圖1IB顯示轉(zhuǎn)基因小鼠消化道K細(xì)胞在混合膳食測(cè)試和口服葡萄糖刺激作用下的人胰島素釋放動(dòng)力學(xué)。圖12顯示在口服葡萄糖(1. 5g葡萄糖/kg體重)后正常對(duì)照小鼠、鏈脲霉素(STZ)治療的對(duì)照小鼠和STZ治療的轉(zhuǎn)基因小鼠的血糖濃度變化。圖13是一組顯微照片，顯示對(duì)照和STZ治療的轉(zhuǎn)基因小鼠胰腺切片的小鼠胰島素免疫組織化學(xué)染色。箭頭表示胰島。圖14為大鼠GIP和小鼠嗜鉻粒蛋白A基因啟動(dòng)子區(qū)的核苷酸序列。圖15為小鼠分泌粒蛋白II (登錄號(hào)AF037451)的啟動(dòng)子和外顯子1以及小鼠葡糖激酶基因啟動(dòng)子(登錄號(hào)U93275)的5'部分的核苷酸序列。圖16為小鼠葡糖激酶基因啟動(dòng)子(登錄號(hào)U93275)的3'部分、人腺苷脫氨酶基因啟動(dòng)子區(qū)(登錄號(hào)X02189)的核苷酸序列；以及人前胰島素原的氨基酸序列和60bp的前胰島素原5'區(qū)。圖17為余下的人前胰島素原3'部分和人瘦素基因cDNA的5'部分的核苷酸序列。圖18為余下的人瘦素3'部分的核苷酸序列、人CCK氨基酸和核苷酸序列以及 60bp的大鼠CCK啟動(dòng)子。圖19為余下的大鼠CCK啟動(dòng)子3'部分的核苷酸序列以及人生長(zhǎng)激素的氨基酸和核苷酸序列。圖20為大鼠GIP啟動(dòng)子-1至_1894bp的序列。發(fā)明詳述本發(fā)明部分基于以足以提供治療的水平在動(dòng)物組織定向生產(chǎn)蛋白。更具體地說(shuō)， 本發(fā)明包括在患者胃腸道內(nèi)分泌細(xì)胞定向表達(dá)任意目標(biāo)蛋白以使所述蛋白以調(diào)節(jié)方式釋放到所述患者血流中的方法。可以使用包含表達(dá)控制元件(例如啟動(dòng)子)的遺傳構(gòu)建物，所述表達(dá)控制元件有效連接至治療性蛋白編碼核酸，將基因表達(dá)導(dǎo)向消化道內(nèi)分泌細(xì)胞。當(dāng)將基因構(gòu)建物摻入到內(nèi)分泌細(xì)胞中時(shí)，其以調(diào)節(jié)方式表達(dá)和分泌編碼蛋白。在進(jìn)食一種增加蛋白產(chǎn)生的物質(zhì)(例如營(yíng)養(yǎng)物)時(shí)，表達(dá)目的核酸編碼蛋白的轉(zhuǎn)化內(nèi)分泌細(xì)胞可分泌治療有效量的蛋白至患者血流中。包含有效連接至人胰島素基因的GIP啟動(dòng)子的遺傳構(gòu)建物在小鼠中的傳遞在轉(zhuǎn)基因后代的胃腸道K細(xì)胞中成功定向表達(dá)和分泌人胰島素。而且，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)人胰島素受膳食調(diào)節(jié)。所述細(xì)胞分泌的胰島素量足以保護(hù)轉(zhuǎn)基因小鼠在胰腺細(xì)胞損傷后免得糖尿病。產(chǎn)生的胰島素還足以提供正常的葡萄糖穩(wěn)態(tài)。因此，通過(guò)體內(nèi)或活體外方法 (例如將分泌胰島素的轉(zhuǎn)化細(xì)胞體外移植入動(dòng)物體內(nèi))將編碼治療性蛋白(例如胰島素) 的基因引入動(dòng)物消化道的膳食調(diào)節(jié)性內(nèi)分泌細(xì)胞中，可用于治療通過(guò)生產(chǎn)蛋白可治療的疾病。按照本發(fā)明，提供獲得生產(chǎn)營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)蛋白的粘膜細(xì)胞的方法。本發(fā)明方法包括在允許細(xì)胞轉(zhuǎn)化的條件下使粘膜細(xì)胞與含表達(dá)控制元件的多核苷酸接觸，該表達(dá)控制元件與蛋白編碼核酸有效連接；并鑒定以營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)方式生產(chǎn)所述蛋白的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，粘膜細(xì)胞與多核苷酸體內(nèi)接觸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，粘膜細(xì)胞與多核苷酸體外接觸。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，與多核苷酸體外接觸的粘膜細(xì)胞適于移植入動(dòng)物體內(nèi)。在其它的實(shí)施方案中，所述粘膜細(xì)胞為內(nèi)分泌細(xì)胞(例如K細(xì)胞)或非內(nèi)分泌細(xì)胞。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，所述粘膜細(xì)胞為干細(xì)胞或多能祖細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的核酸表達(dá)構(gòu)建物用來(lái)在胃腸道內(nèi)分泌細(xì)胞中
8定向表達(dá)蛋白。所述構(gòu)建物含有有效連接至目的核酸序列的表達(dá)控制元件。表達(dá)控制元件包括能夠使消化道內(nèi)分泌細(xì)胞定向表達(dá)連接的目的核酸的啟動(dòng)子。可用本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)方法(滲透壓休克(例如磷酸鈣)、電穿孔、病毒載體、囊泡或脂質(zhì)載體(例如脂轉(zhuǎn)染)、 直接微注射等)將構(gòu)建物引入靶細(xì)胞中。細(xì)胞轉(zhuǎn)化通常使用載體。術(shù)語(yǔ)“載體”是指例如質(zhì)粒、病毒(如病毒載體)或其它本領(lǐng)域已知的載體，它們可通過(guò)插入或摻入多核苷酸進(jìn)行遺傳操作(即“克隆載體”)，或可用于轉(zhuǎn)錄或翻譯插入的多核苷酸(即“表達(dá)載體”)。這樣的載體用于引入多核苷酸(包括與核酸有效連接的營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)型表達(dá)控制元件)，并在體外或體內(nèi)于細(xì)胞中表達(dá)轉(zhuǎn)錄的反義或編碼蛋白。載體通常含有至少一個(gè)用于在細(xì)胞中繁殖的復(fù)制起點(diǎn)。載體中存在的控制元件包括促進(jìn)轉(zhuǎn)錄和翻譯的元件，包括本文提出的表達(dá)控制元件(例如營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)型表達(dá)控制元件)。術(shù)語(yǔ)“控制元件”最低限度應(yīng)包括一種或多種其存在可影響組分表達(dá)，并可包括非啟動(dòng)子或增強(qiáng)子的組分或啟動(dòng)子或增強(qiáng)子以外的組分，例如前導(dǎo)序列和融合配偶體序列、用于產(chǎn)生多基因的內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)(IRES)元件或多順?lè)醋有畔?、用于?nèi)含子的保持基因正確讀框以使mRNA按讀框翻譯的剪接信號(hào)、使目的基因轉(zhuǎn)錄物正確聚腺苷酸化的多腺苷酸信號(hào)、終止密碼子等等。載體可以包含選擇標(biāo)記。正如本領(lǐng)域所已知的一樣，“選擇標(biāo)記”或同義詞是指允許選擇含有其的細(xì)胞的基因?！罢x擇”是指一種在接觸正選擇條件時(shí)只有含正選擇標(biāo)記的細(xì)胞才能存活或被標(biāo)記的過(guò)程。例如，藥物抗性是常用的正選擇標(biāo)記，含正選擇標(biāo)記的細(xì)胞在含選擇藥物的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而那些不含所述抗性基因的細(xì)胞將死亡。合適的藥物抗性基因有賦予對(duì)G418抗性的neo基因或賦予對(duì)潮霉素抗性的hygr 基因或賦予對(duì)嘌呤霉素抗性的puro基因等。其它的正選擇標(biāo)記基因包括允許分類或篩選細(xì)胞的基因。這些基因包括熒光蛋白基因、IacZ基因、堿性磷酸酶基因和表面標(biāo)記如CD8寸。本發(fā)明包括的載體可以包含負(fù)選擇標(biāo)記?！柏?fù)選擇”是指一種在接觸合適的殺死含負(fù)選擇標(biāo)記細(xì)胞的負(fù)選擇條件時(shí)殺死含負(fù)選擇標(biāo)記細(xì)胞的過(guò)程。例如，包含單純皰疹病毒-胸苷激酶(HSV-tk)基因的細(xì)胞對(duì)藥物丙氧鳥苷(GANC)敏感。同樣，gpt基因使細(xì)胞對(duì)6-硫代黃嘌呤敏感。本發(fā)明包括的載體基于病毒載體，例如能夠以染色體外因子復(fù)制的猿猴病毒 40(SV40)或牛乳頭瘤病毒(BPV) (Eukaryotic Viral Vector, Cold spring Harbor Laboratory，Gluzman 主編，1982 ；Sarver 等，Mol. Cell. Biol.，1 :486(1981))。病毒載體包括反轉(zhuǎn)錄病毒、腺相關(guān)病毒、腺病毒、呼腸孤病毒、慢病毒、輪狀病毒基因組等，對(duì)其進(jìn)行修飾以引入粘膜細(xì)胞并控制其中的多核苷酸或轉(zhuǎn)基因表達(dá)(Cone等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6349(1984))?！氨磉_(dá)控制元件”包括影響有效連接的核酸表達(dá)的多核苷酸，例如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子。表達(dá)控制元件和啟動(dòng)子包括那些在特定組織或細(xì)胞類型中起作用的元件，本文稱為“組織特異性表達(dá)控制元件/啟動(dòng)子”。組織特異性表達(dá)控制元件通常在特定的細(xì)胞或組織中起作用，因?yàn)樗鼈兛杀惶囟?xì)胞或組織類型獨(dú)有的轉(zhuǎn)錄激活蛋白或其它轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物識(shí)別?！愄貏e的組織特異性啟動(dòng)子為“消化道內(nèi)分泌細(xì)胞特異性啟動(dòng)子”，其驅(qū)動(dòng)有
9效連接的核酸在消化道內(nèi)分泌細(xì)胞中表達(dá)。GIP啟動(dòng)子是消化道內(nèi)分泌細(xì)胞啟動(dòng)子的一個(gè)具體實(shí)例。GIP啟動(dòng)子包括能夠在胃腸道特異性表達(dá)的多調(diào)節(jié)序列(Tseng，C. C.等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 1992 (1993) ；Yeng, C. Μ.等，Mol. Cell. Endocrinol. 154 161(1999))。長(zhǎng)度約2.5Kb (-1至約-2500bp)大小的啟動(dòng)子使胃和十二指腸定向表達(dá)轉(zhuǎn)基因(圖9和10)。較短的GIP啟動(dòng)子(-1至約-1200bp)能使胃表達(dá)轉(zhuǎn)基因，但不能使十二指腸表達(dá)轉(zhuǎn)基因，并且不能使胰腺定向表達(dá)轉(zhuǎn)基因(Yeng，C. Μ.等，Mol. Cell. Endocrinol. 154 :161 (1999))。因此，-1200至_2500bp的調(diào)節(jié)序列對(duì)于腸GIP生產(chǎn)細(xì)胞定向表達(dá)轉(zhuǎn)基因似乎是必需的。GIP啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄元件的特征鑒定顯示有兩個(gè)TATA盒(-27至-23和-115至-111) 和兩個(gè)CCAAT樣盒(-158至-154和-170至-167)、潛在的AP-1和AP-2位點(diǎn)、cAMP效應(yīng)元件(CRE)以及位于推定的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的潛在胰島素效應(yīng)元件(TRE)。還在GIP啟動(dòng)子中鑒定出兩個(gè)推定的GATA結(jié)合基序(-178至-172 (近側(cè)的GATA)的CAGATAC和-190 至-184 (遠(yuǎn)側(cè)的GATA)的CAGATAA)，它們符合保守GATA結(jié)合基序序列(A/T) GATA (A/G)。根據(jù)熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)的評(píng)價(jià)，GIP啟動(dòng)子遠(yuǎn)側(cè)和近側(cè)GATA基序的特異性突變分別導(dǎo)致 GIP 啟動(dòng)子活性降低約 90%和 35% (Boylan 等，J. Biol. Chem. 273 17438 (1997))。但是， 具有兩個(gè)GATA基序突變的GIP啟動(dòng)子與僅有遠(yuǎn)側(cè)GATA基序改變的啟動(dòng)子表現(xiàn)相同。因此，含一個(gè)或多個(gè)前述核苷酸序列的GIP啟動(dòng)子或變異體是可保持有效連接的核酸葡萄糖調(diào)節(jié)性或組織特異性(消化道)表達(dá)的亞序列實(shí)例。這種亞序列和變異體可用于使有效連接的核酸在體外或體內(nèi)葡萄糖調(diào)節(jié)性或細(xì)胞特異性表達(dá)。組織特異性控制元件的另一個(gè)實(shí)例是胰高血糖素原基因啟動(dòng)子。與GIP啟動(dòng)子類似，胰高血糖素原啟動(dòng)子具有能在胃腸道或大腦和胰腺表達(dá)的多控制序列(Lee，Y.C.等， J. Biol. Chem. 267 10705 (1992) ；Gajic 和 Drucker，Endocrinol. 132 1055 (1993))。大鼠胰高血糖素原啟動(dòng)子序列上游的1300bp部分使轉(zhuǎn)基因在大腦和胰腺定向表達(dá)，但不在胃腸道中表達(dá)(Efrat S.等，Neuron 1 :605(1988))。較長(zhǎng)的胰高血糖素原基因啟動(dòng)子(_1 至-2000bp)控制轉(zhuǎn)基因除了在大腦和胰腺表達(dá)之外還在腸中表達(dá)(Lee，Y.C.等，J. Biol. Chem. 267 :10705 (1992)) 0因此，能夠在消化道中表達(dá)的部分出現(xiàn)在位于胰高血糖素原基因上游1300和2000bp之間的700bp的啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)?？捎糜谑鼓康暮怂嵩谙纼?nèi)分泌細(xì)胞中定向表達(dá)的其它組織特異性表達(dá)控制元件列于表1。其中許多也是營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)元件。例如，GIP啟動(dòng)子包括能使有效連接的核酸應(yīng)答于營(yíng)養(yǎng)物表達(dá)的多調(diào)節(jié)序列。該列表無(wú)意列舉出所有可能用于驅(qū)動(dòng)基因在消化道內(nèi)分泌細(xì)胞表達(dá)的表達(dá)控制元件，僅僅是舉例而已。盡管組織特異性表達(dá)控制元件在其它組織中可能有活性，例如消化道特異性表達(dá)控制元件可能在非消化道組織中有活性，但表達(dá)明顯低于在消化道組織中的表達(dá)(例如非消化道組織比消化道組織低6-10倍)。載體向消化道組織的定向傳遞可限制在機(jī)體其它地方(例如在非靶組織)表達(dá)的可能性。因此，本文包括的組織特異性元件不需要具有絕對(duì)的組織表達(dá)特異性。表 1\ 使消化道內(nèi)分泌細(xì)胞定向表達(dá)蛋白的典型啟動(dòng)子和增強(qiáng)子葡糖激酶_________
嗜鉻粒蛋白A和B 縮膽嚢素
葡萄糖依賴性促胰島素肽肢高血糖素原腺苷脫氨酶促胰液素胃泌素
促生長(zhǎng)素抑制素促胃動(dòng)素 Ghrelin其它的表達(dá)控制元件可使表達(dá)以可調(diào)節(jié)方式進(jìn)行，即信號(hào)或刺激物增加或降低有效連接的核酸表達(dá)。在信號(hào)或刺激物作用下增加有效連接的核酸表達(dá)的調(diào)節(jié)元件也叫做 “誘導(dǎo)型元件”(即受信號(hào)例如營(yíng)養(yǎng)物誘導(dǎo))。在信號(hào)或刺激物作用下降低有效連接的核酸表達(dá)的調(diào)節(jié)元件叫做“抑制型元件”(即信號(hào)降低表達(dá)，使得在信號(hào)去除或不存在時(shí)表達(dá)增加)。通常，所述元件能夠增加或降低的量與存在的信號(hào)或刺激物的量成比例；信號(hào)或刺激物的量越大，表達(dá)的增加或降低就越大。調(diào)節(jié)型表達(dá)控制元件的一個(gè)具體實(shí)例是應(yīng)答于營(yíng)養(yǎng)物或在取消營(yíng)養(yǎng)物時(shí)增加或降低有效連接的核酸表達(dá)的元件，在此情況下該元件叫做“營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)元件”。營(yíng)養(yǎng)誘導(dǎo)型或抑制型元件通常提供基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄(即不存在刺激物或信號(hào)時(shí)的表達(dá)水平)。通常，抑制型元件的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平大于誘導(dǎo)型元件。本文使用的術(shù)語(yǔ)“營(yíng)養(yǎng)物”是指任何可攝入或可消耗的物質(zhì)，例如食物或飲料中存在的物質(zhì)。因?yàn)樵谑澄锘蝻嬃现写嬖谠S多(可能有幾十億種)不同的有機(jī)物和無(wú)機(jī)物，所以本文使用的術(shù)語(yǔ)含義廣闊。營(yíng)養(yǎng)物的特定實(shí)例包括糖(例如葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、甘露糖等)、碳水化合物、淀粉、脂肪(飽和或不飽和脂肪)、脂質(zhì)、脂肪酸、甘油三酯、多肽、氨基酸、纖維素、激素、維生素和礦物質(zhì)。營(yíng)養(yǎng)物還可以調(diào)節(jié)蛋白的翻譯或穩(wěn)定性。因此，“營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)”包括營(yíng)養(yǎng)物調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、 轉(zhuǎn)錄物翻譯為蛋白或蛋白穩(wěn)定性并由此增加或降低轉(zhuǎn)錄物或蛋白的量的各種情況。表達(dá)控制元件可以是“組成型”，使有效連接的核酸在不存在信號(hào)或刺激物的情況下發(fā)生轉(zhuǎn)錄。另外，表達(dá)控制元件還包括能在細(xì)胞周期或分化的特定階段表達(dá)的元件。因此，本發(fā)明還包括能夠組成型、調(diào)節(jié)性(例如營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)性)、組織特異性、細(xì)胞周期特異性和分化期特異性表達(dá)的表達(dá)控制元件。表達(dá)控制元件包括全長(zhǎng)序列(如天然啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件)以及保留全部或部分全長(zhǎng)或非變異體功能(例如保留一定量的營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)性或細(xì)胞特異性表達(dá))的亞序列或多核苷酸變異體。本文使用的術(shù)語(yǔ)“功能”及其各種語(yǔ)法變化在應(yīng)用于核酸或多肽序列、亞序列或片段或核苷酸或氨基酸序列變異體時(shí)，是指該序列具有天然核酸或多肽序列(例如非變
11異體或未修飾的序列)的一種或多種功能。本文使用的術(shù)語(yǔ)“變異體”是指序列(核苷酸或氨基酸)取代(例如點(diǎn)突變)、缺失(內(nèi)部或外部)或添加(例如嵌合多肽)或其它的點(diǎn)突變修飾(例如化學(xué)衍生物，如抗蛋白酶或核酸酶的修飾形式)。通常，氨基酸變異體具有幾個(gè)或若干氨基酸變化(例如1-10、10-20、20-50)，例如一個(gè)或幾個(gè)保守氨基酸取代，或?qū)οＭ儺愺w保留的功能很關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)域之外的非保守氨基酸取代。表達(dá)控制元件，例如營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)元件，還包括功能變異體或亞序列。例如，約2. 5Kb 的葡萄糖調(diào)節(jié)性GIP啟動(dòng)予的亞序列(例如2Kb,1Kb,0. 5Kb,0. 25Kb,0. 20Kb、IOObp或更小)可保留有效連接核酸的葡萄糖調(diào)節(jié)性或組織特異性(消化道或胰腺或大腦)表達(dá)。特性已知的各種啟動(dòng)子的功能結(jié)構(gòu)域可使有效連接核酸的表達(dá)量和表達(dá)模式最佳。本文包括的表達(dá)控制元件可得自細(xì)菌、酵母、植物或動(dòng)物(哺乳動(dòng)物或非哺乳動(dòng)物)，只要其能夠使有效連接核酸的表達(dá)受控。因此，可使用得自任何生物的受物質(zhì)或刺激物(例如營(yíng)養(yǎng)物)誘導(dǎo)的任何表達(dá)控制元件調(diào)節(jié)有效連接核酸在粘膜細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄，并且如本文所述在適當(dāng)時(shí)可用于調(diào)節(jié)所述物質(zhì)或刺激物作用下的編碼蛋白翻譯。營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)型表達(dá)控制元件以例如調(diào)節(jié)涉及糖酵解、脂質(zhì)代謝、碳水化合物代謝和膽固醇(例如類固醇)代謝的酶表達(dá)的啟動(dòng)子形式存在，它們分別受糖、脂肪、碳水化合物和膽固醇調(diào)節(jié)，并適用于本發(fā)明。營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)型控制元件的具體實(shí)例為驅(qū)動(dòng)L-丙酮酸激酶、 乙酰輔酶A羧化酶、spot-14、脂肪酸合酶、磷酸甘油醛脫氫酶、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶、葡萄糖-6-磷酸酶和磷酸果糖激酶表達(dá)的葡萄糖誘導(dǎo)元件(另外參見例如Rutter GA等，News Physiol Sci. 15 149(2000)).營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)型控制元件的另一個(gè)實(shí)例是乙醇脫氫酶基因調(diào)節(jié)元件。營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)型控制元件的再另一個(gè)實(shí)例是維生素D效應(yīng)元件，其能夠在維生素D存在時(shí)表達(dá)。哺乳動(dòng)物金屬硫蛋白基因啟動(dòng)子是金屬誘導(dǎo)的表達(dá)控制元件。同組織特異性控制元件一樣，營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)型控制元件可對(duì)多種營(yíng)養(yǎng)物起反應(yīng)。例如，葡萄糖誘導(dǎo)元件還可以對(duì)乳糖起反應(yīng)。因此，一種特定的營(yíng)養(yǎng)物(例如葡萄糖)并未排除其它營(yíng)養(yǎng)物，因?yàn)槠渌鼱I(yíng)養(yǎng)物可在較低程度上調(diào)節(jié)所述控制元件的活性(增加或降低)。細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)型表達(dá)控制元件的實(shí)例是受半乳糖苷誘導(dǎo)的Iac阻抑蛋白。酵母營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)型表達(dá)控制元件的實(shí)例是存在于GALl和GALlO基因中的gal啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子具有半乳糖誘導(dǎo)型表達(dá)能力。這些元件可有效連接至核酸并導(dǎo)入粘膜細(xì)胞中，以便營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)性生產(chǎn)編碼蛋白。所包括的其它表達(dá)控制元件為對(duì)非營(yíng)養(yǎng)物起反應(yīng)的元件。具體的實(shí)例是具口服活性但通常食物中沒有的化學(xué)物質(zhì)或藥物。非營(yíng)養(yǎng)性藥物或化學(xué)物質(zhì)在攝入時(shí)刺激有效連接至非營(yíng)養(yǎng)型表達(dá)控制元件的核酸表達(dá)。攝入所述化學(xué)物質(zhì)或藥物的具體量控制產(chǎn)生(通過(guò)轉(zhuǎn)錄或分泌)的核酸或蛋白量。例如，當(dāng)藥物誘導(dǎo)型表達(dá)控制元件使胰島素編碼核酸表達(dá)時(shí)，通過(guò)增加藥物消耗量可使消化道中產(chǎn)生的胰島素量增大。這種非營(yíng)養(yǎng)型表達(dá)控制系統(tǒng)的具體實(shí)例可見于例如美國(guó)專利號(hào)5，989，910,5, 935，934,6, 015，709和6，004，941。本文使用的術(shù)語(yǔ)“有效連接”或其各種語(yǔ)法變體是指物理或功能上的所述組分鄰接，使得這些組分可以其希望的方式起作用。在與核酸有效連接的表達(dá)控制元件的實(shí)例中， 這種關(guān)系使所述控制元件調(diào)節(jié)所述核酸的表達(dá)。可在轉(zhuǎn)錄、翻譯、剪接、信使穩(wěn)定性等水平上實(shí)現(xiàn)表達(dá)控制。通常，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的表達(dá)控制元件鄰接在轉(zhuǎn)錄核酸的5'末端附近(即“上游”)。表達(dá)控制元件還可以位于轉(zhuǎn)錄
12序列的3'末端(即“下游”)或轉(zhuǎn)錄物之中(例如在內(nèi)含子中)。表達(dá)控制元件可以位于離轉(zhuǎn)錄序列較遠(yuǎn)的位置(例如距所述核酸100-500、500-1000、2000-5000或更多核苷酸)。 有效連接核酸的表達(dá)至少部分受控于所述元件(例如啟動(dòng)子)，使得所述元件調(diào)節(jié)所述核酸的轉(zhuǎn)錄，合適時(shí)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄物的翻譯。表達(dá)控制元件的一個(gè)具體實(shí)例是啟動(dòng)子，其經(jīng)常位于轉(zhuǎn)錄序列的5'端。表達(dá)控制元件的另一個(gè)實(shí)例是增強(qiáng)子，其可以位于轉(zhuǎn)錄序列的5'、3' 端，也可以位于轉(zhuǎn)錄序列之中。本文使用的術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)生”或“生產(chǎn)”當(dāng)應(yīng)用于粘膜細(xì)胞或組織表達(dá)的蛋白時(shí)，是指粘膜細(xì)胞表達(dá)或分泌蛋白。因此，當(dāng)粘膜細(xì)胞在信號(hào)或刺激物(例如營(yíng)養(yǎng)物)作用下生產(chǎn)蛋白時(shí)，蛋白的表達(dá)和分泌超過(guò)信號(hào)或刺激之前的量。粘膜細(xì)胞或組織生產(chǎn)蛋白可能是由于增加了核酸的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄物的翻譯、轉(zhuǎn)錄物或蛋白的穩(wěn)定性或者編碼蛋白的分泌。通常， 信號(hào)或刺激物(即促分泌素)增加細(xì)胞的蛋白分泌刺激細(xì)胞中已翻譯蛋白釋放。其分泌受控的蛋白通常儲(chǔ)存在內(nèi)分泌細(xì)胞的分泌小泡中。另一方面，信號(hào)或刺激物可增加蛋白編碼核酸的轉(zhuǎn)錄或翻譯以及隨后的翻譯蛋白分泌。因此，在非內(nèi)分泌細(xì)胞的實(shí)例中，信號(hào)或刺激物(例如營(yíng)養(yǎng)物)可通過(guò)營(yíng)養(yǎng)誘導(dǎo)型表達(dá)控制元件刺激蛋白(例如胰島素)編碼核酸的轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞隨后在蛋白翻譯以后分泌編碼蛋白。在內(nèi)分泌細(xì)胞(例如消化道內(nèi)分泌細(xì)胞，如K細(xì)胞、L細(xì)胞等)的實(shí)例中，用于使蛋白表達(dá)的表達(dá)控制元件可以調(diào)節(jié)或者可以不調(diào)節(jié)，但在任一種情況下信號(hào)或刺激物通常將調(diào)節(jié)所述細(xì)胞分泌蛋白。在此情況下，信號(hào)或刺激物起刺激或增加蛋白分泌的促分泌素作用。因此，在內(nèi)分泌細(xì)胞中，無(wú)論表達(dá)是還是不是營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)型(例如組成型啟動(dòng)子)，細(xì)胞生產(chǎn)蛋白都是營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)型，因?yàn)榈鞍椎姆置谑軤I(yíng)養(yǎng)物調(diào)節(jié)。因此，“營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)型”也指營(yíng)養(yǎng)物調(diào)節(jié)細(xì)胞分泌蛋白。與非內(nèi)分泌細(xì)胞通過(guò)增加蛋白編碼核酸轉(zhuǎn)錄以及隨后的分泌生產(chǎn)蛋白相比，內(nèi)分泌細(xì)胞在信號(hào)或刺激物作用下蛋白分泌增加對(duì)信號(hào)或刺激物的反應(yīng)更快。相反，在非內(nèi)分泌細(xì)胞中，信號(hào)或刺激物(如營(yíng)養(yǎng)物)可增加蛋白編碼核酸的轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞隨后分泌翻譯的蛋白而不需要信號(hào)和或刺激物(如營(yíng)養(yǎng)物)。因此，對(duì)于營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)型轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化的非內(nèi)分泌粘膜細(xì)胞，轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄為營(yíng)養(yǎng)誘導(dǎo)型，但分泌不需要營(yíng)養(yǎng)物。核酸可以編碼治療性多肽，如胰島素、胰高血糖素拮抗劑、瘦素、GLP-I或縮膽囊素。例如，在體內(nèi)降低葡萄糖水平、提供正常葡萄糖穩(wěn)態(tài)或減輕與慢性或急性高血糖癥相關(guān)的組織病理學(xué)癥狀方面保留一定能力的全長(zhǎng)胰島素亞序列僅僅是具有其全長(zhǎng)相應(yīng)物一種或多種活性的功能亞序列的一個(gè)實(shí)例。同樣，在抑制食欲或?qū)е麦w重穩(wěn)定或體重減輕、刺激生長(zhǎng)、減少凝血時(shí)間或出血或提供對(duì)外源抗原(例如幽門螺桿菌)的被動(dòng)保護(hù)能力方面保留全部或部分能力的瘦素或CCK或生長(zhǎng)激素、凝血因子或抗體的亞序列或變異體是可在動(dòng)物粘膜組織表達(dá)以提供治療利益的功能序列或變異體的另外的實(shí)例。因此，由“核酸”編碼的“多肽”、“蛋白”和“肽”包括與天然蛋白一樣的全長(zhǎng)天然序列以及功能亞序列、修飾形式或序列變異體，只要所述亞序列、修飾形式或變異體保留一定程度的天然全長(zhǎng)蛋白的功能性。本文使用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”是指已經(jīng)人工引入到細(xì)胞或生物體中的多核苷酸。例如，具有轉(zhuǎn)基因的粘膜細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)基因已通過(guò)遺傳操作或“轉(zhuǎn)化”細(xì)胞導(dǎo)入。轉(zhuǎn)基因?qū)肫渲械募?xì)胞或其子代叫做“轉(zhuǎn)化細(xì)胞”或“轉(zhuǎn)化體”。通常，轉(zhuǎn)基因包含在轉(zhuǎn)化體的子代中，或者成為細(xì)胞所發(fā)育生物的一部分?？蓪⑥D(zhuǎn)基因插入到染色體DNA中，或者作為自主復(fù)制的質(zhì)粒、YAC、小染色體等保持。轉(zhuǎn)基因包括任何轉(zhuǎn)錄為反義RNA或編碼多肽的基因。由轉(zhuǎn)基因編碼的特定多肽包括可檢測(cè)的蛋白，如熒光素酶、半乳糖苷酶、綠色熒光蛋白(用于非侵入性體內(nèi)檢測(cè))、 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶或可檢測(cè)的蛋白(例如可免疫檢測(cè))。例如，可根據(jù)對(duì)細(xì)胞存活或增殖的檢測(cè)(例如在將轉(zhuǎn)化細(xì)胞移植入動(dòng)物粘膜后)，使用可檢測(cè)蛋白評(píng)價(jià)細(xì)胞轉(zhuǎn)化率(例如體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移)、細(xì)胞移植成功率。治療性蛋白包括胰島素，一種用于治療高血糖癥(例如糖尿病)的特定轉(zhuǎn)基因。胰島素是葡萄糖代謝的主要激素調(diào)節(jié)物，促進(jìn)葡萄糖由血液轉(zhuǎn)運(yùn)至關(guān)鍵的代謝器官，如肌肉、 肝臟和脂肪。如實(shí)施例III所顯示，通過(guò)胰島素轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)基因小鼠消化道中產(chǎn)生胰島素預(yù)防小鼠患糖尿病。產(chǎn)生胰島素的量足以恢復(fù)葡萄糖耐受，而胰島素的定時(shí)釋放恢復(fù)了正常的葡萄糖穩(wěn)態(tài)。編碼治療高血糖癥的治療性蛋白的轉(zhuǎn)基因的另一個(gè)實(shí)例是胰高血糖素拮抗劑。胰高血糖素是一種由胰島α-細(xì)胞產(chǎn)生的肽激素，是葡萄糖代謝的主要調(diào)節(jié)物(Unger R. H. & Orci L. N. Eng. J.Med. 304 :1518(1981) ；Unger R. H. Diabetes 25:136(1976))。如同胰島素一樣，血糖濃度介導(dǎo)胰高血糖素分泌。然而，與胰島素相反，胰高血糖素在血糖降低時(shí)分泌。因此，胰高血糖素的循環(huán)濃度在禁食期間最高，而在進(jìn)食期間最低。胰高血糖素水平增加以克制胰島素促進(jìn)葡萄糖儲(chǔ)存，并刺激肝臟釋放葡萄糖至血液中。胰高血糖素拮抗劑的一個(gè)具體實(shí)例是[脫-His1，脫-Phe6，Glu9]胰高血糖素-NH2。在鏈脲霉素糖尿病大鼠中， 血糖水平在靜脈快速濃注(0. 75μ g/g體重)該胰高血糖素拮抗劑的15分鐘內(nèi)下降約37% (Van Tine B. Α.等，Endocrinology 137:3316(1996))。編碼治療高血糖癥或體重過(guò)重(例如肥胖)的治療性蛋白的轉(zhuǎn)基因的另一個(gè)實(shí)例是胰高血糖素樣肽-1 (GLP-I)。GLP-I是一種在進(jìn)食期間由腸L細(xì)胞釋放的激素，它刺激胰腺β -細(xì)胞以增加胰島素分泌。GLP-I具有另外的活性，這種活性使其成為富有吸引力的肥胖和糖尿病治療劑。例如，GLP-I減緩胃排空、抑制食欲、降低胰高血糖素濃度、增加β-細(xì)胞量、刺激胰島素生物合成并以葡萄糖依賴方式分泌，并可能增加組織對(duì)胰島素的敏感性 (Kiefier T. J.，Habener J. F. Endocrin. Rev. 20 :876 (2000))。因此，與進(jìn)食相一致的消化道GLP-I調(diào)節(jié)釋放有利于對(duì)高血糖癥或體重過(guò)重的治療?？苟碾拿窱V (DPP IV)的GLP-1類似物提供較長(zhǎng)期作用和改善的治療能力。因此，可使用本文所述的本發(fā)明，將編碼增加作用持續(xù)時(shí)間的GLP-I類似物的轉(zhuǎn)基因靶向消化道，以提供營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)型產(chǎn)生的GLP-I類似物，用于治療高血糖癥或體重過(guò)重。編碼治療高血糖癥的治療性蛋白的轉(zhuǎn)基因的另一個(gè)實(shí)例是激素抵抗素拮抗劑。抵抗素是一種脂肪細(xì)胞衍生因子，在飲食誘導(dǎo)形式和遺傳形式的肥胖中其表達(dá)提高。中和循環(huán)抵抗素改善了肥胖小鼠的血糖和胰島素作用。相反，給予正常小鼠抵抗素?fù)p害了葡萄糖耐受和胰島素作用(St印pan CM等，Nature 409 :307(2001)) 0因此，在消化道中產(chǎn)生拮抗抵抗素生物作用的蛋白提供了對(duì)肥胖相關(guān)的胰島素抗性和高血糖癥的有效治療。編碼治療體重過(guò)重(例如肥胖)或高血糖癥的治療性蛋白的轉(zhuǎn)基因的再另一個(gè)實(shí)例是瘦素。瘦素盡管主要是由脂肪細(xì)胞產(chǎn)生，但也在胃中以進(jìn)食依賴性方式小量產(chǎn)生。瘦素將有關(guān)脂肪細(xì)胞代謝和體重的信息傳送至大腦的食欲中心，食欲中心發(fā)出減少食物攝取的信號(hào)(促進(jìn)飽脹感)，并增加機(jī)體的能量消耗。每日單次皮下注射瘦素對(duì)人體重減輕僅具有很小的作用，但瘦素治療使嚙齒動(dòng)物脂肪量顯著下降，并且血糖降低(Seufert J.等，Proc Natl Acad Sci USA. 96 :674 (1999))。先前的研究已表明，瘦素在循環(huán)中迅速降解。因此， 以調(diào)節(jié)方式由消化道傳遞可能增強(qiáng)瘦素降低食物攝入和體重以及血糖的臨床作用。編碼治療體重過(guò)重(例如肥胖)或高血糖癥的治療性蛋白的轉(zhuǎn)基因的再另一個(gè)實(shí)例是脂肪細(xì)胞互補(bǔ)相關(guān)蛋白(Acrp30)的C末端球形頭結(jié)構(gòu)域。Acrp30是由分化脂肪細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白。給予小鼠由球形頭結(jié)構(gòu)域組成的Acrp30的蛋白切割產(chǎn)物使體重顯著下降 (Fruebis J.等，Proc. Natl. Acad. ki. USA，98 :2005 (2001))。因此，消化道定向表達(dá)編碼 Acrp30球形結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)基因可促使體重下降。編碼治療體重過(guò)重(例如肥胖)的治療性蛋白的轉(zhuǎn)基因的再另一個(gè)實(shí)例是縮膽囊素(CCK)。CCK是在消化道特定營(yíng)養(yǎng)物作用下由腸分泌的胃腸肽。CCK的釋放與食物消耗量成比例，據(jù)信其向大腦發(fā)射停止進(jìn)食的信號(hào)GchwartZ M.W.等，Nature 404 661-7K2000))。因此，CCK升高可減少進(jìn)食量，并促使體重下降或體重穩(wěn)定(即防止或抑制體重增加)。因此，營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)型CCK傳遞系統(tǒng)可提供用于減少人攝取食物目的的治療作用。編碼治療性蛋白的轉(zhuǎn)基因的另一個(gè)實(shí)例包括治療血友病和其它凝結(jié)/凝血疾病的凝血因子(例如凝血因子VIII、IX或X)、治療生長(zhǎng)疾病或消耗綜合癥的生長(zhǎng)因子(例如生長(zhǎng)激素、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1、血小板衍生生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、酸性和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β等)以及為患者提供抗外源抗原或病原體(例如幽門螺桿菌)的被動(dòng)免疫或保護(hù)或提供對(duì)癌癥、關(guān)節(jié)炎或心血管疾病的治療的抗體(例如人抗體或人源化抗體)。編碼治療性蛋白的其它轉(zhuǎn)基因包括細(xì)胞因子、干擾素(例如干擾素(INF)、 INF-α 2b 禾口 2a、IFN-α Ni、IFN-β lb、IFN-γ)、白介素(例如 IL-I 至 IL-10)、腫瘤壞死因子(TNF-α、TNF-β)、趨化因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、多肽激素、抗生素多肽(例如抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒和/或抗寄生物多肽)、酶(例如腺苷脫氨酶)、促性腺激素、趨化素、脂質(zhì)結(jié)合蛋白、filgastim(Neupogen)、血紅蛋白、促紅細(xì)胞生成素、促胰島素、imigluceras^sarbramostim、組織纖溶酶原激活物(tPA)、尿激酶、鏈激酶、軸突生長(zhǎng)因子(NGF)、苯丙氨酸氨裂解酶、腦衍生軸突因子(BDNF)、軸突生長(zhǎng)因子(NGF)、苯丙氨酸氨裂解酶、血栓形成素(TPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、腺苷脫氨酶、過(guò)氧化氫酶降鈣素、內(nèi)皮素、 L-天冬酰胺胃蛋白酶、尿酸酶胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶彈性蛋白酶、羧肽酶乳糖酶、蔗糖酶內(nèi)在因子、降血鈣素甲狀旁腺激素(PTH)樣激素、可溶性CD4以及抗體和/或其抗原結(jié)合片段(例如 Fab)(例如 orthoclone OKT-e (抗 CD3)、GPIIb/Iia 單克隆抗體)。本文所述轉(zhuǎn)基因特別適用于本發(fā)明，但不限于此。在這方面，熟練技術(shù)人員可容易地預(yù)見到其它轉(zhuǎn)錄為治療性反義RNA或編碼治療性多肽的轉(zhuǎn)基因。靶細(xì)胞包括粘膜細(xì)胞或粘膜部位通常不存在的可以或適于在粘膜部位生長(zhǎng)的細(xì)胞。本文使用的術(shù)語(yǔ)“粘膜”當(dāng)用于表示細(xì)胞時(shí)，是指可以在粘膜生長(zhǎng)的細(xì)胞。粘膜細(xì)胞包括例如通?？梢娪趧?dòng)物粘膜的細(xì)胞，例如消化道(例如嘴(舌頭和頰組織)、食道和胃、小腸和大腸、直腸、肛門)、呼吸道、肺和鼻咽以及其它腔體(例如陰道)的細(xì)胞。因此，粘膜細(xì)胞是指通常存在于前述部位的各種細(xì)胞類型，包括干細(xì)胞或其它分化為各種粘膜細(xì)胞類型的多能細(xì)胞。粘膜細(xì)胞的具體實(shí)例包括內(nèi)分泌細(xì)胞，例如K細(xì)胞、L細(xì)胞、S細(xì)胞、G細(xì)胞、D細(xì)胞、I細(xì)胞、Mo細(xì)胞、Gr細(xì)胞和腸內(nèi)分泌細(xì)胞。通常，內(nèi)分泌細(xì)胞的特征為能夠在信號(hào)或刺激物(“促分泌素”)作用下將合成的蛋白分泌到血液中。非內(nèi)分泌粘膜細(xì)胞包括排列在大多數(shù)粘膜組織外表面的上皮細(xì)胞、粘液細(xì)胞、絨毛細(xì)胞、柱狀細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和Paneth細(xì)胞。通常已知非內(nèi)分泌細(xì)胞在信號(hào)或刺激物作用下不將合成的蛋白分泌到血液中。消化道K細(xì)胞可以起替代細(xì)胞的作用，用于在動(dòng)物中產(chǎn)生適當(dāng)調(diào)節(jié)的生理水平胰島素，這一發(fā)現(xiàn)預(yù)示了一種糖尿病治療方式，使患者免于胰島素注射并降低甚至消除相關(guān)的糖尿病并發(fā)癥。因?yàn)樵谌讼乐锌赡艽嬖跓o(wú)數(shù)K細(xì)胞(Sandst^m 0.，El-Salhy M.， Mech. Ageing Dev. 108 :39 (1999))，所以調(diào)節(jié)這些細(xì)胞中的一部分分泌胰島素可能足以達(dá)到治療作用，包括改善與糖尿病相關(guān)的綜合癥和并發(fā)癥。消化道是機(jī)體最大的內(nèi)分泌器官，能夠產(chǎn)生巨量的蛋白，并含有易于利用分裂細(xì)胞的快速再生組織。靶細(xì)胞如K細(xì)胞和干細(xì)胞，主要位于容易接受非侵入性基因治療技術(shù)的上消化道。因此，非侵入性技術(shù)如口服制劑、內(nèi)窺鏡方法或改良飼管允許利用促進(jìn)轉(zhuǎn)基因整合入宿主基因組的載體。已經(jīng)開發(fā)了傳遞基因至腸道細(xì)胞(包括干細(xì)胞)的載體(Croyle 等，Gene Ther. 5 :645(1998) ；S. J. Henning, Adv. Drug Deliv. Rev. 17 :341 (1997)，美國(guó)專利第5，821,235號(hào)和6，110,456號(hào))。這些載體中有許多已批準(zhǔn)用于人類研究。因此，以可調(diào)節(jié)方式分泌蛋白如胰島素、苗條蛋白、胰高血糖素拮抗劑、GLP-l、GLP-2、(ihrelin、縮膽囊素、生長(zhǎng)激素、凝血因子、抗體等等的消化道細(xì)胞如K細(xì)胞，是治療糖尿病、肥胖、生長(zhǎng)缺陷和其它可通過(guò)在粘膜組織產(chǎn)生蛋白治療的疾病的一種手段。表2顯示了幾種類型的消化道內(nèi)分泌細(xì)胞、在特定營(yíng)養(yǎng)物(“促分泌素”)作用下由所述細(xì)胞分泌的蛋白和典型功能的部分舉例。所述蛋白、內(nèi)分泌細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)物都適用于本發(fā)明。表權(quán)利要求
1.遺傳構(gòu)建物在制備用于治療患有糖尿病或高血糖癥的個(gè)體的藥物中的用途，其中所述遺傳構(gòu)建物包含編碼胰島素的核酸，該核酸的表達(dá)由葡萄糖依賴型促胰島素多肽(GIP) 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其中所述遺傳構(gòu)建物被靶向于由消化道內(nèi)分泌細(xì)胞表達(dá)。
3.如權(quán)利要求1所述的用途，其中所述個(gè)體患有肥胖癥或體重過(guò)重。
4.包含與編碼胰島素的核酸有效連接的葡萄糖依賴型促胰島素多肽(GIP)啟動(dòng)子的多核苷酸在制備用于治療患有高血糖癥或具有患高血糖癥風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的藥物組合物或裝置中的用途，所述多核苷酸用于由葡萄糖、蔗糖、果糖、碳水化合物、多肽、氨基酸或脂肪所誘導(dǎo)的消化道內(nèi)分泌細(xì)胞中胰島素的產(chǎn)生。
5.如權(quán)利要求2或4所述的用途，其中所述消化道內(nèi)分泌細(xì)胞包括以下細(xì)胞中的一種或多種K細(xì)胞、L細(xì)胞、S細(xì)胞、G細(xì)胞、D細(xì)胞、I細(xì)胞、Mo細(xì)胞、Gr細(xì)胞或腸內(nèi)分泌細(xì)胞， 或者分化為K細(xì)胞、L細(xì)胞、S細(xì)胞、G細(xì)胞、D細(xì)胞、I細(xì)胞、Mo細(xì)胞、Gr細(xì)胞或腸內(nèi)分泌細(xì)胞的干細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求4所述的用途，其中所述高血糖癥包括糖尿病。
7.如權(quán)利要求6所述的用途，其中所述糖尿病包括I型糖尿病。
8.如權(quán)利要求6所述的用途，其中所述糖尿病包括胰島素依賴型糖尿病。
9.如權(quán)利要求1或4所述的用途，其中所述個(gè)體的空腹血漿葡萄糖水平高于IlOmg/dl。
10.如權(quán)利要求1或4所述的用途，其中應(yīng)答于營(yíng)養(yǎng)物的消化道內(nèi)分泌細(xì)胞中胰島素的分泌增加。
11.如權(quán)利要求1或4所述的用途，其中所述遺傳構(gòu)建物或多核苷酸包括載體。
12.如權(quán)利要求11所述的用途，其中所述載體包括病毒載體。
13.制備應(yīng)答于營(yíng)養(yǎng)物產(chǎn)生蛋白的消化道粘膜細(xì)胞的體外或離體方法，包括(a)在允許細(xì)胞體外或離體轉(zhuǎn)化的條件下將消化道粘膜細(xì)胞或消化道粘膜干細(xì)胞與包含與編碼胰島素的核酸有效連接的葡萄糖依賴型促胰島素多肽(GIP)啟動(dòng)子的多核苷酸接觸；和(b)鑒定受葡萄糖、蔗糖、果糖、碳水化合物、多肽、氨基酸或脂肪調(diào)節(jié)產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞轉(zhuǎn)化體，從而制備應(yīng)答于營(yíng)養(yǎng)物產(chǎn)生胰島素的消化道粘膜細(xì)胞。
14.受營(yíng)養(yǎng)物調(diào)節(jié)產(chǎn)生胰島素的分離或培養(yǎng)的消化道粘膜細(xì)胞，其中由包含與編碼胰島素的核酸有效連接的葡萄糖依賴型促胰島素多肽(GIP)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因?qū)崿F(xiàn)胰島素的表達(dá)。
15.如權(quán)利要求13或14所述的方法或消化道粘膜細(xì)胞，其中所述消化道粘膜細(xì)胞獲自個(gè)體。
16.如權(quán)利要求15所述的方法或消化道粘膜細(xì)胞，其中所述個(gè)體是人。
17.如權(quán)利要求13或14所述的方法或消化道粘膜細(xì)胞，其中所述消化道粘膜細(xì)胞獲自胃腸道組織或器官或來(lái)源于消化道來(lái)源的細(xì)胞系。
18.如權(quán)利要求17所述的方法或消化道粘膜細(xì)胞，其中所述組織是胃或十二指腸。
19.如權(quán)利要求13-18中任一項(xiàng)所述的方法或消化道粘膜細(xì)胞，其中所述消化道粘膜細(xì)胞是內(nèi)分泌細(xì)胞。
20.如權(quán)利要求19所述的方法或消化道粘膜細(xì)胞，其中所述內(nèi)分泌細(xì)胞是K細(xì)胞。
21.如權(quán)利要求13或14所述的方法或消化道粘膜細(xì)胞，其中所述多核苷酸或轉(zhuǎn)基因包括載體。
22.通過(guò)權(quán)利要求13所述的方法制備的分離的消化道粘膜細(xì)胞，其中該細(xì)胞應(yīng)答于營(yíng)養(yǎng)物產(chǎn)生胰島素。
全文摘要
本發(fā)明提供用于治療可通過(guò)在動(dòng)物粘膜細(xì)胞或組織以可調(diào)節(jié)方式產(chǎn)生蛋白治療的疾病的組合物和方法。所述治療方法包括體內(nèi)和活體外方法，包括將分泌所述蛋白的體外轉(zhuǎn)化細(xì)胞植入哺乳動(dòng)物患者體內(nèi)。
文檔編號(hào)A61P3/04GK102151337SQ201110071640
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2001年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月13日
發(fā)明者A·T·鐘, T·J·基菲爾 申請(qǐng)人:恩根尼公司