專利名稱：一種從中草藥中提取總黃酮的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種從中草藥中提取總黃酮的制備方法。
背景技術(shù)：
黃酮類(lèi)化合物是一類(lèi)存在于植物界的具有生物活性的重要物質(zhì)，廣泛存在于不同 科屬植物中，主要存在于蕓香料、唇形科、豆科、傘形科與菊科中。研究報(bào)道，約有20%的中 草藥中含有黃酮類(lèi)化合物，可見(jiàn)黃酮類(lèi)化合物的資源相當(dāng)豐富。黃酮類(lèi)化合物可以從食物 中攝得，也可從富含黃酮類(lèi)化合物的植物中提取，它不僅能作為防治心腦血管疾病的藥物， 而且有明顯的抗脂質(zhì)過(guò)氧化、抗衰老、清除自由基，降血脂、降低膽固醇、降血糖，抗癌防癌、 免疫調(diào)節(jié)等生理活性，是一類(lèi)具有廣闊應(yīng)用前景的天然成分，也是應(yīng)用前景廣泛的天然抗 氧劑，防腐劑，可用于研制多種保健食品、食品添加劑和化妝品。因此具有很好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用 價(jià)值。近年來(lái)從天然植物中提取黃酮類(lèi)化合物的方法多采用常規(guī)的提取方法，包括冷浸 法、超聲法、回流法等。這些方法具有溶劑用量大、提取時(shí)間長(zhǎng)、操作麻煩、效率較低等弊端。 而分離富集黃酮類(lèi)成分多采用大孔樹(shù)脂柱色譜，以不同比例的含水溶劑梯度洗脫的方法。 由于大量提取液和洗脫液需要濃縮，濃縮方法不當(dāng)往往容易造成有效成分破壞，降低有效 成分的提取率，同時(shí)黃酮提取物中常含有一些重金屬雜質(zhì)，且往往超標(biāo)。Melicope patulinervia (Merr. & Chun)Huang為蕓香科密茱萸屬植物，為灌木或
喬木，分布在中國(guó)大陸的海南的等地，生長(zhǎng)在海拔900 1200米的坡地疏林中，為海南特有 植物。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，該科植物中所含的化學(xué)成分主要為黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi)和萜類(lèi)等，具有顯 著的抗氧化、抑菌殺蟲(chóng)、清熱解毒、行氣止痛，燥濕止癢等作用。是一味民間常用中草藥，民 間主要用于治療咽喉腫痛，熱毒瘡腫，風(fēng)濕痹痛，濕火骨痛，跌打腫痛等癥，外用治療皮膚濕 熱瘡疹，皮膚瘙癢，痔瘡。目前對(duì)其化學(xué)成分的研究及其開(kāi)發(fā)應(yīng)用未見(jiàn)有任何報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種從中草藥中提 取總黃酮的制備方法的技術(shù)方案，其工藝簡(jiǎn)單、提取濃縮方法優(yōu)越、操作方便、綠色高效，總 黃酮提取物的收率較高。所述的一種從中草藥中提取總黃酮的制備方法，其特征在于包括以下步驟
1)原料處理將密茱萸藥材挑選后用粉碎機(jī)打成粗粉，過(guò)20 40目篩；
2)滲漉提取將密茱萸粗粉裝入滲漉筒中，用50% 80%含水乙醇浸泡8 12小時(shí) 后，用50% 80%含水乙醇進(jìn)行滲漉提取，若原料重量為Ikg則含水乙醇的用量為8 16 升，流速為5 8 mL/min,收集滲漉液；
3)閃蒸濃縮將滲漉液在水浴溫度60V 90°C，真空度為0.090 Mpa 0. 095Mpa，進(jìn) 液流速為200 350 mL min-1的條件下進(jìn)行真空薄膜濃縮，回收乙醇，得到每mL藥液折合 含1. 0 2. 0g原料的濃縮液；4)大孔樹(shù)脂吸附純化將得到的濃縮液通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂分離富集，依次用水、10%含 水乙醇、20% 70%含水乙醇進(jìn)行梯度洗脫，最后用70%丙酮洗脫，洗脫流速為5 15 mL · mirT1，分別收集3倍柱體積的各部位洗脫液，收集合并20% 60%含水乙醇各部位的洗脫 液，將合并的洗脫液在60°C 90°C下，真空度為0. 090 Mpa 0. 095Mpa,進(jìn)液流速為250 350 mL · mirT1的條件下進(jìn)行真空薄膜濃縮干燥，即得密茱萸總黃酮提取物干粉。所述的一種從中草藥中提取總黃酮的制備方法，其特征在于步驟2)中用于浸泡 的含水乙醇濃度為60% 70%，浸泡時(shí)間為9-10小時(shí)；用于滲漉提取的含水乙醇濃度為 60% 70%，流速為 6 7 mL/min。所述的一種從中草藥中提取總黃酮的制備方法，其特征在于步驟3)中水浴溫度 為70°C 80°C，真空度為0. 093Mpa，進(jìn)液流速為250 300mL · mirT1。所述的一種從中草藥中提取總黃酮的制備方法，其特征在于步驟4)中依次用 水、10%含水乙醇、20%含水乙醇、40%含水乙醇、60%含水乙醇、70%含水乙醇進(jìn)行梯度洗脫， 最后用70%丙酮洗脫，洗脫流速為8 12mL · mirT1，分別收集3倍柱體積的各部位洗脫液， 收集合并20%含水乙醇、40%含水乙醇和60%含水乙醇各部位的洗脫液。所述的一種從中草藥中提取總黃酮的制備方法，其特征在于步驟4)中依次用 水、10%含水乙醇、25%含水乙醇、35%含水乙醇、45%含水乙醇、55%含水乙醇、70%含水乙醇 進(jìn)行梯度洗脫，最后用70%丙酮洗脫，分別收集3倍柱體積的各部位洗脫液，收集合并、25% 含水乙醇、35%含水乙醇、45%含水乙醇和55%含水乙醇各部位的洗脫液。所述的一種從中草藥中提取總黃酮的制備方法，其特征在于步驟4)中合并的 洗脫液濃縮干燥的溫度為70°C 80°C下，真空度為0. 093 Mpa，進(jìn)液流速為觀0 320 mL · mirT1。所述的大孔吸附樹(shù)脂為Dianon HP-20大孔吸附樹(shù)脂。上述一種從中草藥中提取總黃酮的制備方法，具有以下有益效果
1、本發(fā)明對(duì)密茱萸采用含水乙醇滲漉提取，真空閃蒸濃縮，具有提取溶劑用量少、提取 效率比冷浸法高、室溫提取不破壞有效成分；閃蒸濃縮時(shí)濃縮液受熱溫度低、時(shí)間短、濃縮 速度快、效率高，操作簡(jiǎn)單、使用方便、節(jié)能環(huán)保等優(yōu)勢(shì)。2、上述從密茱萸中提取制備總黃酮的方法，工藝簡(jiǎn)單、提取濃縮方法先進(jìn)、操作方 便、成本低，綠色高效，總黃酮提取物收率高。采用紫外分光光度法測(cè)定所得到的總黃酮提 取物，提取物中總黃酮的含量為6. 12% 15. 58%，總黃酮的提取率為5. 25% 10. 43%，總 黃酮的轉(zhuǎn)移率高達(dá)45. 63% 62. 88%。經(jīng)初步體外生物活性試驗(yàn)表明，密茱萸總黃酮提取 物具有一定的抗菌、抗氧化活性，可用作食品添加劑、抗氧劑、防腐劑、藥物原料等。因此具 有很好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值。3、通過(guò)ICP-MS法測(cè)定總黃酮提取物中重金屬的含量，發(fā)現(xiàn)采用該發(fā)明方法制備 的密茱萸總黃酮中重金屬含量很低，符合《中國(guó)藥典》及《藥用植物及其制劑進(jìn)出口綠色行 業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》的標(biāo)準(zhǔn)。本申請(qǐng)文件中涉及的百分含量除另有說(shuō)明外，液體的百分含量為體積比，固體的
百分含量為重量比。


圖1為5-羥基-6，7. 8-三甲氧基_3' ,4'-亞甲二氧基黃酮的核磁共振氫譜圖； 圖2為5-羥基-6，7. 8-三甲氧基-3' ,4'-亞甲二氧基黃酮的核磁共振碳譜圖3為5，6，7. 8-四甲氧基-3' ,4'-亞甲二氧基黃酮的核磁共振氫譜圖； 圖4為5，6，7.8_四甲氧基-3' ,4'-亞甲二氧基黃酮的核磁共振碳譜圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1
1)原料處理將密茱萸藥材挑選后用粉碎機(jī)打成粗粉，過(guò)20目篩；
2)滲漉提取將密茱萸粗粉裝入滲漉筒中，用60%含水乙醇浸泡10小時(shí)后，用70%含 水乙醇進(jìn)行滲漉提取，若原料重量為Ikg則含水乙醇的用量為12升，流速為6 mL/min，收集 滲漉液；
3)閃蒸濃縮將滲漉液在水浴溫度70°C，真空度為0.095Mpa，進(jìn)液流速為250mL · HiirT1的條件下進(jìn)行真空薄膜濃縮，回收乙醇，得到每mL藥液折合含2. Og原料的濃縮液；
4)大孔樹(shù)脂吸附純化將得到的濃縮液通過(guò)DiaionHP-20大孔吸附樹(shù)脂分離富集，依 次用水、10%含水乙醇、20%含水乙醇、40%含水乙醇、60%含水乙醇、70%含水乙醇進(jìn)行梯度 洗脫，洗脫流速為10 mL · mirT1，分別收集3倍柱體積的各部位洗脫液，收集合并20%含水 乙醇、40%含水乙醇和60%含水乙醇各部位的洗脫液，將合并的洗脫液在70°C下，真空度為 0. 095Mpa，進(jìn)液流速為300 mL ^irT1的條件下進(jìn)行真空薄膜濃縮真空濃縮、干燥，即得密茱 萸總黃酮提取物干粉。在本發(fā)明所述的制備方法中
步驟1)中將密茱萸藥材粗粉過(guò)40目篩；
步驟2)中用于浸泡的含水乙醇濃度為50^^70%或80%，浸泡時(shí)間為8小時(shí)、9小時(shí) 或12小時(shí)；用于滲漉提取的含水乙醇濃度為50 %、60 %或80 %，流速為流速為5 mL/min、7 mL/min 或 8 mL/min ；
步驟3)中水浴溫度為60 °C、80 °C或90°C，真空度為0. 093Mpa,進(jìn)液流速為 200mL · min"\300mL · mirT1 或 350mL · mirT1，得到每 mL 藥液折合含 1. OgU. 3g、l. 5g、l. 8g 原料的濃縮液；
步驟4)中依次用水、10%含水乙醇、25%含水乙醇、35%含水乙醇、45%含水乙醇、55%含 水乙醇、70%含水乙醇進(jìn)行梯度洗脫，最后用70%丙酮洗脫，分別收集3倍柱體積的各部位洗 脫液，收集合并、25%含水乙醇、35%含水乙醇、45%含水乙醇和55%含水乙醇各部位的洗脫液。步驟4)中合并的洗脫液濃縮干燥的溫度為60°C、70°C或80°C，真空度為0.093 Mpa,洗脫流速為 5mL · HiirT1JmL · mirT1、12mL · mirT1 或 15mL · mirT1，進(jìn)液流速為 250 mL ‘ min"\320 mL · mirT1或350 mL · mirT1。上述步驟中用H2O及10%的含水乙醇洗脫為 除去水溶性雜質(zhì)，最后都用70%丙酮洗脫除掉全部雜質(zhì)，再生大孔吸附樹(shù)脂；
其它同實(shí)施例1，能取得本發(fā)明所述的有益效果。以下通過(guò)相應(yīng)的試驗(yàn)對(duì)通過(guò)本發(fā)明制備的總黃酮提取物進(jìn)行總黃酮及重金屬的含量測(cè)定，同時(shí)進(jìn)行體外抗菌及抗氧化活性試驗(yàn)。1、密茱萸提取物中總黃酮的含量測(cè)定
測(cè)定條件UV-2102PCS紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海龍尼柯儀器有限公司)；槲皮素對(duì)照 品(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供)，槲皮素的最大吸收波長(zhǎng)510 nm。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確稱取干燥恒重的槲皮素對(duì)照品5. 5 mg，加入75%乙醇溶解 并定容至50 mL的量瓶中，搖勻得濃度為0. 110 mg · mL—1的對(duì)照品溶液。分別取上述槲皮 素標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0. 5、1. 0、1. 5、2. 0、2. 5、3. 0于10 mL量瓶中，用75%乙醇補(bǔ)充至5 mL，各加 入0.5 mL 5%亞硝酸鈉，搖勻，放置5 min后再各加入10%硝酸鋁0. 5 mL，搖勻。5 min后 再加入4%的氫氧化鈉溶液4 mL，混勻，用75%乙醇稀釋至刻度。15 min后于510 nm處測(cè) 吸光度，試劑為空白參比，以槲皮素質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，吸光度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用 最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得槲皮素含量與吸光度之間的回歸方程y = 12. 93x + 0.44， y=0. 9980。樣品的含量測(cè)定精密稱定干燥的密茱萸提取物干粉(實(shí)施例1)適量，用75%乙 醇溶解并定容至25 mL量瓶中。吸取一定量的上述溶液于10 mL量瓶中，添加75%乙醇溶 液使體積約為5 mL，按照上述繪制槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，依次加入亞硝酸鈉、硝酸鋁和氫 氧化鈉溶液，混勻，用75%乙醇稀釋至刻度。靜置20 min后測(cè)定吸光度。重復(fù)3次測(cè)定， 并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出樣品中總黃酮的含量，計(jì)算出密茱萸提取物中總黃酮的平均含量為 16. 12 % 21. 58%，總黃酮的提取率為5. 25 % 10. 43%，總黃酮的轉(zhuǎn)移率高達(dá)45. 63 %
62. 88%ο經(jīng)系統(tǒng)提取分離，從密茱萸70%乙醇提取物的不同萃取部位得到了若干個(gè)黃酮單 體，經(jīng)過(guò)理化鑒別及光譜技術(shù)鑒定了它們的結(jié)構(gòu)。其中在乙酸乙酯萃取部位分離鑒定出的 5，6，7. 8-四甲氧基-3' ,4'-亞甲二氧基黃酮，5-羥基-6，7. 8-三甲氧基-3' ,4'-亞 甲二氧基黃酮的量非常大。經(jīng)HPLC含量測(cè)定，密茱萸總黃酮提取物中5-羥基-6，7. 8-三 甲氧基-3' ,4'-亞甲二氧基黃酮及5，6，7. 8-四甲氧基-3' ,4'-亞二甲氧基黃酮的 含量分別達(dá)3. 12%和5. 37%。2、密茱萸總黃酮提取物中重金屬元素的含量測(cè)定
(1)儀器與工作參數(shù)采用微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定密茱萸總黃酮提 取物中重金屬元素的含量。X-Series型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國(guó)熱電公司)；MARS-5 型微波消解儀(美國(guó)CEM公司)，附RTP-300 Plus溫控；MiIli-Q Academic超純水處理器 (美國(guó)Millipore公司)。硝酸為優(yōu)級(jí)純，其他試劑均為分析純。儀器工作參數(shù)如下表1。表1 ICP-MS工作參數(shù)
權(quán)利要求
1.一種從中草藥中提取總黃酮的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)原料處理將密茱萸藥材挑選后用粉碎機(jī)打成粗粉，過(guò)20 40目篩；2)滲漉提取將密茱萸粗粉裝入滲漉筒中，用50% 80%含水乙醇浸泡8 12小時(shí) 后，用50% 80%含水乙醇進(jìn)行滲漉提取，若原料重量為Ikg則含水乙醇的用量為8 16 升，流速為5 8 mL/min,收集滲漉液；3)閃蒸濃縮將滲漉液在水浴溫度60V 90°C，真空度為0.090 Mpa 0. 095Mpa，進(jìn) 液流速為200 350 mL ^irT1的條件下進(jìn)行真空薄膜濃縮，回收乙醇，得到每mL藥液折合 含1. 0 2. Og原料的濃縮液；4)大孔樹(shù)脂吸附純化將得到的濃縮液通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂分離富集，依次用水、10%含 水乙醇、20% 70%含水乙醇進(jìn)行梯度洗脫，最后用70%丙酮洗脫，洗脫流速為5 15 mL · mirT1，分別收集3倍柱體積的各部位洗脫液，收集合并20% 60%含水乙醇各部位的洗脫 液，將合并的洗脫液在60°C 90°C下，真空度為0. 090 Mpa 0. 095Mpa,進(jìn)液流速為250 350 mL · mirT1的條件下進(jìn)行真空薄膜濃縮干燥，即得密茱萸總黃酮提取物干粉。
2.如權(quán)利要求1所述的一種從中草藥中提取總黃酮的制備方法，其特征在于步驟2) 中用于浸泡的含水乙醇濃度為60% 70%，浸泡時(shí)間為9-10小時(shí)；用于滲漉提取的含水 乙醇濃度為60% 70%，流速為6 7 mL/min。
3.如權(quán)利要求1所述的一種從中草藥中提取總黃酮的制備方法，其特征在于步驟3) 中水浴溫度為70°C 80°C，真空度為0. 093Mpa，進(jìn)液流速為250 300mL · mirT1。
4.如權(quán)利要求1所述的一種從中草藥中提取總黃酮的制備方法，其特征在于步驟4) 中依次用水、10%含水乙醇、20%含水乙醇、40%含水乙醇、60%含水乙醇、70%含水乙醇進(jìn)行 梯度洗脫，最后用70%丙酮洗脫，洗脫流速為8 12mL · mirT1，分別收集3倍柱體積的各部 位洗脫液，收集合并20%含水乙醇、40%含水乙醇和60%含水乙醇各部位的洗脫液。
5.如權(quán)利要求1所述的一種從中草藥中提取總黃酮的制備方法，其特征在于步驟4) 中依次用水、10%含水乙醇、25%含水乙醇、35%含水乙醇、45%含水乙醇、55%含水乙醇、70% 含水乙醇進(jìn)行梯度洗脫，最后用70%丙酮洗脫，分別收集3倍柱體積的各部位洗脫液，收集 合并、25%含水乙醇、35%含水乙醇、45%含水乙醇和55%含水乙醇各部位的洗脫液。
6.如權(quán)利要求1所述的一種從中草藥中提取總黃酮的制備方法，其特征在于步驟4) 中合并的洗脫液濃縮干燥的溫度為70°C 80°C下，真空度為0.093 Mpa，進(jìn)液流速為 280 320 mL · mirT1。
全文摘要
一種從中草藥中提取總黃酮的制備方法，屬于植物技術(shù)領(lǐng)域。制備工藝包括以密茱萸為原料，用含水乙醇做溶劑進(jìn)行滲漉提??；提取液閃蒸濃縮回收溶劑；濃縮液通大孔吸附樹(shù)脂柱分離富集，用含水溶劑進(jìn)行梯度洗脫，合并一定比例的含水溶劑洗脫液閃蒸濃縮回收溶劑，繼續(xù)真空干燥成干粉即可。其工藝簡(jiǎn)單、提取濃縮方法優(yōu)越、操作方便、綠色高效，提取物中總黃酮的含量為6.12％～15.58%，總黃酮的提取率為5.25％～10.43%，總黃酮的轉(zhuǎn)移率高達(dá)45.63％～62.88%。經(jīng)初步體外生物活性試驗(yàn)表明，密茱萸總黃酮提取物具有一定的抗氧化、抑菌等活性，可用作食品添加劑、抗氧劑、防腐劑等，具有一定的開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A61P11/04GK102145066SQ201110080130
公開(kāi)日2011年8月10日 申請(qǐng)日期2011年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月31日
發(fā)明者劉婷, 胡佳慧, 袁珂, 黃偉飛 申請(qǐng)人:浙江農(nóng)林大學(xué)