專利名稱：納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性復(fù)合IgY的制備方法及其制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及牛乳房炎的治療技術(shù)，尤其涉及到一種納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性復(fù)合IgY的制備方法以其制劑。
背景技術(shù)：
牛乳房炎是奶牛最常見的、也是對奶牛業(yè)生產(chǎn)危害最大的一種疾病。這種疾病會造成奶牛乳腺發(fā)炎腫脹，使產(chǎn)奶量大幅下降。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計數(shù)字顯示，這種疾病使美國制奶業(yè)每年損失大約20億美元，使英國每年損失也達(dá)2億美元以上。由于中國正處于奶牛業(yè)高速發(fā)展期，相關(guān)技術(shù)、措施和設(shè)施還不配套和完善，因此，乳房炎所造成的損失就更加嚴(yán)重，每年高達(dá)上百億元，沉重打擊了中國奶牛業(yè)的發(fā)展。急性乳房炎會直接造成牛乳的廢棄、上乳量減少、牛乳價值降低、獸醫(yī)診療費(fèi)和藥費(fèi)及勞動量增加等經(jīng)濟(jì)損失；隱性乳房炎則因其感染率特別高(一般奶牛場的感染率在30 50%)，所造成的損失也不可輕視，尤其對產(chǎn)乳量會有很大影響，以10頭牛規(guī)模的小奶牛場計算，每年產(chǎn)乳量就將減少3825kg，同時，還有飼料和人工等的間接損失。而且，乳房炎病牛經(jīng)治愈后，其產(chǎn)奶量不會很快恢復(fù)，吃進(jìn)的飼料不能轉(zhuǎn)換成奶汁，有的乳頭甚至因此變“瞎”，不出乳，帶來的經(jīng)濟(jì)損失就更大。目前，治療奶乳房炎普遍采用的是抗生素療法。由于大劑量地使用青霉素、鏈霉素、四環(huán)素和金霉素等藥物，會造成牛乳中抗生素大量殘留。一方面由于牛乳中有抗生素殘留，接種乳酸菌后不易繁殖，使乳酸生成受阻，極大地影響酸乳制品的生產(chǎn)；另一方面當(dāng)人們食用這種含大量抗生素的牛乳后，會引起多種過敏反應(yīng)，甚至發(fā)生過敏性休克，如果長期飲用，還會使機(jī)體內(nèi)的細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，一旦發(fā)生感染性疾病，將給醫(yī)治帶來很大困難，甚至無藥可救。更為嚴(yán)重的是濫用抗生素的結(jié)果，造成目前常用的抗生素對奶牛場廣泛傳播的致病菌已大部分失效，使隱性乳房炎和慢性乳房炎病例越來越多；特別是大量使用抗生素之后形成的L-型變種耐藥致病菌，既使施用再多抗生素，它仍會隱藏在乳房內(nèi)生存和繁殖，慢性感染乳腺，使乳房炎反復(fù)發(fā)作。另外，抗生素會殺滅有益菌，從而影響乳房內(nèi)正常菌群平衡，破壞機(jī)體天然免疫屏障，給有害菌大開方便之門。這些都是造成牛乳房炎無法根治，并且不斷蔓延的根本原因。為了消除抗生素應(yīng)用所帶來的負(fù)面影響，減少和杜絕耐藥致病菌株的出現(xiàn)和傳播，世界衛(wèi)生組織呼吁各國采取緊急措施。美國、英國等許多國家都制定了相應(yīng)的政策嚴(yán)格限制抗生素的使用。根據(jù)歐盟第70/524號令的精神，傳統(tǒng)抗生素將在很短時間內(nèi)被逐一取消，并將在2006年后全部禁作飼用。世界其它各國為與國際接軌，也都相應(yīng)制訂了一系列新法規(guī)。因此，研發(fā)一種安全有效的防治牛乳房炎的新方法，開發(fā)并應(yīng)用既無藥殘，又無污染，又能提高謄經(jīng)濟(jì)效益的治療牛乳房炎的抗生素替代品，是全球奶牛飼養(yǎng)業(yè)發(fā)展的大方、向和迫切需求。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中牛乳房炎影響嚴(yán)重、且無法根治的問題，本發(fā)明要提供一種抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性復(fù)合Ig及其制劑。本發(fā)明首先提供一種納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性復(fù)合IgY的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(SI)篩選引致牛乳房炎的代表性耐藥致病 菌作為病原體，所述耐藥致病菌包括無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及白色念珠菌中的至少兩種；(S2)將所述耐藥致病菌混合、粉碎處理后，加入福氏佐劑，再高速勻化處理形成油包水乳液，即制得耐藥致病菌蛋白復(fù)合抗原；(S3)采用淘汰法篩選具有高免疫應(yīng)答能力的選擇產(chǎn)蛋禽類，再揀取被選出之產(chǎn)蛋禽類所產(chǎn)的免疫蛋；(S4)對所述免疫蛋進(jìn)行消毒，取蛋黃，制得抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性IgY粗品;(S5)將所述IgY粗品進(jìn)一步純化處理，制得抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性IgY純品干粉；(S6)對所述IgY純品干粉作納米化處理，制得納米化抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性IgY純品干粉；(S7)對所述納米化抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性IgY純品干粉作脂質(zhì)體化處理，制得納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性復(fù)合IgY。本發(fā)明還提供一種納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性復(fù)合IgY制劑，其中包括前述方法制備的納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性復(fù)合IgY，還包括針劑或乳膏輔料。本發(fā)明的納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性復(fù)合IgY及其制劑，能定向殺滅引起牛乳房炎的無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及白色念珠菌；特別是還能有效殺滅抗生素對其無能為力的抗藥性耐藥無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和白色念珠菌?？捎行У匾譁缛槌貎?nèi)表面粘膜附著的致病菌,提升治療指數(shù)。這是常規(guī)方法制備的抗牛乳房炎致病菌IgY所做不到的。


本發(fā)明無附圖。
具體實(shí)施例方式在公告號為CN101555281的中國發(fā)明專利中，公開了一種“抗甲型HlNl流感病毒特異性IgY的制備方法及其相關(guān)制劑”，其中的IgY為免疫球蛋白。本發(fā)明的部分實(shí)施步驟與該專利有類似之處，但在選取病原體、制備免疫用抗原等核心步驟上則有明顯區(qū)別，其他后續(xù)處理步驟也有因應(yīng)改進(jìn)之處。一 .制備抗牛乳房炎病原體特異性IgY
I.篩選引致牛乳房炎有代表性的病原體根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，乳房炎的病原體有80 130多種，其中主要的病原體為無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及白色念珠菌等。長期以來，世界各地包括歐美發(fā)達(dá)國家都還是采用抗生素治療牛乳房炎，由于抗生素治療牛乳房炎復(fù)發(fā)率高，只好反復(fù)使用并不斷增加劑量，結(jié) 果造成耐藥致病菌泛濫。事實(shí)證明，由耐藥致病菌引發(fā)的牛乳房炎采用抗生素治療根本是無效的，往往久治不愈而轉(zhuǎn)變成慢性或隠性牛乳房炎，最終只好將奶牛報廢，損失慘重。鑒于這一現(xiàn)狀，本發(fā)明別具一格地選擇耐藥變種的無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及白色念珠菌作為有代表性的病原體，來制作免疫抗原。2.制備免疫用抗原2. I制備耐藥致病菌蛋白混合物在隱性牛乳房炎發(fā)生率較多的內(nèi)蒙呼和浩特市效區(qū)奶牛場現(xiàn)場采集耐藥變種的無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及白色念珠菌菌株，按照無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及白色念珠菌的培養(yǎng)特性和最適培養(yǎng)條件，分別選擇適宜的培養(yǎng)基，分別進(jìn)行耐藥變種的無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及白色念珠菌等菌株大量繁殖，收集培養(yǎng)物，提純、菌株計數(shù)，稀釋分裝；然后，將這五種耐藥致病菌按重量比I 10 : I 10 : I 10 : I 10 : I 10的比例混合，也可將兩種以上牛乳房炎耐藥致病菌按比例混合。最后，再采用超聲粉碎機(jī)將混合的耐藥致病菌粉碎，獲得含全菌和菌體成份的多種耐藥致病菌蛋白混合物。2. 2制備耐藥致病菌蛋白復(fù)合抗原將所制得含全菌和菌體成份的耐藥致病菌蛋白混合物的漿液以I 10 : I 10的比例(通常為I : I)加入福氏佐劑，置入高速勻漿器以30，OOOrpm高速勻化，形成油包水乳液，即制得牛乳房炎耐藥致病菌蛋白復(fù)合抗原。3.制備含高活性抗體的免疫蛋本發(fā)明可選用任何產(chǎn)蛋禽類免疫制備免疫蛋，限于篇幅僅以母雞為例說明，其它禽類完全可依下文所述方法同樣進(jìn)行。首先采用淘汰法選擇產(chǎn)蛋禽類(雞、鴨、鵝、火雞、鴕鳥等)，再用所選擇的禽類，獲得免疫蛋?，F(xiàn)以產(chǎn)蛋母雞為代表說明如下。3. I采用淘汰法選擇具有高免疫應(yīng)答能力的產(chǎn)蛋母雞3. I. I選擇正在產(chǎn)蛋的健康無特定病原體攜帶的(SPF)健康產(chǎn)蛋雞200只并一一用數(shù)字進(jìn)行編號標(biāo)記。然后用上述制得的無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及白色念珠菌耐藥致病菌蛋白復(fù)合抗原對這些產(chǎn)蛋雞進(jìn)行注射免疫。在第一次注射后間隔7天，再以同樣劑量、方法注射第二次，第二次注射后再間隔7天以相同劑量注射第3次，第一次注射后從第20天開始揀取高免疫蛋。對所檢取的免疫蛋按每只雞的編號不同進(jìn)行編碼標(biāo)記。3. 1.2當(dāng)每種編碼的免疫蛋數(shù)量達(dá)到10只左右時，將檢取的每批免疫蛋分別用
O.5%新潔而滅溶液或O. I % KMn04溶液或其它同類消毒液將免疫蛋浸泡15 30分鐘消毒，無菌蒸餾水沖洗、晾干，置于打蛋機(jī)中將蛋殼打碎，用蛋黃篩濾除蛋清留下蛋黃加入4 8倍蒸餾水稀釋攪拌均勻，用lmol/1 NaOH液或者lmol/1 HCL液調(diào)節(jié)PH值至5. 5 6. O，4 6°C下靜置過夜，稀釋液8，OOO 12，000r/min高速離心20分鐘，取上清液用超濾機(jī)超濾濃縮，得到200批抗牛乳房炎病原體特異性IgY濃縮液體。3. I. 3分別以耐藥無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及白色念珠菌作為抗原，采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測所制得的200批抗牛乳房炎病原體特異性IgY濃縮液體中每批對耐藥無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及白色念珠菌的抗體結(jié)合效價。3. I. 4將凡是對耐藥無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及白色念珠菌的抗體結(jié)合效價達(dá)到I : 102,400以上的該批抗牛乳房炎病原體特異性IgY濃縮液體單獨(dú)挑選出來；找出其對應(yīng)的產(chǎn)蛋母雞的編號，把這些產(chǎn)蛋母雞作為選擇的“具有高免疫應(yīng)答能力的產(chǎn)蛋母雞”，其它不符合高免疫應(yīng)答能力的母雞則淘汰不用。4.制備抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性IgY粗品 檢取選擇的高免疫應(yīng)答能力的產(chǎn)蛋母雞所產(chǎn)的免疫蛋，將所獲得的高免疫蛋分別用O. 5%新潔而滅溶液或O. I % KMn04溶液或其它同類消毒液將免疫蛋浸泡15 30分鐘消毒，無菌蒸餾水沖洗、晾干，置于打蛋機(jī)中將蛋殼打碎，用蛋黃篩濾除蛋清留下蛋黃加入4 8倍蒸餾水稀釋攪拌均勻，用lmol/1 NaOH液或者lmol/1 HCL液調(diào)節(jié)PH值至5. 5 6. 0，4 6°C下靜置過夜，稀釋液8，000 12，000r/min高速離心20分鐘，取上清液用超濾機(jī)超濾濃縮。然后，采用美國Pall Ultrafine Filtration Company制造的除病毒過濾系統(tǒng)的細(xì)菌病毒濾除裝置，徹底濾除各種細(xì)菌病毒，確保所制備的IgY絕不含任何病毒和細(xì)菌。第一道細(xì)菌濾除裝置是用0. 22 μ m膜除菌過濾器除去沙門菌(Salmonella)等細(xì)菌；第二道支原體濾除裝置是用0. I μ m膜除支原體過濾器除去支原體；第三道病毒濾除裝置是用Ultipor VFTM DV50除病毒過濾器除去包括禽流感病毒、腸病毒在內(nèi)的多種病毒。最后，將所得濃縮液用冷凍干燥機(jī)干燥，即制得抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性IgY粗品。5.制備抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性IgY純品將所制得的抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性IgY粗品分別過離子交換柱和凝膠交換柱再經(jīng)過親和層析柱進(jìn)行純化，即制得高活性的抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性IgY。采用常規(guī)“水稀釋法”或“聚乙二醇法”等普通方法，而未經(jīng)過親和層析柱層析純化的，所得到的只是初級的IgY粗制品，并不是純化的IgY，其生物活性達(dá)不到醫(yī)療要求。將所制得的抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性IgY純品應(yīng)用冷凍干燥機(jī)干燥，即制得抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性IgY純品干粉。應(yīng)用SDS-PAGE電泳測定法，對按以上工藝所制取的抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性IgY純品進(jìn)行檢測，測得其中IgY含量都在98%以上。6.制備納米化抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性IgY純品干粉取所制得的抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性IgY純品干粉，加入超微粉碎機(jī)中碾磨粉碎，加工成大小在I IOOnm之間、粒度超過> 15000目的超微粒子，制得相應(yīng)的納米化抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性IgY純品干粉。7.制備納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性復(fù)合IgY將以上所制得的納米化抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性IgY純品作脂質(zhì)體化處理，具體實(shí)施方法如下把卵磷脂和膽固醇溶于乙醚中，再將納米化抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性IgY純品加入4mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)配成IgY溶液；然后將含卵磷脂和膽固醇的混懸液與IgY溶液混合，超聲處理2min(每處理O. 5min,間歇.O. 5min),立即在水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至呈凝膠狀，漩渦振蕩使凝膠轉(zhuǎn)相，再繼續(xù)蒸發(fā)除盡乙醚，進(jìn)而超速離心(35000r/min，30min)分離除去未包入的IgY,沉淀用水洗二次 ,離心,得沉淀,用10mmol/L PBS稀釋，即制得納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性復(fù)合IgY。分別以耐藥無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及白色念珠菌作為抗原，采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測以上所制得的納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性復(fù)合IgY對耐藥無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及白色念珠菌的抗體結(jié)合效價都高達(dá)I : 102，400以上?？梢?，本發(fā)明的制備過程中，依次有代表性耐藥致病菌作為病原體、耐藥致病菌蛋白復(fù)合抗原、免疫蛋、抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性IgY粗品、抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性IgY純品、納米化抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性IgY純品，并最后得到納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性復(fù)合IgY。二·實(shí)際應(yīng)用實(shí)際應(yīng)用時，可基于上述所制得的納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性復(fù)合IgY，加入各種輔料制成針劑和乳膏，供應(yīng)給全球各地的奶牛場，用于對牛乳房炎的預(yù)防和治療。大量試驗(yàn)已證明，這種高活性特異性復(fù)合IgY能定向殺滅引起牛乳房炎的無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及白色念珠菌；特別是還能有效殺滅抗生素對其無能為力的抗藥性耐藥無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和白色念珠菌。而且，由于這種特異性IgY只殺滅病原體，對牛乳房內(nèi)的乳酸桿菌等有益菌郝秋毫無犯；因此，不會象抗生素那樣殺滅乳房內(nèi)乳酸桿菌等有益菌，破壞乳房內(nèi)正常的酸性環(huán)境和菌群平衡，造成二次感染或反復(fù)復(fù)發(fā)。更重要的是，使用這種特異性IgY還會恢復(fù)有益菌良好的生長微環(huán)境，構(gòu)建有益菌群，從而形成無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及真菌無法再生存的新的菌群生態(tài)平衡，達(dá)到牛乳房炎不再復(fù)發(fā)的長效抑菌效果。另外，由于本發(fā)明的納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性復(fù)合IgY具有很強(qiáng)的靶向性、延效性和表皮滲透性，可以更有效地滲透深入奶牛乳池內(nèi)表面粘膜層；從而更有效地抑滅乳池內(nèi)表面粘膜附著的致病菌，提升治療指數(shù)。這是常規(guī)方法制備的抗牛乳房炎致病菌IgY所做不到的。除此以外，這種高活性免疫球蛋白IgY是一種天然安全的物質(zhì)，美國食品醫(yī)藥管理局(FDA)已將其列入「一般公認(rèn)安全物質(zhì)(Generally Regarded asSafe, GRAS)」范疇，是人類和奶?？商焯焓秤玫牡爸破烦煞莸奶崛∥?，沒有任何毒副作用，既使長期給奶牛使用也不會產(chǎn)生殘留；因此，不必像施用抗生素藥物治療牛乳房炎那樣需要很長的停擠乳或棄乳期，這一點(diǎn)也具有十分明顯的優(yōu)勢。因?yàn)橥D奶或棄乳造成的損失十分可觀，一般施用抗生素或化學(xué)藥后起碼需要停止擠奶五天以上；因此，乳農(nóng)每施一次藥，每頭牛至少損失125 210公斤牛乳，按一個牧場有100多頭乳牛計算，一個牧場每次施藥就要損失10噸牛乳以上。而采用本發(fā)明的“納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性復(fù)合IgY”的針劑或膏劑等防治牛乳房炎，由于它是無毒、無副作用、無殘留的天然成份；因此，也就不存在停擠奶期和棄乳的問題，從而可大幅度減少奶牛場的損失，提高經(jīng)濟(jì)效益。另外，隨著國民生活水平的提高，人們對食品安全的要求越來越高，而奶源污染問題已經(jīng)成為牛奶質(zhì)量的關(guān)鍵；歐美發(fā)達(dá)國家已制訂了嚴(yán)格限定乳制品中抗生素殘留的標(biāo)準(zhǔn)。中國也在最近通過了生鮮牛乳收購標(biāo)準(zhǔn)(GB6914-86);新的標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)制規(guī)定把“抗生素殘留”列入國家必檢項(xiàng)目。而本發(fā)明的納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性復(fù)合IgY及其制劑為生產(chǎn)出真正意義上的“無抗奶”創(chuàng)造了條件。實(shí)驗(yàn)例I
抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性IgY中的IgY含量檢測應(yīng)用SDS-PAGE (十二烷基硫酸鈉一聚丙烯凝膠)電泳測定法，對按以上方法第4點(diǎn)所制取的抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性IgY粗品進(jìn)行檢測，結(jié)果含IgY 45 52%。將這種IgY粗品經(jīng)二次過柱純化后，得到純IgY。經(jīng)SDS-PAGE分析，純度達(dá)到PAGE純，如下表所示
IgY純品純IgY含量
抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性IgY純品99. 99%實(shí)驗(yàn)例2檢測納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性復(fù)合IgY對有代表性的五種抗原的抗體結(jié)合效價。具體是，分別采用耐藥無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及白色念珠菌作為檢測抗原，用“ELISA”方法檢測所制得的納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性復(fù)合IgY的抗體效價。結(jié)果如下表
_IgY__抗原__抗體結(jié)合效價_
耐藥無乳鏈球菌1:204,800
耐藥停乳鏈球菌1:204,800
納Χ 炎耐藥耐藥金黃色葡萄球菌1:204,800
致病菌特異性復(fù)合IgY -；----
耐藥大腸桿菌I: 204，800
耐藥白色念珠菌I: 204，800從以上檢測結(jié)果可看出，所制備的納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性復(fù)合IgY對作為抗原免疫的五種耐藥致病菌都有很高的抗體結(jié)合效價。試驗(yàn)結(jié)果證明，本發(fā)明所采用的免疫雞篩選和菌體粉碎等免疫激活方法對提高所制備的IgY的抗體效價產(chǎn)生了理想的效果。實(shí)驗(yàn)例3檢測納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性復(fù)合IgY注射劑對有代表性的五種牛乳房炎耐藥致病菌的抑菌和殺菌效果。(一)試驗(yàn)材料、設(shè)備(I)抑菌、殺菌實(shí)驗(yàn)材料納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性復(fù)合IgY注射齊 ，耐藥無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及白色念珠菌，營養(yǎng)瓊脂，營養(yǎng)肉湯，5%羊血營養(yǎng)肉湯。(2)實(shí)驗(yàn)儀器、設(shè)備培養(yǎng)箱，721分光光度計，生理鹽水，吸管，天平等。( 二)試驗(yàn)方法(I)抑菌(MIC)實(shí)驗(yàn)方法取9支無菌試管,每支試管中加入Iml營養(yǎng)肉湯或Iml5%牛血清營養(yǎng)肉湯和Iml已調(diào)整好濃度的細(xì)菌液(耐藥大腸桿菌0D600 = O. 3 ;耐藥金黃色葡萄球菌0D600 = O. 2 ;耐藥無乳鏈球菌0D600 = O. 2 ;耐藥停乳鏈球菌0D600 = O. 2 ;耐藥白色念珠菌0D600 = O. 2)。然后第一支試管加入ImL納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性復(fù)合IgY注射劑懸浮液，待充分混勻后吸出Iml液體加入第二管，充分混勻后吸出Iml液體加入第三管……，依次倍比稀釋，稀釋比為I : 2，1 : 4，1 : 8，1 : 16，1 : 32……。第十管不加本懸浮液，作為陽性對照。將試管放置培養(yǎng)箱，35°C培養(yǎng)過夜。第二天觀察試管培養(yǎng)液澄清度，最高稀釋度的澄清管為抑菌管，計算抑菌濃度(MIC)。(2)殺菌(MBC)實(shí)驗(yàn)方法將上述培養(yǎng)過夜的試管中液體搖勻，從試管中取一接種環(huán)液體接種于血營養(yǎng)瓊脂平板上作次代培養(yǎng)。將血營養(yǎng)瓊脂平板放置培養(yǎng)箱，35°C培養(yǎng)過夜，第二天觀察結(jié)果，殺菌(MBC)的培養(yǎng)皿無菌落生長。(三)結(jié)果(I)抑菌(MIC)觀察培養(yǎng)24小時后最高稀釋度的澄清管為抑菌管，此管的稀釋度為抑菌的稀釋比。(2)殺菌(MBC)觀察血營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)24小時后觀察菌落，最高稀釋度的無細(xì)菌生長的培養(yǎng)皿為殺菌稀釋比。抑菌(MIC)表

權(quán)利要求
1.一種納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性復(fù)合IgY的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 (51)篩選引致牛乳房炎的代表性耐藥致病菌作為病原體，所述耐藥致病菌包括無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及白色念珠菌中的至少兩種； (52)將所述耐藥致病菌混合、粉碎處理后，加入福氏佐劑，再高速勻化處理形成油包水乳液，即制得耐藥致病菌蛋白復(fù)合抗原； (53)采用淘汰法篩選具有高免疫應(yīng)答能力的選擇產(chǎn)蛋禽類，再揀取被選出之產(chǎn)蛋禽類所廣的免疫蛋； (54)對所述免疫蛋進(jìn)行消毒，取蛋黃，制得抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性IgY粗品； (55)將所述IgY粗品進(jìn)一步純化處理，制得抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性IgY純品干粉； (56)對所述IgY純品干粉作納米化處理，制得納米化抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性IgY純品干粉； (57)對所述納米化抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性IgY純品干粉作脂質(zhì)體化處理，制得納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性復(fù)合IgY。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于， 在所述步驟(SI)中包括在隱性牛乳房炎發(fā)生率較多的地區(qū)采集無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及白色念珠菌菌株，分別選擇適宜的培養(yǎng)基進(jìn)行菌株大量繁殖，再收集培養(yǎng)物，提純、菌株計數(shù)，并稀釋分裝； 在所述步驟(S2)中包括將所述五種耐藥致病菌按重量比I 10 : I 10 : I 10 : I 10 : I 10的比例混合，再采用超聲粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎處理，獲得含全菌和菌體成份的多種耐藥致病菌蛋白混合物；將所述耐藥致病菌蛋白混合物的漿液以I 10 I 10的比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿器以30，OOOrpm高速勻化，形成油包水乳液，即制得牛乳房炎耐藥致病菌蛋白復(fù)合抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，在所述步驟(S3)中包括 選擇正在產(chǎn)蛋的健康無特定病原體攜帶的禽類，然后所述耐藥致病菌蛋白復(fù)合抗原進(jìn)行注射免疫，揀取高免疫蛋； 將檢取的免疫蛋消毒，取蛋黃，加入4 8倍蒸餾水稀釋攪拌均勻，用lmol/1 NaOH液、或者lmol/1 HCL液調(diào)節(jié)PH值至5. 5 6. 0，4 6°C下靜置過夜，稀釋液8，000 12，OOOr/min高速離心20分鐘，取上清液用超濾機(jī)超濾濃縮，得到抗牛乳房炎病原體特異性IgY濃縮液體； 分別以耐藥無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及白色念珠菌作為抗原，采用酶聯(lián)免疫法檢測所制得抗牛乳房炎病原體特異性IgY濃縮液體對無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及白色念珠菌的抗體結(jié)合效價，對于結(jié)合效價達(dá)到I : 102,400以上的，選出其對應(yīng)的產(chǎn)蛋禽類。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，在所述步驟(S3)中的注射免疫具體包括在第一次注射后間隔7天，再以同樣劑量、方法注射第二次；第二次注射后再間隔7天以相同劑量注射第三次；并自第一次注射后從第20天開始揀取高免疫蛋。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(S6)的納米化處理步驟包括取所制得的抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性IgY純品干粉，加入超微粉碎機(jī)中碾磨粉碎，力口工成大小在I IOOnm之間、粒度超過> 15000目的超微粒子，即制得相應(yīng)的納米化抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性IgY純品干粉。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(S7)的脂質(zhì)體化處理步驟包括把卵磷脂和膽固醇溶于乙醚中，再將所述納米化抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性IgY純品加入4mmol/L磷酸鹽緩沖液配成IgY溶液；然后將含卵磷脂和膽固醇的混懸液與IgY溶液混合，超聲處理2min，立即在水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至呈凝膠狀，漩渦振蕩使凝膠轉(zhuǎn)相，再繼續(xù)蒸發(fā)除盡乙醚，進(jìn)而超速離心分離除去未包入的IgY，沉淀用水洗二次，離心，得沉淀，用lOmmol/LPBS稀釋，即制得納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性復(fù)合IgY。
7.—種納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性復(fù)合IgY制劑，其特征在于，其中包括根據(jù)權(quán)利要求I所述方法制備的納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性復(fù)合IgY，還包括針劑或乳膏輔料。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的IgY制劑，其特征在于，所述制劑為針劑，所述輔料包括棉籽油、吐溫80、以及蒸餾水。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的IgY制劑，其特征在于，所述制劑為乳膏，所述輔料包括棉籽油、鈦白粉、以及微粉硅膠。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性復(fù)合IgY的制備方法，針對現(xiàn)有技術(shù)中牛乳房炎影響嚴(yán)重、且無法根治的問題，本發(fā)明中選取代表性耐藥致病菌，包括無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及白色念珠菌中的至少兩種作為病原體，依次制備出耐藥致病菌蛋白復(fù)合抗原、免疫蛋、抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性IgY粗品、抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性IgY純品，并將這種抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性IgY純品納米脂質(zhì)體化；最后得到納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎耐藥致病菌特異性復(fù)合IgY。再加入適當(dāng)?shù)妮o料，制成針劑或乳膏。所述制劑對牛乳房炎有明顯療效。
文檔編號A61K39/395GK102731652SQ20111008081
公開日2012年10月17日 申請日期2011年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月31日
發(fā)明者包晟, 包海威, 楊榮鑒, 汪玲 申請人:深圳雅臣生物科技有限公司