專利名稱：篩選結(jié)核桿菌抑制劑的細(xì)胞模型及篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物學(xué)和藥學(xué)領(lǐng)域，涉及篩選結(jié)核桿菌抑制劑的細(xì)胞模型及篩選方法。
背景技術(shù)：
近年來(lái)結(jié)核病在全球范圍內(nèi)卷土重來(lái)，結(jié)核菌的耐藥成為當(dāng)前結(jié)核病治療中所面臨的最嚴(yán)重問(wèn)題。篩選、發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證抗結(jié)核藥物的分子靶標(biāo)，從靶標(biāo)上實(shí)施突破，是獲得新型高效低毒抗結(jié)核藥物、解決結(jié)核治療特別是耐藥結(jié)核治療問(wèn)題的關(guān)鍵所在。核糖體是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所，而細(xì)胞生命的維持依賴于蛋白質(zhì)功能的正 常行使，因此核糖體成為藥物研發(fā)的重要祀標(biāo)(Huntington K M, et al. Synthesis andantibacteria丄 activityof peptide deformylase inhibitors. Biochemistry,2000，39(15) :4543-4551 ；Sinha R R，et al. Thiazoleand oxazole peptides !biosynthesis andmolecular machinery. NatProd Rep，1999，16 (2) :249-263.)。蛋白-蛋白的相互作用是生命活動(dòng)中廣泛而重要的相互作用，是蛋白質(zhì)正常行使其功能的重要條件，因此蛋白-蛋白相互作用是藥物靶標(biāo)研究的另一重要方向。微生物核糖體蛋白由50S大亞基和30S小亞基組成，大亞單位含有23SrRNA，5SrRNA與30多種蛋白質(zhì)，小亞單位含有16SrRNA與20多種蛋白質(zhì)。這些蛋白復(fù)合并與核糖組成核糖體正常行使其功能。在微生物核糖體組成蛋白中，眾多蛋白作為組成型或功能型亞基協(xié)同發(fā)揮作用。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個(gè)蛋白間的相互作用機(jī)制，如通過(guò)共結(jié)晶方法證實(shí)E.coli核糖體大亞基組成蛋白L12和LlO存在相互作用(Gudkov, A. T. The L7/L12 ribosomaldomain of the ribosome !structural andfunctional studies. FEBS Lett，1997，407 :253-256.)。L12(L7/L12)(編碼基因是rplL)是核糖體組成蛋白中唯一的多拷貝蛋白，其中L12是正常的，L7是N末端絲氨酸氨?；牡鞍?，二者以4 I比例的ニ聚體形式存在，簡(jiǎn)稱L12。在核糖體中L12對(duì)于轉(zhuǎn)錄的有效性和精確性是重要的，井能夠激發(fā)轉(zhuǎn)錄因子的GTP激酶活性。在L12的N末端有兩個(gè)與LlO結(jié)合的部位，L12功能的發(fā)揮依賴LlO (編碼基因是 rplj)將其錨定于大亞基(Mihaela Diacnu, et al. Structural Basis for theFunctionof the Ribosome L7/L12 Stalk in Factor Binding and GTPaseActivation.Cell，2005，121 :991-1004 ;Griaznova 0，Traut RR. Deletion of C-terminal residuesof Escherichia coli ribosomalprotein LlO causes the loss of binding of one L7/L12 dimer ribosomes with one L7/L12 dimer are active. Biochemistry,2000,39(14)4075-4081.) oL12和LlO在結(jié)核桿菌中與E. coli中具有高度的保守性，S. T. Cole的研究也表明結(jié)核桿菌中的L12與LlO具有相互作用(S.T.Cole，R. Brosch, J. Parkhill, etal. Deciphering the biology ofMycobacterium tuberculosis from the completegenome sequence. Nature，1998，393，537-544.)。L12 與 LlO 相互作用的正常進(jìn)行是結(jié)核桿菌正常生長(zhǎng)所必須的；而L12和LlO的編碼基因在結(jié)核桿菌內(nèi)具有保守性并且與人類基因具有很低的同源性，因此具備作為抗結(jié)核藥物靶標(biāo)的基本條件。盡管L12和LlO的相互作用已經(jīng)通過(guò)共結(jié)晶方法進(jìn)行驗(yàn)證，但是能否能在生物模型中驗(yàn)證結(jié)核桿菌的L12和LlO相互作用，這種相互作用能否用于新型抗結(jié)核藥物篩選，仍需要進(jìn)ー步的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)創(chuàng)造性的勞動(dòng)和大量的試驗(yàn)，首次利用酵母雙雜交的方法(Fieldsb, Song O. A novel genetic system to detect protein—protein interaction. Nature,1989,340 :245-246 ；M Yang,Z ffu,an dFields S.Protein-peptide interactions analyzedwith he yeast two-hybrid System. Nucleic Acids Res, 1995, 23 :1152-1156.)證明了結(jié)核桿菌L12和LlO之間的相互作用。并且驚奇地發(fā)現(xiàn)，L12和LlO在酵母細(xì)胞中能夠相互作用，使得酵母雙雜交系統(tǒng)載體中的真核轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域在空間上也相互接近，形成完整的轉(zhuǎn)錄因子，從而激活宿主菌報(bào)告基因的表達(dá)。本發(fā)明人基于此建立了 L12和LlO相互作用阻斷劑的體外高通量篩選模型(圖I)，并利用此模型對(duì)4000個(gè)化合物進(jìn)行篩選，成功發(fā)現(xiàn)了具有體外抗結(jié)核活性的陽(yáng)性候選化合物。由此提供了下述發(fā)明本發(fā)明的ー個(gè)方面涉及ー種細(xì)胞，其表達(dá)結(jié)核桿菌核糖體蛋白L12和L10，其中，L12的編碼基因與轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)位于ー個(gè)表達(dá)載體，LlO的編碼基因與轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)位于另ー個(gè)表達(dá)載體。所述的兩個(gè)表達(dá)載體是不同的。具體地，所述載體可以是pGBKT7、pGADT7等。根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其為酵母細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其中，所述轉(zhuǎn)錄因子為GAL4。根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其中，L12蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示，LlO蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。MAKLSTDELLDAFKEMTLLELSDFVKKFEETFEVTAAAPVAVAAAGAAPAGAAVEAAEEQSEFDVILEAAGDKKIGVIKVVREIVSGLGLKEAKDLVDGAPKPLLEKVAKEAADEAKAKLEAAGATVTVK(SEQ ID NO 1)MARADKATAVADIAAQFKESTATLITEYRGLTVANLAELRRSLTGSATYAVAKNTLIKRAASEAGIEGLDELFVGPTAIAFVTGEPVDAAKAIKTFAKEHKALVIKGGYMDGHPLTVAEVERIADLESREVLLAKLAGAMKGNLAKAAGLFNAPASQLARLAAALQEKKACPGPDSAE(SEQ ID NO 2)根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其中，L12蛋白的編碼基因的核苷酸序列序列如SEQ ID NO :3(rplL，GeneID :888078)所示，LlO蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4(rplJ, GeneID :888049)所示。ATGGCAAAGCTCTCCACCGACGAACTGCTGGACGCGTTCAAGGAAATGACCCTGTTGGAGCTCTCCGACTTCGTCAAGAAGTTCGAGGAGACCTTCGAGGTCACCGCCGCCGCTCCAGTCGCCGTCGCCGCCGCCGGTGCCGCCCCGGCCGGTGCCGCCGTCGAGGCTGCCGAGGAGCAGTCCGAGTTCGACGTGATCCTTGAGGCCGCCGGCGACAAGAAGATCGGCGTCATCAAGGTGGTCCGGGAGATCGTTTCCGGCCTGGGCCTCAAGGAGGCCAAGGACCTGGTCGACGGCGCGCCCAAGCCGCTGCTGGAGAAGGTCGCCAAGGAGGCCGCCGACGAGGCCAAGGCCAAGCTGGAGGCCGCCGGCGCCACCGTCACCGTCAAGTAG(SEQ ID NO 3)ATGGCCAGGGCTGACAAGGCCACCGCCGTCGCAGACATCGCAGCGCAGTTCAAGGAGTCGACCGCGACGTTGATCACCGAATACCGCGGCTTGACGGTGGCCAACCTGGCCGAGCTACGCAGGTCTCTGACGGGGTCGGCGACCTACGCGGTGGCCAAAAACACACTCATCAAGCGGGCGGCCTCCGAGGCCGGCATCGAGGGCCTCGACGAACTGTTTGTGGGCCCCACCGCGATCGCGTTCGTCACCGGTGAGCCGGTCGACGCCGCCAAGGCCATCAAGACCTTCGCCAAGGAGCACAAGGCGCTGGTCATCAAGGGCGGCTACATGGACGGCCACCCATTGACCGTGGCCGAAGTCGAGCGCATCGCCGACCTGGAGTCCCGCGAGGTGTTACTGGCCAAGCTGGCCGGTGCGATGAAGGGCAACCTGGCCAAGGCGGCCGGGTTGTTCAACGCGCCGGCCTCGCAGCTGGCCCGGCTCGCGGCCGCCCTGCAGGAAAAGAAGGCCTGCCCAGGCCCAGACTCAGCCGAGTAG(SEQ ID NO :4)根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞能夠在缺陷性培養(yǎng)基SD/-Trp-Leu_Hi s-Ade 上生長(zhǎng)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為經(jīng)共轉(zhuǎn)化能表達(dá)LlO和L12蛋白并且能檢測(cè)此二者相互作用的酵母菌AH109 (AD-L12+BD-L10)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述的篩選模型中能共表達(dá)LlO和L12蛋白并且能檢測(cè)這兩個(gè)蛋白相互作用的重組酵母菌AH109(AD-L12+BD-L10)是通過(guò)如下方法制備 的使用酵母菌AH109、GAL4DNA結(jié)合域表達(dá)載體pGBKT7 (BD)，GAL4DNA激活域表達(dá)載體PGADT7 (AD)(均購(gòu)自clontech酵母雙雜交系統(tǒng))。將重組質(zhì)粒AD-L12+BD-L10通過(guò)LiAc方法共轉(zhuǎn)化入感受態(tài)酵母菌AH109中，在缺陷性培養(yǎng)基SD/-Trp-Leu上培養(yǎng)。挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行L12和LlO相互作用的驗(yàn)證將陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)接到缺陷性培養(yǎng)基SD/-Trp-Leu-His-Ade上，能夠正常生長(zhǎng)。通過(guò)半乳糖苷酶活性檢測(cè)，進(jìn)ー步驗(yàn)證了 L12和LlO的相互作用，將此陽(yáng)性克隆命名為ΑΗ109 (AD-L12+BD-L10)，可以加上篩選陰性對(duì)照ΑΗ109 (AD-T+BD-53)(購(gòu)自clontech酵母雙雜交系統(tǒng))以及篩選空白對(duì)照AH109 —起作為高通量篩選的模型。本發(fā)明的另一方面涉及ー種用于篩選結(jié)核桿菌L12蛋白和LlO蛋白相互作用阻斷齊U、抗結(jié)核桿菌藥物、或者治療和/或預(yù)防結(jié)核病的藥物的細(xì)胞模型，其包含本發(fā)明中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)所述的細(xì)胞模型，其還包含空白對(duì)照細(xì)胞和/或陰性對(duì)照細(xì)胞；優(yōu)選地，所述空白對(duì)照細(xì)胞為不轉(zhuǎn)染有任何載體的空白酵母細(xì)胞，所述陰性對(duì)照細(xì)胞為染有兩個(gè)不同的表達(dá)載體(可以與本發(fā)明的細(xì)胞中的兩個(gè)表達(dá)載體相同)的酵母細(xì)胞，兩個(gè)表達(dá)載體中各插入有不同的基因，該兩個(gè)不同的基因表達(dá)的蛋白能夠相互結(jié)合，并且表達(dá)的蛋白不是L12和LlO ;更優(yōu)選地，所述細(xì)胞模型包含AH109(AD-L12+BD-L10)、AH109 (AD-T+BD-53)(陰性對(duì)照)以及AH109 (空白對(duì)照)。本發(fā)明的還一方面涉及本發(fā)明中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞或者細(xì)胞模型在篩選結(jié)核桿菌L12蛋白和LlO蛋白相互作用阻斷劑、抗結(jié)核桿菌藥物、或者治療和/或預(yù)防結(jié)核病的藥物中，或者測(cè)定抗結(jié)核桿菌活性中的用途。本發(fā)明的還一方面涉及ー種篩選結(jié)核桿菌L12蛋白和LlO蛋白相互作用阻斷劑、抗結(jié)核桿菌藥物、或者治療和/或預(yù)防結(jié)核病的藥物的方法，一種或者測(cè)定抗結(jié)核桿菌活性的方法，包括下述步驟I)將本發(fā)明的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞或者細(xì)胞模型接種并進(jìn)行培養(yǎng)；2)分別向步驟I)中培養(yǎng)的細(xì)胞中加入待測(cè)化合物或組合物，使化合物或組合物的終濃度為 ο μ g/m，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)12-36小時(shí)；3)觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，找出對(duì)模型細(xì)胞具有抑制作用的化合物或組合物，得到初篩陽(yáng)性的化合物或組合物。具體地，當(dāng)加入的化合物或組合物后，通過(guò)與不加入待測(cè)化合物或者組合物的對(duì)照組的生長(zhǎng)情況相比較，可將化合物的作用分為三類(圖2):特異性阻斷作用只有本發(fā)明的細(xì)胞例如生長(zhǎng)受到抑制；非特異性阻斷作用只有本發(fā)明的細(xì)胞和陰性對(duì)照受到抑制；潛在的抗真菌作用本發(fā)明的細(xì)胞、陰性對(duì)照、空白對(duì)照都受到抑制。陰性對(duì)照、空白対照的定義如前面所描述。在ー個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞為AH109(AD-L12+BD_L10)，陰性對(duì)照為AH109 (AD-T+BD-53)，空白對(duì)照為 AH109。根據(jù)本發(fā)明的任一項(xiàng)所述的方法，其還包括下述步驟 4)將初篩陽(yáng)性的化合物或組合物進(jìn)行β -半乳糖苷酶活性抑制檢測(cè)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括下述步驟I)收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞 ΑΗ109 (AD-L12+BD-L10)、ΑΗ109 (AD-T+BD-53)以及ΑΗ109，用缺陷性培養(yǎng)基 SD/-Trp-Leu-His-Ade 將篩選模型 AH109 (AD-L12+BD-L10)、篩選陰性對(duì)照AH109(AD-T+BD-53)以I : 100轉(zhuǎn)接入96孔板，用培養(yǎng)基YH)將篩選空白對(duì)照AH109同樣以I : 100接種至96孔板。每孔加入細(xì)胞培養(yǎng)液198 μ I ;2)將篩選模型 ΑΗ109 (AD-L12+BD-L10)、篩選陰性對(duì)照 ΑΗ109 (AD-T+BD-53)、篩選空白對(duì)照ΑΗ109孔中，加入2 μ I (lmg/ml)化合物或組合物，使化合物或組合物的終濃度為lOyg/m。同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，每孔中含有198μ I細(xì)胞培養(yǎng)液，加入2μ I相應(yīng)的培養(yǎng)基。將96孔板放入30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；3)24h后，取出96孔板觀察每孔中細(xì)胞的生長(zhǎng)情況；4)將初篩陽(yáng)性的化合物或組合物，做β_半乳糖苷酶活性抑制檢測(cè)。將篩選模型ΑΗ109 (AD-L12+BD-L10)、篩選陰性對(duì)照ΑΗ109 (AD-T+BD-53)在缺陷性培養(yǎng)基SD/-Trp-Leu-His-Ade中30°C過(guò)夜培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。之后，將50 μ I過(guò)夜培養(yǎng)細(xì)胞以I 100比例轉(zhuǎn)接至5ml缺陷性培養(yǎng)基SD/-Leu/-Trp中，同時(shí)，加入相應(yīng)濃度(終濃度為50、10、5、1、0. 5、0. lyg/ml)的化合物，繼續(xù)培養(yǎng)。24h后收集細(xì)胞，做β -半乳糖苷酶活性定量檢測(cè)。本發(fā)明的還一方面涉及式I或式II所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備結(jié)核桿菌L12蛋白和LlO蛋白相互作用阻斷劑、抗結(jié)核桿菌藥物、或者治療和/或預(yù)防結(jié)核病的藥物中的用途。
丫々 H0J U \OH hYoh
NH2
式 I (T766 )式 II (T054 )本發(fā)明的還一方面涉及ー種抑制結(jié)核桿菌的方法，包括使用有效量的式I或式II化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的步驟。本發(fā)明的還一方面涉及ー種治療或預(yù)防結(jié)核病發(fā)方法，包括給予有效量的式I或式II化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的步驟。在本發(fā)明中，L12和LlO的相互作用是指L12的N端與LlO的C端能夠結(jié)合。術(shù)語(yǔ)“DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域”是指DNA特異性結(jié)合功能域。GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域靠近羧基端，含有至少ー個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點(diǎn)(UAS)。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域”是指與其他調(diào)控蛋白相互作用的激活功能域。GAL4的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可與RNA聚合酶或轉(zhuǎn)錄因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。發(fā)明的有益效果
本發(fā)明的細(xì)胞或者細(xì)胞模型能夠有效地用于篩選結(jié)核桿菌L12蛋白和LlO蛋白相互作用阻斷劑、抗結(jié)核桿菌藥物、或者治療和/或預(yù)防結(jié)核病的藥物，并且省去了相互作用蛋白的純化，篩選過(guò)程簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，適合于高通量篩選。


圖I :模型篩選策略示意圖。圖2 :用篩選模型篩選化合物的結(jié)果。其中，+指的是加入待測(cè)化合物，-指的是沒(méi)有加入待測(cè)化合物圖3 rplL(L12的編碼基因)、rplj (L10的編碼基因)基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果。其中，泳道I :rplL的PCR產(chǎn)物；泳道2 rplL的空白對(duì)照；泳道3，rplj的PCR產(chǎn)物；泳道4，rplj的空白對(duì)照,泳道Μ,分子量marker。圖4 :從左至右依次是 AD-L12，BD-LlO, AD-LlO, BD-L12 質(zhì)粒的 NdeI，BamHI 雙酶切結(jié)果。泳道I :AD-L12的雙酶切；泳道2 =AD-LlO的雙酶切；泳道3 BD-L12的雙酶切；泳道4 =BD-LlO的雙酶切；泳道M為分子量marker。圖5 :篩選模型酵母菌 AH109 (AD-L12+BD-L10)，篩選陽(yáng)性對(duì)照 AH109 (AD-T+BD-53)以及酵母雙雜交假陰性菌AH109 (AD-L10+BD-L12)，酵母雙雜交自激活檢測(cè)AH109 (AD+BD-L10)、AH109 (AD-L12+BD)，酵母雙雜交陰性對(duì)照 AH109 (AD-T+BD-53)在缺陷性培養(yǎng)基SD/-Trp-Leu-His-Ade上的生長(zhǎng)情況。圖中A代表AD-T+BD-53 ;B代表AD-L12+BD-L10 ；C 代表 AD-L10+BD-L12 ；D 代表 AD-L12+BD ；E 代表 AD+BD-L10 ；F 代表AD_T+BD_lam。圖6 :篩選模型酵母菌 AH109 (AD-L12+BD-L10)，篩選陽(yáng)性對(duì)照 AH109 (AD-T+BD-53)以及酵母雙雜交假陰性菌AH109 (AD-L10+BD-L12)，酵母雙雜交自激活檢測(cè)AH109 (AD+BD-L10)、AH109 (AD-L12+BD)，酵母雙雜交陰性對(duì)照 AH109 (AD-T+BD-53)的 β -半乳糖苷酶活性定性檢測(cè)。圖7 :篩選模型酵母菌 ΑΗ109 (AD-L12+BD-L10)，篩選陽(yáng)性對(duì)照 ΑΗ109 (AD-T+BD-53)以及酵母雙雜交假陰性菌ΑΗ109 (AD-L10+BD-L12)，酵母雙雜交自激活檢測(cè)ΑΗ109 (AD+BD-L10)、AH109 (AD-L12+BD)，酵母雙雜交陰性對(duì)照 ΑΗ109 (AD-T+BD-53)的 β -半乳糖苷酶活性定量檢測(cè)。圖8 :陽(yáng)性化合物Τ766和Τ054的β -半乳糖苷酶活性抑制檢測(cè)。圖8Α，Τ766 ;圖8Β, Τ054。
圖9 :蛋白His-LlO及His_L12的表達(dá)及純化。His-LlO的SDS-PAGE檢測(cè)以及Western blotting分析。圖 9A, His-LlO 的 SDS-PAGE檢測(cè)以及Western blotting分析,其中泳道M,marker ;泳道I,經(jīng)誘導(dǎo)的pET_16b(+)全菌蛋白上清；泳道2,經(jīng)誘導(dǎo)的pET16b_L10全菌蛋白上清；泳道3，純化的His-LlO蛋白。圖9B，His-L12的SDS-PAGE檢測(cè)以及Westernblotting分析,其中泳道M, marker ;泳道I,經(jīng)誘導(dǎo)的pET_16b (+)全菌蛋白上清；泳道2,經(jīng)誘導(dǎo)的pET16b-L12全菌蛋白上清；泳道3，純化的His_L12蛋白。圖10:圖10A，蛋白His_L12與His-LlO相互作用的Biacore檢測(cè)結(jié)果；圖10B，蛋白His-L12與化合物T766相互作用的Biacore檢測(cè)結(jié)果(從上往下每條曲線以此對(duì)應(yīng)于加入如下的化合物T766的量情形40μΜ、20μΜ、10μΜ、5μΜ、2· 5μΜ、0μΜ);圖10C，蛋白His-L12與化合物T054相互作用的Biacore檢測(cè)結(jié)果(從上往下每條曲線以此對(duì)應(yīng)于加入如下的化合物T054的量情形:40μΜ、20μΜ、10μΜ、5μΜ、2· 5μΜ、0μΜ);圖10D，化合 物Τ766和Τ054對(duì)蛋白His-L12與His-LlO相互作用的阻斷。圖IOA-D中，縱坐標(biāo)中的RU (response unit)表示反應(yīng)單位，I個(gè)RU相當(dāng)于I個(gè)反應(yīng)單位。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例I :酵母雙雜交系統(tǒng)的構(gòu)建l.rplL (L12編碼基因)、rplj (L10編碼基因)基因的制備以結(jié)核桿菌H37Rv總cDNA (本室保存；也可商購(gòu)菌株然后用本領(lǐng)域人員熟知的方法例如cDNA提取試劑盒制備得到結(jié)核桿菌H37Rv總cDNA)為模板，設(shè)計(jì)引物I和2，引物3和4，使用TaKaRa公司的高保真PrimeSTAR HS DNA聚合酶，通過(guò)PCR方法得到rplL (L12的編碼基因)、rplj (L10的編碼基因)。具體克隆方法及引物如下I)擴(kuò)增rplL(L12的編碼基因)的引物引物I 5，-TCCATATGGCAAAGCTCTCCACCGACG-3，(SEQ ID NO 5)(下劃線部分為 NdeI酶切位點(diǎn))引物2 :5’ -GCGGATCCACACGCTGGGCAGAGCTAC-3’ (SEQ ID NO :6)(下劃線部分為BamH I酶切位點(diǎn))2)擴(kuò)增rplj (L10的編碼基因)的引物引物3 :5’ -TCCATATGGCCAGGGCTGACAAG-3’ (SEQ ID NO :7)(下劃線部分為 Nde I酶切位點(diǎn))引物4 :5’ -GCGGATCCTGGGTGACTACTCGG-3，(SEQ ID NO 8)(下劃線部分為 BamH I酶切位點(diǎn))PCR方法按照TaKaRa公司的高保真PrimeSTAR HS DNA聚合酶的說(shuō)明書推薦的步驟進(jìn)行。將一部分PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，電泳結(jié)果如圖3所示，大小與預(yù)期ー致。PCR產(chǎn)物回收后，與pEASY-Blunt simple載體連接后測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果正確。2.重組表達(dá)載體的構(gòu)建
上述各片段經(jīng)酶切后，回收酶切產(chǎn)物。BD、AD載體經(jīng)Nde I,BamHI雙酶切后，回收線性載體，并分別與rplL(L12的編碼基因)、rplJ(L10的編碼基因)各片段連接，成功構(gòu)建表達(dá)載體AD-L12，BD-LlO, AD-LlO, BD-Ll2, Nde I，BamH I的酶切鑒定(瓊脂糖凝膠電泳)結(jié)果見圖4，大小與預(yù)期一致。其中酶切體系如下
質(zhì)粒4.0 μ
Nde I1.0 μ
Ban/λ I1.0 μ
IOx Buffer2.0 μ
ddH2012.0 μ
總體積20.0 μ 。連接體系如下
基因片斷7.0 μ
表達(dá)載體1.0 μ
IOxBuffer1.0 μ
Τ4連接酶1.0 μ
CldH2O1.0 μ
總體積10.0 μ103.酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備I)將6ml酵母培養(yǎng)液在室溫下5，OOOg離心5min。2)棄上清，用I. 5ml超純水浮起洗滌，室溫6，OOOg離心5min。3)棄上清，沉淀溶于20 μ I 10ΧΤΕ、20μ1 I X LiAc、160 μ I超純水吹起彈起，SP為酵母感受態(tài)細(xì)胞(Ih內(nèi)用完)。4.共轉(zhuǎn)化在I. 5ml離心管中加入O. I μ g上面構(gòu)建的AD質(zhì)粒DNA和O. I μ gBD質(zhì)粒DNA、以及100 μ g鮭精DNA(鮭精DNA使用前用沸水煮20min后快速置于冰浴)，混勻，加入O. Iml酵母感受態(tài)細(xì)胞，混勻，再加入0.6ml滅菌的PEG/LiAc溶液(體積比10XTE IOXLiAc 50%PEG4000 = I I 8)，高速振蕩 IOs 以混勻，之后，30°C，200rpm 培養(yǎng) 30min，42°C 熱激 15min，再置于冰上冷卻l-2min，14，OOOrpm室溫離心5s，去上清。沉淀用200 μ I滅菌水重懸后涂布在SD/-Leu-Trp (DO/-Trp_Leu O. 64g，YNB 6. 7g,葡萄糖20g，加超純水定容至1000ml，112°C滅菌20min。固體培養(yǎng)基含Difco Agar20g/L。)平板上，30°C倒置培養(yǎng)。把在 SD/-Leu-Trp 平板上生長(zhǎng)的陽(yáng)性克隆接種在 SD/-Leu-Trp-His_Ade (D0/-Trp-Leu_His-AdeO. 6g, YNB 6. 7g,葡萄糖20g,加超純水定容至1000ml, 112°C滅菌20min。固體培養(yǎng)基含Difco Agar 20g /L。)上，如果在SD/-Leu-Trp-His_Ade平板上酵母菌能夠生長(zhǎng)，則說(shuō)明L12和LlO蛋白有相互作用(圖5)。5. β -半乳糖苷酶活性檢測(cè)I) β -半乳糖苷酶活性定性檢測(cè)將在SD/-Leu-Trp-His-Ade上生長(zhǎng)的酵母菌落用無(wú)菌牙簽挑到一張干凈的濾紙上，菌落面朝上，置于液氮中10s，室溫解凍后，將濾紙放入事先浸泡于Z buffer/X-gal溶液中的另ー張干凈的濾紙上，30°C孵育，觀察菌落是否出現(xiàn)藍(lán)色，以8h之內(nèi)出現(xiàn)藍(lán)色為陽(yáng)性，沒(méi)有顏色變化的為陰性(圖6)。由圖6可見，AD-L10+BD-L12的菌落沒(méi)有變藍(lán)色(因此不能夠作為本發(fā)明的細(xì)胞模型)，只有AD-L12+BD-L10的菌落變藍(lán)。2) β -半乳糖苷酶活性定量檢測(cè)a)收集在液體培養(yǎng)基SD/-Leu-Trp-His-Ade中生長(zhǎng)的酵母菌，漩渦混勻測(cè)量0D_值。b)將姆一管菌液轉(zhuǎn)移至3個(gè)I. 5ml的EP管中，14，OOOrpm離心30s。棄去上清，在每個(gè) EP 管中加入 1.5ml Z buffer (O. IM Na2HPO4, 35mM NaH2PO4, IOmM KCl，and ImM MgSO4,pH 7.0),重懸細(xì)胞。再次14，OOOrpm離心30s,棄去上清。用300 μ I Z buffer重懸細(xì)胞。c)將O. Iml細(xì)胞懸液重新置于另ー個(gè)干凈的EP管中。并將此EP管放入液氮
O.5-lmin，之后37°C水浴O. 5-lmin。反復(fù)凍融2次以上，確保細(xì)胞完全裂解。用100 μ I Zbuffer設(shè)置一空白對(duì)照。d)在每ー個(gè)EP管中(包括空白對(duì)照)加入O. 7ml Z buffer(含有O. 27%的β-巰
基こ醇)Oe)迅速加入160 μ I ONPG(用Z buffer溶解,4mg/ml)至姆個(gè)EP管中，并將EP管放入30°C。開始計(jì)吋。當(dāng)EP管中出現(xiàn)黃色后，在每管中加入0.4ml IM Na2CO3，終止反應(yīng)。記錄所用的時(shí)間t。f)將EP管中的液體14，OOOrpm離心lOmin，之后，將上清轉(zhuǎn)移至干凈的比色皿中(不要吸入沉淀，以免影響比色)，測(cè)量OD42tl(與空白對(duì)照管相對(duì)比)。OD42tl應(yīng)在O. 02-1. O之間。g)計(jì)算β -半乳糖苷酶活性。β-gal units = 1000 X OD420/ (t X VX OD600) V = O. Iml X 5h)如圖7為AH109 (AD-L12+BD-L10)的β -半乳糖苷酶活性定量檢測(cè)。實(shí)施例2 :初篩陽(yáng)件化合物的β -半乳糖苷酶活件抑制檢測(cè)I.將篩選模型 ΑΗ109 (AD-L12+BD-L10)、篩選陰性對(duì)照 ΑΗ109 (AD-T+BD-53)在缺陷性培養(yǎng)基SD/-Trp-Leu-His-Ade中30°C過(guò)夜培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。2.將50 μ I過(guò)夜培養(yǎng)細(xì)胞以I : 100比例轉(zhuǎn)接至5ml缺陷性培養(yǎng)基SD/-Leu/_Trp中，同時(shí)，加入相應(yīng)濃度(終濃度為50、10、5、1、0·5、0· lyg/ml)的化合物，繼續(xù)培養(yǎng)。3. 24h后收集細(xì)胞，做β -半乳糖苷酶活性定量檢測(cè)。方法參照實(shí)施例I中所述。求得 β _gal units。4.將沒(méi)有加陽(yáng)性化合物的篩選模型AH109 (AD-L12+BD-L10)、篩選陰性對(duì)照AH109 (AD-T+BD-53)求得的β-gal units (O)值作為100%，加入不同濃度化合物的篩選模型 AH109(AD-L12+BD-L10)、篩選陰性對(duì)照 AH109(AD-T+BD-53)求得的 β -gal units (50,
10、5、1、0· 5、0· I)值分別與 β-gal units (O)相除，得到 β-gal units% (50、10、5、1、0· 5、
O.I)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。其中篩選的化合物為4000種(本實(shí)驗(yàn)室的化合物庫(kù)，也可以使用商購(gòu)的化合物庫(kù)或者任何待測(cè)的樣品，例如化合物或組合物)。初篩陽(yáng)性化合物Τ766和Τ054的結(jié)構(gòu)式分別如下面的式I和式II所示
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞，其表達(dá)結(jié)核桿菌核糖體蛋白L12和L10，其中，L12的編碼基因與轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域位于ー個(gè)表達(dá)載體，LlO的編碼基因與轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于另ー個(gè)表達(dá)載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的細(xì)胞，其滿足如下的(1)-(3)中的一項(xiàng)或者多項(xiàng) (1)所述細(xì)胞為酵母細(xì)胞； (2)所述轉(zhuǎn)錄因子為GAL4； (3)L12蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示，LlO蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的細(xì)胞，其中，L12蛋白的編碼基因的核苷酸序列序列如SEQIDNO 3所示，LlO蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞能夠在缺陷性培養(yǎng)基SD/-Trp-Leu_Hi s-Ade 上生長(zhǎng)。
5.一種用于篩選結(jié)核桿菌L12蛋白和LlO蛋白相互作用阻斷劑、抗結(jié)核桿菌藥物、或者治療和/或預(yù)防結(jié)核病的藥物的細(xì)胞模型，其包含權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的細(xì)胞模型，其還包含空白對(duì)照細(xì)胞和/或陰性對(duì)照細(xì)胞；優(yōu)選地，所述空白對(duì)照細(xì)胞為不轉(zhuǎn)染有任何載體的空白酵母細(xì)胞，所述陰性對(duì)照細(xì)胞為染有兩個(gè)不同的表達(dá)載體的酵母細(xì)胞，兩個(gè)表達(dá)載體中各插入有不同的基因，該兩個(gè)不同的基因表達(dá)的蛋白能夠相互結(jié)合，并且表達(dá)的蛋白不是L12和LlO ;更優(yōu)選地，所述細(xì)胞模型包含 AHlO9 (AD-L12+BD-L10)、AH109 (AD-T+BD-53)以及 AH109。
7.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞或者權(quán)利要求5或6所述的細(xì)胞模型在篩選結(jié)核桿菌L12蛋白和LlO蛋白相互作用阻斷劑、抗結(jié)核桿菌藥物、或者治療和/或預(yù)防結(jié)核病的藥物中，或者測(cè)定抗結(jié)核桿菌活性中的用途。
8.ー種篩選結(jié)核桿菌L12蛋白和LlO蛋白相互作用阻斷劑、抗結(jié)核桿菌藥物、或者治療和/或預(yù)防結(jié)核病的藥物的方法，或者測(cè)定抗結(jié)核桿菌活性的方法，包括下述步驟 1)將權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞或者權(quán)利要求5或6所述的細(xì)胞模型接種并進(jìn)行培養(yǎng)； 2)分別向步驟I)中培養(yǎng)的細(xì)胞中加入待測(cè)化合物或組合物，使化合物或組合物的終濃度為10 μ g/m,繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)12-36小時(shí)； 3)觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，找出對(duì)模型細(xì)胞具有抑制作用的化合物或組合物，得到初篩陽(yáng)性的化合物或組合物； 可選地，還包括下述步驟 4)將初篩陽(yáng)性的化合物或組合物進(jìn)行β_半乳糖苷酶活性抑制檢測(cè)。
9.式I或式II所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備結(jié)核桿菌L12蛋白和LlO蛋白相互作用阻斷劑、抗結(jié)核桿菌藥物、或者治療和/或預(yù)防結(jié)核病的藥物中的用途。
10.ー種抑制結(jié)核桿菌的方法，包括使用有效量的式I或式II化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的步驟。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物學(xué)和藥學(xué)領(lǐng)域，涉及篩選結(jié)核桿菌抑制劑的細(xì)胞模型及篩選方法。具體地，本發(fā)明涉及一種細(xì)胞，其表達(dá)結(jié)核桿菌的L12蛋白和L10蛋白，其中，L12的編碼基因與轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域位于一個(gè)表達(dá)載體，L10的編碼基因與轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于另一個(gè)表達(dá)載體。本發(fā)明還涉及式I或式II所示的化合物在制備結(jié)核桿菌L12蛋白和L10蛋白相互作用阻斷劑、抗結(jié)核桿菌藥物、或者治療和/或預(yù)防結(jié)核病的藥物中的用途。本發(fā)明的細(xì)胞模型能夠有效地用于抗結(jié)核桿菌藥物的篩選。
文檔編號(hào)A61K31/5415GK102719368SQ20111007978
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2011年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月31日
發(fā)明者司書毅, 李妍, 林媛, 洪斌, 王彥昶, 肖春玲, 蔣建東, 高娜娜 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所