專利名稱：治療白介素-6相關(guān)疾病的方法
治療白介素-6相關(guān)疾病的方法本申請是申請日為2004年4月觀日、申請?zhí)枮?00480011401. 1(國際申請?zhí)朠CT/ JP2004/006211)的同名申請的分案申請。
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及通過將白介素-6拮抗劑(IL-6拮抗劑)，特別是抗白介素-6受體 (IL-6R)的抗體(抗-IL-6R抗體)與免疫抑制劑組合，并以高劑量給予抗IL-6R抗體來治療白介素_6(IL-6)相關(guān)疾病的方法。2.相關(guān)
背景技術(shù)：
IL-6是一種細(xì)胞因子，也被稱為B細(xì)胞刺激因子-2 (BSF2)或干擾素β 2。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)IL-6作為分化因子參與B淋巴細(xì)胞系細(xì)胞的活化(Hirano，Τ.等，Nature, 324 =73-76, 1986)，并且后來證明IL-6是影響多種細(xì)胞功能的多功能細(xì)胞因子(Akira，S.等，Adv. in Immunology，54 :1-78,1993)。據(jù)報(bào)道，IL-6誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞系細(xì)胞成熟(Lotz, M.等， J.Exp. Med.，167 1253-1258，1988)。IL-6通過細(xì)胞上兩種類型的蛋白傳導(dǎo)其生物活性。一種是IL-6受體，該蛋白是分子量約為80kD的配體結(jié)合蛋白，IL-6與它結(jié)合(Taga，Τ.等，J. Exp. Med.，166 :967-981， 1987 ；Yamasaki, K.等，Science，241 =825-828,1987) 除了貫穿細(xì)胞膜并在細(xì)胞膜上表達(dá)的膜結(jié)合類型，IL-6受體也可以是主要包含其胞外區(qū)的可溶形式的IL-6受體。國際公開WO 92/19759描述了多種類型的抗IL-6R抗體，例如人源化抗IL-6R抗體和嵌合抗IL-6R抗體。WO 96/11020描述了主要成分是IL-6拮抗劑例如抗IL-6R抗體的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療劑和滑膜細(xì)胞生長抑制劑。W096/12503描述了對由IL-6產(chǎn)生而引起的疾病的治療，所述疾病例子有漿細(xì)胞增多癥、高免疫球蛋白血癥、貧血、腎炎、惡病質(zhì)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、Castleman氏癥以及系膜增殖性腎炎。WO 98/42377描述了與敏化的T細(xì)胞相關(guān)的疾病例如多發(fā)性硬化癥、葡萄膜炎、慢性甲狀腺炎、遲發(fā)性過敏、接觸性皮炎以及遺傳過敏性皮炎的預(yù)防/治療劑，其中活性成分是抗IL-6R抗體。WO 98/42377描述了系統(tǒng)性紅斑狼瘡的治療劑，其中活性成分是抗IL-6R抗體。WO 99/47170描述了 Crohn氏病的治療劑，其中活性成分是抗IL-6R抗體。WO 00/10607描述了胰腺炎的治療劑，其中活性成分是抗IL-6R抗體。WO 02/3492描述了銀屑病的治療劑，其中活性成分是抗IL-6R抗體。另外，WO 02/080969描述了幼年型特發(fā)性關(guān)節(jié)炎的治療劑， 其中活性成分是抗IL-6R抗體。發(fā)明概述如上所述，已經(jīng)知道其活性成分是抗IL-6R抗體的多種預(yù)防或治療劑。然而，還不知道抗IL-6R抗體與免疫抑制劑，例如氨甲蝶呤(methotrexate，MTX)組合在治療IL-6相關(guān)疾病中可獲得協(xié)同作用，不知道在與抗IL-6R抗體一起治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎時(shí)免疫抑制劑，例如氨甲蝶呤(MTX)能降低或預(yù)防變態(tài)反應(yīng)，不知道在以抗IL-6抗體治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎時(shí)高劑量抗IL-6R抗體能降低或預(yù)防變態(tài)反應(yīng)。因此，本發(fā)明提供了治療IL-6相關(guān)疾病的藥物組合物，包括白介素-6拮抗劑(IL-6拮抗劑)和免疫抑制劑。本發(fā)明還提供了包括免疫抑制劑的藥物組合物，以增強(qiáng)使用IL-6拮抗劑治療 IL-6相關(guān)疾病的效果。本發(fā)明還提供了包括免疫抑制劑的藥物組合物，以預(yù)防或降低用IL-6拮抗劑治療IL-6相關(guān)疾病時(shí)的變態(tài)反應(yīng)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于高劑量給藥的IL-6相關(guān)疾病治療劑，該治療劑包括 IL-6拮抗劑。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含高劑量IL-6拮抗劑的藥物組合物，以預(yù)防或降低IL-6 相關(guān)疾病治療中的變態(tài)反應(yīng)。IL-6拮抗劑優(yōu)選是抗IL-6R抗體。抗IL-6R抗體優(yōu)選是抗IL-6R的單克隆抗體。 優(yōu)選，抗IL-6R抗體是抗人IL-6R的單克隆抗體?；蛘邇?yōu)選，抗IL-6R抗體是抗小鼠IL-6R 的單克隆抗體。優(yōu)選，抗IL-6R抗體是重組型抗體。優(yōu)選，人抗IL-6R單克隆抗體是例如 PM-I抗體。優(yōu)選，小鼠抗IL-6R單克隆抗體是例如MR16-1抗體。進(jìn)一步地，抗體可以是抗 IL-6R的嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。特別優(yōu)選抗IL-6R抗體是例如人源化的PM-I抗體。當(dāng)IL-6拮抗劑，特別是抗IL-6R抗體與免疫抑制劑組合時(shí)，IL_6拮抗劑，特別是抗IL-6R抗體的劑量，例如在靜脈輸注的情況下是0. 02-150mg/kg/4周或顯示出與其等同的血液抗IL-6R抗體濃度的劑量，優(yōu)選0. 5-30mg/kg/4周或顯示出與其等同的血液抗IL-6R 抗體濃度的劑量，更優(yōu)選2-8mg/kg/4周或顯示出與其等同的血液抗IL-6R抗體濃度的劑量。當(dāng)高劑量給予IL-6拮抗劑，特別是抗IL-6R抗體時(shí)，IL-6拮抗劑，特別是抗IL-6R 抗體的劑量是，例如在靜脈輸注的情況下不低于細(xì)g/kg/4周或顯示出與其等同的血液抗 IL-6R抗體濃度的劑量，優(yōu)選6-16mg/kg/4周或顯示出與其等同的血液抗IL-6R抗體濃度的劑量，更優(yōu)選6-10mg/kg/4周或顯示出與其等同的血液抗IL-6R抗體濃度的劑量。當(dāng)MTX用作免疫抑制劑時(shí)，MTX的劑量是，例如I-IOOmg/個體(body)/周或顯示出與其等同的血液MTX濃度的劑量，優(yōu)選4-50mg/個體/周或顯示出與其等同的血液MTX濃度的劑量，特別優(yōu)選10-25mg/個體/周或顯示出與其等同的血液MTX濃度的劑量。顯示出所述血藥(如抗IL-6R抗體MTX)濃度的劑量，是指產(chǎn)生等同療效的劑量， 即使血液濃度的轉(zhuǎn)換隨給藥方法如靜脈注射和皮下注射而變化時(shí)，只要療效等同，該劑量就被認(rèn)為是顯示出所述血藥(如抗IL-6R抗體或MTX)濃度的劑量。IL-6相關(guān)疾病的例子包括，急慢性炎癥和自身免疫疾病腎炎、腎小球膜增殖性腎炎(mesangial proliferative nephritis), Crohn氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、胰腺炎、幼年型特發(fā)性關(guān)節(jié)炎或系統(tǒng)性幼年型特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、血管炎、Kawasaki氏病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡 (systemic erythematosus)、銀屑病、Sjogren 綜合癥、成人 Still 氏?。荒[瘤疾病多發(fā)性骨髓瘤、Castleman氏病、惡性淋巴瘤、腎癌；感染性疾病HIV感染、EBV感染；惡病質(zhì)(cachexia)惡病質(zhì)；其它漿細(xì)胞增多癥，高免疫球蛋白血癥，貧血等，優(yōu)選類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，漿細(xì)胞增
6多癥，高免疫球蛋白血癥，貧血，腎炎，惡病質(zhì)，多發(fā)性骨髓瘤，Castleman氏病，腎小球膜增殖性腎炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，Crohn氏病，胰腺炎，銀屑病，幼年型特發(fā)性關(guān)節(jié)炎，或系統(tǒng)性幼年型特發(fā)性關(guān)節(jié)炎。本發(fā)明的藥物組合物可以口服或胃腸外以及全身或局部給藥。例如，可以選擇靜脈注射，如滴注，肌肉注射，腹腔注射，皮下注射，栓劑，結(jié)腸注射，口服腸衣藥等。給藥方法可以根據(jù)患者年齡和狀況適當(dāng)選擇。實(shí)際劑量的上下限受給藥頻率影響，例如給藥間隔長時(shí)每劑藥的劑量增加，給藥間隔短時(shí)每劑藥的劑量減少。對于抗IL-6受體的抗體的優(yōu)選劑量和給藥方式，例如使血液中存在游離抗體的量是有效劑量。作為具體的例子，有分為一至幾次給藥的方法，例如，利用靜脈注射，如滴注和皮下注射的方法，按照如下給藥方案進(jìn)行2次/周，1次/周，1次/2周，1次/4周，1次 /6周，1次/8周等。隨著觀察疾病情況和血液的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的變化，給藥方案可以進(jìn)行調(diào)整， 例如延長給藥間隔從2次/周或1次/周到1次/2周，1次/3周，1次/4周，1次/6周以及1次/8周。當(dāng)與MTX組合給藥時(shí)，例如在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的情況下，典型地，抗IL-6R抗體的劑量高于0. 5mg/kg/周或者是顯示出等同或更多抗風(fēng)濕效果的劑量。例如，當(dāng)1次/4 周進(jìn)行靜脈給藥時(shí)，劑量為0. 02-150mg/kg，優(yōu)選0. 5_30mg/kg，更優(yōu)選2_8mg/kg?？笽L-6R抗體與免疫抑制劑可以同時(shí)給藥或間隔一段時(shí)間給藥。免疫抑制劑還包括抗風(fēng)濕劑，腎上腺皮質(zhì)激素劑等，并包括例如下列藥物A.免疫抑制劑，抗風(fēng)濕劑，腎上腺皮質(zhì)激素劑免疫抑制劑烷化劑環(huán)磷酰胺代謝拮抗劑硫唑嘌呤，甲氨蝶呤，咪唑立賓T細(xì)胞活性抑制劑環(huán)孢菌素，他克莫司抗風(fēng)濕劑羥氯喹，柳氮磺吡啶(sulfasalazine)，來氟米特，依那西普，英夫利昔單抗 (infliximab)，阿達(dá)木單抗(adalimumab)，D-青霉胺，可口服金化合物，可注射金化合物 (肌肉注射)，米諾環(huán)素，硫代蘋果酸金鈉，金諾芬，D-青霉胺，氯苯扎利，布西拉明，阿克他利；腎上腺皮質(zhì)激素劑可的松，氫化可的松類醋酸可的松，氫化可的松，氫化可的松磷酸鈉，氫化可的松琥珀酸鈉，醋酸氟氫可的松潑尼松龍，潑尼松龍類潑尼松龍，潑尼松龍琥珀酸鈉，潑尼松龍磷酸鈉，醋酸鹵潑尼松甲基潑尼松龍類甲基潑尼松龍，醋酸甲基潑尼松龍，甲基潑尼松龍琥珀酸鈉
曲安西龍類曲安西龍，醋酸曲安西龍，曲安西龍錒(triamcinolone actinide)地塞米松類地塞米松，醋酸地塞米松，地塞米松磷酸鈉，地塞米松棕櫚酸酯倍他米松類倍他米松(倍他米松磷酸鈉)，倍他米松，倍他米松磷酸鈉帕拉米松類醋酸帕拉米松免疫抑制劑的劑量，例如在組合MTX治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎時(shí)，例如在口服給藥的情況下，為I-IOOmg/個體/周，優(yōu)選4-50mg，更優(yōu)選7. 5_25mg/個體。此外，抗IL-6R抗體的高劑量是指能預(yù)防或減少變態(tài)反應(yīng)的劑量，該劑量等于或高于治療IL-6相關(guān)疾病的最小有效劑量。例如，在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎且每4周進(jìn)行靜脈滴注的情況下，該劑量包括細(xì)g/kg或更多，優(yōu)選6-16mg/kg，更優(yōu)選6-10mg/kg。上述的給藥方法、給藥間隔以及給藥劑量是優(yōu)選實(shí)例的舉例?？梢赃m當(dāng)選擇顯示出相似療效的給藥方法、間隔和劑量。例如，可以通過測量血液中各種藥物的濃度來選擇與上述優(yōu)選實(shí)例具有相似效果的給藥方法、間隔和劑量。本發(fā)明包括可達(dá)到與上述實(shí)例具有等同血液濃度的給藥方法、間隔和劑量。
具體實(shí)施例方式用在本發(fā)明中的IL-6拮抗劑不需要考慮它的來源、類型、形式，只要它展示預(yù)防或治療IL-6相關(guān)疾病的效果就可以。IL-6拮抗劑是抑制IL-6生物學(xué)活性的物質(zhì)。IL-6拮抗劑優(yōu)選是具有抑制與IL-6， IL-6R，或gpl30的結(jié)合的效果的物質(zhì)。IL-6拮抗劑包括抗IL-6抗體、抗IL-6R抗體、抗 gpl30抗體、經(jīng)修飾的IL-6、經(jīng)修飾的可溶性IL-6R，或IL-6或IL-6R的部分肽，以及展示相似活性的低分子物質(zhì)。用在本發(fā)明中的抗IL-6抗體可以用本領(lǐng)域已知的方法以單克隆或多克隆抗體的形式獲得。就本發(fā)明中所用的抗IL-6抗體來說，優(yōu)選來自哺乳動物的單克隆抗體。來自哺乳動物的單克隆抗體包括雜交瘤生產(chǎn)的抗體和通過基因工程技術(shù)用包含抗體基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞生產(chǎn)的抗體。該抗體可通過與IL-6結(jié)合來抑制IL-6與IL-6受體的結(jié)合，從而阻斷IL-6生物學(xué)活性信號傳導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞。這樣的抗體包括 MH166(Matsuda, Τ. et al.，Eur. J. Immunol.，18 :951-956, 1988)禾口 SK2(Sato, K. et al. , The 21s t Proceedings of the Japanese Society for Immunology,21 :166,1991)。產(chǎn)生抗IL-6抗體的雜交瘤可以基本按如下使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)制備。S卩，雜交瘤可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)免疫方法用IL-6作為致敏抗原進(jìn)行免疫，然后將得到的免疫細(xì)胞用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞融合方法與本領(lǐng)域已知的親本細(xì)胞進(jìn)行融合，并用標(biāo)準(zhǔn)篩選方法篩選生產(chǎn)單克隆抗體的細(xì)胞而得到。具體地，抗IL-6抗體可以如下制備。例如，可以通過公開在Eur. J. Biochem.，168 543-550，1987 J. Immunol.，140 :1534-1541,1988 或者 Agr. Biol. Chem. ,54 :2685-2688,1990的IL-6基因/氨基酸序列，獲得用作致敏抗原以獲得抗體的人IL-6。將IL-6基因序列插入本領(lǐng)域已知的表達(dá)載體中，然后將其轉(zhuǎn)化至合適的宿主細(xì)胞中，接著用本領(lǐng)域已知的方法從細(xì)胞或培養(yǎng)上清液中純化目標(biāo)IL-6蛋白，純化的IL-6蛋白可以用作致敏抗原。同樣，IL-6與其它蛋白的融合蛋白也可以用作致敏抗原。用在本發(fā)明中的抗IL-6受體抗體可以通過本領(lǐng)域已知的方法以單克隆或多克隆抗體的形式獲得。就用于本發(fā)明的抗IL-6受體抗體而言，優(yōu)選來自哺乳動物的單克隆抗體。來自哺乳動物的單克隆抗體包括雜交瘤生產(chǎn)的抗體和通過基因工程技術(shù)用包含抗體基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞而生產(chǎn)的抗體。該抗體可以通過與IL-6受體結(jié)合來抑制IL-6 與IL-6受體的結(jié)合而阻斷IL-6生物活性信號傳導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞。這樣的抗體包括MR16-1 抗體(Tamura，Τ. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 11924-11928，1993)、PM-1 抗體(Hirata, Y. et al.，J. Immunol.，143 :2900-2906,1989)、 AUK-12-20抗體、AUK64-7抗體或AUK146-15抗體(國際專利申請公開No. WO 92-19759)。 其中，特別優(yōu)選的抗體包括PM-I抗體。生產(chǎn)PM-I抗體的雜交瘤細(xì)胞系作為PM-1，已經(jīng)基于布達(dá)佩斯條約以保藏編號 FERM BP-2998于1989年7月12日在國際專利生物保藏單位(AIST Tsukuba Central 6， 1-1，Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki Pref.)作出國際保藏。生產(chǎn) MR16-1 抗體的雜交瘤細(xì)胞系作為大鼠-小鼠雜交瘤MR16-1 (Rat-mouse hybridoma MR16-1)，已基于布達(dá)佩斯條約以保藏編號FERMBP-5875于1997年3月13日在國際專利生物保藏單位(AIST Tsukuba Central6,1-1, Higashil-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki Pref.)作出 IS際 1 。生產(chǎn)抗IL-6受體單克隆抗體的雜交瘤可以基本通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)按如下制備。即，雜交瘤可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)免疫方法用IL-6受體作為致敏抗原進(jìn)行免疫，然后將得到的免疫細(xì)胞用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞融合方法與本領(lǐng)域已知的親本細(xì)胞進(jìn)行融合，用標(biāo)準(zhǔn)篩選方法篩選生產(chǎn)單克隆抗體的細(xì)胞而得到。具體地，抗IL-6受體抗體可以如下制備。例如，用作致敏抗原以獲得抗體的人 IL-6受體可以通過分別公開在歐洲專利申請公開No. EP325474和JP-A-3-155795的IL-6
受體基因/氨基酸序列而獲得。IL-6受體蛋白有兩種類型，S卩，一種表達(dá)在細(xì)胞上，一種與細(xì)胞膜分離(可溶性 IL-6 受體)(Yasukawa, K. et al.，J. Biochem.，108 :673-676)?？扇苄?IL-6 受體基本上由 IL-6受體的胞外區(qū)構(gòu)成，它與膜結(jié)合IL-6受體的區(qū)別在于沒有跨膜區(qū)或沒有跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)。只要被用作致敏抗原生產(chǎn)用于本發(fā)明的抗IL-6受體抗體，兩種IL-6受體蛋白都可以使用。將IL-6受體的基因序列插入本領(lǐng)域已知的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化其至合適的宿主細(xì)胞， 接著用本領(lǐng)域已知的方法從細(xì)胞或培養(yǎng)上清液純化目標(biāo)IL-6受體蛋白，純化的IL-6受體蛋白可以用作致敏抗原。同樣，表達(dá)IL-6受體的細(xì)胞和IL-6受體與其它蛋白的融合蛋白也可以用作致敏抗原。質(zhì)粒pIBIBSF2R包括編碼人IL_6受體的cDNA，包含該質(zhì)粒的大腸桿菌 HB101-pIBIBSF2R已基于布達(dá)佩斯條約以保藏號FERM BP-2232于1989年1月9日起在國際專利生物保藏單位(AIST Tsukuba Central 6,1-1, Higashil-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki Pref.)進(jìn)行國際保藏。
用在本發(fā)明中的抗gpl30抗體可以通過本領(lǐng)域已知的方法以單克隆或多克隆抗體的形式獲得。就用于本發(fā)明的抗gpl30抗體來說，優(yōu)選來自哺乳動物的單克隆抗體。來自哺乳動物的單克隆抗體包括雜交瘤生產(chǎn)的抗體和通過基因工程技術(shù)用包含抗體基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞而生產(chǎn)的抗體。該抗體可以通過與gpl30結(jié)合來抑制IL-6/IL-6受體復(fù)合物與gpl30的結(jié)合從而阻斷IL-6的生物活性信號傳導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞。這樣的抗體包括AM64 抗體(JP-A_3_219894)、4B11 抗體和 2H4 抗體(US5571513)、 B-S12 抗體以及 B-P8 抗體(JP-A-8-291199)。生產(chǎn)抗gpl30單克隆抗體的雜交瘤可以基本通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)按如下制備。 即，雜交瘤可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)免疫方法用gpl30作為致敏抗原進(jìn)行免疫，將得到的免疫細(xì)胞用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞融合方法與本領(lǐng)域已知的親本細(xì)胞進(jìn)行融合，用標(biāo)準(zhǔn)篩選方法篩選生產(chǎn)單克隆抗體的細(xì)胞而得到。具體地，單克隆抗體可以如下制備。例如，用作致敏抗原以獲得抗體的gpl30可以通過使用公開在歐洲專利申請公開No. EP 411946的gpl30基因/氨基酸序列而獲得。將gpl30的基因序列插入本領(lǐng)域已知的表達(dá)載體系統(tǒng)，轉(zhuǎn)化其至合適的宿主細(xì)胞，接著用本領(lǐng)域已知的方法從細(xì)胞或培養(yǎng)上清液純化目標(biāo)gpl30蛋白，純化的gpl30蛋白可以用作致敏抗原。同樣，表達(dá)gpl30的細(xì)胞和gpl30蛋白與其它蛋白的融合蛋白也可以用作致敏抗原。用致敏抗原免疫的哺乳動物沒有特別的限制，但優(yōu)選在考慮與用于細(xì)胞融合的親本細(xì)胞的相容性的情況下進(jìn)行選擇。一般來說，使用嚙齒類動物如小鼠、大鼠和倉鼠。用致敏抗原免疫動物可以通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行。作為常規(guī)方法，可以通過腹膜內(nèi)或皮下給動物注射致敏抗原進(jìn)行。特別是，優(yōu)選致敏抗原適當(dāng)?shù)赜肞BS (磷酸緩沖鹽水)或鹽水稀釋和懸浮，其與適量的標(biāo)準(zhǔn)佐劑，例如弗氏完全佐劑混合，乳化，接著以間隔 4-21天的方式幾次給予哺乳動物。另外，可以在用致敏抗原免疫時(shí)使用合適的載體。動物按照上述方式免疫，然后確認(rèn)所需抗體的血清水平是增加的。接著，從哺乳動物中取出免疫細(xì)胞用于細(xì)胞融合。優(yōu)選地，用于細(xì)胞融合的免疫細(xì)胞特別包括脾細(xì)胞。就作為與上述免疫細(xì)胞融合的伙伴親本細(xì)胞的哺乳動物骨髓瘤細(xì)胞來說，可以適當(dāng)使用本領(lǐng)域已知的細(xì)胞系，例如:P3X63Ag8. 653 (Kearney, J. F. et al.，J. Immunol.， 123 :1548-1550,1979)、P3X63Ag8U. 1 (Current Topics in Microbiology and Immunology, 81 :1-7,1978)、NS-l(Kohler, G. and Milstein, C.，Eur. J. Immunol.，6 :511-519，1976)、 M0C-11(Margulies D. H. et al. , Cell, 8 :405-415,1976), SP2/0 (Shulman, M. et al.， Nature, 276 :269-270,1978)、F0(de St.Groth,S. F. et al.，J. Immunol,Methods,35 :1-21, 1980)、S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med.，148 :311_323，1978)、R210 (Galfre，G. et al.， Nature, 277 :131-133,1979)。上述免疫細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞融合可以基本通過本領(lǐng)域已知的方法，例如 milstein 氏方法(Kohler G. and Milstein C. ,Methods Enzymol. ,73 :3-46,1981)進(jìn)行。更具體地，上述細(xì)胞融合可以例如在細(xì)胞融合促進(jìn)劑存在時(shí)于標(biāo)準(zhǔn)營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行。就細(xì)胞融合促進(jìn)劑來說，例如聚乙二醇(PEG)，仙臺病毒(HVJ)等都可以使用?？梢愿鶕?jù)需要進(jìn)一步加入/使用輔助劑，例如二甲亞砜以提高融合效率。免疫細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的應(yīng)用比例優(yōu)選為例如免疫細(xì)胞為骨髓瘤細(xì)胞的1-10倍。作為用于上述細(xì)胞融合的培養(yǎng)基，可以使用RPMI 1640培養(yǎng)基、適宜骨髓瘤細(xì)胞系生長的MEM培養(yǎng)基，以及可用于該類型細(xì)胞培養(yǎng)物的其他標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，而且可以進(jìn)一步與血清補(bǔ)充物，例如胎牛血清(FCS)組合。為了細(xì)胞融合，可通過將上述免疫細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞以給定量在上述培養(yǎng)基中徹底混合，加入PEG溶液，例如加入在37°C預(yù)熱的標(biāo)準(zhǔn)濃度30-60% (w/v)的平均分子量約 1000-6000的PEG溶液，并混合，以形成目的融合細(xì)胞(雜交細(xì)胞瘤)。隨后，可以通過重復(fù)相繼地添加適宜培養(yǎng)基和離心除上清的操作而去除對雜交瘤生長不利的細(xì)胞融合劑等。雜交瘤可以通過在標(biāo)準(zhǔn)篩選培養(yǎng)基中，例如在HAT培養(yǎng)基(含次黃嘌呤，氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基)中培養(yǎng)而篩選。典型地，在HAT培養(yǎng)基中的培養(yǎng)持續(xù)幾天至幾周，足夠的時(shí)間期限直至除了目的雜交瘤以外的其他細(xì)胞(非融合細(xì)胞)滅絕。然后采用標(biāo)準(zhǔn)極限稀釋方法篩選和克隆生產(chǎn)目的抗體的雜交瘤。此外，除了通過用抗原免疫除人類以外的其它動物獲得上述雜交瘤以外，也可以通過在體外用抗原蛋白或表達(dá)抗原的細(xì)胞致敏人淋巴細(xì)胞，然后將致敏B淋巴細(xì)胞與人骨髓瘤細(xì)胞，例如U266細(xì)胞(參見JP-B-1-59878)融合而獲得具有對期望抗原或表達(dá)該抗原的細(xì)胞的結(jié)合活性的所需人抗體。而且，也可以將抗原或抗原表達(dá)細(xì)胞給予含有人抗體基因所有組成部分的轉(zhuǎn)基因動物，根據(jù)上述方法來獲得所需人抗體(參見國際專利申請公開 Nos. WO 93/12227, W092/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735)。以該方法制備的產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤可以培養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中，也可以長期貯存在液氮中。為了從雜交瘤獲得單克隆抗體，可以使用以下方法按標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)雜交瘤，然后以培養(yǎng)上清液的形式獲得單克隆抗體；或者將雜交瘤施用予相容的哺乳動物以增殖，然后以腹水形式獲得單克隆抗體。前一方法適合獲得高純度抗體，后一方法適合大規(guī)模生產(chǎn)抗體。例如，可以用JP-A-3-139293公開的方法制備產(chǎn)生抗IL_6受體抗體的雜交瘤。所以實(shí)施如下方法將產(chǎn)生PM-I抗體的雜交瘤腹膜內(nèi)注射到BALB/c小鼠以獲得腹水，然后從該腹水純化PM-I抗體，其中產(chǎn)生PM-I抗體的雜交瘤基于布達(dá)佩斯條約以保藏號FERM BP1998于1989年7月12日國際保藏在國際專利生物保藏單位(AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashil-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki Pref.)。而且，可以實(shí)施如下方法將此雜交瘤培養(yǎng)在合適的培養(yǎng)基中，例如培養(yǎng)在RPMI 1640培養(yǎng)基、雜交瘤SFM培養(yǎng)基 (GIBC0-BRL 提供)、或者含有 10%胎牛血清和 5% BM-Condimed Hl (Boehringer Mannheim 提供)的PFHM-II培養(yǎng)基(GIBC0-BRL提供)中，然后從它的培養(yǎng)上清液純化PM-I抗體。在本發(fā)明中，就單克隆抗體來說，可以用按如下方式制備的重組型抗體從雜交瘤中克隆抗體基因，將該基因插入合適的載體，將其導(dǎo)入至宿主細(xì)胞以及采用基因工程技術(shù) (參見，例如，Borrebaeck,C. A. K.禾口Larrick, J. Μ· ,Therapeutic Monoclonal Antibodies, Macmillan出版社在英國出版，1990)。具體地，可以從產(chǎn)生目的抗體的細(xì)胞，例如雜交瘤分離編碼抗體可變區(qū)(V)的 mRNA。為了分離mRNA，可通過本領(lǐng)域已知的方法，例如胍超離心法(Chirgwin，J. Μ. . et al.， Biochemistry, 18 :5294-5299,1979)、AGPC ^ (Chomczynski, P. et al. ， Anal. Biochem.，162 156-159，1987)制備總RNA，然后使用mRNA純化試劑盒(Pharmacia提供)制備mRNA。 同樣，mRNA也可以通過QuickPr印mRNA純化試劑盒(Pharmacia提供)直接制備?？梢詮墨@得的mRNA用逆轉(zhuǎn)錄酶合成抗體V區(qū)的cDNA。也可以使用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶第一鏈cDNA合成試劑盒等合成cDNA。同樣，5' -Ampli FINDER RACE試劑盒(Clontech 提供)和使用 PCR 的 5 ‘ -RACE 法(Frohman，Μ. A. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 8998-9002，1988 ；Belyavsky A. et al. ,Nucleic Acids Res.，17 :2919-2932,1989)也可以用于合成和擴(kuò)增cDNA。從所獲的PCR產(chǎn)物純化目的DNA片段，然后連接至載體DNA。接著， 將這種方法制備的重組載體導(dǎo)入至大腸桿菌，篩選菌落以制備所需重組載體?？梢杂帽绢I(lǐng)域已知的方法，例如脫氧法證實(shí)目的DNA的堿基序列。如果獲得了編碼目的抗體V區(qū)的DNA，那么可以將該DNA與編碼所需抗體的恒定區(qū)(C區(qū))的DNA連接，然后將其摻入表達(dá)載體中?；蛘撸部梢詫⒕幋a抗體V區(qū)的DNA摻入含有抗體C區(qū)的表達(dá)載體中。為了制備用于本發(fā)明的抗體，可以將抗體基因摻入表達(dá)載體以便在表達(dá)調(diào)控區(qū)， 例如在下文中描述的增強(qiáng)子和啟動子的調(diào)節(jié)下表達(dá)。接著，將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞以表達(dá)抗體。在本發(fā)明中，可以用人工修飾的基因重組抗體，例如嵌合抗體、人源化抗體和人抗體以降低對人的同種異體抗原性。這些修飾抗體可以用已知方法制備。嵌合抗體可以通過待導(dǎo)入宿主進(jìn)行生產(chǎn)的將上述獲得的編碼抗體V區(qū)的DNA與編碼人抗體C區(qū)的DNA連接，然后摻入表達(dá)載體中而獲得(參見歐洲專利申請公開No. EP 125023，國際專利申請公開No. W092/19759)。利用這些已知方法，可以獲得用在本發(fā)明中的嵌合抗體。例如，含有編碼PM-I嵌合抗體L鏈和H鏈V區(qū)的DNA的質(zhì)粒分別命名為 Escherichia coli DH5 pPM_k3和Escherichia coli DH5pPM_hl，同時(shí)，含有這些質(zhì)粒的大腸桿菌已基于布達(dá)佩斯條約于1991年2月12日分別以NCIMB 40366、NCIMB 40362國際保藏在國立工業(yè)和海洋微生物保藏有限公司03 St. Machar Drive, Aberdeen AB21RY，蘇格蘭，英國)。人源化抗體也稱重構(gòu)的人抗體，它是非人哺乳動物例如小鼠的抗體的互補(bǔ)決定區(qū) (CDR)植入人抗體互補(bǔ)決定區(qū)的抗體，其常規(guī)基因重組方法也是已知的(參見歐洲專利申請公開NO. EP 125023，國際專利申請公開No. W092/19759)。具體地，由在末端具有重疊部分的幾個寡核苷酸通過PCR合成設(shè)計(jì)用于將小鼠抗體⑶R與人類抗體構(gòu)架區(qū)(FR)連接的DNA序列。所獲DNA與編碼人抗體C區(qū)的DNA連接， 然后摻入表達(dá)載體，將該載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞以產(chǎn)生人源化抗體(參見歐洲專利申請公開EP 239400，國際專利申請公開WO 92/19759)。就經(jīng)由⑶R連接的人抗體FR來說，選擇使互補(bǔ)決定區(qū)形成良好抗原結(jié)合位點(diǎn)的 FR。抗體可變區(qū)的構(gòu)架區(qū)氨基酸，如果需要，可以進(jìn)行替代，以使重構(gòu)的人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)形成正確的抗原結(jié)合位點(diǎn)(Sato, K. et al.，Cancer Res. ,53 =851-856,1993)。人抗體C區(qū)可以用于嵌合抗體和人源化抗體。人抗體C區(qū)包括CY，例如，CyU CY2、CY3或CY4都可以使用?？梢孕揎椚丝贵wC區(qū)來提高抗體穩(wěn)定性或其產(chǎn)量。嵌合抗體由源自非人哺乳動物的抗體的可變區(qū)和源自人抗體的C區(qū)構(gòu)成。人源化抗體由源自非人哺乳動物抗體的互補(bǔ)決定區(qū)和源自人抗體的構(gòu)架區(qū)和C區(qū)構(gòu)成。因此這些抗體降低了在人體內(nèi)的抗原性，從而可被用作本發(fā)明的抗體。用于本發(fā)明的人源化抗體的優(yōu)選具體實(shí)例包括人源化PM-I抗體(參見國際專利申請公開 No. WO 92-19759)。同樣，作為獲得人抗體的方法，除了上述方法以外，利用人抗體文庫通過淘選獲得人抗體的技術(shù)也是已知的。例如，人抗體的可變區(qū)可以通過噬菌體展示方法作為單鏈抗體 (scFv)表達(dá)在噬菌體表面，然后篩選結(jié)合抗原的噬菌體。分析篩選出的噬菌體的基因，可以確定編碼結(jié)合抗原的人抗體的可變區(qū)的DNA序列。如果闡明了結(jié)合抗原的scFv的DNA 序列，那么可以通過合適表達(dá)載體操作該序列以獲得人抗體。這些方法已經(jīng)是已知的且可以引用 WO 92101047,W092/2079UW0 93/06213,WO 93/11236,WO 93/19172,WO 95/01438 和 W095/15388。上述構(gòu)建的抗體基因可以用本領(lǐng)域已知的方法表達(dá)和獲得。當(dāng)使用哺乳動物細(xì)胞時(shí)，抗體基因可以由功能性地連接了常用啟動子、要表達(dá)的抗體基因以及3’下游poly A信號的DNA來表達(dá)，也可以由含有它們的載體來表達(dá)。例如啟動子/增強(qiáng)子可以包括人巨細(xì)胞病毒立即早期啟動子/增強(qiáng)子。同樣，對于能夠用于本發(fā)明抗體的表達(dá)的其它啟動子/增強(qiáng)子，可以使用反轉(zhuǎn)錄病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿猴病毒40 (SV40)的病毒啟動子/增強(qiáng)子和源自哺乳動物細(xì)胞人延伸因子1 α (HEF1 α )的啟動子/增強(qiáng)子。例如，可以根據(jù)Mulligan 等的方法(Mulligan, R. C. et al.，Nature, 277 108-114，1979)在使用SV40啟動子/增強(qiáng)子的情況下進(jìn)行表達(dá)，或可以根據(jù)Mizushima等的方法(Mizushima，S and Nagata, S. ,Nucleic Acids Res.，18 :5322,1990)在使用 HEFl α 啟動子/增強(qiáng)子的情況下進(jìn)行表達(dá)。對于大腸桿菌，可以通過功能性地連接常用啟動子、抗原分泌信號序列和要表達(dá)的抗體基因來表達(dá)抗體基因。例如，啟動子可以包括IacZ啟動子和araB啟動子。在使用 IacZ啟動子和araB啟動子的情況下，可以分別采用Ward等的方法(Ward，Ε. S. et al.， Nature,341 :544-546,1989 ；Ward,Ε. S. et al.，F(xiàn)ASEB J.，6 :2422-2427,1992)和Better等的方法(Better，M.et al.，Science，240 1041-1043，1988)。作為抗體分泌信號序列，當(dāng)在大腸桿菌周質(zhì)中生產(chǎn)的情況下，可以使用pelB信號序列(Lei, S. P. et al.，Bacteriol.，169 =4379-4383,1987) 分離生產(chǎn)于周質(zhì)中的抗體，接著進(jìn)行適當(dāng)?shù)目贵w結(jié)構(gòu)重折疊以便使用抗體(參見，例如W0 96/30394)。可以用源自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭瘤病毒(BPV)的復(fù)制起點(diǎn)。另外，為了在宿主細(xì)胞系統(tǒng)中擴(kuò)增基因拷貝數(shù)，表達(dá)載體可以包括氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)基因， 胸苷激酶(TK)基因，大腸桿菌黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Ecogpt)基因以及二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等作為篩選標(biāo)記。為了生產(chǎn)用于本發(fā)明的抗體，可以使用任選的生產(chǎn)系統(tǒng)。有制備抗體的體外和體內(nèi)生產(chǎn)系統(tǒng)。體外生產(chǎn)系統(tǒng)包括使用真核細(xì)胞的生產(chǎn)系統(tǒng)和使用原核細(xì)胞的生產(chǎn)系統(tǒng)。在使用真核細(xì)胞的情況下，存在使用動物細(xì)胞、植物細(xì)胞或真菌細(xì)胞的生產(chǎn)系統(tǒng)。作為動物細(xì)胞已知(1)哺乳動物細(xì)胞，例如CH0、COS、骨髓瘤細(xì)胞、BHK(幼倉鼠腎細(xì)胞)、HeLa、Vero等，(2)兩棲動物細(xì)胞，例如爪蟾卵母細(xì)胞，或者(3)昆蟲細(xì)胞，例如sf9、sf21、Tn5等。作為植物細(xì)胞已知，源自煙草(Nicotiana tabacum)的細(xì)胞，它可以作為愈傷組織培養(yǎng)。作為真菌細(xì)胞已知酵母，例如酵母屬(Saccharomyces)，如釀酒酵母(Sacchromyces cerevisiae)，和絲狀真菌，例如曲霉屬(Aspergillus)，如黑曲霉 (Aspergillus niger)。當(dāng)使用原核細(xì)胞時(shí)，存在使用細(xì)菌細(xì)胞的生產(chǎn)系統(tǒng)。作為細(xì)菌細(xì)胞，已知大腸桿菌 (E. coli)禾口枯草桿菌(Bacillus sabtilis)?？贵w可以通過將靶抗體基因經(jīng)過轉(zhuǎn)化導(dǎo)入這些細(xì)胞，然后體外培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞而獲得。培養(yǎng)可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行。例如，可以用DMEM、MEM、RPMI 1640以及IMDM 作為培養(yǎng)基，而且也可以與血清補(bǔ)充物，例如胎牛血清(FCS)組合使用。抗體可以通過將導(dǎo)入抗體基因的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至動物腹膜腔內(nèi)而體內(nèi)生產(chǎn)。另一方面，體內(nèi)生產(chǎn)系統(tǒng)包括使用動物的生產(chǎn)系統(tǒng)和使用植物細(xì)胞的生產(chǎn)系統(tǒng)。 當(dāng)使用動物細(xì)胞的情況下，有使用哺乳動物和昆蟲的生產(chǎn)系統(tǒng)。作為哺乳動物，可使用山羊，豬，綿羊，小鼠，牛及其它動物(Vicki Glaser, Spectrum Biotechnology Applications，1993)。同樣，作為昆蟲，可以使用蠶。當(dāng)使用植物的情況下，例如，可以使用煙草。將抗體基因?qū)脒@些動物或植物，在動物或植物體內(nèi)生產(chǎn)抗體，然后收集。例如， 抗體基因可以通過插入編碼天然產(chǎn)生在奶中的蛋白，例如山羊β酪蛋白的基因的中游，以融合基因形式制備。將包含有插入了抗體基因的融合基因的DNA片段注射至山羊胚胎，然后轉(zhuǎn)移至雌性山羊。所需抗體可以從接受該胚胎的山羊生出的轉(zhuǎn)基因山羊或其子代山羊的羊奶中獲得。為了增加含所需抗體的奶的量，可以給轉(zhuǎn)基因山羊使用合適的激素 bert， K. Μ. et al.，Bio/Technology, 12 :699-702,1994)。當(dāng)使用蠶的情況下，用插入了靶抗體基因的桿狀病毒感染蠶，然后從蠶體液獲得所需抗體(Maeda, S. et al.，Nature，315 =592-594,1985)。進(jìn)一步，當(dāng)使用煙草的情況下，將靶抗體基因插入植物表達(dá)載體，例如ΦΜΟΝ 530，然后將該載體導(dǎo)入細(xì)菌，例如根癌土壤桿菌。用這些細(xì)菌感染煙草，例如Nicotiana tabacum，從該煙草的葉子得到所需抗體(Jul ian, K. C.，Ma, etal.，Eur. J. Immunol. ,24 131—138，1994)。在用如上所述體外或體內(nèi)生產(chǎn)系統(tǒng)生產(chǎn)抗體時(shí)，編碼抗體重鏈(H鏈)或輕鏈(L 鏈)的DNA可以分開摻入表達(dá)載體，可將這些載體同時(shí)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，或者將編碼H鏈和L鏈的DNA摻入單個表達(dá)載體，可以用該載體轉(zhuǎn)化宿主(參見國際專利申請公開No. WO 94-11523)。用在本發(fā)明中的抗體可以是抗體片段或其修飾物，只要抗體適合使用就可以。例如，抗體片段包括例如Fab，F(xiàn)(ab' )2，F(xiàn)v或者單鏈Fv (scFv)，在kFv中由合適接頭連接 H鏈和L鏈的Fv。具體地，可以用酶，例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶處理抗體以產(chǎn)生抗體片段，或可以構(gòu)建編碼抗體片段的基因，將該基因?qū)氡磉_(dá)載體，然后在合適宿主細(xì)胞中表達(dá)(參見， 例如Co，Μ. S. et al.，J. Immunol.，152 :2968-2976,1994 ；Better, Μ. & Horwitz，Α. Ε.， Methods in Enzymology, 178 :476-496,1989 ;Plueckthun, A. & Skerra, A. , methods in Enzymology，178 :476-496,1989 ；Lamoyi，E.,Methods in Enzymology,121 :652-663,1989 ； Rousseaux, J. et al. , Methods in Enzymology,121 :663-66,1989 ；Bird, R. E. et al.,
14TIBTECH,9 :132-137,1991)。通過連接H鏈V區(qū)與L鏈V區(qū)獲得SCFv。在該scFv中，H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)優(yōu)選通過接頭，特別是肽接頭連接(Huston，J. S. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 :5879-5883, 1988)。scFv中H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)可以來自如上所述的任何抗體。對于連接V區(qū)的肽接頭，可以使用例如由12-19個氨基酸殘基構(gòu)成的給定單鏈肽。以編碼上述抗體的H鏈或H鏈的V區(qū)以及L鏈或L鏈的V區(qū)的DNA為模板，使用定義編碼期望氨基酸序列的DNA部分的末端的引物，通過PCR方法擴(kuò)增模板中編碼期望氨基酸序列的DNA部分；然后進(jìn)一步組合定義待與H和L鏈連接的肽接頭部分兩端的引物，擴(kuò)增編碼肽接頭部分及所述兩端的DNA，由此獲得編碼scFv的DNA。此外，一旦獲得編碼scFv的DNA，可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法獲得含有它的表達(dá)載體以及用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主，然后可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法使用宿主獲得scFv。對這些抗體片段來說，它們的基因可以如同以上一樣獲得，并通過宿主表達(dá)和生產(chǎn)。本發(fā)明所說的“抗體”包括這些抗體片段。作為對抗體的修飾，也可以用與各種分子諸如聚乙二醇(PEG)結(jié)合的抗體。本發(fā)明所說的“抗體”包括這些抗體修飾物。要獲得這樣的抗體修飾物，可以通過對獲得的抗體進(jìn)行化學(xué)修飾。這些方法在本領(lǐng)域中已經(jīng)建立。如上述生產(chǎn)和表達(dá)的抗體可以從細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外及宿主內(nèi)和宿主外分離，并純化成均質(zhì)的?？梢杂糜H和層析進(jìn)行用于本發(fā)明的抗體的分離和純化。用于親和層析的柱子包括，例如蛋白A柱和蛋白G柱。用于蛋白A柱的載體包括Hyper D, P0R0S, Sepharose F. F.等。用于常規(guī)蛋白的其它分離/純化方法都可以使用，對所用方法沒有限制。例如，可以適當(dāng)選擇和組合上述親和層析以外的層析、過濾、超濾、鹽析以及透析等，以分離和純化用于本發(fā)明的抗體。層析的例子包括離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾等。這樣的層析可以應(yīng)用于HPLC(高效液相層析)。另外，也可以使用反相HPLC?？梢酝ㄟ^測吸光度或通過ELISA測量上述所獲的抗體濃度。即，當(dāng)測吸光度時(shí)，用 PBS(-)適當(dāng)稀釋抗體，接著測在280nm的吸光度，以1. 350D = lmg/ml計(jì)算濃度。當(dāng)使用 ELISA時(shí)，可如下進(jìn)行測量。即，用0. IM碳酸氫鹽緩沖液(pH 9. 6)將山羊抗人IgG(TAG公司提供)稀釋至1 μ g/ml，加入IOOml此IgG至96孔板中(Nunc公司提供)，然后4°C過夜溫育使抗體固定。封閉之后，加入100 μ 1適當(dāng)稀釋的本發(fā)明抗體或含抗體的樣本，或者作為標(biāo)準(zhǔn)的人IgG(Cappel公司提供)，然后室溫溫育1小時(shí)。洗滌之后，再加入100 μ 1稀釋5000倍的堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人IgG(Bio Source 公司提供)，然后室溫溫育1小時(shí)。洗滌后，加入底物溶液，溫育，接著用Microplate Reader Model 3550儀(Bio-Rad提供)測量405nm的吸光度以計(jì)算靶抗體濃度。用于本發(fā)明中的經(jīng)修飾的IL-6是具有IL-6受體結(jié)合話性但是不能傳遞IL_6生物活性的物質(zhì)。即，雖然經(jīng)修飾的IL-6可與IL-6競爭性地結(jié)合IL-6受體，但是由于它不能傳遞IL-6的生物學(xué)活性，所以它可以阻斷IL-6的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。可以通過替代IL-6氨基酸序列中的氨基酸殘基引入變異來獲得經(jīng)修飾的IL-6。 作為經(jīng)修飾的IL-6的來源的IL-6可以獲自任何來源，但考慮到抗原性優(yōu)選人IL-6。具體地，IL-6的修飾可以用本領(lǐng)域已知的分子建模程序，例如WHATIF (Vriend et al.，Mol. Graphics, 8 =52-56,1990)預(yù)測IL-6氨基酸序列二級結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步評價(jià)要替代的氨基酸殘基對整個蛋白的影響而進(jìn)行。在確定合適的將要替代的氨基酸殘基之后，用含有編碼人IL-6基因的堿基序列的載體作為模板，通過常規(guī)PCR法導(dǎo)入使氨基酸被替代的變異，而獲得經(jīng)修飾的IL-6的編碼基因。通過將該編碼基因摻入合適的所需載體中，然后再進(jìn)行上文中記載的重組抗體表達(dá)、生產(chǎn)和純化方法，可以獲得經(jīng)修飾的IL-6。修飾的IL-6 的具體例子公開在 Brakenhoff et al.，J. Biol. Chem.，269 :86-93, 1994 和 Savino et al.，EMBO J.，13 1357-1367，1994，WO 96/18648 和 WO 96/17869。用于本發(fā)明的IL-6的部分肽或IL-6受體的部分肽分別具有結(jié)合IL-6受體或 IL-6的活性，并且是不傳遞IL-6的生物活性的物質(zhì)。S卩，IL-6部分肽或IL-6受體部分肽分別通過結(jié)合和俘獲IL-6受體或IL-6而特異性地抑制IL-6與IL-6受體的結(jié)合。結(jié)果， 由于它們不傳遞IL-6生物活性，所以它們可以阻斷由IL-6引起的信號傳導(dǎo)。IL-6的部分肽或IL-6受體的部分肽是由IL_6或IL_6受體的氨基酸序列中參與 IL-6與IL-6受體結(jié)合的部分或全部氨基酸序列組成的肽。這樣的肽通常由10-80個氨基酸殘基組成，優(yōu)選20-50個，更優(yōu)選20-40個。IL-6的部分肽或IL-6受體的部分肽可以通過確定IL-6或IL-6受體的氨基酸序列中參與和IL-6或IL-6受體結(jié)合的區(qū)域，然后用已知的常規(guī)方法，例如基因工程技術(shù)或肽合成法合成其部分或全部氨基酸序列來制備。為了通過基因工程技術(shù)獲得IL-6的部分肽或IL-6受體的部分肽，可以將編碼所需肽的DNA序列插入至表達(dá)載體，然后再進(jìn)行上文中記載的重組抗體表達(dá)、生產(chǎn)和純化的方法即可。為了通過肽合成法制備IL-6的部分肽或IL-6受體的部分肽，可以用肽合成的典型方法，例如固相合成法或液相合成法。具體地，可以根據(jù)hku Iyakuhin,Kaihatu Vol. 14P印tide Gosei, (Ed.，Yajima， H. , Hirokawa Shoten, 1991)記載的方法進(jìn)行合成。對于固相合成方法來說，例如，可以使用如下方法通過將對應(yīng)于將要合成的肽的C末端的氨基酸結(jié)合至不溶于有機(jī)溶劑的支持物上，然后交替地重復(fù)從氨基酸C末端至N末端方向順序地縮合一個(氨基酸氨基酸中以合適的保護(hù)基團(tuán)保護(hù)了 α-氨基基團(tuán)及側(cè)鏈官能基團(tuán))的反應(yīng)，以及消除樹脂上附著的氨基酸或肽的α-氨基基團(tuán)的保護(hù)基團(tuán)的反應(yīng)，而使肽鏈延伸。固相合成法根據(jù)所用的保護(hù)基團(tuán)的類型可粗略地分為Boc法和Fmoc法。在靶肽以這種方法合成之后，再進(jìn)行去保護(hù)反應(yīng)和肽鏈從支持物上斷裂下來的反應(yīng)。在肽鏈的斷裂反應(yīng)中，典型地在Boc法和Fmoc法中茴香醚分別使用氟化氫或者三氟甲烷磺酸和TFA。在Boc法中，上述保護(hù)的肽-樹脂在茴香醚存在下用氟化氫處理，然后進(jìn)行保護(hù)基團(tuán)的去除和肽從支持物上的斷裂分離以回收肽。將肽冷凍干燥產(chǎn)生粗制肽。另一方面，在Fmoc法中，例如在TFA中，以上述相同的操作方法進(jìn)行去保護(hù)反應(yīng)和肽鏈從支持物分離的斷裂反應(yīng)。將獲得的粗制肽用HPLC分離和純化。在最佳的條件下用典型用來純化蛋白的水-乙腈溶劑洗脫。收集并且冷凍干燥所獲層析圖中的對應(yīng)于峰的級分。上述方法純化得到的肽級分可以通過質(zhì)譜分子量分析、氨基酸構(gòu)成分析或氨基酸序列分析進(jìn)行鑒定。IL-6和IL-6受體的部分肽的具體實(shí)例公開于JP-A-2-188600, 7-324097和 8-311098，以及美國專利5210075。本發(fā)明的藥物組合物根據(jù)其給藥方式可以含有藥學(xué)上可接受的載體和添加劑。載體和添加劑的例子包括水、藥學(xué)上可接受的有機(jī)溶劑、膠原蛋白，聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合物、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、精氨酸鈉、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、黃原膠、阿拉伯膠、酪蛋白、明膠、瓊脂糖、雙甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蠟、十八烷醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳糖、作為藥物添加劑的可接受的表面活性劑等。根據(jù)劑型，所用添加劑可以從上文適當(dāng)選擇或適當(dāng)?shù)慕M合選擇，但并不局限于此。實(shí)施例本發(fā)明在下文通過實(shí)施例和參考實(shí)施例具體描述，但本發(fā)明并不局限于此。實(shí)施例1 MRA是重組人源化的IgGl亞類抗人白介素-6受體的單克隆抗體，它可以抑制細(xì)胞因子白介素-6(IL-6)的功能。在日本和歐洲的早期研究中，MRA顯示了治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的前景，而且它有很好的耐受性。本實(shí)施例是確定MRA單獨(dú)給藥和與氨甲蝶呤組合給藥治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎時(shí)MRA 的最佳劑量的I I期大型試驗(yàn)。在盡管已用氨甲蝶呤治療過規(guī)定的一段時(shí)期的活性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中，對MRA靜脈重復(fù)給藥(單獨(dú)治療和與氨甲蝶呤組合治療)的潛在功效進(jìn)行了評估，并且將該功效與氨甲蝶呤單獨(dú)治療進(jìn)行了比較。評估了 MRA的有效性、安全性及耐受性。方法研究對象入選了基于美國風(fēng)濕病學(xué)會(ACR)的1987疾病分類而診斷出的為期至少6個月的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者?；颊弑仨毣加谢顒有约膊?，并且他們對以至少12. 5mg/ 周或IOmg/周劑量(在非耐受性情況下)施用至少6個月的MTX無充足應(yīng)答或有疾病的突發(fā)。研究設(shè)計(jì)通過中心隨機(jī)法進(jìn)行雙盲、隨機(jī)、平行組研究劑量和給藥方式七組0mg/kg(安慰劑)+MTX、2mg/kgMRA+MTX,4mg/kgMRA+MTX, 8mg/kg MRA+MTX、2mg/kg MRA+MTX 安慰劑、4mg/kg MRA+MTX 安慰劑和 8mg/kg MRA+MTX 安慰劑。MRA或安慰劑通過靜脈輸注以4周為間隔進(jìn)行給藥。MTX或MTX安慰劑通過口服，每周 1次，10-25mg/周給藥。研究方法將指定劑量通過靜脈輸注以4周為間隔共給藥4次，每隔2周直到16 周評估功效和安全性，并在第20周隨訪觀察。功效研究的第一終點(diǎn)(primary endpoint) 為在第16周(最后給藥之后4周)的ACR 20比率。第二終點(diǎn)(secondary endpoint)包括在第16周(最后給藥之后4周)ACR 50和ACR 70的比率。ACR改善標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)在以下7項(xiàng)中，腫脹關(guān)節(jié)數(shù)和疼痛關(guān)節(jié)數(shù)改善20 %或更多而且在剩余5項(xiàng)的3項(xiàng)中觀察到20%或更大的改善時(shí)，這種病例被確定為20%或更高的ACR改善標(biāo)準(zhǔn)。此外，50%和70%改善的病例是指上述20%改善的部分分別被改善了 50%和70% 的病例。(1)腫脹關(guān)節(jié)數(shù)(2)觸痛關(guān)節(jié)數(shù)(3)患者對疼痛的評估(4)患者對疾病活動的總體性評估
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(5)醫(yī)師對疾病活動的總體性評估(6)患者對生理功能的評估(7) CRP 或 ESR表 權(quán)利要求
1.治療IL-6相關(guān)疾病的藥物組合物，包含白介素6拮抗劑(IL-6拮抗劑)和免疫抑制劑。
2.包含免疫抑制劑的藥物組合物，用于增強(qiáng)使用IL-6拮抗劑治療IL-6相關(guān)疾病的效
3.包含免疫抑制劑的藥物組合物，用于在以IL-6拮抗劑治療IL-6相關(guān)疾病中減少或預(yù)防變態(tài)反應(yīng)。
4.以高劑量給藥的治療劑，其包含IL-6拮抗劑。
5.包含高劑量IL-6拮抗劑的藥物組合物，用于減少或預(yù)防IL-6相關(guān)疾病治療中的變態(tài)反應(yīng)。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述IL-6拮抗劑是抗白介素-6受體的抗體(IL-6R抗體)。
7.權(quán)利要求6的藥物組合物，其中所述IL-6R抗體是抗IL-6R的單克隆抗體。
8.權(quán)利要求6或7的藥物組合物，其中所述抗IL-6R抗體是抗人IL-6R的單克隆抗體。
9.權(quán)利要求6或7的藥物組合物，其中所述抗IL-6R抗體是抗小鼠IL-6R的單克隆抗體。
10.權(quán)利要求6-9任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述抗IL-6R抗體是重組抗體。
11.權(quán)利要求8的藥物組合物，其中所述人抗IL-6R單克隆抗體是PM-I抗體。
12.權(quán)利要求9的藥物組合物，其中所述小鼠IL-6R單克隆抗體是MR16-1抗體。
13.權(quán)利要求6-12任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述抗IL-6R抗體是抗IL-6R的嵌合抗體、人源化抗體或人型抗體。
14.權(quán)利要求13的藥物組合物，其中所述抗IL-6R的人源化抗體是人源化PM-I抗體。
15.權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述IL-6相關(guān)疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、 漿細(xì)胞增多癥、高免疫球蛋白血癥、貧血、腎炎、惡病質(zhì)、多發(fā)性骨髓瘤、Castleman氏病、腎小球膜增殖性腎炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、Crohn氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、胰腺炎、銀屑病、幼年型特發(fā)性關(guān)節(jié)炎或系統(tǒng)性幼年型特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、血管炎、以及Kawasaki病。
16.權(quán)利要求1- 3和6 -15任一項(xiàng)的藥物組合物，它是包含免疫抑制劑的所述藥物組合物或者包含抗體和免疫抑制劑的所述藥物組合物，其中抗IL-6R抗體的劑量為 0. 02-150mg/kg/4周或顯示出與其等同的血液抗IL-6R抗體濃度的劑量。
17.權(quán)利要求16的藥物組合物，其中抗IL-6R抗體的劑量為0.5_30mg/kg/4周或顯示出與其等同的血液抗IL-6R抗體濃度的劑量。
18.權(quán)利要求17的藥物組合物，其中抗IL-6R抗體劑量為2-8mg/kg/4周或顯示出與其等同的血液抗IL-6R抗體濃度的劑量。
19.權(quán)利要求4-15任一項(xiàng)的藥物組合物，其是包含抗IL-6R抗體的用于以高劑量給藥治療IL-6相關(guān)疾病的所述治療劑或者其是包含高劑量的抗IL-6R抗體的所述藥物組合物， 其中抗IL-6R抗體劑量是％ig/kg/4周或更高或顯示出與其等同的血液抗IL-6R抗體濃度的劑量。
20.權(quán)利要求19的藥物組合物，其中抗IL-6R抗體劑量是6-16mg/kg/4周或顯示出與其等同的血液抗IL-6R抗體濃度的劑量。
21.權(quán)利要求20的藥物組合物，其中抗IL-6R抗體劑量是6-10mg/kg/4周或顯示出與其等同的血液抗IL-6R抗體濃度的劑量。
22.權(quán)利要求1-3和6-21任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述免疫抑制劑是氨甲蝶呤 (MTX)。
23.權(quán)利要求22的藥物組合物，其中所述MTX的劑量是I-IOOmg/個體/周。
24.權(quán)利要求23的藥物組合物，其中所述MTX的劑量是4-50mg/個體/周。
25.權(quán)利要求M的藥物組合物，其中所述MTX的劑量是7.5-25mg/個體/周。
26.權(quán)利要求1-3和6-25任一項(xiàng)的藥物組合物，用于將所述抗IL-6抗體和所述免疫抑制劑同時(shí)施用。
27.權(quán)利要求1-3和6-25任一項(xiàng)的藥物組合物，用于將所述抗IL-6抗體和所述免疫抑制劑在時(shí)間上間隔施用。
28.白介素-6拮抗劑(IL-6拮抗劑)和免疫抑制劑在制備用于治療IL-6相關(guān)疾病的藥物組合物中的用途。
29.IL-6拮抗劑在制備包含免疫抑制劑的藥物組合物中的用途，其中該藥物組合物用于增強(qiáng)使用IL-6拮抗劑治療IL-6相關(guān)疾病的效果。
30.IL-6拮抗劑在制備包含免疫抑制劑的藥物組合物中的用途，其中所述藥物組合物用于在用IL-6拮抗劑治療IL-6相關(guān)疾病時(shí)減少或預(yù)防變態(tài)反應(yīng)。
31.IL-6拮抗劑在制備包含IL-6拮抗劑的、以高劑量給藥的IL-6相關(guān)疾病治療劑中的用途。
32.IL-6拮抗劑在制備包含高劑量抗IL-6R抗體的藥物組合物中的用途，其中該藥物組合物用于在IL-6相關(guān)疾病治療中減少或預(yù)防變態(tài)反應(yīng)。
33.權(quán)利要求觀-32任一項(xiàng)的用途，其中所述IL-6拮抗劑是抗白介素-6受體的抗體 (IL-6R 抗體)。
34.權(quán)利要求觀-33任一項(xiàng)的用途，其中所述IL-6R抗體是抗IL-6R單克隆抗體。
35.權(quán)利要求觀-34任一項(xiàng)的用途，其中所述抗IL-6R抗體是抗人IL-6R單克隆抗體。
36.權(quán)利要求觀-34任一項(xiàng)的用途，其中所述抗IL-6R抗體是抗小鼠IL-6R單克隆抗體。
37.權(quán)利要求觀-36任一項(xiàng)的用途，其中所述抗IL-6R抗體是重組抗體。
38.權(quán)利要求35的用途，其中所述人抗IL-6R單克隆抗體是PM-I抗體。
39.權(quán)利要求36的用途，其中所述小鼠抗IL-6R單克隆抗體是MR16-1抗體。
40.權(quán)利要求32-39任一項(xiàng)的用途，其中所述抗IL-6R抗體是抗IL-6R的嵌合抗體、人源化抗體或人型抗體。
41.權(quán)利要求40的用途，其中所述抗IL-6R人源化抗體是人源化PM-I抗體。
42.權(quán)利要求21-41任一項(xiàng)的用途，其中所述IL-6相關(guān)疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、漿細(xì)胞增多癥、高免疫球蛋白血癥、貧血、腎炎、惡病質(zhì)、多發(fā)性骨髓瘤、Castleman氏病、腎小球膜增殖性腎炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、Crohn氏病、胰腺炎、銀屑病、幼年型特發(fā)性關(guān)節(jié)炎或系統(tǒng)性幼年型特發(fā)性關(guān)節(jié)炎。
43.權(quán)利要求觀-30和33-42任一項(xiàng)的用途，它是用于制備包含免疫抑制劑的藥物組合物或包含抗IL-6抗體和免疫抑制劑的藥物組合物的所述用途，其中抗IL-6R抗體劑量是 0. 02-150mg/kg/4周或顯示出與其等同的血液抗IL-6R抗體濃度的劑量。
44.權(quán)利要求43的用途，其中抗IL-6R抗體劑量是0.5_30mg/kg/4周或顯示出與其等同的血液抗IL-6R抗體濃度的劑量。
45.權(quán)利要求44的用途，其中抗IL-6R抗體劑量是2-8mg/kg/4周或顯示出與其等同的血液抗IL-6R抗體濃度的劑量。
46.權(quán)利要求31-45任一項(xiàng)的用途，它是用于制備包含抗IL-6R抗體、以高劑量給藥治療IL-6相關(guān)疾病的治療劑或包含高劑量抗IL-6R抗體的所述藥物組合物的所述用途，其中抗IL-6R抗體劑量是％ig/kg/4周或更高或顯示出與其等同的血液抗IL-6R抗體濃度的劑量。
47.權(quán)利要求46的用途，其中抗IL-6R抗體劑量是6_16mg/kg/4周或顯示出與其等同的血液抗IL-6R抗體濃度的劑量。
48.權(quán)利要求47的用途，其中抗IL-6R抗體劑量是6-10mg/kg/4周或顯示出與其等同的血液抗IL-6R抗體濃度的劑量。
49.權(quán)利要求觀-30和33-48任一項(xiàng)的用途，其中所述免疫抑制劑是氨甲蝶呤(MTX)。
50.權(quán)利要求49的藥物組合物，其中所述MTX的劑量是I-IOOmg/個體/周。
51.權(quán)利要求50的藥物組合物，其中所述MTX的劑量是4-50mg/個體/周。
52.權(quán)利要求51的藥物組合物，其中所述MTX的劑量是7.5-25mg/個體/周。
53.權(quán)利要求觀-30和34-52任一項(xiàng)的用途，用于將所述抗IL-6抗體和所述免疫抑制劑同時(shí)施用。
54.權(quán)利要求觀-30和34-52任一項(xiàng)的用途，用于將所述抗IL-6抗體和所述免疫抑制劑在時(shí)間上間隔施用。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療白介素-6(IL-6)相關(guān)疾病的藥物組合物，包括白介素-6拮抗劑(IL-6拮抗劑)和免疫抑制劑。IL-6拮抗劑優(yōu)選抗白介素-6受體(IL-6R)的抗體。
文檔編號A61P35/00GK102172403SQ20111007774
公開日2011年9月7日 申請日期2004年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月28日
發(fā)明者R·N·馬伊尼, 吉田憲彰, 奧田修 申請人:中外制藥株式會社