專利名稱：用于感染的酶療法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含酶的組合物以及用所述酶作為抗感染藥在治療消化道感染或降低消化道感染危險方面的方法。
背景技術(shù)：
在聯(lián)合國經(jīng)濟和社會事務(wù)部人口處(the United Nations Department of Economic and Social Affairs Population Division)的 1998 年世界人口估計和計劃修訂本(Revision of the World Population Estimates and Projections)中，預(yù)計世界人口將于1999年達到60億。報告還說明，世界人口從50億增加到60億僅用了 12年，相比之下，世界人口從10億增加到20億卻用了 123年。到21世紀中期，計劃人口會在73億至 107億之間。最近十年間顯著的人口增長部分是由于應(yīng)用技術(shù)和集約化糧食生產(chǎn)措施導(dǎo)致的糧食生產(chǎn)的有效增加所致。對于將來的增長，需要糧食生產(chǎn)更有效的增加跟上增長。一種使動物性食品生產(chǎn)更為有效的方法涉及在動物飼料中廣泛使用抗微生物化學(xué)藥品和抗生素。在大規(guī)模農(nóng)場內(nèi)，感染的傳播在密集型生產(chǎn)條件下非常迅速。因此，通過預(yù)防性和治療性應(yīng)用這些物質(zhì)來控制流行性疾病。例如，通常的做法是在動物飼料中摻入防治球蟲感染的化學(xué)藥品(例如，沙利霉素、莫能星、羅沙胂(3-硝基)、哈喹諾、卡巴多司和奧喹多司)以及抗微生物的抗生素(例如，桿菌肽、維吉霉素、泰洛星、四環(huán)素、金霉素、青霉素、竹桃霉素、新生霉素、林可霉素、班貝霉素、安普霉素、螺旋霉素、紅霉素、新霉素等等)。 眾所周知這種做法可促進生長并提高飼料轉(zhuǎn)化率。在諸如金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎鏈球菌(Sti^ptococcus pneumoniae)、流感嗜血菌(Haemophilus influenza)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)禾口結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的人類病原體中，多重抗生素抗性的增加已產(chǎn)生這樣的擔心與家畜相關(guān)的微生物中發(fā)生的抗生素抗性可以通過可轉(zhuǎn)移抗藥性因子遷移至人類病原體中。有證據(jù)說明，喂以抗生素的動物是帶有可轉(zhuǎn)移抗藥性因子的細菌源。參見Hooge，F(xiàn)eedstuffs 71 (20) :59，1999。雖然動物和人類所用的抗生素一般不同，但是在可能產(chǎn)生交叉抗性的機理方面有相似性。在一種情況下，氟喹諾酮(fluroquinolone)被批準用以防治某些動物的大腸桿菌感染(大腸桿菌病)并且也用于人類醫(yī)藥中。Hooge，參見上文。最近，由于發(fā)生氟喹諾酮抗性彎曲桿菌并且轉(zhuǎn)移到人，因此FDA/CVM已經(jīng)建議取消在家禽中使用氟喹諾酮恩氟沙星的批準。參見Murhead， S. Feedstuffs 72(45) 1-4，2000。如果在飼料中禁止使用抗生素和抗微生物藥，則肉品生產(chǎn)業(yè)也擔心會造成損失并可能發(fā)生動物病的死灰復(fù)燃。例如，在1986年，瑞典禁止使用飼用抗生素后，動物病增加。這伴隨增加使用治療性抗生素，導(dǎo)致抗生素使用總體增加以及肉畜生產(chǎn)成本增加。 參見 Smith，F(xiàn)eedstuffs 71 (13) :1，1999。1998 年 12 月，歐洲部長級會議(EU Councilof Ministers)決定暫停使用正式批準為飼料生長促進劑非處方藥中的六種抗微生物藥(Official Journal of the European Communities 29. 12.98, Council Regulaion No. 2821/98concerning Directive 70/524) 由于人們擔心肉制品中的殘留物，兩種基于喹喔啉的添加劑也于1999年8月被禁止使用。這些做法的結(jié)果是增加了包括以下正式消除病癥的流行肉用仔雞壞死性腸炎；斷奶仔豬中由于產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)引起的腸炎；豬痢疾和螺旋體性腹瀉；和大腸桿菌相關(guān)腹瀉。參見Miller， United States Animal Health Association, 1999 Proceedings nnn sj] ^ ^Zfe Φ W 抗生素使用禾口抗性——歐洲前景(Antibiotic Usages in Food Animal Production and Resistance-European Perspective)，，。每年有30，000人由于在醫(yī)院內(nèi)感染抗性病原體而死亡，但是由于經(jīng)食物傳播的病原體引起的死亡卻少得多。由經(jīng)食物傳播的病原體引起的死亡中沒有一例與抗生素抗性有關(guān)(參見Smith，參見上文)。因而，并不清楚肉品生產(chǎn)業(yè)使用抗生素是否對人類醫(yī)院內(nèi)感染抗藥性病原體的問題產(chǎn)生影響。另一擔心是缺乏治療抗性病原體感染的新型抗生素。
Henry, C. Μ. ，Chemical and Engineering News, 2000 ^ 3 ^ 6 H,H 41-58 胃。 能意味著，當發(fā)生重大抗生素抗性病原體時，可能沒有有效治療所述感染的新型抗生素。開發(fā)抗生素的困難、市場大小以及管理問題似乎都使大的制藥公司不將其R&D集中到抗生素研制、尤其是用于動物的抗生素研制。對于注冊動物用藥物的新提出的規(guī)定如此之難，使得會停止研制動物用藥物。參見Smith，參見上文。然而，已有數(shù)個小公司參與新型抗生素的研制(Henry，參見上文)。在某些動物群體中，傳染病已經(jīng)大流行。例如，禽球蟲病就是一種只能處理，而沒有得到真正控制的疾病。事實上所有禽群都被感染，并且通常在飼料中輪換使用抗球蟲病化學(xué)藥品，以控制損失，限制抗性株的發(fā)生。球蟲病使家禽生產(chǎn)者每年因損失和花在抗生素藥物(例如沙利霉素)上的藥品費用達$3. 5億。參見Suszkiw，USDA Agricultural Research Service News，1997年10月沘日。截止1999年，據(jù)估計美國每年花費約$1. 1 億用在抗球蟲藥上° 參見 Frost 禾口 Sullivan, U. S. Pharmaceutical Products for Food Animals, Report 5245-54,1995。顯然需要發(fā)現(xiàn)新的更為有效的方法，以防治采用集約農(nóng)業(yè)技術(shù)培育的動物的消化道感染。這種需求基于獲得更高生產(chǎn)效率，以便跟上快速膨脹的世界人口的需要。腸傳染病防治的改進保證較快的生長率并提高飼料轉(zhuǎn)化率。家畜生產(chǎn)中也需要代替抗生素的替代物，以解決人們擔心人類病原體中可能發(fā)生抗生素抗性的問題。當采用以不同于所有抗生素的方式操作的基于酶的療法時，沒有刺激抗性致病微生物(它們給人類健康帶來問題)進化的危險。由于酶是蛋白質(zhì)，因此不可能在肉制品中摻入危險性化學(xué)殘留物，用某些抗生素和抗球蟲病化學(xué)藥品會發(fā)生這種情況。參見American Feed Control Officials Inc. ,Official Publication，1999，“藥物和飼料添加劑(Drugs and Feed Additives)，Section 30. OEnzymes, ”第 206-217 頁，ISBN 1-878341-10-3。發(fā)明概述因此，本發(fā)明的一個目的是提供降低消化道感染影響的酶療法。本發(fā)明的另一個目的是提供通過干擾病原體與消化道細胞的結(jié)合降低消化道感染影響的機制。
就感染引起感染或壞死性腸炎的病原體的動物而論，本發(fā)明的又一個目的是提供提高增重和飼料轉(zhuǎn)化率的方法。本發(fā)明的再一個目的是提供一種適合于口服的劑型，所述劑型有效改善被微生物病原體感染或有被微生物病原體感染危險的受治療者的病癥。在達到這些目的和其它目的的同時，按照本發(fā)明的一個方面，還提供一種包含以下組分的組合物(i) 一種切割影響細胞表面蛋白或糖類釋放的鍵的酶，所述酶不是內(nèi)-1， 4-β-D-甘露聚糖酶，和(ii) 一種所述酶的生理上可接受的載體，其中所述組合物為適合于口服的形式并且不含除所述酶以外的抗感染藥。在一個實施方案中，所述酶切割影響細胞表面蛋白釋放的鍵。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述組合物中包括的酶是鞘磷脂酶或磷脂酶、尤其是 C型或D型磷脂酶。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述選自切割影響細胞表面蛋白或糖類釋放的鍵的酯酶、腦苷脂酶和糖酶。在另一個實施方案中，由蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)菌株、優(yōu)選ATCC 7004或ATCC 6464制備所述酶。或者，通過在巨大芽孢桿菌 (Bacillus megaterium)中表達編碼所述酶的重組DNA獲得所述酶。在另一個實施方案中， 所述酶包含在明膠膠囊殼內(nèi)，并且在所述組合物中用量為200IU/Kg-4000IU/Kg飼料。按照本發(fā)明的另一方面，提供具有上述組分(i)和(ii)的組合物，其中所述生理上可接受的載體是在其中摻入所述酶的飼料。因此，所述組合物可以是不含除所述酶以外的其它抗感染藥的動物飼料。本發(fā)明的動物飼料組合物還包含谷類物料(例如玉米、高粱、 小麥、大麥或燕麥)、蛋白質(zhì)源(例如菜豆或豌豆)和維生素、氨基酸和礦物質(zhì)。按照本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提供如上所述的為固體或液體劑型的組合物。還提供治療消化道感染或降低消化道感染危險的方法，所述方法包括給予患有所述感染或有患所述感染危險的受治療者口服有效量的切割影響細胞表面蛋白或糖類釋放的鍵的酶。其中所述酶不是內(nèi)-I，4_i3-D-甘露聚糖酶。另外，所述方法不包括給予除所述酶本身以外的抗感染藥。所述感染可以由原生動物(例如艾美耳球蟲屬(Eimeria)和隱孢子蟲屬(Cryptosporidium))、細菌(例如梭菌屬(Clostridium))、真菌或酵母病原體引起。甚至還提供包含以下組分的組合物(i) 一種切割影響細胞表面蛋白或糖類釋放的鍵的酶和(ii) 一種所述酶的生理上可接受的載體，其中所述組合物為適合于口服的形式并且不含除所述酶以外的抗感染藥。還提供治療消化道感染或降低消化道感染危險的方法，所述方法包括給予患有所述感染或有患所述感染危險的受治療者口服有效量的切割影響細胞表面蛋白或糖類釋放的鍵的酶，其中所述方法不包括與所述酶一起給予抗微生物有效量的另外的抗感染藥。根據(jù)以下詳細描述，本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)點將變得顯而易見。雖然指出了優(yōu)選實施方案，但所給出的詳細描述和具體實施例僅用于說明，因為根據(jù)該詳細描述，在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種變化和修改對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。此外，所述實施例證明了本發(fā)明的原理，但不能期望具體描述本發(fā)明對于顯然對本領(lǐng)域技術(shù)人員有用的所有的感染實施例的應(yīng)用。附圖簡述

圖1顯示由巨大芽孢桿菌菌株產(chǎn)生的重組PI-PLC酶的抗隱孢子蟲活性。發(fā)明詳述
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一類特定的酶在口服給藥后顯示出顯著的抗生素活性，所述酶的特征在于切割影響細胞表面蛋白或糖類釋放的鍵的能力，所述酶例如在治療消化道感染時有效。 所述酶類包括但不限于鞘磷脂酶和C型磷脂酶和D型磷脂酶以及有類似切割特異性的酶。 因此，該類酶的示例是切割和釋放通過連接于磷脂酰肌醇的鍵而錨定膜的糖蛋白或糖類的酶。因此，磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C (E. C. 3. 1.4. 10)(也簡稱為PI-PLC或1-磷脂酰肌醇磷酸二酯酶)是該類中的一個成員。另一個實例是糖基-磷脂酰肌醇特異性磷脂酶D或 GPI-PLD。 Low 禾口 Prasad，Proc. Natl. Acad. Sci. 85 :980-984,1988。已經(jīng)描述了來源于真核生物的GPI-PLD和PI-PLC酶。參見Low，“通過特異性磷脂酶降解糖基-磷脂酰肌醇錨著點(Degradation of glycosyl-phosphatidylinositol anchors by specific phospholipases) ”，第二章，第 35-63 頁，載于 MOLECULAR AND CELL BIOLOGY OF MEMBRANE PROTEINS :GLYC0LIPID ANCHORS OF CELL-SURFACE PROTEINS, A. J. Turner (編輯)，Ellis Horwood, New York, 1990 ；Low 禾口 Prasad, Proc. Natl. Acad. Sci. 85 :980-984,1988 ；Essen 等，Nature 380 :595-602,1996 禾口 Essen 等，Biochemistry 36 :2753-2762,1997。已經(jīng)描述了來源于原核生物的PI-PLC，包括由細菌胞外產(chǎn)生的 PI-PLC0在PI-PLC已知的細菌源中有蠟樣芽孢桿菌(Stein和Logan, J. Bacteriol. 85 369-381,1963 ；Stein 禾口 Logan, J. Bacteriol. 90 :69-81,1965 ；Ikezawa 等，Biochimica et Biophysica Acta 450 :154-164,1976 ；Griffith 等，Methods in Enzymology 197 :493-502,1991 ；Volwerk 等，J. Cell. Biochem. 39 :315-325, 1989 ；禾口 Kuppe 等， J.Bacteriol. 171 :6077-6083,1989)> 蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis) (Ikezawa 和 Taguchi，Methodsin Enzymology 71 :731-741,1981 ；日本專利文件 JP 55034039)、金黃色葡萄球菌(Low 和 Finean，Biochem J. 162 :235-240,1977)和諾氏梭菌 (Clostridium novyi)(Taguchi 禾口 Ikezawa, Arch. Biochem. Biophys. 186 :196-201,1978)。已經(jīng)基于熒光底物設(shè)計出PI-PLC酶的改進酶測定技術(shù)。參見Hendrickson 等，Biochemistry. 31 :12169-12172,1992 ；Hendrickson, Anal.Biochem. 219 :1-8,1994 ； Hendrickson 等，Bioorg. Med. Chem. Letters. 1 :619-622,1991。雖然不明確歸于任何理論，但本發(fā)明強調(diào)PI-PLC酶有切割細胞表面蛋白的磷脂酰肌醇糖脂錨著點和其它糖基磷脂酰肌醇的能力。參見Low，參見上文；Low和Mltiel， Science 239 :268_275，1988。例如，幾種原生動物寄生蟲的變異型表面糖蛋白和其它表面蛋白以及糖類被糖基-磷脂酰肌醇磷脂(GPI錨著點)錨定，并且對PI-PLC消化和釋放敏感。說明性的物種屬于血吸蟲屬(Schistosoma)、弓形體屬(Toxoplasma)、瘧原蟲屬 (Plasmodium)、錐蟲屬(Trypanosoma)和利什曼原蟲屬(Leishmania) (Low，參見上文)以及艾美耳球蟲屬(Eimeria)、巴貝蟲屬(Babesia)、泰累爾梨蟲屬(Theileria)、賈第鞭毛蟲屬(Giardia)、細滴蟲屬(I^ptomonas)和內(nèi)阿米巴屬(Entamoeba)。參見 McConville 和 Ferguson, Biochemical J. 294 :305-324,1993 ；Pearce 禾口 Sher，J.Immunol. 142 :979-984, 1989 ；Sauma 等，Mol. Med. Biochem. Parasito 1. 46 :73-80,1991 ；Hawn 禾口 Strand，Mol. Med. Biochem. Parasito1. 59 :73-82,1993?？磥砑毎砻娼M分的這種錨定機制對于范圍從酵母到哺乳動物的真核細胞而言是普遍存在的。被認為是非常原始的真核生物一蘭氏賈第鞭毛蟲(Giardia lamblia)體內(nèi)存在GPI錨著點，表明這種錨著點很早在真核生物中進化。與這一了解相一致的是在古細菌中發(fā)現(xiàn)了一種新型甘油磷脂GlcNal-6-肌醇-P-二烷基甘油(Nishihara等，J. Biol. Chem. 267 :12432-12435)，它是已進化的更為復(fù)雜的真核生物GPI錨著點結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。在原生動物中，使用GPI錨定系統(tǒng)比在高等真核生物中更為大量，有證據(jù)說明GPI-錨定結(jié)構(gòu)對于寄生物在昆蟲和哺乳動物宿主體內(nèi)存活很重要(McC0nville*i^rguS0n，參見上文)。 例如，變異型表面糖蛋白的頻繁脫落可能是避免免疫系統(tǒng)攻擊的機制。原生動物柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)含有與布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)的糖蛋白/糖脂類似的磷脂酰肌醇錨定結(jié)構(gòu)。認為這些結(jié)構(gòu)對于膜附著以及后續(xù)感染很重要。參見 Gurnett 等，Mol. Med. Biochem. Parasitol. 41 :177_186，1990。艾美耳球蟲屬結(jié)構(gòu)被錐蟲脂酶和蘇云金芽孢桿菌PI-PLC切割(Gurnett，參見上文)。用PI-PLC 體內(nèi)治療寄生蟲，如果證明切實可行的話，可能有助于宿主免疫系統(tǒng)并且干擾進入消化道的病原體的附著和感染。艾美耳球蟲分布廣，并且是養(yǎng)禽業(yè)費用大的問題。另一種原生動物寄生蟲微小隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum)分布廣，并且在人類和許多動物中引起急性腹瀉性疾病。基于DNA序列，預(yù)測子孢子蛋白GP15/45/60為GPI聯(lián)蛋白，并且與該子孢子蛋白反應(yīng)的單克隆抗體抑制感染(Strong，W. B.等，hfection and Immunity 68: 4117-4134,2000 ；Cevallos,A. Μ.等，Infection and Immunity 68 :4108-4116,2000) 因此，微小隱孢子蟲是另一種可用PI-PLC潛在治療的病原體。原核細菌不含被磷脂酰肌醇錨定的表面糖蛋白和糖類(McConville和Ferguson， 參見上文)，但是PI-PLC仍可能通過干擾附著過程來降低細菌感染。致病大腸桿菌和許多其它熟知的致病腸桿菌科(Enterobacteriaceae)表達細菌粘附素FimH，一種存在于菌毛遠端的^kD甘露糖結(jié)合凝集素。Abraham等，Nature 336 :682_684，1988。已經(jīng)顯示這種粘附素與肥大細胞的CD48，即GPI錨著分子結(jié)合。參見Malaviya等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 :8110-8115,1999。用PI-PLC體外消化，降低了突變型GPI錨著白喉毒素(來自白喉棒桿菌(Corynebacterium diphtheria))受體與鼠類NIH3T3細胞的結(jié)合。參見Lanzrein 等，EMBO J. 15 :725-734，1996。另外，敗毒梭菌(Clostridium septicum) α 毒素和嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)氣單胞菌溶素均借助于C末端GPI錨著點附著于細胞表面，并且可以通過用PI-PLC處理而從細胞表面去除。參見Gordon等，J. Biol. Chem. 274 27274-27280,1999。PI-PLC降低細菌感染影響的機制涉及從宿主肥大細胞釋放CD48結(jié)合部位。此外， FimH與肥大細胞結(jié)合觸發(fā)炎癥反應(yīng)。因而按照本發(fā)明，由于炎癥反應(yīng)涉及腫瘤壞死因子α 的釋放，因此減少結(jié)合部位也應(yīng)該減少可能極度損害腸健康本身的炎癥(Malaviya，參見上文)。因此，通過這種減少炎癥和構(gòu)成腫瘤壞死因子分泌的基礎(chǔ)的機制，按照本發(fā)明進行磷脂酶處理，應(yīng)該緩解特征性病癥(例如過敏性腸綜合征、結(jié)腸炎和局限性回腸炎)的癥狀。 參見 van Deventer, S. J. , Ann. Rheum. Dis. 58 (1) :1114-1120 (1999 年 11 月)。針對病毒性感染，本發(fā)明也應(yīng)該有效，由于它破壞病毒粒子和該病毒將體內(nèi)感染的細胞之間的結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)，本文中描述的口服給藥是有效的，有趣的是，用磷脂酶C預(yù)處理流感病毒，引起約50%病毒磷脂的釋放，導(dǎo)致顯著減少雞胚內(nèi)的感染性。參見Mizutani等，Nature 204 :781-782,1964.相反，用從產(chǎn)氣莢膜梭菌中分離的磷脂酶C預(yù)處理培養(yǎng)的雞胚成纖維細胞，顯著抑制西門利啟森林甲病毒(Semliki Forest Virus)對細胞的后續(xù)感染。參見 Friedman 和 Pastan，Proc. Natl. Acaa. ki. USA 59 :1371_1378，1968。雖然當時本領(lǐng)域并沒有認識到這些現(xiàn)象中的治療意義，但事后認識到，它們與認為構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的一種機制相一致，即病原體-表面配體和/或其相關(guān)的細胞膜受體的切割，中斷了感染所必需的相互作用。本發(fā)明在預(yù)防病毒性感染方面可能有效的另一種方式是消除了病毒GPI錨定蛋白與易感細胞的結(jié)合。對PI-PLC消化敏感的病毒GPI錨定蛋白的一個實例是登革病毒(Dengue Virus) NSl (非結(jié)構(gòu)蛋白 1)。參見 Jacobs 等，F(xiàn)ASEB J 14:1603-1610， 2000。有多個作為病毒結(jié)合部位的宿主細胞GPI錨定蛋白的實例。這些實例包括結(jié)合 GPI錨定CD55(衰變加速因子，DAF)的人艾可病毒(Echovirus)6、7、12和21以及腸道病毒(Enterovirus) 70。 參見 Clarkson 等，J. Virology 69 :5497-5501,1995；Bergelson 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :6245-6248,1994 ；禾Π Karnauchow 等，J. Virology 70 5143-5152,1996。犬細小病毒(Canine Parvovirus) (CPV)感染可以通過用PI-PLC預(yù)處理貓細胞來體外阻斷。參見 Barbis 和 Parrish，Brazilian J. Med. Biol. Res. 27 :401-407, 1994。推定對起始感染重要的某些細胞表面受體通過非GPI錨著點的機制附著于膜上。 這些包括以下結(jié)構(gòu)例如膽固醇酯(Rostand和Esko, J. Biol. Chem. 268 =24053-24059, 1993)、非磷酸化鞘糖脂(Kar Is son, Ann Rev. Biochem 58 :309-350,1989)和諸如磷脂酰乙醇胺和磷脂酰絲氨酸的其它磷脂。參見Sylvester，Infect. Immun. 64 :4060-4066,1996。因此，由于上述原因，在按照本發(fā)明口服給藥后，用對從細胞表面釋放這些結(jié)構(gòu)有活性的合適酯酶、腦苷脂酶、糖酶和磷脂酶靶向這樣的結(jié)構(gòu)，應(yīng)該對治療消化道感染具有有益的效應(yīng)。鑒于真核生物中的磷脂酰肌醇連接的表面蛋白的普遍性，需要給予酶來急性或預(yù)防性切下這種細胞表面蛋白和/或糖類的錨定鍵的本發(fā)明的治療方法，，將發(fā)現(xiàn)可廣泛應(yīng)用于控制消化道的原生動物、細菌、真菌和病毒感染。為此，本發(fā)明的一個關(guān)鍵方面是證實可以口服給予作為抗感染藥的一種酶，所述酶不僅在切除細胞表面組分中有活性，而且在體內(nèi)也有效。值得注意的是，自I960年起一直就可以利用合適的代表性酶PI-PLC，但是迄今為止本方法還沒有被提出過。本發(fā)明的另一方面是應(yīng)用如上所述的酶作為動物飼料制劑中的有效抗感染藥，所述酶治療消耗所述飼料的動物的消化道感染或降低所述消化道感染的危險。含有內(nèi)-1， 4-β-D-甘露聚糖酶的飼料制劑是已知的，并且有些報道已經(jīng)提出甘露聚糖酶的抗真菌活性。參見 WO 00/21381 (PCT/EP99/07835)和 Kudo 等，Experentia 48:227-281,1992。雖然已經(jīng)廣泛地討論了在不含抗生素的飼料中酶應(yīng)用的前景，但是在這些情況下，都是將甘露聚糖酶與已知的抗生素混合。Adams, Feed Mix (2000年特刊)，第16-18頁。因此，在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明涉及含有特征為上述切割活性的酶的組合物， 包括飼料組合物，所述酶不是甘露聚糖酶，或更準確地說不是內(nèi)-I，4_i3-D-甘露聚糖酶， 與例如針對甘露聚糖的酶的區(qū)別在于具有不同的切割特異性，如在ENZYME NOMENCLATURE 1992 (Academic Press)(參見條目 3. 2. 1. 77,3. 2. 1. 78,3. 2. 1. 101,3. 2. 1. 106,3. 2. 1. 130 和3. 2. 1. 137)中所述。此外，本發(fā)明考慮了含有這種酶(包括甘露聚糖酶)、但不含其它抗感染藥的組合物。因此，按照本發(fā)明，可以用得自蠟樣芽孢桿菌并將PI-PLC含量標準化的胞外酶制
9劑，在感染存在時在增重和飼料轉(zhuǎn)化率方面產(chǎn)生非常顯著的改善。這種結(jié)果是出乎人們所料的，因為蠟樣芽孢桿菌是通常引起食物傳染性胃腸炎和蠟樣芽孢桿菌眼內(nèi)炎的機會致病菌。早期研究報道將炭疽芽孢桿菌(B. anthracis)胞外酶或蠟樣芽孢桿菌胞外酶注射到兔子體內(nèi)，引起磷酸酶血癥，甚至死亡。例如，參見Mein和Logan，J. Bacteriol. 85 369-381,1963。因此，令人驚奇的是，按照本發(fā)明，對于由細菌性感染引起的疾病來說，得自引起胃腸炎的病原體的胞外酶會具有治療效應(yīng)。蠟樣芽孢桿菌合成各種各樣的由磷脂酶C和鞘磷脂酶組成的胞外膜活性酶和溶細胞毒素，包括 PI-PLC 和賭溶素(Cereolysin)AB。參見 GiImore，J. Bacteriol. 171 744-753,1989。在上述酶制劑中，由蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)生的胞外磷脂酰肌醇特異性磷脂酶 C[E. C. 3. 1. 4. 10]被認為是一種有效成分。本發(fā)明的酶療法有效地作為抑球蟲劑和抗生素起作用。因此，本發(fā)明的療法特別是在禁止目前使用的物質(zhì)時是一種治療消化道感染的有效的商業(yè)上有前途的方法。如果不包衣，酶能夠由于胃內(nèi)的胃液而不可逆失活。美國專利第4，079，125號描述了改進的可供缺乏酶的哺乳動物攝入的包腸衣的含酶組合物。令人驚奇的是，將沒有包衣的PI-PLC加入到動物飼料中導(dǎo)致有效治療病原體性感染。按照本發(fā)明的酶組合物最好配制為干燥的固體或液體口服組合物。這種組合物一般會包括穩(wěn)定劑，例如緩沖劑、糖類和/或甘醇。按照本發(fā)明，適合于在片劑或膠囊中摻入的干燥的貯存穩(wěn)定的酶制劑如下制備例如可以通過凍干法，在含有惰性或糖載體的流化床干燥器中進行噴霧干燥，或利用結(jié)合成玻璃穩(wěn)定劑的蒸發(fā)技術(shù)。參見Franks等， Biopharm. 4 =38-55,1991。另一種方法包括鹽沉淀(例如硫酸銨沉淀)或溶劑沉淀(如用丙酮)，形成粉末，隨后干燥并與載體混合。某些糖類、特別是單糖、二糖和低聚寡糖是重要的成玻璃糖類。用作載體的示例性糖其中有木糖、果糖、葡萄糖、山梨糖醇和麥芽三糖，如Franks所述，參見上文?；谂c所述酶的相容性、低吸濕傾向和有利的玻璃化轉(zhuǎn)變曲線，選擇糖載體。穩(wěn)定劑海藻糖特別適用于生產(chǎn)環(huán)境溫度穩(wěn)定的生物制品。參見美國專利第4，891，319號；Roser, Biopharm. 4(8) 47-53,1991 ；Colaco 等，Bio/Technology 10 1007-1011,1992 ；Aldridge, Genetic Engineering News, 1995 年 3 月 15 日，第 10-11 頁。本發(fā)明的酶可以配制為液體，例如作為含有降低水活度并且穩(wěn)定所述蛋白的山梨糖醇或甘油的糖漿。這種溶液通常在制藥應(yīng)用之前進行過濾除菌。如上所述，一方面，本發(fā)明涉及作為飼料或食料組分的酶的傳遞。飼料主要由谷類物料、蛋白質(zhì)源、維生素、氨基酸和礦物質(zhì)構(gòu)成。所述谷類物料通常包括玉米、高粱、小麥、大麥或燕麥。所述蛋白質(zhì)源可以是例如菜豆或豌豆。示例性礦物質(zhì)、氨基酸和維生素包括b12、 Α、泛酸、煙酸、核黃素、K、DL-甲硫氨酸、L-賴氨酸、氯化膽堿、葉酸、磷酸二鈣、磺酸鎂、硫酸鉀、碳酸鈣、氯化鈉、亞硒酸鈉、一氧化錳、碘酸鈣、一氧化銅、氧化鋅和D-活化的動物甾醇。供飼料中使用，可以用鹽水(例如，NaCl, 15-18% w/w)或降低濃縮產(chǎn)品中水活度并防止微生物生長的糖漿制備液體酶制劑。諸如苯甲酸鈉、對羥基苯甲酸丙酯、山梨酸鈉或山梨酸鉀、以及棕櫚酸抗壞血酸酯的其它飼料用防腐劑都是經(jīng)批準的化學(xué)防腐劑的實例， 所述防腐劑也可以用來防止制品中由于微生物生長引起的潛在變質(zhì)。參見Association ofAmerican Feed Control Officials, Inc. , Official Publication 2000，第 18 部分，“化學(xué)防腐劑”，第215-217頁，ISBN 1-878341-11-1。這些防腐劑可以用自動噴霧技術(shù)通過制粒后大量稀釋而應(yīng)用于飼料。參見i^odge等，F(xiàn)eedStuffS，1997年9月四日。如果相容的話，這種液體制劑可以含有穩(wěn)定性糖類，例如山梨糖醇或甘油。為提高轉(zhuǎn)化率，可以包括作為飼料所需組分的材料，例如其它酶或熱不穩(wěn)定的維生素。在飼料以非顆粒的粉料形式(即不經(jīng)熱處理)使用的情況下，本發(fā)明的酶可以作為干濃縮物提供，以供在飼料混合器中添加。這種干酶濃縮物如下制備首先采用 IOKd NMWC或其它合適的超濾器濃縮液體酶制劑，以達到高百分率的酶含量，然后與非常干的載體例如粗玉米粉、粗大豆粉或甚至批準用于飼料的惰性物質(zhì)或不溶性鹽摻混。參見 Official Publication, American Feed Control Officials，參見上文，第 582 部分，“動物飼料中一般認為安全的物質(zhì)”。有多種技術(shù)可用來產(chǎn)生足以耐受某些飼料碾磨機制粒過程、同時在較低溫度下保持足夠的活性以在消化道內(nèi)起作用的穩(wěn)定的酶。眾所周知修飾蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，主要通過改變編碼DNA序列，或者其次，通過化學(xué)修飾，可以使酶更穩(wěn)定，以抵抗失活。在該方面的一個說明是應(yīng)用酶晶體的化學(xué)交聯(lián)。參見Collins等，Organic Process Research and Development 2(6) :400-406,1998.增加本發(fā)明酶穩(wěn)定性的另一種方法需要通過誘變編碼目的酶的基因來改變氨基酸，或獲得可供改組的基因或基因的一部分。參見Crameri等， Nature 391 :288-291,1998 ；Arnold，Nature Biotechnol. 16 :617-618,1998b ；Zhao 等， Nature Biotechnol. 16 :258-235,1998 ；Zhao 禾口 Arnold，Protein Eng. 12 :47_53，1999。突變和選擇以使具有所需特性的酶“定向進化”也是切實可行的。例如，參見Giver等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 12809-12813，1998 ;Liao 等，Proc. Nat’ 1. Acad. Sci. USA 83: 576-580，1986 ；Cherry 等，Nature Biotechnol. 17 :379-384,1999。某些蛋白質(zhì)的修飾(包括糖基化、PEG化(PEGylation)和琥珀?；?也可以增強穩(wěn)定性并改變最適PH，這些是可以使本發(fā)明中所用酶最優(yōu)化的特征。因此，已知的方法可以在這方面用來制備經(jīng)修飾的酶，以供按照實施例進行測試，以估計本發(fā)明療法的適應(yīng)性。用于生產(chǎn)PI-PLC的一種有效方法是將蠟樣芽孢桿菌基因克隆到巨大芽孢桿菌中。表達系統(tǒng)(Rygus 和 HiIlen，Appl. Microbiol. Bacteriol. 35 :594-599,1991)利用得自巨大芽孢桿菌木糖調(diào)節(jié)子的元件(Rygus等，Arch. Microbiol. 155 =535-542,1991)，并可在市場上從BIOlOl Corp. (Vista，California)獲得。在用四環(huán)素抗性穩(wěn)定化質(zhì)粒中，在 PI-PLC基因前導(dǎo)編碼序列和巨大芽孢桿菌xylA基因的前三個氨基酸之間產(chǎn)生融合體，所述融合體受木糖效應(yīng)阻抑蛋白調(diào)節(jié)。具有增強表達的該類型的菌株為生產(chǎn)按照本發(fā)明摻入到動物飼料中的商業(yè)上有用量的PI-PLC提供了一種切實可行的方法。某些蠟樣芽孢桿菌分離株產(chǎn)生諸如衣霉素的抗生素。參見Kamogashira等， Agric. Biol. Chem. 52 :859-861,1988。賭樣芽孢桿菌的另一分離株(ATCC 53522)在美國專利第4，877，738號和第5，049，379號中被描述為預(yù)防植物猝倒病和根腐病的生物防治藥。 認為這種作用是由于以下兩種抗生素的作用引起的名為“Zwittermicin”，一種396道爾頓線性氨基多元醇；和“抗生素B”，一種氨基糖苷。在下文詳述的實施例中，通過排除酶制劑中可能的低分子量抗生素，消除涉及這兩種抗生素的可能性。具體地說，借助于一種IOKd分子量截止膜，濃縮無細胞發(fā)酵肉湯。含有大于IOKd的蛋白質(zhì)的濃縮物用于進一步加工。諸如Handelsman描述的小分子量抗生素(參見上文) 會通過該濾膜。而且，利用硫酸銨沉淀法沉淀溶液中的高分子量蛋白質(zhì)，留下低分子量物質(zhì)。將硫酸銨沉淀物重新溶解后，所得酶溶液對緩沖液透析，再一次處理以去除低分子量抗生素。最后，將所述蛋白質(zhì)再用硫酸銨第二次沉淀，以去除溶液中任何余下的低分子量化合物。這四種處理法的聯(lián)合應(yīng)用非常不利于下述的可能性所觀察到的抗生素效應(yīng)是由于ATCC 6464或ATCC 7004產(chǎn)生的低分子量抗生素引起的。也用大腸桿菌試驗菌株，測試發(fā)酵肉湯中存在的抗生素，但未檢測到抗生素的活性。參照以下說明性實施例，下文進一步描述了本發(fā)明。實施例1蠟樣芽孢桿菌ATCC 6464和ATCC 7004冷凍儲備培養(yǎng)物的制備打開得自ATCC的裝有凍干細胞的管形瓶，將凍干細胞接種到由10g/L Amberferm 4015 (Red Star) ,5g/L Amberex 695 (Red Star)和 5g/L 氯化鈉、pH 7.0 構(gòu)成的種子培養(yǎng)基中，于30°C生長。將原始培養(yǎng)物在LB肉湯瓊脂板上劃線接種，然后將所得單菌落接種到裝有20mL種子培養(yǎng)基的250mL帶擋板的搖瓶(Bellco)中，于30°C振蕩培養(yǎng)。當培養(yǎng)物密度達到OD6tltl讀數(shù)為1. 5時，加入無菌甘油至約10% v/v，將裝有1. SmL培養(yǎng)物的管形瓶于-80°C 冷凍。實施例2培養(yǎng)蠟樣芽孢桿菌ATCC 6464和ATCC 7004分離株用以生產(chǎn)磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C兩個Biostat C發(fā)酵罐(每個30升)，分批裝入自來水中的以下物質(zhì)組成的培養(yǎng)基:25g/L 2號營養(yǎng)肉湯(Oxoid)，10g/L胰蛋白胨(Difco)，10g/L酵母提取物(Difco)和 0. lmL/L Mazu DPlOP Modll消泡劑(BASF)。原始批料體積為9. 5L,肉湯于121°C滅菌40 分鐘。滅菌后，將初始PH用氨氣調(diào)至7.0。在含500mL相同培養(yǎng)基的4升帶擋板的搖瓶中，制備種子培養(yǎng)物用于接種，所述搖瓶帶有抽氣器連接件(Bellco)以及與連接件連接的硅氧烷管。將搖瓶在高壓滅菌器中于 121°C滅菌50分鐘，然后用由ATTC寄出的樣品(shipment)制備的1. SmL冷凍儲用培養(yǎng)物 (實施例1)接種前。將種子搖瓶培養(yǎng)物在可控環(huán)境震蕩培養(yǎng)器(NBS G-25型)中以200RPM 于30°C振搖培養(yǎng)5. 5小時。接種前，ATCC 7004培養(yǎng)物的OD600為1. 53，pH為6. 58。ATCC 6464 培養(yǎng)物的 OD600 為 1. 28，pH 為 6. 79。將500mL種子培養(yǎng)物接種到30_L發(fā)酵罐中并在以下條件下進行操作溫度30°C， 混合RPM 600，氣流10升/分鐘，壓力0. 5巴。原始培養(yǎng)物的OD6tltl為0. 81。在6小時時， 終止發(fā)酵，ATCC 7004的終OD6tltl為22. 1，ATCC 6464的終OD6tltl為2。在不控制pH下進行發(fā)酵，ATCC 7004的終pH為8. 17，ATCC 6464的終pH為8. 13。進一步加工之前，從發(fā)酵罐中取出肉湯，將其冷卻至8 °C。實際上用與所述兩種ATCC蠟樣芽孢桿菌分離株相同的方法，所述發(fā)酵罐再進行第二次發(fā)酵。在這種情況下，使用第6小時的種子培養(yǎng)物，0D_為2.86(ATCC 7004)，OD600 為 1. 98 (ATCC 6464)，pH 為 6. 69 (ATCC 7004)，pH 為 6. 65 (ATCC 6464)。主發(fā)酵進行 6. 5 小時，終 0D_ 為 35. 9 (ATCC 7004)，終 OD6tltl 為 33. 6 (ATCC 6464)。冷藏時的終 pH 為 8. 38 (ATCC 7004)，終 pH 為 8. 47 (ATCC 6464)。實施例3通過過濾去除細胞以及PI-PLC酶的濃縮
采用兩個首尾相連的A/G Technology (UFP-500-K-6A) 3mm中空纖維500，000分子量截止(500Kd NMWC)濾器，從4個發(fā)酵罐批料中每個批料取出并洗滌細胞。用蠕動泵以約 2升/分鐘，通過濾膜泵出冷卻的肉湯，再循環(huán)回貯存器。將含所述酶的透過液收集到冰上冷卻的貯存器中。將含細胞的肉湯原始體積約9升濃縮至約2升，此時用IOmM Tris-HCl, PH8. 5開始滲濾。在收集總體積約14升透過液后，終止細胞洗滌。用兩個首尾相連的A/G Technology (UFP-10-C-4XTCA) 0. 5mm 中空纖維 10，000 分子量截止濾器(IOKd)，濃縮500Kd透過液(每個發(fā)酵罐約14升)。使用濃縮物再循環(huán)的相同泵送方法，只是棄去透過液。將得自每個發(fā)酵罐體積約500mL的終濃縮物用于下一個加
工步驟。實施例4PI-PLC酶的進一步純化和濃縮將得自每種蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵的IOKd超濾濃縮物(實施例3)用硫酸銨調(diào)至80% 飽和度，在冰上混合60分鐘。將溶液在Sorvall GSA轉(zhuǎn)子中以6000RPM離心15分鐘。棄去上清液，將沉淀溶于最小體積的IOmM Tris-HCUO. 2mM EDTA(pH 7.5)中，然后對同樣緩沖液冷透析。采用染料結(jié)合測定(BioRad)測量每種濃縮物中的蛋白質(zhì)，采用基于HPLC的檢測方法和熒光底物(Molecular Probes, Inc.，P-3764，1_芘丁基肌醇磷酸，鋰鹽)，測定 PI-PLC 的水平(Hendrickson 等，Bioorg. Med. Chem. Letters 1 :619-622,1991)。下表 1 總結(jié)了測定數(shù)據(jù)，并根據(jù)對4種制劑中的每種制劑所得的純度，預(yù)測了大致純度和總酶量。酶制劑于-20°C凍藏待進一步加工。表1. PI-PLC粗酶制劑的分析匯總
ATCC蛋白質(zhì)比活制劑中估計的按純量酶制劑菌林mg/LU/mg1總蛋白純度2計算的編號(Hlg)%總 PI-PLC(mg)170041.861.753252.929.49264641.440.523450.8672.99370041.354.422087.3615.3464642.061.722561.955.001U =單位=1微摩爾/分種。2基于假定100%純蛋白質(zhì)的比活為60U/mg(HendrickSOn，參見上文)。實施例5酶制劑應(yīng)用于動物飼料之前的合并和濃縮合并所述酶制劑1、2、3和4，總體積為675mL。緩慢加入硫酸銨(492g)，然后將溶液在冰上混合幾分鐘。將溶液離心，收集沉淀。將沉淀部分溶于最小量的20mM磷酸緩沖液 (pH 7. 0)中。所得溶液為70. 9mL，密度1. 057克/cc。測定的蛋白質(zhì)濃度約為25. 5mg/mL。測定的PI-PLC活性約為1. 13U/mg,PI-PLC的估計純度為1. 88%。將全部溶液于_20°C凍藏，解凍后用于均勻處理200磅雞飼料。
實施例6蠟樣芽孢桿菌PI-PLC基因的克隆和在巨大芽孢桿菌中表達已經(jīng)對編碼磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(PI-PLC)的基因進行了測序。參見Kuppe 等，J. Bacteriol. 171 =6077-6083,1989 采用 PCR 技術(shù)，從蠟樣芽孢桿菌(ATCC 6464)染色體DNA中克隆PI-PLC基因。使用巨大芽孢桿菌表達載體pMEGA (BIO 101, Vista, CA) 0設(shè)計兩種引物，即 5，-GACTAGTAATAAGAAGTTAATTTTG-3，(弓丨物 1)和 5，-CGGGATCCATATTGTTGG TTATTGG-3’ (引物2)，其中引物-1中有一個SpeI位點，引物_2中有一個BamHI位點。將經(jīng)PCR擴增的PI-PLC基因連接到pMEGA的SpeI-BamHI位點中，產(chǎn)生質(zhì)粒 PCG682。在所述表達載體中的SpeI位點上，將PI-PLC蛋白與xylA基因產(chǎn)物的前三個氨基酸融合。PI-PLC基因的表達在xylA啟動子的調(diào)節(jié)下進行。用搖瓶發(fā)酵評價巨大芽孢桿菌中磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C的產(chǎn)量。用0. 2mL種子培養(yǎng)物接種含有10 μ g/ml四環(huán)素的 LB肉湯(20mL)，于37°C在250rpm的搖床上培養(yǎng)。在OD6tltl約為0. 5時，加入5g/L D-⑴-木糖，以誘導(dǎo)xylA啟動子。3小時后，通過離心收獲上清液。根據(jù)熒光底物方法(Hendrickson 等，Biochemistry 31 12169—12172，1992 ；Hendrickson, Anal. Biochem. 219 :1_8，1994)， 使用I-芘丁基肌醇-I-磷酸底物(Molecular Probes, Eugene, OR)，并通過HPLC檢測，測定磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C的活性。表2. PI-PLC表達的測量
權(quán)利要求
1.一種組合物，所述組合物包含(i) 一種實現(xiàn)切割由磷脂酰肌醇和錨定膜的糖蛋白或糖類構(gòu)成的鍵的酶，其中所述切割實現(xiàn)細胞表面蛋白或糖類的釋放，所述酶的量可以有效地治療消化道感染或降低消化道感染危險，其中所述酶能夠切割4-甲基傘形基肌醇-1-磷酸N-甲基-嗎啉鹽得到熒光產(chǎn)物甲基傘形酮，和(ii) 一種所述酶的生理上可接受的載體， 其中所述組合物適合于口服給藥。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物是一種飼料。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物不含除所述酶以外的抗感染藥。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中所述酶切割影響細胞表面蛋白釋放的鍵。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中所述酶選自切割影響細胞表面蛋白或糖類釋放的鍵的酯酶。
6.權(quán)利要求5的組合物，其中所述酯酶是磷脂酶。
7.權(quán)利要求6的組合物，其中所述磷脂酶是C型磷脂酶或D型磷脂酶。
8.權(quán)利要求6的組合物，其中所述磷脂酶是磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C。
9.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物還包含一種穩(wěn)定劑、一種糖載體或一種防腐劑。
10.權(quán)利要求9的組合物，其中所述穩(wěn)定劑是緩沖劑、糖類或甘醇。
11.權(quán)利要求9的組合物，其中所述糖載體選自木糖、果糖、葡萄糖、山梨糖醇和麥芽三糖。
12.權(quán)利要求9的組合物，其中所述防腐劑選自對羥基苯甲酸丙酯、山梨酸鈉、山梨酸鉀和棕櫚酸抗壞血酸酯。
13.權(quán)利要求1-12中任一項的組合物，其中所述載體是一種在其中摻入所述酶的食料。
14.權(quán)利要求1的組合物，其中所述食料是一種由谷類物料、蛋白質(zhì)源、維生素、氨基酸和礦物質(zhì)組成的動物飼料。
15.權(quán)利要求14的組合物，其中所述谷類物料是玉米、高粱、小麥、大麥或燕麥。
16.權(quán)利要求14的組合物，其中所述蛋白質(zhì)源是菜豆或豌豆。
17.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物為固體制劑或液體制劑。
18.權(quán)利要求1的組合物，其中所述酶包含在片劑或明膠膠囊殼內(nèi)。
19.權(quán)利要求1的組合物，其中所述酶從蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)菌株制備。
20.權(quán)利要求19的組合物，其中所述蠟樣芽孢桿菌菌株是ATCC7004或ATCC 6464。
21.權(quán)利要求1的組合物，其中所述酶通過重組DNA在宿主生物中表達來獲得。
22.權(quán)利要求21的組合物，其中所述宿主生物來自巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)菌株。
23.權(quán)利要求1的組合物，其中所述酶用量為200IU/Kg-4000IU/Kg飼料。
24.權(quán)利要求1的組合物在生產(chǎn)用于治療消化道感染或降低消化道感染危險的口服劑型藥物中的應(yīng)用。
25.權(quán)利要求對的應(yīng)用，其中所述酶切割影響細胞表面蛋白釋放的鍵。
26.權(quán)利要求對的應(yīng)用，其中所述應(yīng)用不包括給予除所述酶以外的抗感染藥。
27.權(quán)利要求對的應(yīng)用，其中所述感染由原生動物、細菌、病毒或真菌病原體引起。
28.權(quán)利要求27的應(yīng)用，其中所述感染由酵母引起。
29.權(quán)利要求27的應(yīng)用，其中所述感染由艾美耳球蟲屬(Eimeria)的原生動物病原體引起。
30.權(quán)利要求27的應(yīng)用，其中所述感染由隱孢子蟲屬(Cryptosporidium)的原生動物病原體引起。
31.權(quán)利要求27的應(yīng)用，其中所述感染由梭菌屬(Clostridium)的細菌病原體引起。
32.權(quán)利要求對的應(yīng)用，其中所述酶從蠟樣芽孢桿菌菌株生產(chǎn)。
33.權(quán)利要求32的應(yīng)用，其中所述蠟樣芽孢桿菌菌株是ATCC7004或ATCC 6464。
34.權(quán)利要求對的應(yīng)用，其中所述酶通過重組DNA在宿主生物中表達來獲得。
35.權(quán)利要求34的應(yīng)用，其中所述宿主生物來自巨大芽孢桿菌菌株。
36.權(quán)利要求對的應(yīng)用，其中所述酶選自切割影響細胞表面蛋白或糖類釋放的鍵的酯酶。
37.權(quán)利要求36的應(yīng)用，其中所述酯酶是磷脂酶。
38.權(quán)利要求37的應(yīng)用，其中所述磷脂酶是C型磷脂酶或D型磷脂酶。
39.權(quán)利要求37的應(yīng)用，其中所述磷脂酶是磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C。
全文摘要
一類特殊的酶，所述酶的特征在于切割影響細胞表面蛋白或糖類釋放的鍵的能力，不含抗感染藥的所述酶顯示出顯著的抗感染活性?？诜?，這些酶例如有效治療人和動物的消化道感染。在后一情況下，有顯著提高生長率、飼料轉(zhuǎn)化率并且改善總體健康狀況的益處。
文檔編號A61K38/43GK102172262SQ20111007692
公開日2011年9月7日 申請日期2000年12月8日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月10日
發(fā)明者D·M·安德森, D·W·福德格, H-Y邵, L·劉 申請人:坎姆根公司